CN105358159B - 用于细胞动员中的硫酸葡聚糖 - Google Patents

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Abstract

使用3500与9500Da范围内的硫酸葡聚糖来动员细胞诸如干细胞和/或祖细胞以及特定白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流。硫酸葡聚糖具有非常快速的细胞动员效应，这意味着任何细胞收获可以几乎立即在施用硫酸葡聚糖后开始。

Description

用于细胞动员中的硫酸葡聚糖
技术领域
实施方案一般涉及进入受试者血流中的细胞的动员。
发明背景
干细胞和祖细胞是具有分裂和发育以形成成熟系统的任何细胞类型的能力的未成熟细胞。造血干细胞(HSC)能够产生免疫系统和骨髓的细胞。HSC移植(HSCT)被用来恢复患者的正常造血以治疗在化疗或放射后的各种疾病。在过去的几十年中，HSCT已经变成各种病症(包括多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和需要同种异体移植的病症)的临床例行治疗。不管在近几年中的明显改进，但是手术仍然与相当高的致病率和死亡率相关联，这是由于并发症和原发疾病的复发。还继续需要改进干细胞来源、细胞收获程序、调理疗法和免疫抑制治疗。存在两种主要类型的HSCT，或同种异体(其中干细胞源自相容的健康供体)或自体，当干细胞从患者收集且在高剂量的化疗/放疗调理疗法后的后期给回相同患者。在同种异体以及特别是自体HSCT中，周边血液如今具有与干细胞来源几乎完全更换的骨髓。作为细胞来源的周边血液是优选的，因为它涉及供体的较少侵入式手术且所移植细胞的植入相比于使用骨髓作为细胞来源的更加快速。
不管在近几年中的明显改进，但是手术仍然与相当高的致病率和死亡率相关联，此由于移植相关性并发症(主要是同种异体)和原发疾病的复发(主要是自体)导致。因此，还继续需要改进干细胞来源、细胞收获方案、调理疗法和免疫抑制治疗。
如今，干细胞是通过用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)处理供体而动员到周边血液且所述细胞是通过血液成分分离术收集以供后续移植用。在输注至接受者的血流中后，健康造血细胞迁移到骨髓，在那它们可以分化产生成熟血液细胞并恢复造血。最近，已经批准普乐沙福(plerixafor)(MOZOBILTM，AMD3100，1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]-双-1,4,8,11-四氮杂环四癸烷)与G-CSF组合来增加MM和NHL患者中祖细胞的动员。
G-CSF和普乐沙福的组合治疗的一个明显局限是减缓干细胞动员。虽然小鼠中的实验数据指示在施用普乐沙福1小时后于动员干细胞中出现峰(Broxmeyer 2005)，但是人类中对应的峰是在施用普乐沙福约9小时后首次开始(MozobilTM产品专论)。由此，被动员干细胞的收获延迟直到施用普乐沙福约11小时后，这暗示长住院时间(MozobilTM产品专论)。因此，实践是普乐沙福需要在实际细胞收获前的那天施用。
Sweeney 2000和Sweeney 2002研究硫酸化多糖(包括10kDa的硫酸葡聚糖)在小鼠和猴干细胞/祖细胞的动员中的效应。在小鼠和猴中，施用硫酸葡聚糖分别3小时和6小时后，硫酸葡聚糖导致集落形成细胞(CFC)的动员。因此，在Sweeney 2000和Sweeney 2002中所呈现的结果似乎指示，就动员干细胞/祖细胞而言，硫酸葡聚糖比普乐沙福慢约三倍。
发明概要
一般目标是提供一种靶细胞进入受试者血流中的有效动员。
另一个一般目标是提供在受试者血流中高水平的被动员靶细胞。
这些和其它目标是通过本文所公开的实施方案得到满足。
所述实施方案的一方面涉及一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物，其用于动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液。所述实施方案的一个相关方面定义一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物的用途，其用于制造动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液的药物。所述实施方案的另一相关方面定义一种动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液的方法。所述方法包括施用有效量的具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物给所述受试者。
所述实施方案的另一方面涉及一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物，其用于动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流。所述实施方案的一相关方面定义一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物的用途，其用于制造动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流的药物。所述实施方案的另一相关方面定义一种动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流的方法。所述方法包括施用有效量的具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物给所述受试者。
所述实施方案的又一方面涉及一种细胞动员组合物，其包括具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物以及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。所述实施方案的其它相关方面定义一种细胞动员组合物，其包括具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物和G-CSF，其用于动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液和/或用于动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流。所述实施方案的进一步相关方面定义一种细胞动员组合物的用途，所述组合物包括具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物和G-CSF，其用于制造用于动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液和/或用于动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流的药物。所述实施方案的还有其它相关方面定义一种动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液或动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流的方法。所述方法包括施用有效量的细胞动员组合物给所述受试者，所述组合物包括具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物和G-CSF。
在一个实施方案中，所述药学上可接受的衍生物优选为硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐。
本发明者已发现，关于平均分子量具有狭窄范围的硫酸葡聚糖相比于具有更小或更大平均分子量的硫酸葡聚糖分子实现显著改进的细胞动员。
具有低于本发明实施方案范围的平均分子量的硫酸葡聚糖分子就动员祖细胞和/或干细胞或白血球而言并不具有任何明显效果。具有高于本发明实施方案范围的平均分子量的硫酸葡聚糖分子似乎不具有任何加成效应以及当与其它细胞动员化合物诸如G-CSF一起使用时没有协同效应，且似乎相比于本发明实施例具有更缓慢的动员效应。
本发明实施方案提供一种具有未预期动员特性的有效细胞动员，其几乎在施用硫酸葡聚糖后立即触发细胞动员，被动员细胞的峰值已经在施用硫酸葡聚糖后在小鼠中7.5-30分钟内且在人类中30-120分钟内开始。所述实施方案的硫酸葡聚糖分子可以额外地与其它细胞动员化合物以协同方式组合来甚至进一步增加被动员细胞数量。
附图简述
所述实施方案连同其其它目标和优点可最好通过参考以下描述以及附图一起来理解，其中：
图1说明通过单次s.c.注射硫酸葡聚糖(LMW-DS)或AMD3100相比于对照(柠檬酸单水合物(CAM))所引发的白细胞动员。在3小时(LMW-DS)或1小时(AMD3100)后采集血样。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较LMW-DS或AMD3100(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)或相对于AMD3100比较LMW-DS
图2说明LMW-DS对HGF血液浓度的效应。用单次s.c.注射LMW-DS或AMD3100处理动物。使用CAM作为媒介物对照。在3小时(LMW-DS)或1小时(AMD3100)后采集血样。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较LMW-DS或AMD3100(*p<0.05，***p<0.001)或相对于AMD3100比较LMW-DS
图3说明通过单次i.v.注射LMW-DS和AMD3100到周边血液的白细胞动员。使用CAM作为媒介物对照。在30分钟(LMW-DS和媒介物)或1小时(AMD3100)后采集血样。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较LMW-DS或AMD3100(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)或相对于AMD3100比较LMW-DS
图4A和4B说明单次i.v.注射LMW-DS或s.c.注射AMD3100对动员周边血液中的造血集落形成细胞(CFC)的效应。使用CAM缓冲液(i.v.)作为媒介物对照。在30分钟(LMW-DS和媒介物)或1小时(AMD3100)后采集血样。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较LMW-DS或AMD3100(*p<0.05，**p<0.01)或相对于AMD3100比较LMW-DS
图5说明在单次i.v.注射LMW-DS或CAM(对照)后被动员祖细胞(CFC)的祖细胞亚型(CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E)的区别。使用CAM缓冲液作为对照且此值是使用0值(阴性对照)。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较LMW-DS(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图6说明通过G-CSF和LMW-DS或G-CSF和AMD3100的组合相比于CAM缓冲液(媒介物)所引发的白细胞动员。在30分钟(LMW-DS和媒介物)或1小时(AMD3100)后采集血样。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较G-CSF+LMW-DS或G-CSF和AMD3100(G-CSF+CAM)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)或相对于G-CSF+AMD3100比较G-CSF+LMW-DS
图7A和7B说明G-CSF和LMW-DS或G-CSF和AMD3100在周边血液中祖细胞动员的组合治疗。使用CAM缓冲液作为媒介物对照。在30分钟(LMW-DS和媒介物)或1小时(AMD3100)后采集血样。显示平均值±SEM。统计分析相对于对照组比较G-CSF+LMW-DS或G-CSF和AMD3100(G-CSF+CAM)(*p<0.05，**p<0.01)或相对于G-CSF+AMD3100比较G-CSF+LMW-DS
图8说明在小鼠中单次注射100mg/kg LMW-DS、G-CSF、G-CSF+LMW-DS、G-CSF+AMD3100(5mg/kg)或CAM(媒介物)后祖细胞的动员的观察。用G-CSF和LMW-DS的组合治疗相比于CAM缓冲液、LMW-DS和G-CSF显著增加CFC数量。误差棒显示SEM，n＝6-10。
图9说明在小鼠中单次注射100mg/kg LMW-DS、G-CSF、G-CSF+LMW-DS、G-CSF+AMD3100(5mg/kg)或CAM(媒介物)后淋巴细胞的动员的观察。施用LMW-DS相比于G-CSF或AMD3100的单一疗法增加周边血液中的淋巴细胞，且与G-CSF组合，相比于G-CSF+AMD3100增加显著。误差棒显示SEM，n＝6-10。
图10说明硫酸葡聚糖对周边血液中白血球的效应。用单次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖(DS3或DS5)以50mg/kg的剂量处理动物。使用缓冲盐水(NaCl)作为媒介物对照。一些动物使用五巴比妥钠(PNB)代替异氟烷进行镇静，来比较不同麻醉方法的效应。误差棒显示SEM。使用学生T检验来评估相比于对照组的统计上显著差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图11说明硫酸葡聚糖对动员造血祖细胞进入周边血液中的效应。用单次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖(DS3或DS5)或媒介物(NaCl)处理动物。误差棒显示SEM。使用学生T检验来评估相比于对照组的统计上显著差异(*p<0.05)。
图12说明硫酸葡聚糖对增加周边血液中的HGF水平的疗效。用单次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖(DS3或DS5)或媒介物(NaCl)处理动物。误差棒显示SEM。使用学生T检验来评估相比于对照组的统计上显著差异(***p<0.001)。
图13说明在接受10分钟i.v.输注15mg/kg LMW-DS(上图)、18mg/kg LMW-DS(中图)或24mg/kg LMW-DS(下图)在0时间时人类周边血液中的淋巴细胞的动员。黑线代表平均淋巴细胞水平且灰线代表单人类的淋巴细胞水平。
具体实施方式
本发明实施方案一般涉及动物，优选是哺乳动物且特别是人类的细胞动员。特定来说，所述实施方案涉及干细胞和/或祖细胞和/或特定白血球的动员，其可用于例如细胞移植，包括造血干细胞移植(HSCT)。
所述实施方案是基于硫酸葡聚糖关于受试者，优选是哺乳动物受试者且更优选是人类受试者的细胞动员的未预期特性。
因此所述实施方案的一方面涉及一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物，其用于动员祖细胞和/或干细胞通常从受试者(优选哺乳动物受试者且更优选人类受试者)的骨髓(BM)进入周边血液(PB)。
在周边血液中，干细胞和/或祖细胞是可获得用于收获且因此可用于细胞移植，包括HSCT。或者，干细胞和/或祖细胞进入周边血液的动员可以实现有利的效果而不需从受试者收获，例如活体内循环用于组织或器官修复，诸如心肌修复。
因此，这方面的一个实施方案涉及一种动员祖细胞和/或干细胞，优选地从受试者(优选人类受试者)的骨髓进入周边血液的方法。所述方法包括施用有效量的具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物给所述受试者。这方面的另一实施方案涉及一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物的用途，其用于制造用于动员祖细胞和/或干细胞，优选地从受试者(优选人类受试者)的骨髓进入周边血液的药物。
表述“祖细胞”在此是指可以响应于刺激形成分化的造血或髓系细胞的特定细胞。在样本中的祖细胞可以通过它们形成各种类型的集落形成单位(CFU)的能力而识别。此类CFU类型尤其包括CFU-粒细胞、巨噬细胞(CFU-GM)、CFU-粒细胞、红细胞、单核细胞、巨噬细胞(CFU-GEMM)、突释形成单位-红细胞(BFU-E)。“干细胞”是祖细胞的较低分化形式，且通常(尽管不是总是)表达人类的细胞表面糖蛋白CD34。
如本文中所呈现的实验数据证实，就硫酸葡聚糖的平均分子量而言存在下限以具有任何细胞动员效应，参见图10和11。因此，具有本发明实施方案范围以下的平均分子量的硫酸葡聚糖分子并不显示任何就动员祖细胞和/或干细胞而言或事实上就动员白血球，特别是淋巴细胞，或诱发肝细胞生长因子(HGF)而言的显著阳性效应，参见图10-12。
具有本发明实施方案范围以上的平均分子量的硫酸葡聚糖分子也具有就细胞动员而言的不良效应。
Sweeney 2000和Sweeney 2002指出，10kDa的硫酸葡聚糖在小鼠中就动员祖细胞/干细胞而言比普乐沙福缓慢约三倍，其中收获时间表明为施用硫酸葡聚糖后的3小时，相比之下在施用普乐沙福后的约1小时后收获(Broxmeyer 2005)。本文所呈现的实验数据指出，具有根据实施方案的平均分子量的硫酸葡聚糖在小鼠中几乎在施用硫酸葡聚糖后立即造成被动员集落形成细胞(CFC)的数量增加且峰值出现在使用硫酸葡聚糖后的7.5至30分钟，相比之下普乐沙福是1小时且10kDa的硫酸葡聚糖为3小时。相应地，在人类患者中，CFC动员的峰值将出现在施用硫酸葡聚糖后约0.5至3小时，诸如约1小时。因此，在人类中进行的通过硫酸葡聚糖的CFC动员似乎在人类中比在小鼠中缓慢约6至9倍。这种种间关系类似于普乐沙福，其中在人类中CFC动员的峰值出现在施用普乐沙福后约9小时时，相比之下在小鼠中是在施用普乐沙福后1小时时。
因此，所述实施方案的硫酸葡聚糖似乎具有比更大硫酸葡聚糖分子在先前技术中所指出般显著更快速的细胞动员效应，参见Sweeney2000和Sweeney 2002。
Han 1998研究具有10kDa的分子量的硫酸葡聚糖和G-CSF在小鼠中关于白血球(WBC)、单核细胞(MNC)和CFU-GM的动员。作者讨论在小鼠中，周边WBC、MNC和CFU-GM的峰值出现在i.v.注射15-30mg硫酸葡聚糖10kDa后2至5小时。因此，提及的时间段类似于由Sweeney 2000和Sweeney 2002所建议的3小时。
Han 1998进一步比较在每天给予10μg/kg G-CSF持续5天(G-CSF组)、第5天给予15mg/kg硫酸葡聚糖10kDa一次(DS组)和每天给予10μg/kg G-CSF持续5天以及第5天给予15mg/kg硫酸葡聚糖10kDa一次(DS+G-CSF组)后WBC、MNC和CFU-GM的施用后水平。就WBC和MNC而言，所述三个组中任一组中不存在显著差异。DS组具有12.9+1.6个具有>50个细胞的集落的CFU-GM水平，G-CSF组具有17.1+1.9个集落的CFU-GM水平，而DS和G-CSF的组合治疗(DS+G-CSF组)具有19.8+2.3的CFU-GM水平，即，稍高于仅用G-CSF治疗所达到的水平。
因此，Han 1998指出，具有10kDa的平均分子量的硫酸葡聚糖导致在小鼠中在施用后2至5小时出现动员峰，且此硫酸葡聚糖与G-CSF的组合几乎没有任何超过小鼠中仅G-CSF治疗的额外效应。
具有所述实施方案的平均分子量的硫酸葡聚糖具有相比于在Han 1998中所公开的硫酸葡聚糖10kDa的施用特性和效应显著不同的施用特性和效应。首先，所述实施方案的硫酸葡聚糖似乎具有比更大硫酸葡聚糖分子在先前技术中所指出般显著更快速的细胞动员效应(7.5-30分钟相对于2-5小时)。其次，所述实施方案的硫酸葡聚糖具有就细胞动员而言当与G-CSF组合时的协同效应。因此，如本文所公开的硫酸葡聚糖与G-CSF的组合导致周边血液中的被动员祖细胞和淋巴细胞的增加大于仅使用硫酸葡聚糖和仅使用G-CSF的组合效应，参见图6-9。因此，具有在本发明实施方案的范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖当与G-CSF组合时具有真协同效应。
结论是，就硫酸葡聚糖的平均分子量而言的选定范围提供相比于具有在本发明实施方案的发明范围以外的平均分子量的硫酸葡聚糖分子明显更有效的细胞动员。
如本文所呈现的实验数据证实，所述实施方案的硫酸葡聚糖不仅动员与普乐沙福相同总数量的祖细胞和干细胞(就CFC总数量而言)，而且硫酸葡聚糖施用可以与其它物质，诸如G-CSF以协同方式组合，来实现相比于普乐沙福和G-CSF的相应组合显著更高水平的CFC总数量。此外，硫酸葡聚糖的CFC动员特性不同于利用普乐沙福的CFC动员。特定来说，所述实施方案的硫酸葡聚糖能够达到相比于普乐沙福更高水平的CFU-GEMM和BFU-E CFC类型。
通过施用所述实施方案的硫酸葡聚糖所触发的非常快速的细胞动员启用相比于普乐沙福基本不同的施用相对于效应特性，这是由于快速许多的CFC动员。因此，在这方面，所述实施方案的硫酸葡聚糖的施用优选就达到被动员CFC的峰值的所需时序而言进行配合和同步。例如，如果被动员CFC是从受试者的周边血液收获，则硫酸葡聚糖的施用优选配合和同步为在人类受试者开始CFC收获前(以前)的约0小时至约8小时，更优选约0小时至约6小时出现。更优选地，硫酸葡聚糖的施用发生在开始CFC收获前的约0小时至约4小时。
在用普乐沙福和G-CSF的组合治疗后，CFC细胞的收获发生在每次收获情景的约4小时期间且因此配合从施用普乐沙福后的9小时直至13小时。
根据所述实施方案的相应收获方案则为进行4小时的CFC收获，从施用硫酸葡聚糖后的0直至4小时、0.25直至4.25小时、0.5直至4.5小时、0.75直至4.75小时、1直至5小时、1.25直至5.25小时、1.5直至5.5小时、1.75直至5.75小时、2直至6小时、2.25直至6.25小时、2.5直至6.5小时、2.75直至6.75小时、3直至7小时、3.25直至7.25小时、3.5直至7.5小时、3.75直至7.75小时、4直至8小时、4.25直至8.25小时、4.5直至8.5小时、4.75直至8.75小时、5直至9小时、5.25直至9.25小时、5.5直至9.5小时、5.75直至9.75小时、6直至10小时、6.25直至10.25小时、6.5直至10.5小时、6.75直至10.75小时、7直至11小时、7.25直至11.25小时、7.5直至11.5小时、7.75直至11.75小时或8直至12小时。在一优选的实施方案中，细胞收获的开始优选地发生在施用硫酸葡聚糖后的约0.5小时、0.75小时、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.25小时、2.5小时、2.75小时、3小时、3.25小时、3.5小时、3.75小时或4小时。
因此，在一个特定实施方案中，利用硫酸葡聚糖引起的细胞动员的干细胞和/或祖细胞的收获优选在当使用普乐沙福作为动员引发剂时CFC收获甚至开始以前完成。
初步人类数据指出，利用硫酸葡聚糖的细胞动员峰值在施用硫酸葡聚糖后的约1小时时，且开始在施用硫酸葡聚糖后的约6小时时下降且在施用硫酸葡聚糖后的至少约24小时回到正常水平。因此，细胞动员的峰值在施用硫酸葡聚糖后约1小时开始，这显示于图15中，由在时间0小时时施用不同剂量的硫酸葡聚糖给人类受试者后淋巴细胞的动员所例示。因此，在人类中，细胞动员的峰值效应通常出现在施用硫酸葡聚糖后的头三个小时内。
因此，硫酸葡聚糖施用导致相比于普乐沙福更快速且更有效的细胞动员，且因此检索所需量的被动员细胞所需的血液成分分离天数的数量将下降。对于具有不足细胞计数的受试者，在预定的血液成分分离访问时，硫酸葡聚糖治疗目标为确保细胞的即刻动员且血液成分分离可以按计划开始。这将利于血液成分分离中心计算且减少必须经历多次动员程序的受试者的数量。
如本文所呈现的利用硫酸葡聚糖所进行的研究已记录祖细胞的即刻动员。因此在小鼠中CFC数量峰值已经在施用后7.5分钟出现，其中长效峰值持续至少1小时。使用硫酸葡聚糖的HSC动员似乎比当前动员疗法(包括普乐沙福治疗)更快速，其在小鼠中具有在1小时时的独特峰。
HSC的快速、有效且可预测的动员将减少患者的住院时间。此也将有益于血液成分分离中心，这是因为较少的血液成分分离预约和由于过低的细胞计数所致的更少的对消次数。
在硫酸葡聚糖的更快速的动员效应背后的一个可能的作用机制呈现于下文中，其不同于普乐沙福。简言之，硫酸葡聚糖结合在BM间质细胞上的肝素结合域，其释放间质细胞源性因子1(SDF-1)和HSC进入周边血液。在另一方面，普乐沙福通过作用为SDF-1拮抗剂来影响SDF-1梯度，从而导致增加周边血液中的HSC量。在断裂SDF-1梯度时间的不同表明动员物质的不同作用机制。对于硫酸葡聚糖所表明的机制可以通过以下来解释：通过结合在另外带负电的硫酸乙酰肝素(HS)上的带正电的氨基酸的特异性序列(称为肝素结合域)。这造成SDF-1释放进入循环并提高血清浓度(Sweeney 2002和Pablos 2003)。
控制HSC到骨髓的归巢和离开骨髓的动员的精确机制尚未知，但是特定来说，细胞因子SDF-1和其受体CXCR4起到枢轴作用。HSC表达CXCR4且SDF-1是由骨髓产生。SDF-1是锚固到间质细胞、内皮细胞的膜上和细胞外基质的蛋白多糖(PG)。
在小鼠和非人类灵长动物中，硫酸葡聚糖破坏SDF-1梯度，其中在血液中提高水平且在BM中降低水平。SDF-1的增加很可能归因于来自硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸葡聚糖的移位，其使内皮细胞表面上或BM和其它组织中的细胞外基质的趋化细胞素隔离。在猴中，单次注射硫酸葡聚糖导致在6小时后周边SDF-1的最大水平，其在24小时后回到基线(Sweeney 2002)。在另一方面，普乐沙福结合SDF-1的受体CXCR4和CXCR7(Kalatskaya2009)，且由此破坏骨髓间质中结合SDF-1并释放细胞。普乐沙福通过作用为SDF-1拮抗剂影响此SDF-1梯度，从而导致周边血液中的HSC量增加(Broxmeyer 2005和Lapidot 2003)。
除了相比于普乐沙福实现明显更快速的细胞动员以外，硫酸葡聚糖施用也实现不同的干细胞或祖细胞动员特性。特定来说，硫酸葡聚糖提供相比于普乐沙福更高水平的CFC类型，BFU-E和CFU-GEMM。所述实施方案的这种细胞动员特性可以具有多个临床效益。例如，已确立，注入至患者的CFU-GEMM的数量是与嗜中性粒细胞和血小板的恢复时间相关(Roodman 1987)。因此，移植具有增加CFU-GEMM含量的HSC将降低患者具有增加感染风险的关键时间期且将极大有益于患者。此外，被动员细胞中增加水平的BFU-E也将有益于细胞移植。已证实，在细胞移植期间注入的BFU-E细胞的数量改进嗜中性粒细胞和血小板恢复以及造血恢复(Cooper 1997和Hassan 1997)。
根据这个方面，通过硫酸葡聚糖施用动员的干细胞和/或祖细胞可以根据相关领域中所熟知的技术，诸如血液成分分离进行收获。简言之，将静脉内小管与患者连接以连续地循环患者的血液通过血液成分分离机且然后回到患者。血液成分分离机然后分离不同类型的血液和免疫细胞。
所收获的干细胞和/或祖细胞可用于同种异体或自体移植，诸如HSCT。
然后，所收获的干细胞和/或祖细胞可注入到接受者，其可以为患者自身(自体移植)或另一患者(同种异体移植)。如今，存在几种其中干细胞和/或祖细胞移植为疗法的疾病或病症。例如，已建议同种异体移植来治疗各种恶性肿瘤和癌症疾病，包括急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性疾病(MPD)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏病(HD)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)和青少年慢性骨髓性白血病。相应地，已建议自体移植用于以下恶性肿瘤MM、NHL、HD、AML、神经母细胞瘤、卵巢癌和生殖细胞肿瘤。其它癌症疾病包括毛细胞白血病(HCL)、急性早幼粒细胞白血病(APL)和其它骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
即使HSCT是主要用于血液和淋巴癌症的疗法，但是它也是各种其它获得性和先天性病症的替代疗法，所述病症包括再生障碍性贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、先天性全血细胞减少症、Blackfan-Diamond贫血、重型地中海贫血、镰状细胞性贫血、重度联合免疫缺陷症、Wiskott-Aldrich综合征、先天性代谢异常、自身免疫性疾病和淀粉样变(Copelan2006)。
此外，由于硫酸葡聚糖具有对血液细胞增加的动员效应且经由与当前使用的动员剂普乐沙福不同的作用机制实施其效应，硫酸葡聚糖治疗可用于所有HSCT患者以及利用当前疗法未达到足够干细胞动员的难治性患者中。
硫酸葡聚糖施用不仅造成非常快速且明显增加的祖细胞和/或干细胞通常从骨髓进入受试者的周边血液的动员。所述实施方案的硫酸葡聚糖另外在施用后立即具有对多种血液参数的积极效应且引发白血球(WBC)的快速动员。WBC动员可以为所述实施方案的特定有益的方面，因为被动员的WBC可以降低感染风险且缩短在进行HSCT后的关键时间。
根据所述实施方案的硫酸葡聚糖的一个非常有趣的特征在于硫酸葡聚糖特定地造成淋巴细胞的高度动员，明显高于普乐沙福。
因此，所述实施方案的另一方面涉及一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物，其用于动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者(优选哺乳动物受试者且更优选为人类受试者)的血流。
因此，这方面的一个实施方案涉及一种动员靶白血球，特别是淋巴细胞，进入受试者(优选人类受试者)的血流的方法。所述方法包括施用有效量的具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物给所述受试者。这方面的另一实施方案定义一种具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物的用途，其用于制造用于动员靶白血球，特别是淋巴细胞进入受试者的血流的药物。
可以根据这方面使用所述实施方案的硫酸葡聚糖以动员来自受试者的除祖细胞和/或干细胞以外的淋巴细胞。然而，硫酸葡聚糖可以替代地主要用于动员淋巴细胞作为靶细胞来用于各种需要淋巴细胞的应用或疗法中。
淋巴细胞的任何收获和硫酸葡聚糖的施用优选地如本文先前针对干细胞和/或祖细胞动员所述进行配合和同步。因此，优选地，硫酸葡聚糖施用的配合和同步发生在人类受试者开始淋巴细胞收获前的约0至约8小时，优选约0至约6小时和更优选约0小时至约4小时。先前所公开的优选的相对于硫酸葡聚糖施用的收获间隔也可有利地用于淋巴细胞收获。
更高的注入淋巴细胞含量结合HSCT具有多种有益优点。例如，增加注入到受试者的淋巴细胞数量连同先前所收获的干细胞和/或祖细胞将降低感染风险且改进总体结果。对于MM和NHL患者，更高的注入淋巴细胞剂量预测在自体造血干细胞移植后更高的淋巴细胞回收，其继而预测卓越的总体存活。增加的淋巴细胞剂量在第15天转为绝对淋巴细胞计数(ALC-15)。已得出结论，NHL患者的中位数总存活率和无进展存活期对于接受0.68x109个淋巴细胞/kg的患者明显比那些接受0.34x109个淋巴细胞/kg的患者更好，且在MM患者中利用更高的淋巴细胞产量获得类似效益(Porrata 2004b)。
在用普乐沙福进行的临床试验中，介于20至25％的HSCT患者经历移植后感染(CHMP评估报告Mozobil(普乐沙福)程序号EMEA/H/C/001030)。社区呼吸系统病毒已经被识别为严重感染的可能病因，尤其在接受HSCT的患者中。此外，具有症状性上呼吸道感染的HSCT接受者具有更高的进展为严重肺炎的倾向，其中死亡率高达50-70％(Chemaly 2006)。所述实施方案的硫酸葡聚糖可以降低这些感染风险，这是由于增加的淋巴细胞水平。
提出改进总存活率的机制为更快速的淋巴细胞植入和重建，从而产生更强烈的移植物对肿瘤(GVT)效应，这减少残余癌症(Porrata 2004a、2004b、2009和Hiwase 2008)。如在实验结果中所呈现，单次施用硫酸葡聚糖至少使单一疗法中的淋巴细胞释放相比于单次施用G-CSF或普乐沙福加倍。硫酸葡聚糖与G-CSF的组合在动员淋巴细胞方面相比于G-CSF和普乐沙福的组合为约2倍有效。
对WBC且尤其淋巴细胞的引发效应可能是基于根本机制，即已显示在小鼠和非人类灵长动物中，硫酸葡聚糖破坏SDF-1梯度，其中在血液中增加的细胞水平和在BM中降低的水平(Sweeney 2002)。SDF-1的增加很可能归因于来自硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸葡聚糖的竞争性置换，其使内皮细胞表面上或BM和其它组织中的细胞外基质的趋化细胞素隔离。另一可能的机制为硫酸葡聚糖通过细胞间相互作用，例如，白细胞碾压和选择素介导的白细胞粘附来干涉白血球。
因此，根据所述实施方案的硫酸葡聚糖可以结合供体淋巴细胞输注(DLI)使用。DLI为一种过继性免疫疗法，有时在HSCT后使用。在DLI中，来自源干细胞的淋巴细胞在干细胞和/或祖细胞移植后被注入以扩大抗肿瘤免疫反应或确保供体干细胞保持植入。此疗法的目标在于通过GVT效应引发患者癌症的缓解。由此供体淋巴细胞可以攻击和控制残余癌细胞的生长。
有利地，所述实施方案的硫酸葡聚糖与G-CSF组合使用来治疗受试者且改进被动员细胞的产率。如在实验部分所公开，硫酸葡聚糖与G-CSF的组合治疗相比于仅硫酸葡聚糖治疗以协同方式增加被动员细胞(干细胞和祖细胞以及各种WBC)的数量。此外，硫酸葡聚糖与G-CSF的组合导致相比于普乐沙福和G-CSF的组合明显更高水平的被动员细胞。如在普乐沙福和G-CSF之间所见的协同效应似乎对于硫酸葡聚糖与G-CSF的组合甚至更为突出。这是未预期的，特别是按照Han 1998，其中硫酸葡聚糖10kDa与G-CSF的组合提供基本上与仅使用G-CSF相同的结果。
因此所述实施方案的又一方面涉及一种细胞动员组合物，其包括具有3500与9500Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的衍生物以及G-CSF。这个方面的相关实施方案定义所述实施方案的硫酸葡聚糖与G-CSF的组合用途，其用于动员受试者(优选人类受试者)的细胞，特别是干细胞和/或祖细胞和/或WBC且特别是淋巴细胞。
所述细胞动员组合物优选地也包含媒介物，诸如水性溶剂。
因此，这方面的一个实施方案涉及一种动员细胞，诸如干细胞和/或祖细胞和/或淋巴细胞，进入受试者(优选人类受试者)的周边血液的方法。所述方法包括施用有效量的根据所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物以及有效量的G-CSF或施用上述细胞动员组合物给所述受试者。这方面的另一实施方案定义一种根据所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物与G-CSF的组合或上述细胞动员组合物，其用于动员细胞，优选干细胞和/或祖细胞和/或淋巴细胞，进入受试者(优选人类受试者)的周边血液。这方面的又一实施方案定义一种根据所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物与G-CSF的组合或上述细胞动员组合物的用途，其用于制造用于动员细胞，优选干细胞和/或祖细胞和/或淋巴细胞，进入受试者(优选人类受试者)的周边血液的药物。
根据这方面使用的G-CSF可以来自任何适宜的G-CSF源，包括重组或纯化G-CSF。非限制性实例包括(非格司亭(filgrastim)，其为G-CSF类似物)、(来格司亭(lenograstim)，其为重组G-CSF)、(培非格司亭(pegfilgrastim)，其为非格司亭的聚乙二醇形式)。生物活性的片段、变体、衍生物或融合分子可替代或另外地用作G-CSF源，假若其具有类似于天然G-CSF的动员细胞的能力。
当前，在血液成分分离前每天早上施用G-CSF(10μg/kg)给受试者持续4天，且然后在血液成分分离的每天早上施用。这种施用方案也可结合所述实施方案的硫酸葡聚糖使用。因此，G-CSF优选地在硫酸葡聚糖施用和细胞收获前的一种或几种情境下施用给受试者，诸如在血液成分分离前1至7天一次或两次或2至4天一次或两次且优选额外地在血液成分分离当天早上施用。
替代地或另外地，硫酸葡聚糖施用可以在G-CSF施用前发生。例如，根据所述实施方案的硫酸葡聚糖具有当进一步如下文所论述地施用给受试者时引发HGF的额外有益效应。然后，其可有益于当将G-CSF施用给受试者时具有受试者周边血液中的增加的HGF水平。在一个优选实施方案中，则不仅可在G-CSF前或事实上与其一起施用硫酸葡聚糖，而且优选地在上述G-CSF施用方案结束后施用。
硫酸葡聚糖与G-CSF的组合以协同方式增加周边血液中的CFC数量，达到18000CFC/mL血液，即，超过对照组100倍且似乎比普乐沙福与G-CSF的组合更加有效。在一些患者中，G-CSF与普乐沙福的组合治疗不动员足够量的HSC用于后续移植。将G-CSF与硫酸葡聚糖组合可改进这些难治性患者的HSC产率且使能够进行计划的移植。利用硫酸葡聚糖和G-CSF所致的周边血液中CFC数量的协同增加将对于经历自体干细胞移植的患者有利，其中难以从所述患者获得保证的细胞计数来继续后续移植。
一般来说，在血液成分分离程序中，必须从供体获得足够数量的HSC来进行后续成功的移植。在临床状况下，HSC细胞的数量被测量为血液成分分离产物中的CD34+细胞量。此标记物已被证明为化疗后植入的恒定且强烈预示因子。然后，CD34+细胞群体为异质性且CD34+标记物仅为HSC功能的代用标记物。一般来说，<2.5x106个CD34+细胞/千对于HSCT是不足够的，且>20x106CD34+个细胞的移植可能产生植入综合征，其为非预期发生的干细胞移植毒性且有时是致命的。在这些数量之间，存在文献记录支持，越多细胞检索，移植结果越好，因为植入更快速，住院时间减少且由此降低成本。
为了成功进行造血干细胞移植，即确保有效且快速植入以避免感染和避免疾病复发，因此足够量的周边血液干细胞的动员是重要的。
不论其是否为自体和同种异体移植，首要目标为实现成功的植入。植入失败将导致临界情况，其可能导致患者没有造血和免疫系统。为了避免这种威胁生命的情况，必须确保移植物含有足够的细胞来确保成功的植入。如果细胞计数过低，那么骨髓清除疗法必须被推迟且失去宝贵的时间。此外，在骨髓清除疗法后，利用更高数量的祖细胞的移植可能导致更快速的植入，其可导致降低住院和支持性护理需求。如所提及，用于增加血液中的循环造血祖细胞数量的标准方法为利用G-CSF处理供体几天。甚至利用当前治疗(普乐沙福和G-CSF)，所有患者没有实现足够的细胞计数来保证移植。此外，在移植后，存在感染和疾病复发风险。对于这些患者，硫酸葡聚糖具有用作挽救疗法或用作普乐沙福和G-CSF的替代方案的潜能。
除了其对动员的效应以外，所述实施方案的硫酸葡聚糖发挥额外效应，其可具有有利的针对HSCT结果的暗示。硫酸葡聚糖引发即时和提高的血浆水平的肝细胞生长因子(HGF)，一种对不同细胞类型具有促分裂效应的激素且有利于所移植细胞的植入(Roos1995和Zioncheck 1995)。HGF也作为当与粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)组合时对HSC生长(Kmiecik 1992和Weimar 1998)以及由GM-CSF、G-CSF或M-CSF所引发的人类脐带血源性HSC的集落形成(Goff 1996)的协同增殖因子起作用。HGF也显示为在缺乏c-kit/SCF(一种对于原始造血细胞的生长和增殖重要的信号传导系统)的小鼠中部分恢复造血(Yu1998)。在存在促红血球生成素下，HGF引发从CD34+细胞形成红细胞突释形成单位(BFU-E)集落(Galimi 1994)。我们的结果显示，硫酸葡聚糖相比于普乐沙福引发显著更多的BFU-E，其可能是由于相比于普乐沙福更为显著的提高HGF。
与当前治疗相比，硫酸葡聚糖具有以几种方式改进祖细胞和其它血液细胞的动员以及后续移植结果的潜能，其将对患者具有重大效益。一般来说，硫酸葡聚糖已显示增加循环WBC、淋巴细胞、HGF和祖细胞的产率。
这些特异性细胞和生长因子的增加的动员将极大改进患者的结果，由于其将由于更好和更快速的所移植细胞的植入而改进移植的结果。硫酸葡聚糖治疗可以降低感染风险，由于淋巴细胞含量和CFU-GEMM似乎增加，其可缩短嗜中性粒细胞减少症的时间。此也将暗示更短的患者住院时间。此外，硫酸葡聚糖治疗可能够使更多患者接受HSCT。
更有效的动员将降低从患者的重复细胞收获的需要且因此降低副作用(主要来自长期施用G-CSF)的风险，由于治疗期被缩短。硫酸葡聚糖增加HSC的总产量，其通过达到为了保证移植的最小量的被动员HSC以及增加细胞收获的预测来使患者获益。
在小鼠中，经硫酸葡聚糖治疗的干细胞的植入和归巢已经显示比未治疗干细胞更有效(Hayakawa 2009)。这表明，除了能使更多移植以外，硫酸葡聚糖具有通过增加HSC移植的可预测性，减少HSCT后并发症，减低重复细胞收获的需求，帮助更多患者达到为了保证HSCT的最小量细胞且增加在HSCT后接受成功植入的患者数量，来增加HSCT成功率的潜能。
提出改进总存活率的机制为更快速的淋巴细胞植入和重建，从而产生更强烈的GVT效应，这减少残余癌症(Porrata 2009)。施用硫酸葡聚糖至少使单一疗法中的淋巴细胞释放相比于单次施用G-CSF或普乐沙福加倍。硫酸葡聚糖与G-CSF的组合使动员淋巴细胞释放相比于G-CSF和普乐沙福的组合加倍。
另外，增加的淋巴细胞产率也将可用于DLI，可用于同种异体移植，其中采用重复的淋巴细胞输注来改进移植的结果。
此外，硫酸葡聚糖造成相比于基线水平HGF增加超过100倍，且相比于普乐沙福，增加超过25倍，这指示已经在15分钟后HGF的即时提升(从<160至16000pg/mL)。这些水平足够高来引发细胞增殖。
以下表1汇总利用硫酸葡聚糖所实现的一些有益效应。
表1-硫酸葡聚糖治疗的优点
使用根据所述实施方案的硫酸葡聚糖的祖细胞和/或干细胞和/或靶白血球，可选地与HGF一起的动员可具有除了从接受硫酸葡聚糖施用的受试者收获细胞以外的医学及临床用途。因此，可以根据如上文所提及的各种医学应用，来使用细胞进入受试者周边血液的动员。例如，动员进入人类受试者的周边血液的HSC可以用于治疗、预防各种自身免疫性疾病或至少减少其症状，所述疾病包括(但不限于)类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、多发性硬化症(MS)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、干燥综合征和炎症性肠病。不动员进入周边血液的干细胞和/或祖细胞的其它用途可以为引起组织和器官修复，包括心脏修复。
此外，靶白血球，诸如淋巴细胞进入受试者的血流的动员可以用于各种医学应用中。例如，提高周边血液中淋巴细胞的水平可以用于治疗、预防各种实体和血液性癌症或至少减少其症状，所述癌症包括(但不限于)慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和乳腺癌。
因此，施用根据所述实施方案的硫酸葡聚糖不一定必须用于出于从受试者收获细胞的目的来动员细胞。施用硫酸葡聚糖可以替代地出于达到受试者周边血液中增加水平或含量的所需细胞的目的而使用，其中所述细胞可以在受试者中发挥所需功能。
根据所述实施方案的硫酸葡聚糖为具有3500与9500Da范围内的平均分子量的低分子量硫酸葡聚糖(LMW-DS)。
在一个特定实施方案中，所述硫酸葡聚糖具有4500与7000Da范围内的平均分子量。更优选地，所述硫酸葡聚糖具有4500与5500Da范围内的平均分子量，诸如4.6kDa、4.7kDa、4.8kDa、4.9kD、5.0kDa、5.1kDa、5.2kDa、5.3kDa或5.4kDa的平均分子量。
可以根据实施方案使用的硫酸葡聚糖的一个实例具有5139Da的平均分子量和1.2009的多分散性指数(PDI)。
在一个特定实施方案中，所述硫酸葡聚糖具有实质上狭窄的分子量分布。在此种实施方案中，大多数硫酸葡聚糖分子具有在3500与9500Da优选范围内的受限分子量。在一实例实施方案中，少于20％的硫酸葡聚糖分子具有高于8000Da的分子量，优选少于15％，诸如少于10％或少于5％的硫酸葡聚糖分子具有高于8000Da的分子量。此外或或者，少于40％的硫酸葡聚糖分子具有低于3000Da的分子量，优选少于35％，诸如少于30％或少于25％的硫酸葡聚糖分子具有低于3000Da的分子量。
硫酸葡聚糖为葡聚糖的聚阴离子性衍生物且包含硫。硫酸葡聚糖的平均硫含量优选为15至20％且更优选为约17％，一般对应于约2个硫酸根基团/葡糖基残基。在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖的硫含量优选为等于或至少接近于葡聚糖分子最大可能的硫含量程度。
根据所述实施方案的硫酸葡聚糖可以提供为硫酸葡聚糖的药学上可接受的衍生物。这些药学上可接受的衍生物包括硫酸葡聚糖的盐和溶剂化物，例如钠盐或钾盐。
硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物优选地通过注射至受试者且特别是通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射或腹腔内(i.p.)注射，优选为i.v.或s.c.注射，来施用。可以使用的其它非经肠施用途径包括肌肉内和关节内注射。对于这些施用途径，硫酸葡聚糖优选地以呈具有选定溶剂或赋形剂的液体形式的制剂提供。有利地，所述溶剂为水性溶剂且特别是缓冲溶液。此缓冲溶液的一个非限制性实例为柠檬酸缓冲液，诸如柠檬酸单水合物(CAM)缓冲液或磷酸盐缓冲液。例如，所述实施方案的硫酸葡聚糖可以溶解于盐水，诸如0.9％NaCl盐水中，且然后任选地用75mM CAM缓冲且使用氢氧化钠将pH调整为约5.9。另外未缓冲的溶液是可行的，包括水性注射溶液，诸如盐水。另外，如果缓冲溶液是所需的，那么可使用除CAM以外的其它缓冲系统。
所述实施方案不限于注射且其它施用途径可替换地使用，包括经口、经鼻、经颊、经直肠、经真皮、经气管、经支气管或局部。然后，用基于特定施用途径选择的合适的赋形剂或载剂配制活性化合物，硫酸葡聚糖。
硫酸葡聚糖的合适的剂量范围可根据患者的大小和体重、待治疗的患者病症和其它考虑而变化。特别对人类受试者来说，可能的剂量范围可以为1μg/kg至150mg/kg体重，优选0.1mg/kg至50mg/kg体重，更优选为0.25至50mg/kg体重。说明性实例包括0.3mg/kg至50mg/kg体重、1mg/kg至50mg/kg体重，且更优选为5mg/kg至25mg/kg体重，诸如5mg/kg至20mg/kg体重或5mg/kg至15mg/kg体重。此外，可以使用较低浓度，诸如0.5至5mg/kg体重。
所述实施方案的硫酸葡聚糖可以在单一施用情境下，诸如以单次团块注射的形式施用。此团块剂量可以非常快速地注射到患者，但是有利地，输注一段时间，使得硫酸葡聚糖溶液经几分钟时间输注到患者，诸如5到10分钟期间。一般预期，根据所述实施方案，单次剂量和注射或输注(或实际上其它施用)是足以达到患者的治疗效应。然而，可能的是在不同施用情境下分多次剂量施用硫酸葡聚糖。例如，单次团块注射可以补充长期输注硫酸葡聚糖溶液。
硫酸葡聚糖可任选地也在多种施用情境下施用，诸如除了在细胞动员当天还在施用G-CSF之前，或除了在细胞动员当天还在施用G-CSF之前和连同其一起，或除了在细胞动员当天还连同施用G-CSF一起。在不同施用情境下使用的硫酸葡聚糖的特定剂量可以为相同或不同。例如，相比于在细胞动员当天使用的剂量，可在施用G-CSF之前和连同其一起时的施用情境下使用较低的硫酸葡聚糖剂量。
实验
进行一系列小鼠实验，以表征硫酸葡聚糖对动员的效应以及获得关于合适剂量、收获时间、施用模式以及相比于使用普乐沙福(AMD3100)与G-CSF()组合的当前治疗的效应的额外知识。
小鼠
雌性DBA/2小鼠是获自Harlan实验室(荷兰)和查尔斯河实验室(德国)。将所有动物保持在乌普萨拉大学的动物设施处，圈养在标准条件下且根据机构指导方针提供随意的食物与水。使用7至40周龄，体重17至31g的动物。所有实验经瑞典乌普萨拉当地的动物伦理委员会核准。
动员方案
G-CSF(安进公司，荷兰)是提供为0.3mg/mL的无菌等渗水溶液，且在正常盐水中稀释至50μg/mL的浓度。G-CSF是以2.5μg的剂量作为单次皮下注射施用，在第-2天和第-1天的早上和晚上。使用不同平均分子量的硫酸葡聚糖：
Meito-平均分子量为6939Da，由Meito Sangyo有限公司(日本东京)提供且溶于柠檬酸单水合物(CAM)缓冲液；
pKC-平均分子量为5139Da，由pK Chemicals A/S(丹麦哥本哈根)提供且溶于CAM缓冲液或0.9％NaCl(费森尤斯卡比)中；和
TdB-平均分子量为3.3kDa，由TdB咨询公司(乌普萨拉，瑞典)提供且溶于0.9％NaCl(费森尤斯卡比)。
AMD3100是购自Sigma Aldrich(德国)且溶于正常盐水中至2mg/mL的浓度。第0天，对小鼠i.v.或s.c.施用100mg/kg硫酸葡聚糖或s.c施用5mg/kg AMD3100，除非另外指明。在对照组中，对动物i.v.或s.c.施用CAM缓冲液或0.9％NaCl。所有动物接受约50-100μL每种溶液(2.5-5mL/kg)。
Meito Sangyo有限公司批次N-3188具有以下分子量分布：
pK Chemicals A/S批次31497具有以下分子量分布：
TdB咨询公司批次20341具有以下分子量分布：
Mp＝峰平均分子量
Mn＝数均分子量
AMw＝重均分子量
集落形成细胞测定
周边血液是通过在异氟烷麻醉下，使用EDTA(从0.5M EDTA的原液(由Rudbeck实验室制备)在0.9％NaCl中以1:2.5稀释制得的0.2M EDTA)冲洗的注射器的末端心脏穿刺来取样。
将血液(100-200μL)转移到含有肝素(最终浓度17.5IE/mL)的聚丙烯管中。使用氯化铵溶液(StemCell Technologies，Vancouver，BC，加拿大)耗竭红细胞。将残余细胞再悬浮于含有2％胎牛血清(StemCell Technologies)的Iscove改良杜氏培养基中，并根据制造商指示与2mL补充有重组细胞因子混合物(MethoCult 3434；StemCell Technologies)和青霉素-链霉素的甲基纤维素培养基混合。将1.1mL含有HPC的培养物接种于35mm皿(Sarstedt，兰斯克鲁纳，瑞典)中并置于在37℃下具有5％CO2的加湿室中。在培养第12天计数集落的总数。
血液学分析
周边血液是通过在异氟烷麻醉下，使用EDTA冲洗的注射器的末端心脏穿刺来取样并转移到含有1.6mg EDTA(Sarstedt，兰斯克鲁纳，瑞典)的聚丙烯管中。
全血计数是在瑞典农业大学(SLU)(乌普萨拉，瑞典)，使用自动化细胞计数器(Advia 2120血液学系统；西门子医疗诊断公司，伊利诺斯州，USA)获得。
HGF-ELISA
周边血液是通过在异氟烷麻醉下(除非另外指出)，使用EDTA冲洗(如上制备的0.2M EDTA)的末端心脏穿刺来取样。
血浆是通过在3000g下离心EDTA血液5分钟制备，并在20℃下冷冻直到分析。根据来自制造商的指示，进行HGF ELISA测定(RnD系统，明尼阿波里斯市，USA)。
统计
将数据表示为平均值加减SEM。使用学生t检验(双尾，等方差)进行组间比较。使用Microsoft Excel进行统计分析。在p值小于0.05下的差异被视为统计上显著。
硫酸葡聚糖s.c.剂量对周边血液细胞动员的发现研究
用s.c.注射硫酸葡聚糖(10、50、150和500mg/kg，pKC)、AMD3100(5mg/kg，阳性对照)或CAM缓冲液(阴性对照)，处理小鼠(DBA/2N，8-14周龄，查尔斯河)。所用剂量的AMD3100和细胞收获的1小时是此药物在小鼠中的所记录的最佳给药方案(Broxmeyer 2005)。使用根据上文的血液学分析，分析血液。更详细来说，在最后一次注射后3小时时(对于AMD3100是1小时)杀死小鼠并在周边血液中测定血液学差异分析。收集血清和/或血浆样本并储存在-20℃下直到分析。血液是通过由EDTA冲洗的注射器的心脏穿刺收集并与EDTA和重组水蛭素混合用于细胞计数分析且仅与EDTA混合用于HGF分析。
在硫酸葡聚糖施用后3小时时，存在剂量依赖性循环白血球(WBC)，主要是淋巴细胞(图1)和HGF(图2)增加。10-50mg/kg硫酸葡聚糖和AMD3100 5mg/kg的剂量显示类似效应，而150和500mg/kg硫酸葡聚糖的效应比AMD3100效应显著增加(分别p<0.001和p<0.01)。施用50、150和500mg/kg的硫酸葡聚糖出现显著(p<0.001)增加的循环HGF水平(图2)，其比AMD3100更加明显。
表2汇总在分别施用硫酸葡聚糖(LMW-DS)和AMD3100后的血液参数。所述表指示相比于对照(CAM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)或相比于AMD3100在施用LMW-DS或AMD3100后的周边血液中的血液学变量。
表2-在施用LMW-DS后，周边血液中的血液学变量
MCV：平均微粒子体积 MCHC：平均微粒子血红素浓度
MPV：平均血小板体积 WBC：白血球 LUC：白细胞
单位：红细胞1012个细胞/L，其它细胞109个细胞/L，MCV(fl)，MCHC(g/L)，HCT(g/L)
硫酸葡聚糖i.v.剂量对周边血液细胞动员的发现研究
使用25-200mg/kg硫酸葡聚糖(Meito)i.v.对DBA/2OlaHsd小鼠(7-12周龄，Harlan)进行动员。使用AMD3100(5mg/kg，s.c.)或CAM缓冲液(i.v.)作为阳性和阴性对照。使用根据上文的CFC-测定和血液学分析，分析血液。
相比于AMD3100(5mg/kg)和对照CAM缓冲液，单次i.v.注射硫酸葡聚糖(25、50、100和200mg/kg，Meito)在硫酸葡聚糖注射后已经30分钟的周边血液中引起WBC(p<0.01)，主要是淋巴细胞(p<0.001)的显著增加(图3)。利用四种剂量的硫酸葡聚糖所实现的动员水平相对于AMD3100显著增加。
硫酸葡聚糖对CFC的动员效应也是显著，在给予最低剂量下已经明显(25mg/kg，p<0.001)。效应似乎以剂量依赖性方式增加。就总CFC而言，在200mg/kg硫酸葡聚糖后的效应类似于AMD3100，5mg/kg的效应(图4A和4B)。
在单次剂量施用AMD3100(s.c.)和硫酸葡聚糖(i.v.)后，CFC的增加相比于WBC的一般增加(相对于对照3至5倍)更高(相对于对照6至12倍)。这可能表明对祖细胞动员的特定作用机制(图4A和4B)。
也研究对不同祖细胞亚型CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E的动员效应(图4A和4B)和硫酸葡聚糖似乎增加BFU-E的程度大于AMD3100。
硫酸葡聚糖施用途径对周边血液细胞动员的效应
使用100mg/kg硫酸葡聚糖(Meito，i.v.和s.c.)，对DBA/2N小鼠(9-10个月大，查尔斯河)进行动员。使用根据上文的CFC-测定和血液学分析，分析血液。
比较在i.v.和s.c.施用100mg/kg硫酸葡聚糖后，对周边血液细胞的效应(n＝3)。对于两种施用途径在施用后30分钟收获细胞。对于不同施用途径，在施用后30分钟，对循环WBC、淋巴细胞、CFC或CFC亚型没有显著差异，参见表3。
表3-s.c.和i.v.施用的血液参数的比较
s.c.LMW-DS i.v.LMW-DS
WBC，*109/L 12.5+1.1 16.2±1.8
淋巴细胞，*109/L 9.9±1.2 12.6±1.7
CFC，*109/L 692±111 712±175
CFC-GM，*109/L 604±83 592±172
CFC-GEMM，*109/L 28±10 28±10
BFU-E，*109/L 60±22 92±12
硫酸葡聚糖对周边血液细胞动员的时间-效应关系
使用50mg/kg硫酸葡聚糖(pKC,i.v.)或100mg/kg硫酸葡聚糖(Meito，i.v.)，对DBA/2N小鼠(8-14周龄，查尔斯河)进行动员。使用CAM缓冲液(i.v.)作为阴性对照。使用CFC-测定、血液学分析和HGF-ELISA，分析血液。
i.v.施用硫酸葡聚糖(100mg/kg)的动员效应显示在施用后约30分钟时最高数量的WBC和淋巴细胞且在3小时时下降但仍然升高。可以看到，CFC非常快速的增加，峰值早已在施用后7.5分钟时开始(图5)。不同亚型的祖细胞峰值出现的时间稍不同：BFU-E是在施用后7.5分钟时且CFU-GM/CFU-GEMM是介于15至30分钟之间。HGF是在15分钟后增加至最高水平(15960pg/mL)且随后沉降。然而，在另一实验中测量HGF且不是在7.5分钟时取样(参见表4)。在施用后1小时，AMD3100将HGF水平增加至650±230pg/mL。
表4-在i.v.施用硫酸葡聚糖(LMW-DS)后的细胞动员
因此，相比于对照(CAM)，i.v.施用给小鼠的硫酸葡聚糖(100mg/kg)快速增加周边血液中的WBC数量且特别是淋巴细胞(Lymph)硫酸葡聚糖不会影响血小板(PLT)数量。硫酸葡聚糖也快速地增加血浆中HGF的量。结果以平均值±SEM记录于表4中，n.a.＝未分析。统计相比于CAM缓冲液呈现，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
硫酸葡聚糖与G-CSF的组合对周边血液细胞动员
血液成分分离前患者的标准处理是基于每日注射G-CSF持续一周。临床上，硫酸葡聚糖可以与G-CSF组合使用。在一项小鼠研究中，将2.5μg/只动物的G-CSF每天两次(隔8小时)施用，持续2天(Broxmeyer 1999)。为了研究G-CSF和硫酸葡聚糖的组合的效应，用G-CSF持续2天(2x2.5μg/天，s.c.)和第3天，或用硫酸葡聚糖(5、25、100mg/kg，Meito，i.v.)、CAM(阴性对照，i.v.)或AMD3100(阳性对照，5mg/kg，s.c.)注射，处理DBA/2OlaHsd小鼠(10-15周龄，Harlan)。使用CFC-测定和血液学分析，分析血液。
G-CSF相比于正常增加WBC数量(参见图1和3，仅施用CAM)且加入硫酸葡聚糖(25和100mg/kg)以协同模式增加WBC和淋巴细胞数量。WBC和淋巴细胞的增加显著比AMD3100(5mg/kg)施用后更加明显(图6)。
将硫酸葡聚糖以100mg/kg的剂量加入至G-CSF中使得周边血液中的祖细胞巨量且协同的增加且硫酸葡聚糖似乎作为动员剂比AMD3100更有效(图7A和7B)。相比于G-CSF和AMD3100组合，硫酸葡聚糖和G-CSF的组合动员更多的CFU-GEMM和BFU-E祖细胞(图7B)。
所进行的实验显示硫酸葡聚糖在s.c.和i.v.施用后对WBC、淋巴细胞和CFC的动员的剂量-效应关系。CFC的增加相比于WBC的一般增加(相对于对照的4至5倍)似乎更高(相对于对照的6至12倍)。i.v.施用的硫酸葡聚糖(100mg/kg)的时间效应在CFC、WBC和淋巴细胞中快速增加。峰值已在7.5分钟后开始，其显著早于AMD3100。硫酸葡聚糖与G-CSF的组合显示周边血液中CFC的未预期和显著的增加，达到18000CFC(超过对照组的100倍)且似乎比AMD3100与G-CSF的组合更加有效，参见图8。相对于最佳剂量的AMD3100，在单疗法中硫酸葡聚糖施用导致WBC和淋巴细胞的显著更高的动员且似乎也动员更多的BFU-E。相对于AMD3100，与G-CSF组合的硫酸葡聚糖施用导致显著更高的WBC和淋巴细胞动员，且似乎也动员更多的CFC、BFU-E和CFU-GEMM，参见图7A、7B、8和9。硫酸葡聚糖在施用后15分钟增加血浆中HGF至高水平(从<160至16000pg/mL)，比1小时后的AMD3100多25倍。
通过不同平均分子量的低分子量硫酸葡聚糖来比较对造血细胞的动员
动物
将雌性DBA/2Ola小鼠(Harlan，荷兰)保持在乌普萨拉大学的动物设施中，圈养在标准条件下且随意提供食物和水。使用重17至22g的动物。
实验设计
DBA/2-雌性分成四个群组：1)媒介物(NaCl水溶液)(n＝8)，2)50mg/kg硫酸葡聚糖DS3(n＝5)，3)50mg/kg硫酸葡聚糖DS5(n＝5)和4)50mg/kg硫酸葡聚糖DS5PNB(n＝5)。组4)用戊巴比妥钠(PNB)代替异氟烷进行镇静，以评估麻醉方案的改变是否会影响动员。
物质的施用
将DS5(平均Mw 5.1kDa，pKC丹麦，批次31497)和DS3(平均Mw 3.3kDa，TdB咨询公司，瑞典乌普萨拉，批次20341)溶于0.9％NaCl(费森尤斯卡比)中至20mg/mL，且经由20μm过滤器过滤以获得无菌溶液。动物接受2.5mL/kg(约50μL)经由尾静脉经静脉内注射。
血液学分析
结果显示于图10和表6中。DS3不显示总体WBC或淋巴细胞的任何显著改变而记录嗜中性粒细胞的轻微下降。
表6-在施用硫酸葡聚糖物质后，周边血液中的血液学变量
MVC＝平均微粒子体积；MCHC＝平均微粒子血红素浓度，相比于媒介物(NaCl)的血液学变量：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
DS3不引起CFC数量的显著增加，如图11中所示。DS5引起HGF的显著增加，与麻醉剂的使用无关，而较低分子量的物质(DS3)未显示HGF的显著增加，参见图12。本文所呈现的数据显示，相比于DS5，DS3为不良的动员剂。DS3并没有增加HGF到超过媒介物的任何程度。
上述实施方案应理解为本发明的几个说明性实例。对于本领域技术人员应了解，可以对实施方案进行各种修改、组合和变化而不脱离本发明的范围。特别是，在技术上可行的情况下，在不同实施方案中的不同部分解决方案可以在其它配置中组合。
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Claims (14)

1.具有4500与7000Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的盐在制备用于动员祖细胞和/或干细胞进入受试者的周边血液的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述祖细胞和/或干细胞是选自由以下组成的群组的集落形成细胞：集落形成单位-粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞以及突释形成单位-红细胞。
3.具有4500与7000Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的盐在制备用于动员靶白血球进入受试者的血流的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述靶白血球是淋巴细胞。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐具有4500与5500Da范围内的平均分子量。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐具有在15至20％范围内的平均硫含量。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物是所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐的水性注射溶液。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物是配制成以0.1至50mg硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐/kg所述受试者的体重范围内的剂量施用。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物是配制成在动员所述细胞进入人类受试者的血流中的时间点前间隔0小时至6小时以内施用给人类受试者。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物是配制成在动员所述细胞进入所述人类受试者的所述血流中的所述时间点前间隔0小时至4小时以内施用给所述人类受试者。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物是配制为与粒细胞-集落刺激因子G-CSF组合用于动员所述细胞进入所述受试者的所述周边血液。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述G-CSF是配制成在动员所述细胞进入所述受试者的血流中的时间点前的2至4天施用给所述受试者一次或两次。
13.一种细胞动员组合物在制备用于动员祖细胞进入受试者的周边血液的药物中的用途，所述细胞动员组合物包括具有4500与7000Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的盐以及粒细胞集落刺激因子G-CSF。
14.一种细胞动员组合物在制备用于动员靶淋巴细胞进入受试者的血流中的药物中的用途，其中所述细胞动员组合物包括具有4500与7000Da范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖，或其药学上可接受的盐以及粒细胞集落刺激因子G-CSF。
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