ES2780907T3 - Sulfato de dextrano para su uso en la movilización de células - Google Patents

Abstract

Sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la movilización de células progenitoras y/o madre en la sangre periférica de un sujeto, siendo dichas células progenitoras y/o madre capaces de restaurar la hematopoyesis normal después de la quimioterapia o la radiación cuando se infunde en un sujeto que padece una enfermedad cancerígena seleccionada de entre el grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndromes mielodisplásicos (SMD), trastornos mieloproliferativos (TMP), linfoma no Hodgkin (LNH), enfermedad de Hodgkin (EH), leucemia linfocítica crónica (LLC), mieloma múltiple (MM), leucemia mieloide crónica juvenil, neuroblastoma, cáncer de ovario, tumores de células germinales, leucemia de células pilosas (LCP) y leucemia promielocítica aguda (LPA).

Description

DESCRIPCIÓN

Sulfato de dextrano para su uso en la movilización de células

CAMPO TÉCNICO

Las realizaciones generalmente se refieren a la movilización de células en el torrente sanguíneo de un sujeto.

ANTECEDENTES

Las células madre y las células progenitoras son células inmaduras con capacidad para dividirse y desarrollarse para formar cualquier tipo celular del sistema maduro. Las células madre hematopoyéticas (CMH) pueden producir las células del sistema inmunitario y la médula ósea. El trasplante de CMH (TCMH) se usa para restaurar la hematopoyesis normal en un paciente para tratar diversas enfermedades después de la quimioterapia o la radiación. Durante las últimas dos décadas, el TCMH se ha convertido en un tratamiento clínico de rutina para una variedad de afecciones que incluyen mieloma múltiple (MM), linfoma no Hodgkin (LNH) y afecciones que requieren un trasplante de aloinjerto. A pesar de las aparentes mejoras en los últimos años, el procedimiento aún se asocia con una tasa comparablemente alta de morbilidad y mortalidad debido a complicaciones y recaídas de la enfermedad subyacente. También existe una necesidad continua de mejora de las fuentes de células madre, los procedimientos de recogida de células, los regímenes de acondicionamiento y el tratamiento inmunosupresor. Existen dos tipos principales de TCMH, ya sea alogénico, con células madre que proceden de un donante sano compatible, o autólogo, cuando las células madre se recogen y luego se devuelven al mismo paciente después de terapia de acondicionamiento con quimioterapia/radioterapia de alta dosis. En TCMH alogénico y particularmente autólogo, la sangre periférica ha reemplazado hoy día casi por completo la médula ósea como fuente de células madre. Se prefiere la sangre periférica como fuente celular ya que implica un procedimiento menos invasivo para el donante y el injerto de células trasplantadas es más rápido en comparación con el uso de la médula ósea como fuente celular.

A pesar de las aparentes mejoras durante los últimos años, el procedimiento todavía se asocia con una tasa de morbilidad y mortalidad comparablemente alta debido a complicaciones relacionadas con el trasplante (principalmente alogénico) y la recaída de la enfermedad subyacente (principalmente autólogo). Por ende, existe una necesidad continua de mejora de las fuentes de células madre, los protocolos de recogida de células, los regímenes de acondicionamiento y el tratamiento inmunosupresor.

Hoy en día, las células madre se movilizan a la sangre periférica mediante el tratamiento del donante con factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) y las células se recogen por aféresis para su posterior trasplante. Después de la infusión en el torrente sanguíneo del receptor, las células hematopoyéticas sanas migran a la médula ósea, donde pueden diferenciarse para producir células sanguíneas maduras y restaurar la hematopoyesis. Recientemente se aprobó plerixafor (MOZOBIL™, AMD3100, 1,1 '-[1,4-fenilenbis (metileno)]-bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano) en combinación con G-CSF para aumentar la movilización de las células progenitoras en pacientes con MM y LNH.

Una limitación significativa con el tratamiento combinatorio con G-CSF y plerixafor es la lentitud en la movilización de células madre. Aunque los datos experimentales en ratones indican un pico en las células madre movilizadas después de 1 hora después de la administración de plerixafor (Broxmeyer 2005), el pico correspondiente en humanos comienza primero alrededor de 9 horas después de la administración de plerixafor (Mozobil™ Product Monograph). De este modo, la recogida de células madre movilizadas se retrasa hasta aproximadamente 11 horas después de la administración de plerixafor, lo que implica largos tiempos de hospitalización (Monografía del producto Mozobil™). Por lo tanto, es una práctica que plerixafor deba administrarse el día anterior a la recogida celular real.

Sweeney 2000 y Sweeney 2002 investigaron los efectos de los polisacáridos sulfatados, incluido el sulfato de dextrano de 10 kDa, en la movilización de células madre/progenitoras en ratones y monos. En ratones y monos, el sulfato de dextrano resultó en la movilización de células formadoras de colonias (CFC) después de 3 horas y 6 horas, respectivamente, de la administración de sulfato de dextrano. Por lo tanto, los resultados presentados en Sweeney 2000 y Sweeney 2002 parecen indicar que el sulfato de dextrano es aproximadamente tres veces más lento en comparación con plerixafor en términos de movilización de células madre/progenitoras.

RESUMEN

Un objetivo general es proporcionar una movilización eficiente de células diana en el torrente sanguíneo de un sujeto. Otro objetivo general es proporcionar un alto nivel de células diana movilizadas en el torrente sanguíneo de un sujeto.

Estos y otros objetivos se cumplen mediante las realizaciones descritas en esta solicitud.

Un aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la movilización de células progenitoras y/o células madre en la sangre periférica de un sujeto.

Otro aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la movilización de glóbulos blancos diana, en particular linfocitos, en el torrente sanguíneo de un sujeto.

Un aspecto adicional de las realizaciones se refiere a una composición de movilización de células que comprende sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF). Otros aspectos relacionados de las realizaciones definen una composición de movilización de células que comprende sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 3500 y 9500 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y G-CSF para su uso en la movilización de células progenitoras y/o madre en la sangre periférica de un sujeto y/o para su uso en la movilización de glóbulos blancos diana, en particular linfocitos, en el torrente sanguíneo de un sujeto.

En una realización, el derivado farmacéuticamente aceptable es preferentemente una sal farmacéuticamente aceptable de sulfato de dextrano.

Los inventores han encontrado que el sulfato de dextrano de un intervalo estrecho con respecto al peso molecular promedio logra una mejora significativa en la movilización celular en comparación con las moléculas de sulfato de dextrano que tienen pesos moleculares promedio más pequeños o más grandes.

Las moléculas de sulfato de dextrano que tienen un peso molecular promedio por debajo del intervalo de las presentes realizaciones no tienen ningún efecto significativo en términos de movilización de células progenitoras y/o madre o glóbulos blancos. Las moléculas de sulfato de dextrano que tienen un peso molecular promedio por encima del intervalo de las presentes realizaciones no parecen tener ningún efecto aditivo y ningún efecto sinérgico cuando se usan junto con otros compuestos de movilización de células, como G-CSF, y parecen tener un efecto de movilización más lento en comparación con las realizaciones presentes.

Las presentes realizaciones proporcionan una movilización celular eficiente con un perfil de movilización inesperado que desencadena la movilización celular casi inmediatamente después de la administración de sulfato de dextrano con un pico en las células movilizadas que comienza ya en un plazo de 7,5-30 minutos después de la administración de sulfato de dextrano en ratones y en un plazo de 30-120 minutos en humanos. Las moléculas de sulfato de dextrano de las realizaciones se pueden combinar adicionalmente de manera sinérgica con otros compuestos de movilización de células para aumentar aún más el número de células movilizadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las realizaciones, junto con otros objetivos y ventajas de la misma, puede comprenderse de la mejor manera al referirse a la siguiente descripción, tomándola junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La Fig. 1 ilustra la movilización de leucocitos inducida por una única inyección s.c. de sulfato de dextrano (LMW-DS) o AMD3100 en comparación con el control (ácido cítrico monohidrato (ACM)). Se tomaron muestras de sangre después de 3 horas (LMW-DS) o 1 hora (AMD3100). Se muestra la media ± EeM. El análisis estadístico comparó LMW-DS o AMD3100 con el grupo de control (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) o LMW-DS en comparación con AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, fffp<0,001).

La Fig. 2 ilustra el efecto de LMW-DS en la concentración sanguínea de HGF. Los animales fueron tratados con una única inyección s.c. de LMW-DS o AMD3100. ACM se usó como control del vehículo. Se tomaron muestras de sangre después de 3 horas (LMW-DS) o 1 hora (AMD3100). Se muestra la media ± EEM. El análisis estadístico comparó LMW-DS o AMD3100 con el grupo de control (*p<0,05, ***p<0,001) o LMW-DS en comparación con AMD3100 (t t tp<0,001).

La Fig. 3 ilustra la movilización de leucocitos a la sangre periférica mediante una única inyección i.v. de LMW-DS y AMD3100. ACM se utilizó como control del vehículo. Se tomaron muestras de sangre después de 30 minutos (LMW-DS y vehículo) o 1 hora (AMD3100). Se muestra la media ± EEM. El análisis estadístico comparó LMW-DS o AMD3100 con el grupo de control (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) o LMW-DS en comparación con AMD3100 (tp<0,05, t tp<0,01, t t tp<0,001).

Las Fig. 4A y 4B ilustran el efecto de una única inyección i.v. de LMW-DS o una inyección s.c. de AMD3100 en la movilización de células formadoras de colonias hematopoyéticas (CFC) en sangre periférica. Tampón ACM (i.v.) se utilizó como control del vehículo. Se tomaron muestras de sangre después de 30 minutos (LMW-DS y vehículo) o 1 hora (AMD3100). Se muestra la media ± EEM. El análisis estadístico comparó LMW-DS o AMD3100 con el grupo de control (*p<0,05, **p<0,01) o LMW-DS en comparación con AMD3100 (f p<0,05).

La Fig. 5 ilustra una distinción del subtipo progenitor (CFU-GM, CFU-GEMM y BFU-E) de células progenitoras movilizadas (CFC) después de una única inyección i.v. con LMW-DS o ACM (control). El tampón ACM se utilizó como control y este valor se utilizó como un valor 0 (control negativo). Se muestra la media ± EEM. El análisis estadístico comparó LMW-DS con el grupo de control (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

La Fig. 6 ilustra la movilización de leucocitos inducida por la combinación de G-CSF y LMW-DS o G-CSF y AMD3100 en comparación con el tampón ACM (vehículo). Se tomaron muestras de sangre después de 30 minutos (LMW-DS y vehículo) o 1 hora (AMD3100). Se muestra la media ± EEM. El análisis estadístico comparó G-CSF LMW-DS o G-CSF y AMD3100 con el grupo de control (G-CSF ACM) (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) o G-CSF LMW-DS en comparación con G-CSF AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01, tttp<0,001).

Las Fig. 7A y 7B ilustran el tratamiento combinado de G-CSF y LMW-DS o G-CSF y AMD3100 en la movilización de células progenitoras en sangre periférica. El tampón ACM se utilizó como control del vehículo. Se tomaron muestras de sangre después de 30 minutos (LMW-DS y vehículo) o 1 hora (AMD3100). Se muestra la media ± EEM. El análisis estadístico comparó G-CSF LMW-DS o G-CSF y AMD3100 con el grupo de control (G-CSF ACM) (*p<0,05, **p<0,01) o G-CSF LMW-DS en comparación con G-CSF AMD3100 (tp<0,05, ttp<0,01).

La Fig. 8 es una descripción general de la movilización de células progenitoras después de inyecciones únicas en ratones de 100 mg/kg de LMW-DS, G-CSF, G-CSF LMW-DS, G-CSF AMD3100 (5 mg/kg) o ACM (vehículo). El tratamiento combinado con G-CSF y LMW-DS aumentó significativamente el número de CFC en comparación con el tampón ACM, LMW-DS y G-CSF. Las barras de error muestran EEM, n = 6-10.

La Fig. 9 es una descripción general de la movilización de linfocitos después de inyecciones únicas en ratones de 100 mg/kg de LMW-DS, G-CSF, G-CSF LMW-DS, G-CSF AMD3100 (5 mg/kg) o ACM (vehículo). La administración de LMW-DS aumentó los linfocitos en sangre periférica en comparación con la terapia única de G-CSF o AMD3100 y en combinación con G-CSF el aumento fue significativo en comparación con G-CSF AMD3100. Las barras de error muestran EEM, n = 6-10.

La Fig. 10 ilustra los efectos del sulfato de dextrano en los glóbulos blancos en la sangre periférica. Los animales fueron tratados con una única inyección i.v. de sulfato de dextrano de diferentes pesos moleculares promedio (DS3 o DS5) en dosis de 50 mg/kg. Se usó solución salina tamponada (NaCl) como control del vehículo. Algunos animales se sedaron usando pentobarbital sódico (PNB) en lugar de isoflurano para comparar el efecto de diferentes procedimientos de anestesia. Las barras de error muestran EEM. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar las diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo de control (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). La Fig. 11 ilustra la eficacia del sulfato de dextrano en la movilización de células progenitoras hematopoyéticas en sangre periférica. Los animales fueron tratados con una única inyección i.v. de sulfato de dextrano de diferente peso molecular promedio (DS3 o DS5) o con vehículo (NaCl). Las barras de error muestran EEM. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar las diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo de control (*p<0,05). La Fig. 12 ilustra la eficacia del sulfato de dextrano para aumentar los niveles de HGF en sangre periférica. Los animales fueron tratados con una única inyección i.v. de sulfato de dextrano de diferente peso molecular promedio (DS3 o DS5) o con vehículo (NaCl). Las barras de error muestran EEM. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar las diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo de control (***p<0,001).

La Fig. 13 ilustra la movilización de linfocitos en sangre periférica en humanos que reciben durante10 minutos una infusión i.v. de 15 mg/kg de LMW-DS (panel superior), 18 mg/kg de LMW-DS (panel central) o 24 mg/kg de LMW-DS (panel inferior) en el momento 0. La línea negra representa los niveles promedio de linfocitos y las líneas grises representan los niveles de linfocitos en humanos individuales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las presentes realizaciones generalmente se refieren a la movilización celular en animales, preferentemente mamíferos, y en particular humanos. En particular, las realizaciones se refieren a la movilización de células madre y/o progenitoras y/o ciertos glóbulos blancos que pueden usarse, por ejemplo, en el trasplante de células, incluido el trasplante de células madre hematopoyéticas (TCMH).

Las realizaciones se basan en características inesperadas de sulfato de dextrano relacionadas con la movilización de células en un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero y más preferentemente un sujeto humano.

Por lo tanto, un aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la movilización de células progenitoras y/o madre, normalmente de la médula ósea (MO), en la sangre periférica (SP) de un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero, y más preferentemente un sujeto humano.

En la sangre periférica, las células madre y/o progenitoras están disponibles para la recogida y, por lo tanto, pueden usarse en el trasplante de células, incluido el TCMH. Alternativamente, la movilización de las células madre y/o progenitoras en la sangre periférica puede lograr efectos ventajosos sin ser recogidas del sujeto, por ejemplo, circuladas in vivo para la reparación de tejidos u órganos, como la reparación del miocardio. Por lo tanto, una realización de este aspecto se refiere a un procedimiento de movilización de células progenitoras y/o madre, preferentemente de la médula ósea, a la sangre periférica de un sujeto, preferentemente un sujeto humano. El procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. La expresión "células progenitoras" se refiere en esta solicitud a ciertas células que pueden formar células hematopoyéticas o mieloides diferenciadas en respuesta a estímulos. Las células progenitoras en una muestra se pueden identificar por su capacidad para formar unidades formadoras de colonias (UFC) de varios tipos. Dichos tipos de UFC incluyen UFC-granulocitos, macrófagos (UFC-GM), UFC-granulocitos, eritrocitos, monocitos, megacariocitos (UFC-GEMM), unidades formadoras de colonias eritroides en ramillete (BFU-E) entre otros. Las "células madre" son formas menos diferenciadas de células progenitoras y normalmente, aunque no siempre, expresan la glicoproteína CD34 de la superficie celular en humanos.

Los datos experimentales tal como se presentan en esta solicitud demuestran que existe un límite inferior con respecto al peso molecular promedio del sulfato de dextrano para tener un efecto de movilización celular, véanse las Fig. 10 y 11. De este modo, las moléculas de sulfato de dextrano que tienen un peso molecular promedio por debajo del intervalo de las presentes realizaciones no muestran ningún efecto positivo significativo con respecto a la movilización de células progenitoras y/o madre, o de hecho con respecto a la movilización de glóbulos blancos, en particular linfocitos, 0 la inducción del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), véanse las Fig. 10-12.

Las moléculas de sulfato de dextrano que tienen un peso molecular promedio por encima del intervalo de las presentes realizaciones también tienen efectos inferiores con respecto a la movilización celular.

Sweeney 2000 y Sweeney 2002 indicaron que sulfato de dextrano de 10 kDa fue aproximadamente tres veces más lento que plerixafor en ratones en términos de movilización de células progenitoras/madre con un tiempo de recogida sugerido de 3 horas después de la administración de sulfato de dextrano en comparación con la recogida después de 1 hora tras la administración de plerixafor (Broxmeyer 2005). Los datos experimentales presentados en esta solicitud indican que el sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio según las realizaciones provoca casi de inmediato un aumento en el número de células formadoras de colonias (CFC) movilizadas y que el pico se produce 7,5-30 minutos después de la administración de sulfato de dextrano en ratones en comparación con 1 hora para plerixafor y 3 horas para sulfato de dextrano de 10 kDa. De manera correspondiente, en pacientes humanos, el pico en la movilización de CFC se producirá en aproximadamente 0,5 a 3 horas, como aproximadamente 1 hora después de la administración de sulfato de dextrano. Por ende, la movilización de CFC por el sulfato de dextrano realizada en humanos parece ser de 6 a 9 veces más lenta en humanos que en ratones. Esta relación entre especies es similar a plerixafor, donde el pico en la movilización de CFC se produce aproximadamente 9 horas después de la administración de plerixafor en humanos en comparación con 1 hora después de la administración de plerixafor en ratones.

Por ende, el sulfato de dextrano de las realizaciones parece tener un efecto de movilización celular significativamente más rápido que el indicado en la técnica anterior para moléculas de sulfato de dextrano más grandes, véanse Sweeney 2000 y Sweeney 2002.

Han 1998 investigó el sulfato de dextrano que tiene un peso molecular de 10 kDa y G-CSF con respecto a la movilización de glóbulos blancos (GB), células mononucleares (CMN) y CFU-GM en ratones. Los autores analizaron que los picos en GB periféricos, CMN y CFU-GM se producen 2-5 horas después de una inyección i.v. de 15-30 mg de sulfato de dextrano de 10 kDa en ratones. Por ende, el período de tiempo mencionado es similar a las tres horas sugeridas por Sweeney 2000 y Sweeney 2002.

Han 1998 comparó además los niveles posteriores a la administración de GB periféricos, CMN y CFU-GM después de 10 |jg/kg de G-CSF administrados todos los días durante cinco días (grupo G-CSF), 15 mg/kg de sulfato de dextrano de 10 kDa administrados una vez el día 5 (grupo DS) y 10 jg/kg de G-CSF administrados todos los días durante cinco días y 15 mg/kg de sulfato de dextrano de 10 kDa administrados una vez el día 5 (grupo DS G-CSF). No hubo diferencias significativas en ninguno de los tres grupos con respecto a GB y CMN. El grupo DS tenía un nivel de CFU-GM de 12,9 ± 1,6 colonias con >50 células, el grupo G-CSF tenía un nivel de CFU-GM de 17,1 ± 1,9 colonias, mientras que el tratamiento combinado de DS y G-CSF (grupo DS G-CSF) tenía un nivel de CFU-GM de 19,8 ± 2,3, es decir, ligeramente superior al nivel alcanzado simplemente con el tratamiento con G-CSF.

Por ende, Han 1998 indicó que el sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio de 10 kDa dio como resultado un pico de movilización después de 2-5 horas desde el momento de la administración en ratones y que la combinación de este sulfato de dextrano con G-CSF apenas tuvo ningún efecto adicional sobre el único tratamiento con G-CSF en ratones.

El sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio de las realizaciones tiene un perfil y efecto de administración significativamente diferente en comparación con lo que se describe para el sulfato de dextrano de 10 kDa en Han 1998. En primer lugar, el sulfato de dextrano de las realizaciones parece tener un efecto de movilización celular significativamente más rápido que el indicado en la técnica anterior para moléculas de sulfato de dextrano más grandes (7,5-30 minutos frente a 2-5 horas). En segundo lugar, el sulfato de dextrano de las realizaciones tiene un efecto sinérgico con respecto a la movilización celular cuando se combina con G-CSF. Por ende, la combinación de sulfato de dextrano y el tratamiento con G-CSF como se describe en esta solicitud dio como resultado un aumento en las células progenitoras movilizadas y los linfocitos en la sangre periférica que fue mayor que el efecto combinado de solo usar sulfato de dextrano y solo usar G-CSF, véanse las Fig. 6-9. Por ende, el sulfato de dextrano con un peso molecular promedio dentro del intervalo de las presentes realizaciones tiene un verdadero efecto sinérgico cuando se combina con G-CSF.

Como consecuencia, el intervalo seleccionado con respecto al peso molecular promedio del sulfato de dextrano proporciona una movilización celular significativamente más eficiente en comparación con las moléculas de sulfato de dextrano que tienen un peso molecular promedio fuera del intervalo inventivo de las presentes realizaciones.

Los datos experimentales que se presentan en esta solicitud demuestran que el sulfato de dextrano de las realizaciones no solo moviliza aproximadamente el mismo número total de células progenitoras y madre, en términos del número total de CFC, que plerixafor, sino que la administración de sulfato de dextrano puede combinarse sinérgicamente con otras sustancias, como G-CSF, para lograr niveles significativamente más altos de número total de CFC en comparación con las combinaciones correspondientes de plerixafor y G-CSF. Además, el perfil de movilización de CFC del sulfato de dextrano difiere de la movilización de CFC con plerixafor. En particular, el sulfato de dextrano de las realizaciones es capaz de alcanzar niveles más altos de los tipos CFC de UFC-GEMM y BFU-E en comparación con plerixafor.

La movilización celular muy rápida provocada por la administración de sulfato de dextrano de las realizaciones permite un perfil de administración frente al efecto fundamentalmente diferente en comparación con plerixafor debido a la movilización de CFC mucho más rápida. De este modo, en este aspecto, la administración del sulfato de dextrano de las realizaciones está preferentemente coordinada y sincronizada con respecto al tiempo deseado de lograr un pico en CFC movilizadas. Por ejemplo, si las CFC movilizadas se recogiesen de la sangre periférica de un sujeto, la administración de sulfato de dextrano se coordinará y sincronizará preferentemente de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 8 horas, más preferentemente de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 6 horas previas (antes) al inicio de la recogida de CFC para un sujeto humano. Más preferentemente, la administración de sulfato de dextrano se produce de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 4 horas previas al comienzo de la recogida de CFC.

La recogida de células CFC después de un tratamiento combinado con plerixafor y G-CSF se produce durante aproximadamente 4 horas por ocasión de recogida y, por lo tanto, se coordina de 9 horas hasta 13 horas después de la administración de plerixafor.

Un protocolo de recogida correspondiente según las realizaciones podría ser realizar una recogida de CFC de 4 horas de 0 hasta 4 horas, de 0,25 hasta 4,25 horas, de 0,5 hasta 4,5 horas, de 0,75 hasta 4,75 horas, de 1 hasta 5 horas, de 1,25 hasta 5,25 horas, de 1,5 hasta 5,5 horas, de 1,75 hasta 5,75 horas, de 2 hasta 6 horas, de 2,25 hasta 6,25 horas, de 2,5 hasta 6,5 horas, de 2,75 hasta 6,75 horas, de 3 hasta 7 horas, de 3,25 hasta 7,25 horas, de 3,5 hasta 7,5 horas, de 3,75 hasta 7,75 horas, de 4 hasta 8 horas, de 4,25 hasta 8,25 horas, de 4,5 hasta 8,5 horas, de 4,75 hasta 8,75 horas, de 5 hasta 9 horas, de 5,25 hasta 9,25 horas, de 5,5 hasta 9,5 horas, de 5,75 hasta 9,75 horas, de 6 hasta 10 horas, de 6,25 hasta 10,25 horas, de 6,5 hasta 10,5 horas, de 6,75 hasta 10,75 horas, de 7 hasta 11 horas, de 7,25 hasta 11,25 horas, de 7,5 hasta 11,5 horas, de 7,75 hasta 11,75 horas o de 8 hasta 12 horas después de la administración de sulfato de dextrano. En una realización preferida de la invención, el inicio de la recogida de células se produce preferentemente aproximadamente 0,5 horas, 0,75 horas, 1 hora, 1,25 horas, 1,5 horas, 1,75 horas, 2 horas, 2,25 horas, 2,5 horas, 2,75 horas, 3 horas, 3,25 horas, 3,5 horas, 3,75 horas o 4 horas después de la administración de sulfato de dextrano.

De este modo, en una realización particular, la recogida de células madre y/o progenitoras con movilización celular inducida por sulfato de dextrano ya se ha completado ventajosamente antes de que la recogida de CFC haya comenzado incluso cuando se usa plerixafor como agente inductor de la movilización.

Los datos preliminares en humanos indican que la movilización celular con picos de sulfato de dextrano se alcanza aproximadamente 1 hora después de la administración de sulfato de dextrano y comienza a disminuir aproximadamente 6 horas después de la administración de sulfato de dextrano y vuelve a los niveles normales al menos aproximadamente 24 horas después de la administración de sulfato de dextrano. De este modo, el pico en la movilización celular comienza aproximadamente 1 hora después de la administración de sulfato de dextrano, que se muestra en la Fig. 15 ejemplificada por la movilización de linfocitos después de la administración de diferentes dosis de sulfato de dextrano a sujetos humanos en un tiempo de 0 horas. De este modo, el efecto máximo en la movilización celular en humanos se produce normalmente dentro de las primeras tres horas después de la administración de sulfato de dextrano.

De este modo, la administración de sulfato de dextrano conduce a una movilización de células más rápida y más eficiente en comparación con plerixafor y, por lo tanto, el número de días de aféresis necesarios para recuperar la cantidad deseada de células movilizadas disminuirá. Para los sujetos con recuento celular insuficiente, en la visita para aféresis programada, el tratamiento con sulfato de dextrano tiene como objetivo asegurar la movilización inmediata de las células y la aféresis puede iniciarse según lo planeado. Facilitará la planificación en los centros de aféresis y reducirá el número de sujetos que deben someterse a múltiples procedimientos de movilización.

Los estudios realizados con sulfato de dextrano, tal como se presentan en esta solicitud, han documentado una movilización inmediata de las células progenitoras. De este modo, el número de CFC alcanza un pico de 7,5 minutos después de la administración con un pico de larga duración que persiste durante al menos 1 hora en ratones. La movilización de CMH usando sulfato de dextrano parece ser más rápida en comparación con el régimen de movilización actual, incluido el tratamiento con plerixafor, que tiene un pico distinto a 1 hora en ratones.

Una movilización rápida, eficiente y predecible de CMH reduciría el tiempo de hospitalización del paciente. Esto también beneficiaría a los centros de aféresis debido a menos citas para aféresis y menos sesiones canceladas debido a un recuento de células demasiado bajo.

A continuación se presenta un posible mecanismo de acción detrás de los efectos de movilización más rápidos del sulfato de dextrano, que es diferente en comparación con plerixafor. Brevemente, el sulfato de dextrano se une al dominio de unión a heparina en las células estromales de ^m O, que libera el factor 1 derivado de las células estromales (SDF-1) y CMH en la sangre periférica. Plerixafor, por otro lado, afecta al gradiente de SDF-1 al actuar como un antagonista de SDF-1, lo que aumenta las cantidades de CMH en la sangre periférica. La diferencia de tiempo en la ruptura del gradiente SDF-1 sugiere diferentes mecanismos de acción para movilizar sustancias. El mecanismo sugerido para el sulfato de dextrano puede explicarse uniéndose a una secuencia específica de aminoácidos cargados positivamente denominada dominio de unión a heparina en el heparán sulfato (HS) cargado negativamente. Esto provoca una liberación de SDF-1 en circulación y una concentración sérica elevada (Sweeney 2002 y Pablos 2003). Se desconocen los mecanismos exactos que controlan el retorno linfocítico dirigido y la movilización de CMH hacia y desde la médula ósea, pero particularmente la citocina SDF-1 y su receptor CXCR4 desempeñan un papel fundamental. CMH expresa CXCR4 y SDF-1 es producido por la médula ósea. s DF-1 está anclado a los proteoglicanos (PG) en la membrana de las células del estroma, las células endoteliales y la matriz extracelular.

El sulfato de dextrano altera el gradiente de SDF-1 con niveles elevados en sangre y niveles disminuidos en MO en ratones y primates no humanos. El aumento de SDF-1 probablemente se deba al desplazamiento competitivo con sulfato de dextrano de los proteoglicanos de heparán sulfato (PGHS) que secuestran la quimiocina en las superficies de las células endoteliales o la matriz extracelular en la MO y otros tejidos. En los monos, una única inyección de sulfato de dextrano dio como resultado niveles máximos de SDF-1 periférico después de 6 horas que volvieron al valor basal después de 24 horas (Sweeney 2002). Plerixafor, por otro lado, se une a los receptores de SDF-1, CXCR4 y CXCR7 (Kalatskaya 2009) y, por lo tanto, altera la unión a SDF-1 en el estroma de la médula ósea y libera las células. Plerixafor afecta a este gradiente de SDF-1 al actuar como un antagonista de SDF-1, lo que aumenta las cantidades de CMH en la sangre periférica (Broxmeyer 2005 y Lapidot 2003).

Además de lograr una movilización celular significativamente más rápida en comparación con plerixafor, la administración de sulfato de dextrano también logra diferentes perfiles de movilización de células madre o progenitoras.

En particular, el sulfato de dextrano proporciona niveles más altos de los tipos CFC de BFU-E y UFC-GEMM en comparación con plerixafor. Este perfil de movilización celular de las realizaciones puede tener varios beneficios clínicos. Por ejemplo, se ha establecido que el número de UFC-GEMM infundidas al paciente se correlaciona con el tiempo de recuperación de neutrófilos y plaquetas (Roodman 1987). Por ende, el trasplante de CMH con un mayor contenido de UFC-GEMM disminuiría el período de tiempo crítico con un mayor riesgo de infecciones para el paciente y sería de gran beneficio para el paciente. También el aumento de los niveles de BFU-E en las células movilizadas será beneficioso en los trasplantes de células. Se ha demostrado que el número de células BFU-E infundidas durante el trasplante de células mejoró la recuperación de neutrófilos y plaquetas y la recuperación hematopoyética (Cooper 1997 y Hassan 1997).

Las células madre y/o progenitoras movilizadas por la administración de sulfato de dextrano según este aspecto se pueden recoger según técnicas bien conocidas en la técnica, como la aféresis. Brevemente, se conectan tubos intravenosos al paciente para que circule continuamente la sangre del paciente a través de una máquina de aféresis y luego regrese al paciente. La máquina de aféresis luego separa diferentes tipos de sangre y células inmunitarias. Las células madre y/o células progenitoras recogidas pueden usarse en trasplantes alogénicos o autólogos, como el TCMH.

Las células madre y/o células progenitoras recogidas se pueden infundir a un receptor, que es el propio paciente (trasplante autólogo) u otro paciente (trasplante alogénico). Hoy en día, hay varias enfermedades y trastornos donde el trasplante de células madre y/o progenitoras es una terapia. Por ejemplo, se ha sugerido el trasplante alogénico para tratar diversas neoplasias y enfermedades cancerígenas que incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndromes mielodisplásicos (SMD), trastornos mieloproliferativos (TMP), linfoma no Hodgkin (LNH), enfermedad de Hodgkin (EH), leucemia linfocítica crónica (LLC), mieloma múltiple (MM) y leucemia mieloide crónica juvenil. En consecuencia, se sugirió un trasplante autólogo para las siguientes neoplasias MM, LNH, EH, LMA, neuroblastoma, cáncer de ovario y tumores de células germinales. Otras enfermedades cancerígenas incluyen leucemia de células pilosas (LCP), leucemia promielocítica aguda (LPA) y otros mielomas, leucemias y linfomas.

A pesar de que el TCMH es una terapia utilizada principalmente para los cánceres hematológicos y linfoides, es una alternativa en una variedad de otras afecciones adquiridas y congénitas que incluyen anemia aplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna, anemia de Fanconi, anemia de Blackfan-Diamond, talasemia mayor, anemia falciforme, inmunodeficiencia combinada severa, síndrome de Wiskott-Aldrich, errores innatos del metabolismo, trastornos autoinmunitarios y amiloidosis (Copelan 2006).

Además, dado que el sulfato de dextrano tiene un mayor efecto de movilización en las células sanguíneas y realiza sus efectos a través de un mecanismo de acción diferente que el agente de movilización utilizado actualmente, plerixafor, el tratamiento con sulfato de dextrano puede ser útil en todos los pacientes con TCMH, así como en pacientes refractarios al no lograr suficiente movilización de células madre con las terapias actuales.

La administración de sulfato de dextrano no solo causa un aumento muy rápido y significativo en la movilización de células progenitoras y/o madre, normalmente de la médula ósea, hacia la sangre periférica de un sujeto. El sulfato de dextrano de las realizaciones tiene adicionalmente efectos positivos sobre varios parámetros sanguíneos inmediatamente después de la administración e induce una rápida movilización de glóbulos blancos (GB). La movilización de GB puede ser un aspecto beneficioso particular de las realizaciones ya que los GB movilizados pueden reducir el riesgo de infección y el tiempo crítico después de un TCMH realizado.

Una característica muy interesante del sulfato de dextrano según las realizaciones es que el sulfato de dextrano en particular provoca una alta movilización de linfocitos, significativamente mayor en comparación con plerixafor.

Por lo tanto, otro aspecto de las realizaciones se refiere al sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la movilización de glóbulos blancos diana, en particular linfocitos, en el torrente sanguíneo de un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero, y más preferentemente un sujeto humano.

El sulfato de dextrano de las realizaciones se puede usar según este aspecto para movilizar linfocitos además de células progenitoras y/o madre de un sujeto. Sin embargo, el sulfato de dextrano podría usarse alternativamente principalmente para movilizar linfocitos como células diana para usarse en diversas aplicaciones o terapias donde se necesitan linfocitos.

Cualquier recogida de linfocitos y la administración de sulfato de dextrano se coordinan y sincronizan preferentemente como se describe anteriormente en esta solicitud para la movilización de células madre y/o progenitoras. Por ende, la administración de sulfato de dextrano se coordina y sincroniza preferentemente de aproximadamente 0 a aproximadamente 8 horas, preferentemente de aproximadamente 0 a aproximadamente 6 horas y más preferentemente de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 4 horas antes del inicio de la recogida de linfocitos de un sujeto humano. Los intervalos de recogida preferidos descritos anteriormente en relación con la administración de sulfato de dextrano también se pueden usar ventajosamente para la recogida de linfocitos.

El mayor contenido de linfocitos infundidos tiene varias ventajas beneficiosas en relación con TCMH. Por ejemplo, una mayor cantidad de linfocitos infundidos a un sujeto junto con células madre y/o progenitoras previamente recogidas reducirá el riesgo de infecciones y mejorará el resultado general. Una mayor dosis de linfocitos infundidos predice una mayor recuperación de linfocitos, que a su vez, predice una supervivencia general superior después del trasplante de células madre hematopoyéticas autólogas para pacientes con MM y LNH. El aumento de la dosis de linfocitos se traduce en un recuento absoluto de linfocitos en el día 15 (RAL-15). Se ha concluido que la mediana de supervivencia general y supervivencia libre de progresión para pacientes con LNH son significativamente mejores para pacientes que reciben 0,68 x 109 linfocitos/kg en comparación con los que reciben 0,34 x 109 linfocitos/kg, y beneficios similares con un mayor rendimiento de linfocitos en pacientes con MM (Porrata 2004b).

En los ensayos clínicos realizados con plerixafor, entre el 20-25 % de los pacientes con TCMH experimentaron infecciones después del trasplante (CHMP Assessment Report Mozobil (plerixafor) Procedure No. EMEA/H/C/001030). Los virus respiratorios comunitarios se han reconocido como una posible causa de infecciones graves, especialmente en pacientes sometidos a TCMH. Además, los receptores de TCMH con infección sintomática de las vías respiratorias superiores tienen una mayor tendencia a desarrollar una neumonía grave con una mortalidad de hasta 50-70 % (Chemaly 2006). El sulfato de dextrano de las realizaciones puede reducir estos riesgos de infecciones debido al aumento de los niveles de linfocitos.

Se propone que el mecanismo para mejorar la supervivencia general sea un injerto y una reconstitución más rápidos de los linfocitos, lo que resulta en un efecto más fuerte de injerto contra tumor (ICT), disminuyendo el cáncer residual (Porrata 2004a, 2004b, 2009 y Hiwase 2008). Como se presenta en los resultados experimentales, la administración única de sulfato de dextrano al menos duplicó la liberación de linfocitos en terapia única en comparación con la administración única de G-CSF o plerixafor. El sulfato de dextrano en combinación con G-CSF es aproximadamente dos veces más eficiente en la movilización de linfocitos en comparación con la combinación de G-CSF y plerixafor.

Los efectos inductores en los GB y especialmente en los linfocitos podrían basarse en el mecanismo subyacente de que se ha demostrado que el sulfato de dextrano altera el gradiente de SDF-1 con niveles elevados de células en sangre y niveles disminuidos en MO en ratones y primates no humanos (Sweeney 2002). El aumento de SDF-1 probablemente se deba al desplazamiento competitivo con sulfato de dextrano de los proteoglicanos de heparán sulfato que secuestran la quimiocina en las superficies de las células endoteliales o la matriz extracelular en la MO y otros tejidos. Otro posible mecanismo es que el sulfato de dextrano interfiere con los leucocitos por las interacciones de célula a célula, por ejemplo, el rodamiento de leucocitos y la adhesión de leucocitos mediada por selectina.

El sulfato de dextrano según las realizaciones, por lo tanto, se puede usar en conexión con la infusión de linfocitos de donante (ILD). La ILD es una inmunoterapia adoptiva que a veces se usa después del TCMH. En ILD, los linfocitos del donante original de células madre se infunden, después del trasplante de células madre y/o progenitoras, para aumentar una respuesta inmunitaria antitumoral o asegurar que las células madre del donante permanezcan injertadas. El objetivo de esta terapia es inducir una remisión del cáncer del paciente por el efecto ICT. Los linfocitos del donante pueden atacar y controlar el crecimiento de las células cancerígenas residuales.

El sulfato de dextrano de las realizaciones se usa ventajosamente en combinación con G-CSF para tratar sujetos y mejorar el rendimiento de las células movilizadas. Como se describe en la sección experimental, el tratamiento combinado de sulfato de dextrano y G-CSF aumentó sinérgicamente el número de células movilizadas, tanto células madre como progenitoras y diversos GB, en comparación con el tratamiento con sulfato de dextrano solo. Además, la combinación de sulfato de dextrano y G-CSF conduce a niveles significativamente más altos de células movilizadas en comparación con la combinación de plerixafor y G-CSF. El efecto sinérgico visto entre plerixafor y G-CSF parece ser aún más prominente para la combinación de sulfato de dextrano y G-CSF. Esto fue inesperado en particular a tenor de Han 1998, donde la combinación de sulfato de dextrano de 10 kDa y G-CSF dio básicamente el mismo resultado que solo usando G-CSF.

Por lo tanto, un aspecto adicional se refiere a una composición de movilización de células que comprende sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 3500 y 9500 Da, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y G-CSF. Las realizaciones relacionadas de este aspecto definen el uso combinado de sulfato de dextrano de las realizaciones y G-CSF para movilizar células, en particular células madre y/o progenitoras y/o GB y en particular linfocitos en un sujeto, preferentemente un sujeto humano.

La composición de movilización de células preferentemente también comprende un vehículo, tal como un disolvente acuoso.

Por lo tanto, una realización de este aspecto se refiere a un procedimiento de movilización de células, tales como células madre y/o progenitoras y/o linfocitos, en la sangre periférica de un sujeto, preferentemente un sujeto humano. El procedimiento comprende administrar una cantidad efectiva de sulfato de dextrano según las realizaciones, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y una cantidad efectiva de G-CSF o administrar la composición de movilización de células mencionada anteriormente al sujeto. Otra realización de este aspecto define una combinación de sulfato de dextrano según las realizaciones, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y G-CSF o la composición de movilización de células mencionada anteriormente para su uso en la movilización de células, preferentemente células madre y/o progenitoras y/o linfocitos, en la sangre periférica de un sujeto, preferentemente un sujeto humano. Una realización adicional de este aspecto se refiere al uso de una combinación de sulfato de dextrano según las realizaciones, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y G-CSF o la composición de movilización de células mencionada anteriormente para la fabricación de un medicamento para movilizar células, preferentemente células madre y/o progenitoras y/o linfocitos, en la sangre periférica de un sujeto, preferentemente un sujeto humano.

El G-CSF usado según este aspecto puede ser de cualquier fuente de G-CSF adecuada incluyendo G-CSF recombinante o purificado. Ejemplos no limitativos incluyen NEUPOGEN® (filgrastim que es un análogo de G-CSF), NEUTROGIN® (lenograstim que es un G-CSF recombinante), NEULASTA® (pegfilgrastim que es una forma de filgrastim de polietilenglicol). Los fragmentos biológicamente activos, las variantes, los derivados o las moléculas de fusión se pueden usar de forma alternativa o adicional como fuente de G-CSF si tienen la capacidad de movilizar células similares al G-CSF nativo.

Actualmente, se administra G-CSF (10 pg/kg) al sujeto cada mañana durante 4 días antes de la aféresis y luego cada mañana de aféresis. Este protocolo de administración se puede usar también en relación con el sulfato de dextrano de las realizaciones. Por ende, el G-CSF se administra preferentemente al sujeto en una o algunas ocasiones antes de la administración de sulfato de dextrano y la recogida de células, tal como una o dos veces durante 1-7 días, tal como una o dos veces durante 2-4 días antes de la aféresis y preferentemente adicionalmente en la mañana del día de aféresis.

Alternativamente, o además, la administración de sulfato de dextrano puede tener lugar antes de la administración de G-CSF. Por ejemplo, el sulfato de dextrano según las realizaciones tiene el efecto beneficioso adicional de inducir HGF cuando se administra a un sujeto como se analiza más adelante aquí. Entonces podría ser beneficioso haber aumentado los niveles de HGF en la sangre periférica del sujeto cuando se administra G-CSF al sujeto. En una realización preferida de la invención, el sulfato de dextrano se administra no solo antes o, de hecho, junto con G-CSF, sino que también se administra preferentemente después del final del protocolo de administración de G-CSF mencionado anteriormente.

La combinación de sulfato de dextrano con G-CSF aumentó sinérgicamente el número de CFC en sangre periférica hasta 18000 CFC/ml de sangre, es decir, más de 100 veces el control y aparentemente más eficiente en comparación con plerixafor en combinación con G-CSF. En algunos pacientes, el tratamiento con G-CSF en combinación con plerixafor no moviliza cantidades suficientes de CMH para un trasplante posterior. La combinación de G-CSF con sulfato de dextrano puede mejorar el rendimiento de CMH en estos pacientes refractarios y permitir el trasplante planificado. El aumento sinérgico en el número de CFC en sangre periférica con sulfato de dextrano y G-CSF será ventajoso para los pacientes sometidos a un trasplante autólogo de células madre donde es problemático obtener recuentos de células garantizados del paciente para continuar con el siguiente trasplante.

En general, se debe obtener un número suficiente de CMH del donante en el procedimiento de aféresis para un trasplante exitoso posterior. En la situación clínica, el número de células CMH se mide como la cantidad de células CD34+ en el producto de aféresis. Este marcador se ha demostrado como un factor predictivo consistente y fuerte de injerto después de la quimioterapia. Sin embargo, la población celular CD34+ es heterogénea y el marcador CD34+ es solo un marcador sustituto de la función CMH. En general <2,5 * 106 células CD34+ por kilo son inadecuadas para un TCMH y un trasplante de >20 * 106 células CD34+ pueden generar el síndrome de injerto, que es una toxicidad del trasplante de células madre que se produce inesperadamente y ocasionalmente es mortal. Entre estos números hay documentación que respalda que cuantas más células se recuperen mejor será el resultado de trasplante, ya que el injerto es más rápido, el tiempo de hospitalización se reduce y, por lo tanto, los costos se reducen.

Para tener éxito con el trasplante de células madre hematopoyéticas, es decir, para asegurar un injerto efectivo y rápido para evitar infecciones e impedir la recaída de la enfermedad, es importante la movilización de cantidades suficientes de células madre de sangre periférica.

Independientemente de si se trata de un trasplante autólogo y alogénico, el objetivo principal es lograr un injerto exitoso. De lo contrario, se producirá una situación crítica que puede conducir a un paciente sin sistemas hematológicos e inmunológicos. Para evitar una situación tan peligrosa para la vida, debe asegurarse que el trasplante contenga suficientes células para asegurar un injerto exitoso. Si el recuento de células es demasiado bajo, la terapia mieloablativa tendrá que posponerse y se perderá un tiempo valioso. Además, después de la terapia mieloablativa, el trasplante con un mayor número de células progenitoras puede conducir a un injerto más rápido, lo que puede resultar en una menor necesidad de hospitalización y tratamiento complementario. Como se mencionó, el procedimiento estándar para aumentar el número de células progenitoras hematopoyéticas circulantes en la sangre es tratar al donante con G-CSF durante varios días. Incluso con el tratamiento actual (plerixafor y G-CSF), todos los pacientes no logran un recuento celular suficiente para justificar el trasplante. Además, después del trasplante existe el riesgo de infección y recaída de la enfermedad. Para estos pacientes, el sulfato de dextrano tiene el potencial de actuar como terapia de rescate o como alternativa a plerixafor y G-CSF.

Además de sus efectos sobre la movilización, el sulfato de dextrano de las realizaciones ejerce efectos adicionales que podrían tener implicaciones favorables para el resultado del TCMH. El sulfato de dextrano induce niveles plasmáticos inmediatos y elevados de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), una hormona con efecto mitogénico en diferentes tipos de células y que favorece el injerto de células trasplantadas (Roos 1995 y Zioncheck 1995). E1HGF también funciona como un factor proliferativo sinérgico en el crecimiento de CMH cuando se combina con el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) (Kmiecik 1992 y Weimar 1998), así como la formación de colonias de CMH derivadas de sangre del cordón umbilical humano inducida por GM-CSF, G-CSF o M-CSF (Goff 1996). HGF también ha demostrado restaurar parcialmente la hematopoyesis en ratones deficientes en c-kit/SCF, un sistema de señalización importante para el crecimiento y la proliferación de células hematopoyéticas primitivas (Yu 1998). El HGF en presencia de eritropoyetina induce la formación de colonias de unidades formadoras de colonias eritroides en ramillete (BFU-E) a partir de células CD34+ (Galimi 1994). Nuestros resultados muestran que el sulfato de dextrano induce significativamente más BFU-E en comparación con plerixafor, lo que puede deberse a la elevación más pronunciada de HGF en comparación con plerixafor.

El sulfato de dextrano tiene, en comparación con el tratamiento actual, el potencial para mejorar la movilización de células progenitoras y otras células sanguíneas y el siguiente resultado de trasplante de varias maneras que serían de beneficio significativo para el paciente. En general, se ha demostrado que el sulfato de dextrano aumenta el rendimiento de los GB, linfocitos, HGF y células progenitoras circulantes.

Una mayor movilización de estas células específicas y factores de crecimiento mejoraría en gran medida el resultado para el paciente, ya que mejoraría el resultado del trasplante debido a un injerto mejor y más rápido de las células trasplantadas. El tratamiento con sulfato de dextrano puede reducir el riesgo de infecciones ya que el contenido de linfocitos y UFC-GEMM parece aumentar, lo que puede acortar el tiempo de neutropenia. Esto también implicará un menor tiempo de hospitalización para el paciente. Además, la movilización con sulfato de dextrano puede permitir que más pacientes reciban TCMH.

Una movilización más eficiente reducirá la necesidad de recogidas celulares repetidas del paciente y, por lo tanto, reducirá el riesgo de efectos secundarios (principalmente de la administración a largo plazo de G-CSF) ya que el período de tratamiento se acorta. El sulfato de dextrano aumenta el rendimiento total de las CMH, lo que beneficia al paciente al alcanzar la cantidad mínima de CMH movilizadas para garantizar el trasplante, así como aumentar la predicción para la recogida de células.

Se ha demostrado que el injerto y retorno linfocítico dirigido de células madre tratadas con sulfato de dextrano son más eficientes que las células madre no tratadas en ratones (Hayakawa 2009). Esto sugiere que, además de permitir más trasplantes, el sulfato de dextrano tiene el potencial de aumentar la tasa de éxito del TCMH al aumentar la previsibilidad del trasplante de MMH, reducir las complicaciones después del TCMH, reducir la necesidad de la recogida celular repetida y ayudar a que más pacientes alcancen la cantidad mínima de células para garantizar un TCMH y aumentar el número de pacientes que reciben un injerto exitoso después del TCMH.

Se propone que el mecanismo para mejorar la supervivencia general sea un injerto y una reconstitución más rápidos de los linfocitos, lo que da como resultado un efecto ICT más fuerte, disminuyendo el cáncer residual (Porrata 2009). La administración de sulfato de dextrano al menos duplica la liberación de linfocitos en terapia única en comparación con la administración única de G-CSF o plerixafor. El sulfato de dextrano en combinación con G-CSF duplica la liberación de la movilización de linfocitos en comparación con la combinación de G-CSF y plerixafor.

Además, un mayor rendimiento de linfocitos también será útil en ILD, útil para el trasplante de aloinjerto donde se utilizan infusiones repetidas de linfocitos para mejorar el resultado del trasplante.

Además, el sulfato de dextrano causa más de un aumento de 100 veces de HGF en comparación con los niveles basales y 25 veces más que plerixafor, lo que indica una elevación inmediata de HGF (de <160 a 16000 pg/ml) ya después de 15 minutos. Estos niveles son lo suficientemente altos como para inducir la proliferación celular.

La Tabla 1 a continuación resume algunos de los efectos beneficiosos logrados con sulfato de dextrano.

T l 1 - n l r mi n n lf xr n

La movilización de células progenitoras y/o madre y/o glóbulos blancos diana, opcionalmente junto con HGF, usando sulfato de dextrano según las realizaciones puede tener usos médicos y clínicos diferentes a la recogida de las células del sujeto que recibe la administración de sulfato de dextrano. De este modo, la movilización de las células en la sangre periférica del sujeto puede usarse según diversas aplicaciones médicas como se menciona anteriormente. Por ejemplo, las CMH movilizadas en la sangre periférica de un sujeto humano se pueden usar para tratar, impedir o al menos reducir los síntomas de una variedad de enfermedades autoinmunitarias que incluyen, entre otros, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes tipo 1, esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), síndrome de Sjogren y enfermedad inflamatoria intestinal. Otros usos de las células madre y/o progenitoras inmovilizadas en la sangre periférica pueden ser inducir la reparación de tejidos y órganos, incluida la reparación del corazón. También la movilización de glóbulos blancos diana, como los linfocitos, en la sangre periférica de un sujeto podría usarse en diversas aplicaciones médicas. Por ejemplo, elevar el nivel de linfocitos en la sangre periférica podría usarse para tratar, impedir o al menos reducir los síntomas de una variedad de cánceres sólidos y hematológicos que incluyen, entre otros, leucemia linfocítica crónica (LLC) y cáncer de mama.

De este modo, la administración de sulfato de dextrano según las realizaciones no necesariamente tiene que usarse para movilizar células con el fin de recoger las células del sujeto. En cambio, la administración de sulfato de dextrano se puede usar con el propósito de lograr un nivel o cantidad aumentada de las células deseadas en la sangre periférica del sujeto, donde las células pueden ejercer una función deseada en el sujeto.

En una realización particular, el sulfato de dextrano tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da. Más preferentemente, el sulfato de dextrano tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 5500 Da, tal como un peso molecular promedio de 4,6 kDa, 4,7 kDa, 4,8 kDa, 4,9 kD, 5,0 kDa, 5,1 kDa, 5,2 kDa, 5,3 kDa o 5,4 kDa.

Un ejemplo de sulfato de dextrano que puede usarse según las realizaciones tiene un peso molecular promedio de 5139 Da y un índice de polidispersidad (IPD) de 1,2009.

El sulfato de dextrano es un derivado polianiónico de dextrano y contiene azufre. El contenido promedio de azufre para el sulfato de dextrano es preferentemente del 15 al 20 % y más preferentemente de aproximadamente el 17 %, que generalmente corresponde a aproximadamente dos grupos sulfato por residuo de glucosilo. En una realización particular, el contenido de azufre del sulfato de dextrano es preferentemente igual o al menos cercano al grado máximo posible de contenido de azufre de las moléculas de dextrano.

El sulfato de dextrano según las realizaciones se puede proporcionar como un derivado farmacéuticamente aceptable de sulfato de dextrano. Dichos derivados farmacéuticamente aceptables incluyen sales y solvatos de sulfato de dextrano, por ejemplo, una sal de sodio o de potasio.

El sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo se administra preferentemente mediante inyección al sujeto y en particular por inyección por vía intravenosa (i.v.) inyección subcutánea (s.c.) o inyección intraperitoneal (i.p.), preferentemente inyección i.v. o s.c.. Otras vías de administración parenteral que pueden usarse incluyen inyección intramuscular e intraarticular. Para estas vías de administración, el sulfato de dextrano se proporciona preferentemente en una formulación en forma líquida con un disolvente o excipiente seleccionado. El disolvente es ventajosamente un disolvente acuoso y en particular una solución tampón. Un ejemplo no limitante de tal solución tampón es un tampón de ácido cítrico, tal como el tampón de ácido cítrico monohidrato (ACM), o un tampón de fosfato. Por ejemplo, el sulfato de dextrano de las realizaciones puede disolverse en solución salina, tal como solución salina de NaCl al 0,9 %, y luego opcionalmente tamponarse con ACM 75 mM y ajustar el pH a aproximadamente 5,9 usando hidróxido de sodio. También son posibles soluciones no tamponadas, incluidas soluciones de inyección acuosas, como solución salina. Además, se podrían usar otros sistemas de tampón diferentes a ACM si se desea una solución tamponada.

Las realizaciones no se limitan a inyecciones y, alternativamente, se pueden usar otras vías de administración que incluyen oral, nasal, bucal, rectal, dérmica, traqueal, bronquial o tópica. El compuesto activo, sulfato de dextrano, se formula luego con un excipiente o vehículo adecuado que se selecciona en función de la vía de administración particular.

Los intervalos de dosis adecuados para el sulfato de dextrano pueden variar según el tamaño y el peso del paciente, la afección para la que se trata el paciente y otras consideraciones. En particular para sujetos humanos, un posible intervalo de dosificación podría ser de 1 pg/kg a 150 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de 0,25 a 50 mg/kg de peso corporal. Los ejemplos ilustrativos incluyen de 0,3 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, y más preferentemente de 5 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, como 5 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal o de 5 mg/kg a 15 mg/kg de peso corporal. También podría usarse una concentración más baja, como 0,5-5 mg/kg de peso corporal.

El sulfato de dextrano de las realizaciones se puede administrar en una única ocasión de administración, tal como en forma de una inyección de bolo único. Esta dosis en bolo puede inyectarse bastante rápido al paciente, pero se infunde ventajosamente con el tiempo, de modo que la solución de sulfato de dextrano se infunde al paciente durante unos minutos, como durante 5 a 10 minutos. Generalmente se espera que una única dosis e inyección o infusión (o de hecho otra administración) sea suficiente para lograr un efecto terapéutico en el paciente según las realizaciones. Sin embargo, es posible administrar el sulfato de dextrano en múltiples dosis en diferentes ocasiones de administración. Por ejemplo, una inyección de bolo único se puede complementar con una infusión prolongada de una solución de sulfato de dextrano.

El sulfato de dextrano también se puede administrar opcionalmente en múltiples ocasiones de administración, como antes de la administración de G-CSF además de en la fecha de movilización celular, o antes y junto con la administración de G-CSF además de en la fecha de la movilización celular, o junto con la administración de G-CSF además de en la fecha de movilización celular. Las dosificaciones particulares de sulfato de dextrano utilizadas en las diferentes ocasiones de administración pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, una dosis más baja de sulfato de dextrano podría usarse en las ocasiones de administración antes y junto con la administración de G-CSF en comparación con la dosis usada en la fecha de movilización celular.

EXPERIMENTOS

Se realizó una serie de experimentos en ratones para caracterizar los efectos del sulfato de dextrano en la movilización y obtener un conocimiento adicional sobre las dosis adecuadas, el tiempo de recogida, el modo de administración y el efecto en comparación con el tratamiento actual que usa plerixafor (AMD3100) en combinación con G-CSF (NEUPOGEN®).

Ratones

Se obtuvieron ratones hembra DBA/2 de los laboratorios Harlan (Países Bajos) y laboratorios Charles River (Alemania). Todos los animales se mantuvieron en las instalaciones de animales de la Universidad de Uppsala, se alojaron en condiciones estándar y se les proporcionó comida y agua ad libitum según pautas institucionales. Se usaron animales de 7-40 semanas de edad que pesaban 17-31 g. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal local, Uppsala, Suecia.

Protocolo de movilización

Se suministró G-CSF (NEUPOGEN®, Amgen, Holanda) como solución acuosa isotónica estéril a 0,3 mg/ml y se diluyó en solución salina normal a una concentración de 50 |jg/ml. El G-CSF se administró a una dosis de 2,5 |jg como una inyección subcutánea única, mañana y tarde, día -2 y día -1. Se utilizó sulfato de dextrano de diferentes pesos moleculares promedio:

Meito: un peso molecular promedio de 6939 Da proporcionado por Meito Sangyo co Ltd (Tokio, Japón) y se disolvió en tampón de ácido cítrico monohidrato (ACM);

pKC: un peso molecular promedio de 5139 Da proporcionado por pK Chemicals A/S (Copenhague, Dinamarca) y se disolvió en tampón ACM o NaCl al 0,9 % (Fresenius Kabi); y

TdB: un peso molecular promedio de 3,3 kDa proporcionado por la asesoría TdB (Uppsala, Suecia) y se disolvió en NaCl al 0,9 % (Fresenius Kabi).

AMD3100 se adquirió en Sigma Aldrich (Alemania) y se disolvió en solución salina normal a una concentración de 2 mg/ml. El día 0 se les administraron a los ratones 100 mg/kg de sulfato de dextrano i.v. o s.c. o 5 mg/kg de AMD3100 s.c. a menos que se especifique lo contrario, en el grupo de control, los animales recibieron tampón ACM o NaCl al 0,9 % i.v. o s.c..Todos los animales recibieron aproximadamente 50-100 j l de cada solución (2,5-5 ml/kg).

El lote N-3188 de Meito San o co Ltd tenía la si uiente distribución de eso molecular:

El l 14 K h mi l A ní l i i n i ri i n m l l r

El l 2 41 l rí T B ní l i i n i ri i n m l l r

Ensayo de células formadoras de colonias

Se tomaron muestras de sangre periférica mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia con isoflurano usando jeringas purgadas con EDTA (EDTA 0,2 M preparado a partir de una solución madre de EDTA 0,5 M (preparado por el laboratorio Rudbeck) diluido 1:2,5 en NaCl al 0,9 %.

Se transfirió sangre (100-200 pl) a tubos de polipropileno que contenían heparina (concentración final 17,5 lE/ml). Los eritrocitos se agotaron usando una solución de cloruro de amonio (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Las células restantes se volvieron a suspender en medio Dulbecco modificado de Iscove con suero bovino fetal al 2 % (StemCell Technologies) y se mezclaron con 2 ml de medio de metilcelulosa suplementado con un cóctel de citocinas recombinantes (MethoCult 3434; StemCell Technologies) y penicilina-estreptomicina según las instrucciones del fabricante. Los cultivos de 1,1 ml que contenían CPH se sembraron en placas de 35 mm (Sarstedt, Landskrona, Suecia) y se colocaron en una cámara humidificada con 5 % de CO² a 37 °C. El número total de colonias se contó en el día 12 de cultivo.

Análisis hematológico

Se tomó muestras de sangre periférica mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia con isoflurano usando jeringas purgadas con EDTA y se transfirió a tubos de polipropileno que contenían 1,6 mg de EDTA (Sarstedt, Landskrona, Suecia).

Se obtuvieron recuentos sanguíneos completos utilizando un contador celular automatizado (sistemas de hematología Advia 2120; Siemens healthcare diagnostics Inc, Illinois, EE. UU.) en la Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas (SLU), Uppsala, Suecia.

HGF-ELISA

Se tomó muestras de sangre periférica mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia con isoflurano (a menos que se indique lo contrario) utilizando jeringas purgadas con EDTA (EDTA 0,2 M preparado como se indicó anteriormente).

El plasma se preparó centrifugando sangre con EDTA durante 5 minutos a 3000 g, y se congeló a 20 °C hasta el análisis. El ensayo HGF-ELISA (RnD systems, Minneapolis, EE. UU.) se realizó según las instrucciones del fabricante. Estadísticas

Los datos se expresan como valores medios más y menos EEM. La comparación entre grupos se realizó mediante la prueba t de Student (dos colas, varianza igual). Los análisis estadísticos se realizaron con Microsoft Excel. Las diferencias con un valor p menor a 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Estudio de búsqueda de dosis s.c. de sulfato de dextrano sobre movilización de células sanguíneas periféricas Los ratones (DBA/2N, 8-14 semanas, Charles River) fueron tratados con inyecciones s.c. de sulfato de dextrano (10, 50, 150 y 500 mg/kg, pKC), AMD3100 (5 mg/kg, control positivo) o tampón ACM (control negativo). La dosis utilizada de AMD3100 y 1 hora para la recogida de células fue el régimen de dosificación óptimo notificado para este fármaco en ratones (Broxmeyer 2005). La sangre se analizó mediante análisis hematológico según lo anterior. Con más detalle, los ratones fueron sacrificados 3 horas después de la última inyección (1 hora para AMD3100) y se determinó el análisis de diferenciación hematológica en sangre periférica. Se recogieron muestras de suero y/o plasma y se almacenaron a -20 °C hasta el análisis. La sangre se extrajo mediante punción cardíaca con jeringas purgadas con EDTA y se mezcló con EDTA y lepirudina para el análisis del recuento celular y solo EDTA para el análisis de HGF. Hubo un aumento dependiente de la dosis de glóbulos blancos circulantes (GB), principalmente linfocitos (Fig. 1) y HGF (Fig. 2) a las 3 horas después de la administración de sulfato de dextrano. Las dosis de 10-50 mg/kg de sulfato de dextrano y AMD3100 de 5 mg/kg mostraron efectos similares, mientras que los efectos de 150 y 500 mg/kg de sulfato de dextrano aumentaron significativamente (p<0,001 y p<0,01 respectivamente) en comparación con el efecto de AMD3100. La administración de sulfato de dextrano a 50, 150 y 500 mg/kg dio lugar a niveles significativamente aumentados (p<0,001) (Fig. 2) de HGF circulante que fueron más pronunciados que AMD3100.

La Tabla 2 resume los parámetros sanguíneos después de la administración de sulfato de dextrano (LMW-DS) y AMD3100, respectivamente. La tabla indica las variables hematológicas en sangre periférica después de la administración de LMW-DS o AMD3100 en comparación con el control (ACM, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) o en comparación con AMD3100 (fp<0,05, t1p<0,01, tt1p<0,001).

T l 2 - ri l h m l i n n r rif ri l mini r i n LM -D

Estudio de búsqueda de dosis s.c. de sulfato de dextrano sobre movilización de células sanguíneas periféricas La movilización se realizó en ratones DBA/2OlaHsd (7-12 semanas, Harlan) usando 25-200 mg/kg de sulfato de dextrano (Meito) i.v. como controles positivos y negativos, AMD3100 (5 mg/kg, s.c.) o se utilizó tampón ACM (i.v.). La sangre se analizó usando el ensayo CFC y el análisis hematológico según lo anterior.

En comparación con AMD3100 (5 mg/kg) y las inyecciones únicas de sulfato de dextrano i.v.con tampón ACM de control (25, 50, 100 y 200 mg/kg, Meito) indujeron un aumento significativo de GB (p<0,01), principalmente de linfocitos (p<0,001), en sangre periférica ya 30 minutos después de la inyección de sulfato de dextrano (Fig. 3). Los niveles de movilización logrados con las cuatro dosis de sulfato de dextrano aumentaron significativamente frente a AMD3100. El efecto de movilización del sulfato de dextrano en CFC también fue evidente ya en la dosis más baja administrada (25 mg/kg, p<0,001). El efecto pareció aumentar de forma dependiente de la dosis. El efecto después de 200 mg/kg de sulfato de dextrano fue similar al de AMD3100, 5 mg/kg, con respecto a las CFC totales (Figs. 4a y 4B).

El aumento de CFC después de administraciones de dosis única de AMD3100 (s.c.) y sulfato de dextrano (i.v.) fue mayor (6-12 veces sobre el control) en comparación con el aumento general de GB (3-5 veces sobre el control). Esto podría sugerir un mecanismo de acción específico sobre la movilización de células progenitoras (Figs. 4A y 4B). También se estudió el efecto de movilización en los diferentes subtipos de células progenitoras, UFC-GM, UFC-GEMM y BFU-E (Figs. 4A y 4B) y el sulfato de dextrano pareció aumentar BFU-E en mayor medida que AMD3100.

Efecto de la vía de administración de sulfato de dextrano en la movilización de células sanguíneas periféricas La movilización se realizó en ratones DBA/2N (9-10 meses, Charles River) usando 100 mg/kg de sulfato de dextrano (Meito, i.v. y s.c.). La sangre se analizó usando el ensayo CFC y el análisis hematológico según lo anterior.

El efecto sobre las células de sangre periférica después de la administración de 100 mg/kg de sulfato de dextrano i.v. y s.c. fue comparado (n = 5). Las células se recogieron 30 minutos después de la administración para ambas vías de administración. No hubo diferencias significativas en GB, linfocitos, CFC o subtipos de CFC circulantes 30 minutos después de la administración para las diferentes vías de administración, véase la Tabla 3.

Tabla 3 - com aración de arámetros san uíneos ara administración s.c. e i.v.

Relación tiempo-efecto del sulfato de dextrano en la movilización de células sanguíneas periféricas

La movilización se realizó en ratones DBA/2N (8-14 semanas, Charles River) usando 50 mg/kg de sulfato de dextrano (pKC, i.v.) o 100 mg/kg de sulfato de dextrano (Meito, i.v.). Como control negativo, se utilizó tampón ACM (i.v.). La sangre se analizó usando el ensayo CFC, análisis hematológico y HGF-ELISA.

El efecto de movilización de sulfato de dextrano administrado i.v. (100 mg/kg) mostró el mayor número de GB y linfocitos alrededor de los 30 minutos y disminuyó, pero aún seguía elevado a las 3 horas después de la administración. Se pudo ver un aumento muy rápido de ^c F^c con un pico que comienza ya a los 7,5 minutos después de la administración (Fig. 5). Los diferentes subtipos de células progenitoras alcanzaron un pico ligeramente diferente en el tiempo: BFU-E a los 7,5 minutos y UFC-g M/UFC-GEMM entre 15-30 minutos después de la administración. E1HGF se incrementó al nivel más alto después de 15 minutos (15960 pg/ml) y luego disminuyó. Sin embargo, e1HGF se midió en otro experimento y no se muestreó a los 7,5 minutos (véase la Tabla 4). AMD3100 aumentó los niveles de HGF a 650 ± 230 pg/ml una hora después de la administración.

Tabla 4 - movilización celular des ués de la administración i.v. de sulfato de dextrano LMW-DS

De este modo, la administración i.v. de sulfato de dextrano (100 mg/kg) a ratones aumentó rápidamente el número de GB y en particular de linfocitos (linfa) en sangre periférica en comparación con el control (ACM). El sulfato de dextrano no afectó al número de plaquetas (PLT). El sulfato de dextrano también aumentó rápidamente la cantidad de HGF en plasma. Los resultados se notifican en la Tabla 4 como media ± EEM, n.a. = no analizado. Estadísticas presentadas en comparación con el tampón ACM, *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.

Sulfato de dextrano en combinación con G-CSF en la movilización de células sanguíneas periféricas El tratamiento estándar de los pacientes antes de la aféresis se basa en inyecciones diarias de G-CSF durante hasta una semana. Clínicamente, el sulfato de dextrano podría usarse en combinación con G-CSF. En un estudio en ratones, se administraron 2,5 pg/animal de G-CSF dos veces al día (con 8 horas de diferencia) durante 2 días (Broxmeyer 1999). Para investigar el efecto de la combinación de G-CSF y sulfato de dextrano, se trataron ratones DBA/2OlaHsd (10-15 semanas, Harlan) con G-CSF durante 2 días (NEUPOGEN®, 2 x 2,5 pg/día, s.c.) y el día 3 se les inyectó sulfato de dextrano (5, 25, 100 mg/kg, Meito, i.v.), ACM (control negativo, i.v.) o AMD3100 (control positivo, 5 mg/kg, s.c.). La sangre se analizó mediante análisis de CFC y análisis hematológico.

G-CSF aumentó el número de GB en comparación con lo normal (véanse las Fig. 1 y 3 solo para la administración de ACM) y la adición de sulfato de dextrano (25 y 100 mg/kg) aumentó los GB y el número de linfocitos en un modo sinérgico. El aumento de GB y linfocitos fue significativamente más pronunciado que después de la administración de AMD3100 (5 mg/kg) (Fig. 6).

La adición de sulfato de dextrano en una dosis de 100 mg/kg a G-CSF produce un aumento vasto y sinérgico de células progenitoras en sangre periférica y el sulfato de dextrano parece ser más eficiente como agente movilizador que AMD3100 (Figs. 7A y 7B). La combinación de sulfato de dextrano y G-CSF movilizó más progenitores de UFC-GEMM y BFU-E (Fig. 7B) en comparación con la combinación G-CSF y AMD3100.

Los experimentos realizados mostraron una relación dosis-efecto de sulfato de dextrano en la movilización de GB, linfocitos y CFC, tanto después de la administración s.c. como de i.v.. El aumento de CFC parecía ser mayor (6-12 veces sobre el control) en comparación con el aumento general de GB (4-5 veces sobre el control). El efecto del tiempo de sulfato de dextrano administrado i.v. (100 mg/kg) fue un aumento rápido en CFC, GB y linfocitos. El pico comenzó ya después de 7,5 minutos, que fue significativamente más temprano que para AMD3100. La combinación de sulfato de dextrano con G-CSF mostró un aumento inesperado y pronunciado de CFC en sangre periférica hasta 18000 CFC (más de 100 veces sobre el control), y aparentemente más eficiente en comparación con AMD3100 en combinación con G-CSF, véase la Fig.8. La administración de sulfato de dextrano resultó en una movilización significativamente mayor de GB y linfocitos, y también pareció movilizar más BFU-E en monoterapia frente a una dosis óptima de AMD3100. La administración de sulfato de dextrano en combinación con G-CSF resultó en una movilización significativamente mayor de GB y linfocitos, y también pareció movilizar más CFC, BFU-E y UFC-GEMM frente a AMD3100, véanse las Fig. 7A, 7B, 8 y 9. El sulfato de dextrano aumentó el HGF en plasma a niveles altos (de <160 a 16000 pg/ml) 15 minutos después de la administración, 25 veces más que AMD3100 después de 1 hora.

Comparación sobre la movilización de células hematopoyéticas por sulfato de dextrano de bajo peso molecular de diferentes pesos moleculares promedio

Animales

Se mantuvieron ratones hembra DBA/2Ola (Harlan, Holanda) en las instalaciones de animales de la Universidad de Uppsala en condiciones estándar y se les proporcionó comida y agua adlibitum. Se usaron animales que pesaban 17­ 22 g.

Diseño experimental

DBA/2 hembras se agruparon en cuatro grupos: 1) vehículo (NaCl ac. (n = 8), 2) 50 mg/kg de dextrano sulfato DS3 (n = 5), 3) 50 mg/kg de dextrano sulfato DS5 (n = 5) y 4) 50 mg/kg de dextrano sulfato DS5 PNB (n = 5). El grupo 4) fue sedado con pentobarbital sódico (PNB) en lugar de isoflurano, para evaluar si un cambio en el protocolo de anestesia afecta a la movilización.

Administración de sustancias

DS5 (promedio Mw 5,1 kDa, pKC Dinamarca, lote 31497) y DS3 (promedio Mw 3,3 kDa, Asesoría TdB, Uppsala Suecia, lote 20341) se disolvieron en NaCl al 0,9 % (Fresenius Kabi), a 20 mg/ml y se filtraron a través de un filtro de 20 pm para obtener una solución estéril. Los animales recibieron 2,5 ml/kg (aproximadamente 50 pl) por vía intravenosa a través de la vena de la cola.

Análisis hematológico

Los resultados se muestran en la Fig. 10 y en la Tabla 6. DS3 no mostró ninguna alteración significativa en los GB o linfocitos en general, mientras que se notificó una ligera disminución en los neutrófilos.

Tabla 6 - variables hematológicas en sangre periférica después de la administración de sustancias de sulfato de dextrano

DS3 no indujo un aumento significativo en el número de CFC, como se muestra en la Fig. 11. DS5 indujo un aumento significativo en HGF independiente del uso de anestesia, mientras que la sustancia de menor peso molecular (DS3) no mostró un aumento significativo en HGF, véase la Fig. 12. Los datos presentados en esta solicitud muestran que DS3 es un agente movilizador pobre en comparación con DS5. DS3 no aumenta HGF en ningún grado más allá del vehículo.

Las realizaciones descritas anteriormente han de entenderse como unos pocos ejemplos ilustrativos de la presente invención. Resultará evidente para los expertos en la materia que se pueden realizar diversas modificaciones, combinaciones y cambios en las realizaciones sin alejarse del alcance de la presente invención. En particular, las soluciones de partes diferentes en las diferentes realizaciones se pueden combinar en otras configuraciones, cuando sea técnicamente posible.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la movilización de células progenitoras y/o madre en la sangre periférica de un sujeto, siendo dichas células progenitoras y/o madre capaces de restaurar la hematopoyesis normal después de la quimioterapia o la radiación cuando se infunde en un sujeto que padece una enfermedad cancerígena seleccionada de entre el grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndromes mielodisplásicos (SMD), trastornos mieloproliferativos (TMP), linfoma no Hodgkin (LNH), enfermedad de Hodgkin (EH), leucemia linfocítica crónica (LLC), mieloma múltiple (MM), leucemia mieloide crónica juvenil, neuroblastoma, cáncer de ovario, tumores de células germinales, leucemia de células pilosas (LCP) y leucemia promielocítica aguda (LPA).

2. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 1, donde dichas células progenitoras y/o madre son células formadoras de colonias seleccionadas de entre un grupo que consiste en una unidad formadora de colonias de granulocitos, eritrocitos, monocitos, megacariocitos, UFC-GEMM y unidades formadoras de colonias eritroides en ramillete, BFU-E.

3. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 1 o 2 que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 5500 Da.

4. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un contenido promedio de azufre en un intervalo de 15 a 20 %, y preferentemente de aproximadamente 17 %.

5. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula como una solución acuosa para inyección.

6. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administrarse en una dosificación en un intervalo de 0,1 a 50 mg/kg de peso corporal de dicho sujeto, preferentemente de 1 a 50 mg/kg de peso corporal de dicho sujeto, y más preferentemente de 5 a 25 mg/kg de peso corporal de dicho sujeto.

7. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para administrarse a un sujeto humano dentro de un intervalo de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 6 horas antes de un punto de tiempo de movilización de dichas células en dicho torrente sanguíneo de dicho sujeto humano, preferentemente dentro de un intervalo de aproximadamente 0 horas a aproximadamente 4 horas antes de dicho punto de tiempo de movilización de dichas células a dicho torrente sanguíneo de dicho sujeto humano.

8. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula para su uso combinado con un factor de estimulación de colonias de granulocitos, G-CSF, al movilizar dichas células en dicha sangre periférica de dicho sujeto.

9. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 8, donde dicho G-CSF se formula para administrarse a dicho sujeto una o dos veces durante 2-4 días antes de un punto de tiempo de movilización de dichas células en dicho torrente sanguíneo de dicho sujeto y preferentemente de manera adicional en un día de dicho punto de tiempo de movilización de dichas células en dicho torrente sanguíneo de dicho sujeto.

10. El sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho sulfato de dextrano, o dicha sal farmacéuticamente aceptable del mismo induce además el factor de crecimiento de hepatocitos, HGF, en dicho torrente sanguíneo de dicho sujeto.

11. Una composición de movilización de células que comprende sulfato de dextrano que tiene un peso molecular promedio en un intervalo de 4500 y 7000 Da, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y factor de estimulación de colonias de granulocitos, G-CSF.

12. La composición según la reivindicación 11, que comprende además un disolvente acuoso.

13. Una composición de movilización de células según la reivindicación 11 o 12 para su uso como medicamento.

14. Una composición de movilización de células según la reivindicación 11 o 12 para su uso en la movilización de células progenitoras y/o madre en la sangre periférica de un sujeto, siendo dichas células progenitoras y/o madre capaces de restaurar la hematopoyesis normal después de la quimioterapia o radiación cuando se infunde en un sujeto que padece una enfermedad cancerígena seleccionada de entre el grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), síndromes mielodisplásicos (SMD), trastornos mieloproliferativos (TMP), linfoma no Hodgkin (LNH), enfermedad de Hodgkin (EH), leucemia linfocítica crónica (LLC), mieloma múltiple (MM), leucemia mieloide crónica juvenil, neuroblastoma, cáncer de ovario, tumores de células germinales, leucemia de células pilosas (LCP) y leucemia promielocítica aguda (LPA).