SA517381722B1 - تركيبة وسط لتحضير سم البتيلينيوم - Google Patents
تركيبة وسط لتحضير سم البتيلينيوم Download PDFInfo
- Publication number
- SA517381722B1 SA517381722B1 SA517381722A SA517381722A SA517381722B1 SA 517381722 B1 SA517381722 B1 SA 517381722B1 SA 517381722 A SA517381722 A SA 517381722A SA 517381722 A SA517381722 A SA 517381722A SA 517381722 B1 SA517381722 B1 SA 517381722B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- medium
- apf
- plant
- derived
- media
- Prior art date
Links
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 title claims abstract description 13
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 113
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 113
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 113
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 109
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims abstract description 83
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 claims abstract description 65
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 63
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims abstract description 45
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 28
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 28
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims abstract description 10
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 235000016816 Pisum sativum subsp sativum Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 32
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 25
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 25
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 25
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 25
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 19
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 19
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 16
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 14
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 12
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 11
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 9
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 2
- 241001492658 Cyanea koolauensis Species 0.000 claims 1
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- 235000017276 Salvia Nutrition 0.000 claims 1
- 241001072909 Salvia Species 0.000 claims 1
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims 1
- PZTQVMXMKVTIRC-UHFFFAOYSA-L chembl2028348 Chemical compound [Ca+2].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C)=CC=C1N=NC1=C(O)C(C([O-])=O)=CC2=CC=CC=C12 PZTQVMXMKVTIRC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 claims 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 claims 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 39
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 abstract description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 224
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 114
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 57
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 45
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 44
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 44
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 44
- 239000000306 component Substances 0.000 description 38
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 34
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 34
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 25
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 25
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 24
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 23
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 23
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 9
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 6
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 5
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 5
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 4
- -1 gla disaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 4
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 4
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 4
- 244000239635 ulla Species 0.000 description 4
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 4
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 4
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 4
- ZKHFSIMBFARVHY-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrochloride Chemical compound Cl.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O ZKHFSIMBFARVHY-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 3
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 3
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 3
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- FGCSIJPPCNCQJB-FAOVPRGRSA-M sodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O FGCSIJPPCNCQJB-FAOVPRGRSA-M 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- IXHADCPJRQNDGG-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-chloroethyl)amino]-1-(4-phenylphenyl)propan-1-one Chemical compound C1=CC(C(=O)CCN(CCCl)CCCl)=CC=C1C1=CC=CC=C1 IXHADCPJRQNDGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 2
- 101100412446 Caenorhabditis elegans rer-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100234002 Drosophila melanogaster Shal gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- FYIFITNFHGKSOB-UHFFFAOYSA-J P(=O)([O-])([O-])[O-].[K+].[K+].P(=O)([O-])(O)O.[Na+].[Na+] Chemical compound P(=O)([O-])([O-])[O-].[K+].[K+].P(=O)([O-])(O)O.[Na+].[Na+] FYIFITNFHGKSOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 244000166071 Shorea robusta Species 0.000 description 2
- 235000015076 Shorea robusta Nutrition 0.000 description 2
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 description 2
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 2
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 239000007143 thioglycolate medium Substances 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010072075 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000976416 Isatis tinctoria subsp. canescens Species 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 101710126507 Toxin 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 101710099833 Venom protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003131 biological toxin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 208000017580 chronic wasting disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical compound [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 description 1
- OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L disodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-] OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 208000037957 feline spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000008298 histiocytosis Diseases 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003350 kerosene Substances 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 201000007770 spastic cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 201000008417 spastic hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 208000037956 transmissible mink encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
يتعلق الاختراع الحالي بتركيبة وسط medium composition لإنتاج سم البتيلينيوم botulinum toxin و، على الأخص، بتركيبة وسط لزراعة Clostridium sp. قادر على إنتاج سم البتيلينيوم botulinum toxin. تشتمل تركيبة الوسط من الاختراع الحالي على ناتج تحلل كازين casein hydrolysate وببتون peptone واحد على الأقل مشتق من نبات يُختار من المجموعة التي تتكون من ناتج تحلل البازلاء garden pea hydrolysate ، ناتج تحلل بذرة القطن cotton seed hydrolysate وناتج تحلل جلوتين القمح gluten hydrolysate. عند استخدام الوسط وفقاً للاختراع الحالي، الذي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات plant-derived peptones ، نواتج تحلل كازين casein hydrolysate ، ومعادن minerals ، لزراعة Clostridium botulinum، يبلغ معدل نمو البكتريا growth rate of the bacterium في الوسط نحو أكبر من ذلك الموجود في كل من الوسط medium المستخدم حالياً والوسط الذي يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات plant-derived peptones بمفرده. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم استخدام الوسط من الاختراع الحالي، يتم إنتاج تركيز مرتفع من سم البتيلينيوم botulinum toxin بواسطة زراعة ال
Description
تركيبة وسط لتحضير سم البتيلينيوم Medium Composition for Preparing Botulinum Toxin الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بتركيبة وسط medium composition لإنتاج سم البتيلينيوم botulinum toxin 5 « على الأخص» بتركيبة وسط لزراعة Clostridium sp. قادرة على zl سم البتيلينيوم. تشتمل تركيبة الوسط من الاختراع الحالي على ناتج تحلل كازين casein peptone (sing hydrolysate 5 واحد على الأقل مشتق من نبات يُختار من المجموعة التى تتكون من ناتج تحلل البازلاء garden pea hydrolysate « بذرة القطن cotton seed hydrolysate وناتج تحلل جلوتين القمح .gluten hydrolysate تم اكتشاف مجموعة متنوعة من Clostridium sp التي تفرز السموم العصبية السامة neurotoxic toxins منذ 1890؛ وتم تمييز السموم التي يتم إفرازها من هذه البكتيريا 10 38 على مدى السنوات ال 70 الماضية ) Schant, E.
J. et al., Microbiol.
Rev., 2 56:80). يتم تصنيف السموم العصبية المشتقة Neurotoxic toxins derived من «Clostridium sp أي؛ سموم بتيلينيوم botulinum toxins ؛ إلى 7 أنماط مصلية serotypes (الأنواع من أ إلى ز) بناءً على خصائصها المصلية. يحتوي كل من السموم على بروتين السم الذي يتسم بحجم يبلغ 1 نحو 50 1 كيلو دالتون وبشتمل بشكل طبيعي على معقد من عدة بروتينات غير سامة مرتبطة به. ويتكون المركب المتوسط )300 كيلو دالتون) من بروتين سام ig ng غير سام بخلاف راصة دموية؛ ويتكون معقد كبير (450 كيلو دالتون) ومعقد كبير a (900 كيلو دالتون) من معقد متوسط الحجم مرتبط بالراصة الدموية ( ,44:419 Sugiyama, H., Microbiol.
Rev., Cajal .0 أن بروتينات الراصة الدموية هذه غير السامة تعمل على حماية السموم من الرقم 0 الهيدروجيني pH المنخفض وإنزيمات بروتياز protease المختلفة فى الأمعاء .
يتم تخليق السم في صورة عديد ببتيد 0017060106 فردي يتسم بوزن Ada يبلغ نحو 150 كيلو دالتون في الخلاياء ثم ينشطر عند الموضع 3/1 بدءًا من طرف النهاية N بواسطة تأثير البروتياز 486 داخل الخلايا أو العلاج بإنزيم صناعي Jie تريسين trypsin. في وحدتين: سلسلة خفيفة light chain (ا؛ الوزن الجزيئي يبلغ: 50 كيلو دالتون) وسلسلة heavy chain ald eH) 5 الوزن الجزيئي يبلغ: 100 كيلو دالتون). تسبب andl المنشطر بصورة كبيرة في زيادة السمية مقارنة بالبتيد الفردي. يتم ربط اثنين من الوحدات مع بعضها البعض بواسطة رابطة ثنائي كبريتيد disulfide bond وتتسم بوظائف مختلفة. ترتبط السلسلة الثقيلة بمستقبلات الخلية المستهدفة (Park.
MLK. et al, FEMS Microbiol.
Lett., 72:243, 1990) ووظائف للتفاعل مع غشاء حيوي عند الرقم الهيدروجيني منخفض pH) يبلغ 4( لتشكيل قناة ) Mantecucco, C. et 0 1993 ,18:324 ,.1185 ,.21)» وتتسم السلسلة الخفيفة بنشاط دوائي للتدخل في إفراز الناقلات العصبية؛ عندما تكون منفذة LAY بواسطة استخدام مادة مطهرة أو يتم إدخالها بواسطة التوصيل الكهربي أو ما إلى ذلك ) Poulain, 8. et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA., 8 65:4090). يعمل andl على تثبيط الالتقام الخلوي الخارجي أسيتيل الكولين في التشابك العصبي الكوليني المسبق لوصلة عصبية عضلية ليسبب الوهن. وروعي أنه حتى المعالجة بكمية صغيرة جدًا من السم تعمل على تثبيط السمية؛ مما يشير إلى أن السم ليس له أي نشاط إنزيمي ( Simpson, L. et al., Ann.
Rev.
Pharmacol.
Toxicol., 26:427, 1986 .ا). Gig لتقرير صدر مؤخراً» يتسم السم بنشاط ميتالوبيبتيداز (metallopeptidase وتشتمل ركائزه على بروتين مرتبط بسينابتويريفين synaptobrevin ؛ سينتاكسين syntaxin ؛ سينابتوسومال synaptosomal 20 يبلغ 25 كيلو دالتون ((SNAP2S) وما إلى ذلك»؛ والتي تكون Ble عن بروتينات وحدة من معقد التقام خلوي خارجي آلي. يستخدم كل نوع من السم واحد من ثلاثة بروتينات من المذكورة أعلاه كركيزة eld ومن المعروف أن السموم من النوع F DB و6 يتسبب في انشطار سينابتويريفين SYnaptobrevin عند موقع معين؛ تتسبب السموم من النوع GEA انشطار SNAP2S عند موقع معين؛ ويتسبب النوع © في انشطار سينتاكسين syntaxin عند 5 موقع معين )1994 ,265:9153 .(Binz, T. et al., J.
Biol.
Chem.,
على وجه الخصوص؛ يعرف أن سم بتيلينيوم botulinum toxin من النوع Sas A للذويان في محلول مائي مخفف عند الرقم الهيدروجيني PH يتراوح من 6.8-4.0. ومن المعروف أن البروتين غير السام المستقر يتم فصله عن السم العصبي عند الرقم الهيدروجيني يبلغ نحو 7 أو أعلى؛ ونتيجة لذلك؛ يتم فقد السمية تدريجيًا. على وجه الخصوص؛ من المعروف أن السمية تنخفض عند زيادة الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة. يُعد سم بتيلينيوم مميت لجسم الإنسان حتى بكميات صغيرة وسهل إنتاجه بكميات كبيرة. وبالتالي؛ فهو يشكل 4 أسلحة إرهاب بيولوجية رئيسية مع عصيات الجمرة الخبيثة Bacillus anthracis « Yersinia pestis وفيروس الجدري smallpox virus ومع ذلك؛ اتضح أنه عندما يتم حقن سم بتيلينيوم من النوع A بجرعة لا تؤثر بشكل منهجي على جسم الإنسان؛ فإنه يمكن أن يتسبب في 0 شلل العضلات الموضعية في موقع الحقن. واستنادا إلى هذه الخاصية؛ يمكن استخدام سم بتيلينيوم من النوع A في مجموعة واسعة من التطبيقات؛ Loy في ذلك عوامل إزالة وينكل» وعوامل لعلاج شلل نصفي تشنجي وشلل دماغي؛ إلخ. وهكذا؛ زاد الطلب على سم بتيلينيوم من النوع A وتم إجراء دراسات حول طرق إنتاج سم البتيلينيوم وذلك لتلبية الطلب بنشاط. يتمثل المنتج التجاري النمطي الحالي في diag) BOTOX® سم عصبي نقي من سم بتيلينيوم من 5 النوع ظ) المتاح تجارياً من (Siig Allergan, Inc., USA قارورة 100 وحدة من BOTOX® من حوالي 5 نانوجرام من معقد سم عصبي نقي من سم بتيلينيوم من النوع A 0.5 مجم من مصل زلالي بشري human serum albumin و0.9 مجم من كلوريد الصوديوم sodium 6 وتتم إعادة تشكيله باستخدام محلول ملحي معقم دون مادة حافظة (حقن 0.9 7 من كلوريد الصوديوم). وتشمل المنتجات التجارية الأخرى Dysport® (معقد من سم بوتولينوم Clostridium 0 من النوع A والراصة الدموية؛ الذي يحتوي على لاكتوز lactose ومصل زلالي بشري في تركيبة صيدلانية تشتمل على سم بتيلينيوم ويتم sale] تشكيله باستخدام 70.9 من كلوريد الصوديوم قبل الاستخدام) المتاح Glad من Ipsen 1-10 ., UK, MyoBIoc® (محلول قابل للحقن pH) يبلغ نحو 5.6) يشتمل على سم بتيلينيوم من النوع 8 مصل زلالي بشري human serum albumin ؛ سكسينات صوديوم sodium succinate وكلوريد صوديوم sodium chloride 25 متاح تجاريًا من .Solstice Neurosciences, ١١6
يحتوي وسط زراعة «Clostridium botulinum والذي يُستخدم عادةً في طريقة لإنتاج سم بتيلينيوم كما هو مبين في براءة الاختراع الكورية رقم 1339349-10 على مكونات حيوانية. وهكذاء إذا وُجد حيوان Osan غير طبيعي يعرف delay يسبب اعتلال الدماغ الاسفنجي المُعدي في المكونات الحيوانية بسبب التلوث؛ فإنه يفرض مشاكل في عملية إنتاج سم بتيلينيوم. وتُعرف اعتلال الدماغ الاسفنجي المُعدي Transmissible spongiform encephalopathy (TSE) باسم اضطراب عصبي تنكسي يسبب تنكس خطير للخلايا العصبية؛ وتشتمل الأمثلة عليه على اعتلال الدماغ الإسفنجية البقري «(BSE) bovine spongiform encephalopathy راعوش Scrapie ؛ مرض كروتزفيلد جاكوب «(CJD) Creutzfeldt-Jakob disease متلازمة جيرستمان ستراوسلر ششينكر Gerstmann—Straussler-Scheinker syndrome « Kuru ys 0 « واعتلال الدماغ المنكي transmissible mink encephalopathy (gail « ومرض الهزال المزمن chronic wasting disease ؛ واعتلال الدماغ الإسفنجي في القطط feline spongiform encephalopathy ؛ وما إلى ذلك؛ والذي يؤثر على البشر والحيوانات. ورد بأن BSE يعبر حاجز الأنواع ويصيب حتى البشر. يتسم العامل الذي يسبب اعتلال الدماغ الاسفنجي الشعدي transmissible spongiform (TSE) encephalopathy 5 بأنه يتسم بأنه لا يولد مناعة وله فترة حضانة طويلة. من التحليل النسيجي المرضي لأنسجة المخ البقري المتضرر من مرض BSE يمكن ملاحظة أن الفجوات الإسفنجية الخاصة تم تشكيلها في الدماغ بسبب تلف الخلايا العصبية وترسب ألياف البروتين غير الطبيعية .abnormal protein fibers يرجع السبب في TSE إلى الجسيم البروتيني المعدي المعروفة باسم بريون غير الطبيعي. على 0 عكس الفيروسات العامة التي تتطلب حمض نوويء البريون غير الطبيعي عبارة عن جسيمات معدية تتكون من البروتين وحده دون الاحتواء على الحمض النووي. وفيما يتعلق بمرض TSE من المعروف أنه عندما يرتبط بريون غير الطبيعي (PrPsc) abnormal prion أي الذي يكون عبارة عن جسيم معدي بالبريون الطبيعي00600 (PrPe) normal يتم تحويله إلى بربون مسبب للأمراض والذي يتراكم بعد ذلك في الدماغ Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc ( brain .(Disord., 3:52-78, 1989 5
مرض كروتزفيلد جاكوب Creutzfeldt-Jakob disease عبارة عن اضطراب تنكسي عصبي neurodegenerative disorder من اعتلال الدماغ الاسفنجي المُعدي في الإنسان human (TSE) transmissible spongiform encephalopathy حيث يمثل العامل المُعدي بشكل واضح صورة متماثلة غير طبيعية من بروتين بريون. يمكن أن يتدهور الفرد المصاب بمرض كروتزفيلد جاكوب من الصحة المثالية الظاهرة إلى طفرات حركية في غضون ستة أشهر. وبالتالي؛
يمكن أن توجد مخاطر محتملة للحصول على مرض بواسطة بريون 00007 ؛ die مرض كروتزفيلد جاكوب Creutzfeldt-Jakob disease « من إعطاء تركيبة صيدلانية تحتوي على سم بيولوجي؛ Jie بتيلينيوم» تم الحصول عليه باستخدام منتجات مشتقة من الحيوانات. وهكذاء إذا تم تحضير تركيبة صيدلانية بواسطة sale عقار ناتجة باستخدام مكونات مشتقة من
0 الحيوان؛ يمكن أن يخضع المريض لخطر محتمل يكمن في استقبال مسببات الأمراض المختلفة أو العوامل المعدية. في ظل هذه الخلفية التقنية؛ وجد المخترعون الحاليون أنه عندما يتم استخدام وسيط يحتوي على ببتون مشتق من نبات خالي من اعتلال الدماغ الإسفنجى transmissible spongiform (TSE) encephalopathy المُعدي ومكونات معدنية؛ وناتج تحليل كازيين casein
hydrolysate 5 على سبيل (Jal ناتج تحليل كازيين casein hydrolysate معتمد - TSE لزراعة Clostridium botulinum لمنع مخاطر تطور المرض المشتق من بريون الموصوف مسبقاً؛ يمكن استبعاد مخاطر تطور المرض المشتق من بريون التي يمكن أن تحدث في الوسط المستخدم حاليًا (الوسط الأصلي)؛ ويمكن زيادة معدل نمو Clostridium botulinum في الوسط مقارنة بذلك في الوسط المستخدم حاليًا والوسط الذي يحتوي على ببتون مشتق من (ll وبالتالي
0 استكمال الاختراع الحالي. تكنولوجيا الفن السابق: يتم تطوير العديد من تركيبات الوسط المشتق من نبات لاستبدال تركيبات الوسط المشتق من حيوان التي قد تؤدي إلى حدوث مرض عند إعطاءها إلى جسم الإنسان. يكشف الطلب الدولي رقم: 12-01/05997 عن تركيبات أوساط تشمل ناتج تحلل كازين NZ-CaseTT casein hydrolysate وببتونات مختلفة مشتقة من الصويا لا50.
يصف الطلب gall رقم: 12-01/05997 زراعة مطثية كزازية tetanus toxin based on cthe culturing لكن يكون الوسط المذكور مناسب أيضًا لزراعة .Clostridium botulinum يتعلق موضوع الطلب الدولي رقم: 12-2006/042542 بإنتاج سم الكزاز على أساس زراعة عصية الكزاز tetanus toxin based on the culturing فى أوساط تخمير fermentation 5 06018 حيث تكون المادة المغذية البروتينية مشتقة من ببتون غير حيواني وغير صويا Non— SOY وبشار إلى ببتون غير الصويا Jie ببتون القمح Wheat peptone ؛ ببتون القطن cotton peptone وببتون البازلاء peptone 068. وعلى وجه التحديد؛ يتم استبدال الكازين بببتون غير صويا .non-soy peptone تصف براءة الاختراع الأوروبية رقم: 11-2133415 أوساط لزراعة مطثية حالة للنسج حيث يمكن 10 اختيار الببتون من مصدر نباتي Jie فول الصويا soy bean البازلاء pea )00 61/) و/أو القمح Wheat يتعلق الطلب الأمريكي رقم: 2005/069562 -1] بإنتاج سم البتيلينيوم في الأوساط الخالية من البروتين الحيواني Ally تشمل منتج صويا متحلل ماثيًا مثل ببتون الصويا. يتعلق موضوع -2009( 2009 FANG et al( PNAS, vol. 106, no. 32, 11 August ),)08-11 بإنتاج سم مطثية عسيرة في الأوساط الخالية تمامًا من البروتينات الحيوانية وبروتينات الألبان» أي؛ تشتمل تركيبات الأوساط على ببتون نباتي ولا تشتمل على كازين. وتتمثل مشكلة الفن السابق التي يمكن للاختراع التغلب عليها في أنه عند استخدام التركيبة كتركيبة وسط مشتق من نبات؛ فإنها لا تُظهر تأثير مرضي Lad يتعلق بمعدل زراعة Clostridium 70 أو كفاءة إنتاج السم. 0 الوصف العام للاختراع يهدف الاختراع الحالي إلى توفير تركيبة وسط جديدة تشتمل على ببتون مشتق من نبات لا تنطوي على مخاطر العدوى باعتلال الدماغ الاسفنجي المُعدي transmissible spongiform (TSE) encephalopathy وناتج تحلل لا يوجد به مخاطر عدوى (TSE وطريقة لإنتاج سم
البتيلينيوم» تعمل على تحسين إنتاج سم البتيلينيوم بواسطة زراعة Clostridium botulinum في تركيبة الوسط. لتحقيق الهدف المذكور أعلاه؛ يوفر الاختراع الحالي تركيبة وسط تزراعة Clostridium botulinum تشتمل تركيبة الوسط على : ببتون واحد على الأقل مشتق من نبات يُختار من
المجموعة التي تتكون من ناتج تحلل البازلاء» ناتج تحلل بذرة القطن وناتج تحلل جلوتين القمح» ناتج تحلل كازيين. كما يوفر الاختراع الحالي طريقة لإنتاج سم البتيلينيوم» تشتمل على الخطوات التالية: (أ) زراعة Clostridium: botulinum باستخدام تركيبة الوسط لإنتاج سم البتيلينيوم؛ و(ب) استخلاص سم البتيلينيوم الناتج.
0 عند استخدام الوسط طبقًا للاختراع الحالي لزراعة العصية الوشيقية ؛ يكون معدل نمو البكتيريا في الوسط أعلى من معدل النمو في كل من الأوساط في الاستخدام الحالي والوسط المحتوي على ببتون مشتق من نبات فقط. بالإضافة إلى ذلك؛ عند استخدام الوسط طبقًا للاختراع الحالي؛ يمكن إنتاج تركيز عالي من سم البتيلينيوم من خلال زراعة البكتيريا بطريقة آمنة. باستخدام تركيبة الوسط الجديدة المطلوب حمايتها Gls لزراعة Clostridium botulinum تشمل
5 ببتونات مشتقة من نبات تشمل ناتج تحلل بازلاء؛ ناتج تحلل بذور القطن وناتج تحلل جلوتين القمح بنسبة 1: 0.68- 14.46: 0.09- 9.87 بالوزن؛ وناتج تحلل «(lS يزيد معدل نمو البكتيريا بصورة واضحة ويمكن إنتاج تركيز عالي من سم البتيلينيوم. شرح مختصر للرسومات الشكل 1 يوضح نمو Clostridium botulinum في وسط خالي من بروتين حيواني animal
(APF) protein-free 0 يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات.
الشكل 2 يوضح نمو Clostridium botulinum في وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات» معادن minerals ؛ أحماض أمينية amino acids وفيتامينات vitamins
الشكل 3 يوضح نتائج فحص ما إذا تم تشكيل راسب بعد تعقيم وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات؛ (alae أحماض أمينية وفيتامينات. الشكل 4 يوضح نتائج فحص ما إذا تم تشكيل راسب بعد تعقيم وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن.
الشكل 5 يوضح نمو Clostridium botulinum في أوساط تم الحصول عليها بواسطة إضافة فيتامينات بالإضافة إلى ذلك؛ أحماض أمينية و "48080967 "BD بدون جلوكوز Glucose وا- جلوتامين L-Glutamine " إلى الأوساط لزراعة (Ly التى تحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن.
الشكل 6 يوضح نمو Clostridium botulinum في أوساط لزراعة (LS التي تحتوي على أنواع مختلفة من ببتونات مشتقة من نبات. الشكل 7 يوضح مخططات محيطية من FFD لتصفية المعادن» وتحقيق أفضل استجابة. الشكل 7 مخطط محيطي لوضعية مرتفعة؛ الشكل 7 ب عبارة عن مخطط Jame لوضعية متوسطة؛ الشكل 7 ج عبارة عن مخطط محيطي لوضعية منخفضة؛ والشكل 7د تحقيق أفضل استجابة لأقصى OD 5 الشكل 8 يوضح مخططات محيطية ل FFD لتصفية المعادن» وتحقيق أفضل استجابة. الشكل 8 عبارة عن مخطط محيطي لوضعية مرتفعة؛ الشكل 8 ب عبارة عن مخطط محيطي لوضعية متوسطة؛ الشكل 8 ج عبارة عن مخطط محيطي لوضعية منخفضة؛ والشكل 8د تحقيق أفضل استجابة لأقصى OD الشكل 9 يوضح مخططات محيطية لتصفية ببتون النباتي؛ وتحقيق أفضل استجابة. الشكل 9 عبارة عن مخطط محيطي لوضعية متوسطة ¢ الشكل وب عبارة عن مخطط محيطي لوضعية منخفضة؛ والشكل 9ج تحقيق أفضل استجابة لأقصى 00. الشكل 10 يوضح منحنى نمو Clostridium botulinum في وسط (JAA من بروتين حيواني (APF) animal protein-free المختار في النهاية؛ وتغير في تركيز السم.
— 0 1 — الشكل 11 يوضح مخطط محيطي لوسط مزرعة عند 24 ساعة بعد تطعيم Clostridium 0 في وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات الذي يتم إليه إضافة ناتج تحليل كازين. الشكل 11 عبارة عن مخطط Jase لإعدادات منخفضة؛ والشكل 11ب عبارة عن مخطط محيطى لإعدادات متوسطة.
الشكل 12 يوضح أفضل استجابة لوسط مزرعة عند 24 ساعة بعد تطعيم Clostridium A botulinum وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات يتم إليه إضافة ناتج تحليل كازين. إحصائي و(ب) مخطط لبرنامج إحصائي .
(ب). الشكل 5 1 عبارة عن مجموعة من مخططات توضح قيم نان معتمدة على الزمن تشير إلى نمو Clostridium botulinum في وسط مستخدم Lila وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات ووسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات وناتج تحلل كازين. الوصف التفصيلي:
5 في الاختراع الحالي» أوضحت تركيبة وسط خالي من بروتين حيواني animal protein-free (APF) معدل نمو متزايد ل Clostridium botulinum مقارنة بالوسط المستخدم حالياً (الوسط oa! ولكن تم مراعاة إضافة مكونات وسط تعمل أيضاً على زيادة معدل نمو البكتريا growth rate of the bacterium ولا ينطوي على مخاطر العدوى ب TSE أو ما إلى ذلك. dull تمت إضافة ناتج تحليل كازيين casein hydrolysate (على سبيل المثال؛ ناتج تحليل
0 كازبين casein hydrolysate معتمد- (TSE لم يُذكر أنه يسبب عدوى TSE إلى الوسط APF وتم فحص نمو البكتريا في الوسط APF كنتيجة لذلك؛ أوضح الوسط APF معدل نمو متزايد للبكتريا مقارنةً بالوسط المستخدم Ulla ووسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات بمفرده. بالتالي» إذا تم استخدام الوسط المذكور أعلاه؛ يمكن إنتاج تركيز مرتفع من سم البتيلينيوم بواسطة زراعة البكتريا بطريقة آمنة تحت ظروف خالية من TSE
كما استخدم في هذه الوثيقة؛ يشير المصطلح “ الوسط المستخدم حالياً أو الوسط الأصلي ” إلى وسط يشتمل على ناتج تحلل كازين casein hydrolysate ؛ مستخلص خميرة yeast extract ووسط ثيو جليكولات cthioglycollate التي تمثل مكونات وسط مشتق من الحيوان. يشير المصطلح “وسط خالي من بروتين حيواني (APF) animal protein-free إلى وسط لا
يحتوي على بروتين مشتق من الحيوان والذي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات -1801م derived peptones + معادن وجلوكوز. في أحد أمثلة الاختراع الحالي؛ لإنتاج سم البتيلينيوم بواسطة زراعة Clostridium botulinum تحت ظروف خالية من اعتلال الدماغ الاسفنجي المُعدي spongiform encephalopathy (TSE) تم تحضير وسط APF يشتمل على ببتون مشتق من نبات خالي من TSE ومقارنته
0 بالوسط المستخدم حالياً (يحتوي على مكون حيواني). كنتيجة (IN يمكن أن يتضح أن تركيبة وسط أمثل لزراعة Clostridium botulinum عبارة عن واحدة تشتمل على ببتون مشتق من نبات؛ معدن واحد على الأقل يُختار من المجموعة التي تتكون من 141142004 K2HPO4 (Na2HPO4 4 ومصدر كريون carbon source (على سبيل (JU جلوكوز)؛ ولوحظ النمو الأمثل للبكتريا في هذا الوسط. كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 13 تم تحديد أن
5 المحتوبات الأمثل لببتونات مشتقة من نبات plant-derived peptones في تركيبة الوسط المختارة في النهاية لزراعة Clostridium botulinum عبارة عن 5 [aa لتر من Hy-Pea™ [aa 10 7404 لتر من UltraPep™ Cotton و5 جم/ لتر من 460111 (HyPep™ وتشتمل المحتويات الأمثل للمعادن في تركيبة الوسط على 5.5 جم/ لتر من 211004»ا و3 جم/ لتر من .Na2HPO4
0 في مثال آخر من الاختراع الحالي؛ تم قياس تركيز نمط نمو Clostridium botulinum في وسط خالي من بروتين حيواني (APF) animal protein-free المختار في النهاية الذي يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن؛ وتركيز السم. كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 12 والشكل 10؛ بدأت قيمة OD في الزيادة بعد 12 ساعة من من زراعة Clostridium botulinum وعند 24 ساعة من الزراعة؛ أوضحت المزرعة 0054001070 يبلغ
5 3.5465 و0060000 lun 3.0695. ثم؛ انخفضت قيمة OD بالتدريج؛ وعند 48 ساعة
من الزراعة؛ أوضحت المزرعة 00540017 يبلغ 0.792 5 00600017 يبلغ 0.7224. بدأ تركيز السم في المادة الطافية لمزرعة Clostridium botulinum في الزيادة بعد 5 ساعات من الزراعة وأوضح قيمة نهائية تبلغ 31.41 ميكرو جرام/ مل. عندما تم قياس تركيز السم بعد تمزق البكترياء تم الاحتفاظ بالسم الذي بداً إنتاجه بعد 5 ساعات من الزراعة؛ واستمر تركيز السم في الزبادة؛ عند مستوى منتظم بعد 28 ساعة من الزراعة؛ وأوضح قيمة نهائية تبلغ 38.39 ميكرو جرام/ مل. في مثال AT من الاختراع الحالي؛ تم فحص نمو Clostridium botulinum في وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات plant-derived peptones وناتج تحلل كازين casein hydrolysate كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 17 والشكل 15؛ أوضح الوسط 0 المستخدم حالياً زيادة في معدل النمو بعد 24 ساعة من زراعة Clostridium botulinum وأوضح قيمة قمة 00540017 تبلغ 3.384 عند 39 ساعة من الزراعة. أوضح وسط يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات APF زيادة في معدل النمو بعد 18 ساعة من الزراعة وأوضح قيمة قمة 01054001 تبلغ 3.526 عند 28 ساعة من الزراعة. بالإضافة إلى cally أوضح وسط APF يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات + ناتج تحلل كازين 5 زيادة في معدل النمو بعد 18 ساعة من الزراعة وأوضح dad قمة 005400107 تبلغ 5.628 عند 6 ساعة من الزراعة. بالتالي» تمت مقارنة قيمة 010540017 عند 24 dels من الزراعة؛ أوضح الوسط المستخدم حالياً قيمة 0054001 تبلغ 1.2382« أوضح وسط APF يشتمل على ببتونات مشتقة من نبات قيمة 00540017 تبلغ 2.8595 وأوضح وسط APF يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات + ناتج تحلل كازين قيمة 010540017 تبلغ 5.244. بالتالي؛ بلغت قيمة 0 00 لوسط APF يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات + ناتج تحلل كازين عند 24 ساعة نحو 3 مرة أكبر من تلك الخاصة بالوسط المستخدم Ulla ونحو 1.83 مرة أكبر كم تلك الخاصة بالوسط APF الذي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات. وبلغت قيمة قمة OD لوسط APF يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات + ناتج تحلل كازين نحو 1.6 مرة أكبر من تلك الخاصة بالوسط APF الذي يحتوي على ببتونات مشتقة من plant-derived peptones «ily .
على النحو الموضح في الجدول 18( تم تحديد أن المحتويات الأمثل للببتونات المشتقة من نبات في تركيبة الوسط المختارة في النهاية لزراعة «Clostridium botulinum الذي يحتوي على ناتج Jas كازين casein خالي العدوى باعتلال الدماغ الاسفنجي الشعدي spongiform (TSE) encephalopathy تشتمل على 5 جم/ لتر من 7404 Hy-Pea™ و10 جم/ لتر من UltraPep™ Cotton و5 [an لتر من 460111 7م1708 وتشتمل المحتويات الأمثل
للمعادن في تركية الوسط على 5.5 جم/ لتر من KZHPO4 و3جم/ لتر من (Na2HPO4 وتشتمل محتويات نواتج تحلل كازين على 20 جم/ لتر من N=Z-Amine A و11 جم/ لتر من N-Z-Case TT sly على هذاء في أحد الجوانب»؛ يتعلق الاختراع الحالي بتركيبة وسط لزراعة Clostridium
botulinum 0 تشتمل تركيبة الوسط على : ببتون واحد على الأقل مشتق من نبات يُختار من المجموعة التي تتكون من ناتج تحلل البازلاء» ناتج تحلل بذرة القطن وناتج تحلل جلوتين القمح؛ و ناتج تحلل كازين .casein hydrolysate كما استخدم في هذه الوثيقة؛ يشير المصطلح “ ببتون مشتق من نبات ” إلى ببتون مستخلص من البازلاء؛ بذرة القطن أو جلوتين القمح. بشكل مفضل؛ يمكن أن يكون الببتون المشتق من نبات
se 5 عن 7404 HyPep™ 7504 HyPep™ i (UltraPep™ Cotton (Hy-Pea™ 4601N متاح تجارياً ولكنه لا يقتصر عليه؛ يشير المصطلح “ 'ناتج تحلل كازين” إلى مكون يتم استخلاصه من لبن. بشكل مفضل؛ يمكن أن يكون ناتج تحلل كازين عبارة عن ناتج تحلل كازين يحتوي على نحو 94.5-85.5 7 بالوزن من ببتيدات لها وزن جزيئي يبلغ 500 دارسي أو أقل؛ أو mils تحلل كازين يحتوي على نحو 70.25-63.56 7 بالوزن من ببتيدات لها وزن جزيئي يبلغ
0 500 دارسي أو أقل. بشكل مفضل أكثر» يمكن أن يكون ناتج تحلل كازين le عن -2-ل8 Amine A متاح تجارياً أو (N-Z-Case TT ولكنه لا يقتصر عليه. كما استخدم في هذه الوثيقة؛ يشير المصطلح " ببتون مشتق من نبات " أو " ناتج تحلل مشتق من نبات " إلى منتج يتم الحصول عليه بواسطة تحلل بروتين معزول من نبات. على سبيل المثال؛ يشير ببتون البازلاء (ناتج تحلل البازلاء) إلى منتج يتم الحصول عليه بواسطة تحلل بروتين إجمالي
— 1 4 —
معزول من البازلاء. بالإضافة إلى ذلك؛ يشير المصطلح © 'ناتج تحلل كازين" إلى منتج يتم
الحصول عليه بواسطة تحلل بروتين كازين .
يتم تحلل البروتين المشتق من نبات أو بروتين كازين بشكل مفضل بواسطة اهتضام جزئي. يتم
تحلل البروتين بشكل مفضل بواسطة المعالجة بحمض » المعالجة بقاعدة؛ المعالجة بإنزيم؛ المعالجة عند ضغط مرتفع؛ المعالجة بالحرارة أو المعالجة الفيزيائية. بشكل مفضل أكثر؛ يمكن أن يكون
الببتون المشتق من نبات أو ناتج تحلل كازين Ble casein عن واحد يتم الحصول عليه بواسطة
المعالجة بإنزيم . تتمثل المعالجة الفيزيائية؛ على سبيل المثتال؛ فى الطحن .
يكون الببتون المشتق من نبات أو ناتج تحلل كازين casein الذي يتم استخدامه في الاختراع
الحالي عبارة عن منتج تحلل جزئي من بروتين؛ عبارة عن خليط لا يشتمل فقط على أحماض
0 أمينية amino acids عبارة عن جزيئات فردية؛ ولكن أيضاً ببتيدات peptides مكونة من العديد إلى العديد من عشرات الأحماض الأمينية amino acids ؛ وجزبئات البروتين السليمة. في الاختراع الحالي؛ يمكن أن يبلغ محتوى الببتون المشتق من نبات في تركيبة الوسط 10-0.1 7# وزن/ حجم (100-1 جم/ لتر من)؛ بشكل مفضل 5-0.2 7 وزن/ حجم (50-2 جم/ لتر من)؛ بشكل مفضل أكثر 2-0.5 7 وزن/ [an 20-5( ana لتر).
5 في الاختراع الحالي» يمكن أن يكون محتوي ناتج تحلل الكازين في تركيبة الوسط Ble عن 0.22- 15.5 7 بالوزن / حجم (2.2- 155 جم/ لتر)؛ بشكل مفضل 0.44- 7.75 7 بالوزن/ fan 77.5 -4.4( ana لتر), بشكل مفضل أكثر 1.1- 3.1 7 بالوزن/ حجم (11-
1 جم/ لتر). في الاختراع الحالي» يمكن أن يكون محتوي ناتج تحلل الكازين عبارة عن ناتج تحلل يحتوي على
A 94 . 5 -85 5 20 بالوزن من ببتيدات لها U9 > يبلغ 500 دارسي أو أقل و/ أو ناتج تحلل يحتوي على 63.56- 70.25 7 بالوزن من ببتيدات لها وزن جزيئي يبلغ 500 دارسي أو أقل. في الاختراع الحالي ٠» يشتمل ناتج تحلل الكازين على كل من ناتج تحلل يحتوي على 85.5-
5 7 بالوزن من ببتيدات لها وزن جزيئي يبلغ 500 دارسي أو أقل و ناتج تحلل يحتوي على A 70.25 -63 .56 بالوزن من ببتيدات لها EC A) يبلغ 500 دارسي أو أقل ¢ Sag أن
تبلغ نسبة محتوى ناتج تحلل يحتوي على 85.5- 94.5 7 بالوزن من ببتيدات لها وزن جزيئي يبلغ 500 دارسي أو أقل و ناتج تحلل يحتوي على 63.56- 70.25 7 بالوزن من ببتيدات لها وزن جزيئي يبلغ 500 دارسي أو أقل 40-0.1: 0.01- 22 بالوزن؛ بشكل مفضل 10- 30: 16.5-5 بالوزن»؛ (Sing مفضل أكثر 24-16: 8.8- 13.2 بالوزن.
في الاختراع الحالي» تحتوي تركيبة الوسط على كل ناتج تحلل البازلاء» ناتج تحلل بذرة القطن وناتج تحلل جلوتين القمح» ويمكن أن تبلغ نسبة محتوى ناتج تحلل البازلاء» ناتج تحلل بذرة القطن وناتج تحلل جلوتين القمح في تركيبة الوسط 1: 43.62-0.24: 50.57-0.01 بالوزن؛ بشكل مفضل 9.87-0.09:14.46-0.68:1 بالوزن» بشكل مفضل أكثر 1.4-0.6:2.4-1.6:1 بالوزن.
0 في الاختراع الحالي» يمكن أن تحتوي تركيبة الوسط لزراعة Clostridium botulinum أيضاً على مصدر كربون ومعدن واحد على الأقل يُختار من المجموعة التي تتكون من داي بوتاسيوم فوسفات dipotassium phosphate (211004»ا)؛ gla صوديوم فوسفات disodium (Na2HPO4) phosphate و مونو بوتاسيوم فوسفات monopotassium phosphate (KH2PO4)
في هذه الوثيقة؛ تتضمن أمثلة مصدر الكريون carbon source ؛ على سبيل المثال لا الحصرء أحادي السكاريد monosaccharides على سبيل المثال؛ جلوكوز glucose ؛ فركتوز fructose الخ.)» gla سكاريد disaccharides على سبيل المثال؛ مالتوز maltose « سكروز sucrose ؛ الخ.؛ قليل السكاريد oligosaccharides عديد السكاريد Je polysaccharides سبيل المثال؛ دكسترين dextrin ؛ سيكلو دكسترين cyclodextrin «
0 شاء all كحولات سكرية sugar alcohols على سبيل المثال؛ زيليتول Xylitol ¢ سورييتول sorbitol ؛ إريثريتول erythritol » الخ.. في الاختراع الحالي؛ يمكن أن يبلغ محتوى المعدن في تركيبة الوسط 3.5-0.05 7 وزن/ حجم (35-0.5 جم/ لتر من)؛ بشكل مفضل 1.75-0.1 7 وزن/ حجم (17.5-1 جم/ لتر من)؛ وبشكل مفضل أكثر 0.7-0.25 7 وزن/ حجم (7-2.5 جم/ لتر من).
— 6 1 — في جانب آخرء يتعلق الاختراع الحالي بطريقة لإنتاج سم البتيلينيوم» تشتمل على الخطوات التالية: (أ) زراعة Clostridium botulinum باستخدام الموصوف مسبقاً تركيبة وسط لإنتاج سم البتيلينيوم؛ و(ب) استخلاص سم البتيلينيوم الناتج. في الاختراع الحالي» يمكن shal الزراعة تحت ظروف لا هوائية؛ ويمكن أن يُختار سم البتيلينيوم 5 .من المجموعة التي تتكون من سم البتيلينيوم من الأنواع 8 GF ED CB الأمثلة فيما يلي في هذه الوثيقة؛ يتم وصف الاختراع الحالي بمزيد من التفصيل بالإشارة إلى الأمثلة. يتضح لواحد من ذوي المهارة العادية في الفن أن هذه الأمثلة ترد لأغراض توضيحية فقط ولا تفسر على أنها مقيدة لنطاق الاختراع الحالي. Jal يتم تحديد النطاق الجوهري للاختراع الحالي 0 بواسطة عناصر الحماية المرفقة ومكافئاتها. المتال 1: زراعة Clostridium botulinum فى وسط يبتون مشتق من نبات 1-1: تركيبة من وسط يستخدم حالياً في الزراعة تم شراء الكواشف ومكونات الوسط المستخدم في الاختراع الحاني من Kerry Sigma (USA) (USA) .عمل «Gibco Life Technologies (USA) (BD Biosciences (USA) Quest (USA); 5 تم استخدام الوسط المستخدم حالياً الذي يشتمل على تركيبة تشتمل على 72 ناتج تحلل كازين [as 20) casein hydrolysate لتر «(oe 71 مستخلص خميرة )10 جم/ لتر (oe 71 جلوكوز glucose )10 جم/ لتر من) 70.55 وسط ثيوجليكولات thioglycollate medium )5 جم/ لتر من) لزراعة المزرعة والزراعة الرئيسي ل Clostridium botulinum لإنتاج سم 0 البتيلينيوم. يتكون 5 جم من وسط ثيوجليكولات لكل لتر من الوسط المستخدم حالياً من 2.52 جم من اهتضام إنزيمي لكازين casein ؛ 0.84 جم من مستخلص خميرة yeast extract « جم من دكستروز dextrose ؛ 0.085 جم من ثيوجليكولات صوديوم sodium thioglycollate » 0.42 جم من كلوريد الصوديوم NaCl ( Sodium chloride ) 0.085
— 7 1 — جم من -ا سيستين cysteine ¢ 0.00014 جم من رسازورين g Resazurin 0.125 جم من .bacteriological agar «sis lal 1 -2 . تركيبة وسط APF المستخدم فى الزراعة تم تحضير وسط مقارنة سالب بواسطة A) ناتج تحلل كازين» مستخلص خميرة yeast extract ووسط ثيو جليكولات thioglycollate من الوسط المستخدم حالياً (الوسط الأصلي) لزراعة «Clostridium botulinum وتم تحضير وسط خالي من بروتين حيواني animal protein— (APF) free بواسطة إضافة 4 مرشحات ببتون مشتق من نبات )7404 (Hy-Pea™ (HyPep™ 4601N 5 (HyPep™ 7504 UltraPep™ Cotton إلى وسط المقارنة السالب (الجدول 1( 0 الجدول 1 يوضح مكونات وسط APF يحتوي على الببتون المشتق من نبات لزراعة Clostridium botulinum مقارنة مع الوسط المستخدم حالياً. الجدول 1 (جم/ لتر) االمستخدم اسالبة APF حالياً كلوريد صوديوم 0١ 0.420 0.420 0.420 Sodium 0.42 (NaCl) chloride
— 8 1 — وسط ثبوجليكولات thioglycollate |5 medium 3-1: زراعة بذور Clostridium botulinum تم تطعيم 20 ميكرو لتر من the Korean Centers for ) Clostridium botulinum (Disease Control and Prevention Accession No.: 4-029-CBB-1S-001 في أنبوب زراعة يحتوي على 10 مل من وسط معقم له كل من التركيبات الموصوفة في الأمثلة 1-1 و2-1 وتم إخضاعه إلى مزرعة بذور أولية (مزرعة ثابتة) عند 35م لمدة 30-22 ساعة تحت ظروف لا هوائية. عند تأكيد نمو البكتريا في مزرعة البذور الأولية؛ تم تطعيم 8 مل من مزرعة البذور الأولية في زجاجة زراعة سعتها 1 لتر تحتوي على 800 مل من وسط معقم له نفس تركيبة الوسط وتم إخضاعها إلى مزرعة بذور ثانوية (مزرعة ثابتة) عند 35 م لمدة 15-8 ساعة تحت ظروف لا هوائية .anaerobic 0 4-1 : مزرعة رئيسية من Clostridium botulinum لإنتاج سم بتيلينيوم botulinum toxin بواسطة زراعة «Clostridium botulinum تم تأكيد الزراعة الرئيسي للبكتريا. على dag التحديد؛ تم تحضير 9.3 لتر من وسط به كل من التركيبات الموصوفة في aby f 1 _ 1 و 1 -2 ووضعهة في وسيلة حضانة سعتها 0 1 -لتر 3 يليه تعقيم الوسط. تم إمداد النيتروجين لخلق ظروف لا هوائية؛ وتم تأكيد نمو LK عند درجة حرارة تبلغ 35 م وسرعة تحريك تبلغ 50 دورة في الدقيقة.
— 9 1 — تم تطعيم مزرعة البذور الثانوية في dala) مزرعة سعتها 1 لتر في المثال 3-1 في وسيلة حضانة سعتها 10 لتر من خلال خط تطعيم متصل diay التطعيم الخاص بوسيلة الحضانة التي سعتها 10 لتر . تم زراعة Clostridium botulinum في وسيلة حضانة سعتها 10 لتر تحت ظروف 35 م و50 دورة في الدقيقة وتم رصد ظروف زراعة المجموعة وتسجيلها. عند زراعة البكتربا sad 100 ساعة أو أكثر؛ تم إنهاء المزرعة الرئيسية. تمت مقارنة نمو Clostridium botulinum فى وسط خالى من بروتين حيوانى animal (APF) protein-free تم تحضيره بواسطة إضافة 4 أنواع من مرشحات من ببتون Gide من نبات UltraPep™ (Hy-Pea™ 7404) plant-derived peptone candidates (HYPep™ 4601N 5 (HyPep™ 7504 (Cotton إلى وسط المقارنة السالب بذلك الخاص بالبكتريا في وسط المقارنة السالب الذي تم تحضيره بواسطة إزالة ناتج تحلل كازين؛ مستخلص خميرة yeast extract ووسط ثيو جليكولات thioglycollate من الوسط المستخدم حالياً (الوسط الأصلي) (الجدول 1). كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 1 والشكل 1؛ لم ينمو Clostridium 0 في وسط المقارنة السالب؛ ولكنه بدا في النمو في الوسط الأصلي (الوسط المستخدم 5 حالياً) عند 24 ساعة بعد تطعيم البكتريا Tag في النمو في الوسط الذي يحتوي على الببتون المشتق من نبات عند 30 ساعة بعد تطعيم البكتريا bacterium المثال 2: زراعة Clostridium botulinum فى وسط يحتوي على ببتون مشتق من cal معدن» حمض أمينى Amino Acid وفيتامين Vitamin ولأن نمو Clostridium botulinum في الوسط الذي تم تحضيره بواسطة إضافة 4 ببتونات 0 مشتقة من نبات plant-derived peptones فى المثال 1 كان Waid منه فى الوسط (hay) تم توفير محاليل له على النحو التالي. 1( لفحص تأثير وظيفة ثيو جليكولات thioglycollate لخلق ظروف لا هوائية» تمت إزالة ثيوجليكولات من الوسط الأصلي (الوسط المستخدم حالياً)؛ وتم تحليل التغير في معدل نمو البكتريا فى وسط خالى من ثيو جليكولات thioglycollate
— 0 2 — 2( ولأن معدل النمو الأبطأ يمكن أن يرجع إلى نقص مصدر النيتروجين؛ تمت زيادة تركيز الببتون في الوسط المستخدم لزراعة البكتريا ضعفين. 3) تمت مقارنة نمو Clostridium botulinum في وسط تم الحصول عليه بواسطة إضافة معدن؛ حمض أميني وفيتامين إلى الوسط الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات مع نمو Clostridium botulinum 5 فى وسط خالى من بروتين حيوانى animal protein—free .)2 (الجدول (Allergan) 8.012+716 في براءة الاختراع الأمريكية رقم aie تم الكشف (APF) الذي يحتوي على ببتونات «Clostridium botulinum الجدول 2 يوضح مكونات الوسط لزراعة أحماض أمينية وفيتامينات. (alae مشتقة من نبات؛ 2 الجدول
APF Lug (APF| طم APF| APF | مكونات الوسط الوسط دم المرشح zed yall] المرشح المرشح Allergan] حالياً كلوريد صوديوم 0.4 0.42 ]0.42 0.42 0.42 0.42 2 Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل كازين 20 20 20 casein hydrolysate مستخلص خميرة 10|yeast ]10 10 12 extract
— 2 1 —
وسط ثيوجليكولات 5 5 thioglycollate medium
i he نّ ب كن ة
re 1 PH كن ة
rer 1 - | ١ كك كفك ة
مرة
32.5 32. Soy ببتون
5 كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 2 والشكل 2؛ عند زراعة البكتريا في الوسط المستخدم حالياً بدون ثيو جليكولات cthioglycollate كان معدل نمو البكتريا في الوسط aie Uf في الوسط الذي يحتوي على ثيو جليكولات thioglycollate للإشارة إلى أن ثيو جليكولات يؤثر على معدل نمو البكتريا. عند زيادة تركيز الببتون في الوسط مرتين؛ لم تنمو البكتريا في الوسط. بينما فى الحالة التى تمت فيها إضافة مكونات معدنية؛ تمت إضافة أحماض أمينية وفيتامينات إلى
— 2 2 — الوسط الذي يحتوي على ببتون؛ تشابه معدل نمو البكتريا مع ذلك الموجود في الوسط المستخدم حالياً؛ ولكن تم تشكيل راسب بعد تعقيم الوسط. بالإضافة إلى ذلك؛ لوحظ أن معدل نمو البكتريا في وسط APF من Allergan’s مشابهاً لذلك الموجود في الوسط المستخدم حالياً. المثال 3 : إنتاج aly بواسطة تعقيم وسط يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات plant- (alas ¢ derived peptones 5 حمض أمينى وفيتامين فى المثال 2؛ لوحظ أن معدل نمو Clostridium botulinum فى الوسط يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات؛ معادن؛ أحماض أمينية وفيتامينات؛ من بين مرشحات الوسط APF 2 إلى 4 الموضحة في الجدول 2 مشابهاً لذلك الوارد في الوسط المستخدم حالياً. مع ذلك؛ تم فحص تشكيل راسب تم تحضيره بعد تعقيم الوسطه وبالتالي سببه (الجدول 3). 0 الجدول 3 يوضح مكونات وسط لزراعة (Clostridium botulinum الذي تم استخدامه في التعقيم ويحتوي على ببتونات مشتقة من نبات؛ معادن؛ أحماض أمينية وفيتامينات. الجدول 3 مكونات الوسط جم/ | الوسط (APF (APF| (APF| (APF| الوسط لتر المستخدم al الوسط | الوسط | المرشح) Wa المرشح) المرشح) المرشح) كلوريد صوديوم 0.5 0.5١ 0.5 0.5 0.5 0.5
Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل كازين ]20 20 casein hydrolysate
— 2 3 —
مستخلص خميرة 10 10 yeast extract
وسط ثيوجليكولات |5 5 thioglycollate medium
i 1 HH ب 0 0 ال الأ
10 10 10 10 10 UltraPep™
Cotton
BEER RE rer 1 5
10 10 10 10 10 HyPep™ 460
IN
IX IX IX Vitamin Kit (الإضافة
100X بعد التعقيم)
خليط حمض أميني IX IX IX (الإضافة
50 مرة بعد التعقيم) كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 3 والشكل 3( فقط في الحالة التي تتم فيها إضافة معادن إلى الوسط الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات؛ تم تشكيل مادة مترسبة بعد تعقيم
— 4 2 — الوسطء لتشير إلى أن السبب الرئيسي لتشكيل الراسب هو المعادن. يُعتقد أن هذا يرجع إلى أن مكونات المعدن تفاعلت مع بعضها البعض تحت ظروف درجة حرارة مرتفعة وضغط مرتفع أثناء تعقيم الوسط. المثال 4: تشكيل راسب بواسطة تعقيم وسط يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن لتحديد مكونات المعدن الموجودة في تشكيل راسب يسببه التعقيم كما تم تأكيده في المثال 3؛ تمت إضافة توليفات مختلفة من مكونات مختلفة إلى الأوساط؛ يليها التعقيم (الجدول 4). الجدول 4 يوضح مكونات أوساط زراعة (Clostridium botulinum التي تحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن؛ ونتائج تعقيم الأوساط. الجدول 4 مكونات dass أجم/ bag] 1 2 3 4 5 لتر االمستخدم ا(الوسط أ(الوسط ا(الوسط أ(الوسط Jas sll) حالياً المرشح المرشح المرشح المرشح pall] (APF| (APF| (APF| (APF| (APF جلوكوز 10 ]10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد صوديوم 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sodium chloride (NaCl)
— 5 2 — مستخلص خميرة ]10 101 yeast extract وسط ثيوجليكولات 5 5١ thioglycollate medium 20 20 20 20 20 20 Hy-Pea™ 7404 10 10 10 10 10 UltraPep™
Cotton 10 10 10 10 10 10 HyPep™ 7504 10 10 10 10 10 10 HyPep™ 4601N
HEE
BEEN
ا كنا كنا كا ا
I li 1 4 4 1 3 ) تابع الجدول 4
مكونات الوسط Of 7 8 9 10 11 12 (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح (APF (APF (APF (APF (APF (APF (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد صوديوم 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sodium chloride (NaCl تخلص خميرة yeast extract وسط ثيوجليكولات thioglycollate medium 20 20 20 20 20 20 20 Hy-Pea™ 7404 10 10 10 10 10 10 UltraPep™
Cotton
— 2 7 —
10 10 10 10 10 10 HyPep™
7504
10 10 10 10 10 10 10 HyPep™
4601N
10 10 10 1504
7120 كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 4 والشكل 4؛ من بين الأوساط التي تحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن ‘ يحتوي الوسط على K2HPO4 , MgSO47H20 ويبحتوي الوسط على Na2HPO4 3 MgSO47H20 الذي كون راسب بعد التعقيم. المثال 5: زراعة Clostridium botulinum تحت ظروف لم يتم فيها تشكيل راسب في وسط
APF 5 تم إجراء تجرية لتحديد ما إذا كان زراعة Clostridium botulinum ممكناً عند إضافة الفيتامين والحمض الأميني بالإضافة إلى ذلك إلى الوسط APF من المثال 4 الذي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن. بالإضافة إلى ذلك؛ تم إجراء تجرية لفحص ما إذا كان زراعة البكتريا مكناً في وسط خالي من ببتون مشتق من نبات ومعدن ويحتوي على فيتامينات؛ أحماض أمينية و/ 0 أو ™ "BD Recharge بدون جلوكوز glucose وا- Cat No. )" glutamine liga BD Bioscience ,670002( مكون وسط أساسه مستخلص خميرة Sa yeast extract من جلوكوز glucose وا- جلوتامين glutamine (الجدول 5).
— 2 8 —
الجدول 5 يوضح مكونات أوساط تم الحصول عليها بواسطة إضافة فيتامينات بالإضافة إلى ذلك؛ أحماض أمينية "BD Recharge™ g بدون جلوكوز glucose وا- جلوتامين" إلى الوسط لزراعة «Clostridium botulinum الذي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ومعادن؛ ومعدلات نمو البكتريا فى الوسط.
الجدول 5 مكونات الوسط | اجم/ الوسط 1 2 3 4 5 لتر المستخ (الوسط ا (الوسط ا(الوسط ا(الوسط ا(الوسط دم المرشح المرشح المرشح المرشح االمرشح حالياً (APF| (APF| (APF -طح) (APF| كلوريد صوديوم 0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 0.5 0.5 0.5 Sodium chloride (NaCl مستخلص sped |10 ]10 yeast extract وسط ثيوجليكولات 5١ 5 thioglycollate medium ثيوجليكولات صوديوم
— 2 9 — 20 20 20 20 20 20 Hy-Pea™ 7404 10 10 10 10 10 UltraPep™
Cotton
I ai 10 10 10 10 10 10 HyPep™ 4601N 1
BEEN
HEEEE
BEER سانا ا
IX IX IX IX Vitamin Kit 100X
IX IX IX IX خليط حمض أميني 0 مرة 45. جلوكوز W/o 42| -L glucose
L— جلوتامين
Glutamine 1 14 144
— 0 3 — التفاصيل ينمو في ينمو في اينمو في 24 24 24 ساعة ساعة اساعة تابع الجدول 5 مكونات الوسط 6 7 8 9 10 11 12 (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط (الوسط المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح (APF (APF (APF (APF (APF (APF (APF كلوريد صوديوم 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sodium chloride (NaCl تخلص خميرة yeast extract وسط ثيوجليكولات thioglycollate medium ثيوجليكولات 1 صوديوم
— 3 1 — 20 20 20 20 20 Hy-Pea™ 7404 10 10 10 10 UltraPep™
Cotton 10 10 10 10 10 HyPep™ 4601N
IX IX IX IX Vitamin Kit 100X
IX IX IX IX خليط حمض أميني مرة 50 45.42 45.42 2 45.42 جلوكوز 0 وا- glucose جلوتامين -ا
Glutamine 0 BE
— 2 3 — التفاصيل ينمو في ينمو في 24 48 de Lu de Lu كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 5 والشكل 5؛ فقط في الحالة التي اشتمل فيها الوسط على ببتونات مشتقة من نبات وتوليفة من اثنين أو أكثر من معادن داي بوتاسيوم فوسفات gla ((K2HPO4) dipotassium phosphate صوديوم فوسفات disodium phosphate (Na2HPO4) و مونو بوتاسيوم فوسفات (KH2PO4) monopotassium phosphate واحتوت أيضاً على فيتامين والحمض الأمينى؛ نمت Clostridium botulinum فى غضون 24 ساعة بعد تطعيم البكتريا. بالإضافة إلى ذلك؛ في الحالة التي كان فيها الوسط خالياً من ببتون مشتق من نبات ومعدن واحتوى على فيتامينات؛ أحماض أمينية و7 BD Recharge بدون جلوكوز glucose وا- جلوتامين glutamine البكتريا نمت فى غضون 48 ساعة بعد تطعيم البكتريا. (Lobia تشتمل 0 التركيبة المناسبة أكثر لوسط لزراعة Clostridium botulinum على ببتونات مشتقة من aly داي بوتاسيوم فوسفات ((K2ZHPO4) dipotassium phosphate داي صوديوم فوسفات (Na2ZHPO4) disodium phosphate و مونو بوتاسيوم فوسفات monopotassium ((KH2PO4)phosphate أحماض أمينية وفيتامينات. المثال 6: 5 ززراعة Clostridium botulinum فى أوساط تحتوي على ببتونات مختلفة مشتقة من نبات تم إجراء تجرية لفحص ما إذا كان زراعة Clostridium botulinum ممكناً عند إضافة توليفات مختلفة من ببتونات مشتقة من نبات إلى الوسط APF من Jal 5. الجدول 6 : يوضح مكونات الوسط لزراعة «Clostridium botulinum الذي يحتوي على ببتونات مختلفة 0 مشتقة من نبات؛ ونتائج فحص نمو البكتريا في الأوساط.
— 3 3 — الجدول 6 : مكونات الوسطأجم/ لتر |الوسط 1 2 3 4 5 المستخدم Jaws) ا(الوسط dawg) (الوسط Lug) حالياً المرشح المرشح المرشح المرشح االمرشح (APF| (APF| (APF| (APF| (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 صوديوم Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل ]20 20 كازين casein hydrolysate مستخلص 10 10 خميرة yeast extract وسط 5 ثيوجليكولات thioglycolla te medium
— 3 4 — 0.1] تيوجليكولات صوديوم 10 10 10 Hy-Pea™ 704 10 10 UltraPep™
Cotton 10 10 10 HyPep™ 7504 10 10 10 HyPep™ 4601N 10 MgSO4
TH20
IX IX IX IX Vitamin Kit 100X
IX Ix] x] Ix خليط حمض
X50 أميني
— 5 3 — 0 جلوكوز 45.42 glucose و-ا جلوتامين )0 1 4 1 1 1 تابع الجدول 6 مكونات الوسط |6 7 8 9 10 11 12 13 (الوسط |(الوسط ا(الوسط ا(الوسط |(الوسط ا(الوسط Jas gl) ا(الوسط المرشح المرشح |المرشح |المرشح |المرشح |المرشح |المرشح el] (APF | (APF| (APF| (APF| (APF | طح (APF| (APF| جلوكوز 10 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد صوديوم |0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل كازين casein hydrolysate وخا خميرة yeast extract
٠ 3 6 ٠ وسط ثيوجليكولات thioglycollat e medium ثيوجليكولات 0.1 صوديوم 10 10 Hy-Pea™ 7404 10 10 10 UltraPep™
Cotton 10 10 10 HyPep™ 7504 10 10 10 HyPep™ 4601N
MgSO4
TH20
IX IX IX IX IX IX IX IX| Vitamin Kit 100X
— 7 3 — خليط حمض IX IX IX IX IX IX IX IX| أميني X50 0 جلوكوز 2 45.4 glucose و-ا 2 جلوتامين كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 6 والشكل 6؛ حتى عند إضافة واحد فقط أو اثنين من ال 4 ببتونات المشتقة من نبات إلى الوسط؛ كان زراعة Clostridium botulinum ممكناً. بمراعاة نتائج الأمثلة 5 و6؛ يمكن أن يتضح أن ببتون واحد على الأقل مشتق من نبات ينبغي أن يوجد فى الوسط وأن الببتون المشتق من نبات لا يمكن استبداله ب "460181987 "BD بدون جلوكوز glucose وا- جلوتامين (Cat No. 670002, BD Bioscience) " glutamine مكون وسط أساسه مستخلص خميرة yeast extract - خالى من جلوكوز 9100056 وا- جلوتامين glutamine المثال 7: تجرية لاختيار اثنين من 3 معادن موجودة في الوسط فى الأمثلة 1 إلى 7 تم تحديد أن تركيبة الوسط APF المستخدمة لزراعة Clostridium botulinum 0 تشتمل على جلوكوز؛ كلوريد صوديوم (NaCl) Sodium chloride 4 ببتونات مشتقة من نبات؛ 3 (alae الأحماض الأمينية؛ وفيتامينات. من بين مكونات الوسط هذه؛ تمت ally) مكونات الوسط التي لا تتسم بأي تأثير كبير على نمو البكتريا لتقليل عدد مكونات الوسط. بالتالي؛ تم الحكم بأن الأحماض الأمينية والفيتامينات ليس لها تأثير يذكر على نمو Clostridium botulinum وبموجب هذا الحكم؛ تمت إزالة الأحماض الأمينية والفيتامينات من 5 مكونات الوسط. بالإضافة إلى ذلك؛ لاختيار 2 من 3 معادن» تم زراعة البكتريا باستخدام تركيبات الوسط الموضحة في الجدول 3 وتم قياس قيم (540 نانو متر و600 نانو متر) عند 24 deli و5 4 ساعة يعد تطعيم البكتريا ومقارنته .
— 8 3 — الجدول 7 يوضح تركيبات الأوساط الناتجة من الاختيار في المرحلة الأولى للمعادن ونمو Clostridium botulinum في الأوساط. الجدول 7 مكونات جم/ لتر bull] |1 2 3 4 5 الوسط المستخدم ا(الوسط ا(الوسط Lust) ا(الوسط ا (الوسط حالياً المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح (APF| (APF| (APF| (APF| (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 50 صوديوم Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل ]20 20 كازين مستخلص 10 10 yeast extract وسط 5 5 ثيوجليكولات thioglycoll ate medium 10 10 10 10 10 10 Hy-
Pea™ 7404 10 10 10 10 10 Ultra
Pep™
Cotton 10 10 10 10 10 101 HyPep™ 7504 10 10 10 10 10 101 HyPep™ 4601N
HEE ه[ذَناً و١[ لانن
DEERE قينا مك 5١ Na2HPO 4 4.218 3.226 06 - -١ 0.942] مزرعة لمدة ا540نانو 0.024] 7 ساعة أمتر 4
OD
3.593] 2.691 3.832 = -١ 0.780 600 نانو متر 6 0.020
مزرعة -١ 2.459] 5540 sad = 4.716 ]5.220 3.502 8 ساعة أمتر 0.014 ]0.019 نان 600 2.057 - = 2 4.268 2.989 نانو متر 0.015 0.018 تابع الجدول 7 مكونات الوسط |6 (الوسط 7 (الوسط 8 (الوسط 9 (الوسط 10 11 المرشح المرشح المرشح المرشح (الوسط (الوسط (APF (APF (APF (APF المرشح المرشح (APF (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 صوديوم Sodium chloride (NaCl ناتج تحليل كازين وخا خميرة yeast extract
وسط ثيوجليكولات thioglycollat e medium Hy-Pea™ ]10 10 10 10 10 10 7404 Ultra Pep ™ |10 10 10 10 10 10 Cotton HyPep™ 10 10 10 10 10 10 7504 HyPep™ 10 10 10 10 10 10 4601N ممتعة 5 ا ا يك كا ذا EEE مزرعة لمدة 3.214 ]4.964 |3.991 |3.951 3.938 3.594 4 ساعة OD
3.036١ 3.335 3.341 3.351 4.304] 2.680 مزرعة لمدة 5.460 2.06 2.603 5.726 5.6822 5.434 8 ساعة OD
— 4 2 — 4.459) 4.647) 4.6858 2.020 1.587] 4.480
كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 7؛ عند 24 ساعة بعد تطعيم البكترياء أوضح
الوسط المستخدم OD das Ula (540 نانو متر) تبلغ 0.942 وأوضح الوسط APF الذي
يحتوي على
داي بوتاسيوم فوسفات (K2HPO4) dipotassium phosphate و داي صوديوم فوسفات (Na2HPO4) disodium phosphate 5 أعلى قمية ل OD (540 نانو متر) تبلغ 4.964 من
بين وسط خالي من بروتين حيواني (APF) animal protein-free بالإضافة إلى ذلك؛ عند
8 ساعة بعد تطعيم (Lyall أوضح الوسط APF الذي يحتوي على KH2PO4 و Na2HPO4
. والنمو البكتيري النشط OD ل das le
في الوقت نفسه؛ على النحو الموضح في الشكل 7 تم رسم مخططات محيطية لداي بوتاسيوم
0 فوسفات ((KZHPO4) dipotassium phosphate داي صوديوم فوسفات disodium (Na2HPO4) phosphate توضح تأثيرات رئيسية كبيرة. كنتيجة لذلك؛ عند زيادة تركيزات (Na2HPO4 3 K2HPO4 زادت قيمة .OD وأوضح el Clostridium botulinum نمو عند إضافة المعادن إلى الوسط عند تركيزات تبلغ =KH2PO4 0 جم/ لتر =K2HPO4 (1s [o> 5.5 لتر من ؛ و [o> 5= Na2HPO4 لتر .
في الوقت cans لتأكيد نتائج المزرعة البكتيرية وفقاً لمزيد من الإضافة الدقيقة للمعادن» تم shal تجرية عند المرحلة الثانية باستخدام طريقة سطح الاستجابة. ولأن تركيبة الوسط لا يمكن أن تتخذ قيمة سالبة؛ تم تخطيط التجرية باستخدام تصميم مركب مركزي موجه central composite (CCF) faced وإجرائها بواسطة زراعة البكتريا في تركيبات الوسط الموضحة في الجدول 8. ثم؛ تم إقران النتائج التجريبية مع نتائج التي تم إجرائها مسبقاً وإخضاعها إلى تحليل إحصائي.
0 الجدول 8 يوضح تركيبات أوساط تم الحصول عليها بواسطة الاختيار في المرحلة الثانية للمعادن ونمو Clostridium botulinum فى الأوساط.
— 3 4 — الجدول 8 مكونات الوسط fas لتر 1١ (الوسط 2 (الوسط 3 (الوسط |4 (الوسط المرشح المرشح المرشح المرشح (APF (APF (APF (APF 0 5 0 5 0 0.5 0.5 كلوريد صوديوم
Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل كازين 20 casein hydrolysate مستخلص خميرة yeast extract وسط ثيوجليكولات 5 thioglycollate medium ا 7 ا ا ١ ١ 'ً ١ ا j ] ا j ] 7 ّ 1
— 4 4 — Es OD 24 ساعة u540 |4.408 3.587 2.233 4.639 متر 0 نانو 3.836 ]3.086 ]1.896 4.068 متر OD 48 ساعة 0كنانو 5.021 ]5.760 ا4.359 3.594 متر £1600 4.284 ]4.925 3.6952 3.049 متر تابع الجدول 8 مكونات الوسط 5 (الوسط 6 (الوسط 7 (الوسط 8 (الوسط 9 (الوسط الوسط المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المستخدم (APF (APF (APF (APF (APF حالياً كلوريد صوديوم 50 50 50 0.5 0.5 Sodium chloride (NaCl) ناتج تحليل كازين 20 casein hydrolysate
مستخلص خميرة 10 TT وسط ثيوجليكولات thioglycollate medium — 10 10 10 10 UltraPep™
TT
— — - - - - - ce i يوم من سن 0
— 6 4 — تم رسم مخططات محيطية واستخدامها للمقارنة. على النحو الموضح في الأشكال 8 زادت dad OD بانخفاض تركيز 4012004ا. عند مقارنة الظروف (Jia) كانت النتائج مختلفة عن نتائج FFD يسبب تأثير الانحناء؛ وكانت K2HPO4 dard متشابهة؛ ولكن تغيرت قيمة Na2HPO4 من 5 جم/ لتر إلى 3.1313 جم/ لتر. بالتالي؛ تم التأكيد بأن الظروف المعدنية الأمثل للوسط بواسطة التحليل الإحصائي هي 5.5 [aa لتر من K2ZHPO4 و3 جم/ لتر من Na2HPO4 المتال 8: تجرية لاختيار ببتونات مشتقة من نبات موجودة في وسط على النحو الموضح في الجداول 9 و10 تم إقران ببتونات مشتقة من نبات وفقاً لتصميم dad وتم فحص نمو Clostridium botulinum في وسط يحتوي على الببتونات المقترنة المشتقة من نبات. 0 الجدول 9 يوضح تركيبات أوساط تم الحصول عليها بواسطة الاختيار في المرحلة الأولى لببتونات مشتقة من نبات ونمو Clostridium botulinum باستخدام الأوساط. الجدول 9 مكونات جم/ لتر 1١ 2 3 4 5 الوسط (الوسط أ(الوسط ١(الوسط Lush aud) المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح (APF| (APF| (APF| (APF| (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ]0.5 صوديوم Sodium chloride
HERES
ناتج تحليل 20 كازين casein 10] مستخلص yeast extract وسط ثيوجليكولات thioglycoll ate medium 5 10 5 10| Hy-Pea™ 7404 5 5 5 10 UltraPep ™ Cotton 5 5 10 5 10| HyPep™ 7504 10 5 5 5 101 HyPep™ 4601N
HERES
3.317| 3.305| 3.345 2.440 3.541١ نان 24 0كنانو ساعة متر 00 نانو |3.058 |2.066 |2.868 2.831 2.853 متر OD 48 40كنانو ا0.811 |0.935 |0.731 ا0.799 1.400 ساعة متر 0 نانو ]0.714 0.795 0.647 0.694 ]1.199 متر تابع الجدول 9 «bse 6 7 8 9 10 11 الوسط الوسط (الوسط ا(الوسط |(الوسط Joust) ا(الوسط ا(الوسط االمستخدم المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح احالياً (APF| (APF| (APF| (APF| (APF| (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد 0.5 0.5 {0.5 ]0.5 0.5 0.5 صوديوم Sodium chloride (NaCl)
— 4 9 — ناتج تحليل 20 كازين casein مستخلص yeast extract وسط 5 ثيوجليكولات thioglycoll ate medium 10 6.667 6.667 Hy-
Pea™ 7404 10 206.667 6.667 UltraPep ™ Cotton 10 20 6.667 10| HyPep™ 7504 10 6.667 101 HyPep™ 4601N
BB
Na2HPO 3 3 4 OD 24 ]2.852 |3.695 2.772 |2.353 ]1.688 4.842 2.2391 ساعة 3.183 2.376 2.014 ]1.419 4.245 1.893 OD 48 ]0.777 1.660 1.090 1.5810 1.402 2.093 3.341 ساعة 0.680 ]1.403 ]0.929 ]1.548 1.210 1.764 2.812 الجدول 10 يوضح تركيبات أوساط تم الحصول عليها بواسطة الاختيار في المرحلة الثانية لببتونات مشتقة من نبات ونمو Clostridium botulinum باستخدام الأوساط. الجدول 10 مكونات الوسط اجم/ لتر 1 2 3 4 5 6 (الوسط ا(الوسط |(الوسط ا(الوسط | Joist) ا(الوسط المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح المرشح (APF| (APF| (APF| (APF| (APF| (APF BY YEN 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد 0.5 0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 0.5 صوديوم
-5 1 —
Sodium chloride (NaCl) 201 ناتج تحليل كازين casein hydrolysate 10 مستخلص yeast خميرة extract وسط ثيوجليكولات thioglycollat e medium 10 10 Hy-Pea™ 7404 10|6.667 10 101 UltraPep™
Cotton 10 10] HyPep™ 7504 10 6.667 10] HyPep™ 4601N
-2 5 — ee اا سجن كد كا اا كا كا كاك OD 24 ساعةا40كنانو |1.289(3.272(2.581(2.349(3.640(3.425 مولار 2.244١ 2.029 3.159 2.969 L600 1.096 1.096 مولار OD 48 ساعةا40كنانو |1.148]1.501{0.961|1.633|0.836|0.769 مولار 0 نانو (0.675ا1.42010.732 0.854 1.270 0.982 مولار تابع الجدول 10 مكونات الوسط |7 8 9 10 11 12 13 الوسط (الوسط |(الوسط |(الوسط |(الوسط |(الوسط |(الوسط | Jaws gl) |المستخدم المرشح |المرشح ell] pall |المرشح |المرشح |المرشح احالياً (APF| (APF| (APF| (APF| (APF| (APF| (APF جلوكوز 10 10 10 10 10 10 10 10 glucose كلوريد صوديوم ]0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 ]0.5 0.5
Sodium chloride (NaCl)
— 5 3 — ناتج تحليل 20 كازين casein hydrolysate مستخلص خميرة yeast extract وسط ثيوجليكولات thioglycollate medium 10 10] 0 20 Hy-Pea™ 7404 10 10] 0 UltraPep™
Cotton 10 10 10| 6 HyPep™ 7 7504 10 10 10 6.66 20 HyPep™ 7 46011] 2.208 4.80 5.23| 5.37 3.45 1.25 0.77] 3.51] ساعة 24 OD 9 5 6 7 7 6 4
-4 5 — 3.03 |0.64 |1.09 2.95 ,4.68 4.53 4.241 1.863 2 9 8 0 9 4 6 OD 48 ساعة 0.80 ]0.88 ]1.27 |0.96 |1.98 ا1.99 2.01 3.1685 3 0 8 2 6 4 0 9 |0.74 |1.12 |0.81 1.70 |1.71 1.71 2.708 8 4 4 8 8 0 7 كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الأشكال 9؛ تم رسم مخططات محيطية واستخدامها للتحليل. تم تحديد أن 7504 HyPep™ المناظر للمكون © له أدنى تأثير على نمو Clostridium botulinum بناءً على هذا التحديد؛ تم استبعاد 7504 HYPep™ من مكونات الوسط. ختاماً»؛ تم تحديد أن تركيبة الببتونات المشتقة من نبات المختارة في النهاية الموجودة في الوسط تشتمل على 5 [aa لتر من 7504 "1/0801 10 جم/ لتر من UltraPep™ Cotton و5 fan لتر من 460111 7م11/06. المثال 9: زراعة Clostridium botulinum في وسط يحتوي أو لا يحتوي على كلوريد صوديوم (NaCl) Sodium chloride اشتملت تركيبات الوسط المستخدمة في الأمثلة 1 إلى 8 على كميات صغيرة (0.5 جم/ لتر) من .NaCl لفحص نمو Clostridium botulinum وفقاً لتغير 0 تركيز «NaCl تم تعديل محتوى NaCl في الوسط إلى نطاق يتراوح من 0 إلى 1 جم/ لتر من؛ يليه زراعة البكتريا في الوسط. الجدول 11 يوضح مكونات أوساط تحتوي على -ا80ل لزراعة Clostridium botulinum ونمو Clostridium botulinum في الأوساط. الجدول 11 مكونات الوسط faa 11 (الوسط أ2 (الوسط 37 (الوسط 4 (الوسط لتر المرشح المرشح. المرشح . المرشح (APF (APF (APF (APF
— 5 5 — 0 . 5 0 . 5 كلوريد صوديوم
Sodium chloride ( NaCl )
Hy-Pea™ 7404 10 10 10 10 UltraPep ™
Cotton 5 5 5 5 5 HyPep™ 4601N 2.148 2.151 2.154 2.166] 540 ساعة 24 OD نانو مولار 1.922 1.922 1.923 1.940] 600 نانو مولار 11 تابع الجدول
— 6 5 — مكونات Jaws 57 (الوسط 6 (الوسط |7 (الوسط /8 (الوسط 9 (الوسط المرشح المرشح المرشح . المرشح . المرشح (APF| (APF| (APF| (APF| (APF كلوريد صوديوم 0.5 0.5 1 1 1 Sodium chloride (NaCl) Hy-Pea™ 5 7404 UltraPep ™ 10 10 10 10 10 Cotton HyPep™ 5 5 5 5 5 4601N dels 24 OD 2.115 2.120 2.145 2.147 2.140 1.892 1.896 1.919 1.922 1.917 كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الشكل 11( لم يوجد أي اختلاف في نمو البكتريا سواء اشتمل الوسط على NaCl أو لم يشتمل عليه. بالتالي؛ تم استبعاد NaCl من مكونات وسط APF النهائية.
— 7 5 — المثال 10: قياس نمو نمط Clostridium botulinum في وسط APF المختار في النهاية وتركيز السم تم تطعيم Clostridium botulinum في وسط مزرعة Clostridium botulinum المختار في النهايية )10 جم/ لتر من جلوكوز» 5 جم/ لتر من 7404 (Hy-Pea™ 10 جم/ لتر من UltraPep™ Cotton 5 5 جم/ لتر من (HyPep™ 4601IN 5.5 جم/ لتر من 211004ما و3 جم/ لتر من (Na2HPO4 الذي تم تحديده بناءً على نتائج الأمثلة 1 إلى 9؛ ثم تم قياس نمط نمو البكتريا وتركيز السم. الجدول 12 يوضح OD dad المعتمدة على الزمن وتركيز السم ل Clostridium botulinum الذي تم إنمائه في وسط APF المختار في النهاية. 0 الجدول 12 المزرعة المادة الطافية بعد تمزق السلالة “ل ]540 نانو 600 نانو > (ساعة) (ميكرو جرام/ مل) ا(ميكرو جرام/ مل) Ysa أمولار ow | | > ] | | . BE 0 oo oo | | | ’ i ’ | | | } ) BE ow | | i | | ’ or 0 i | ’ ” 1.6252 1.4484 10.22 2.3435 2.0215 18.15
— 8 5 — 2.777 ]2.4015 29.26 J } j | J . ’ ) J ’ ’ | ’ 3.5465 3.0695 31.73 i | ’ j | © ’ | - 2 742 21.20 38.00 0.792 ]0.7224 ]31.41 38.39 كنتيجة لذلك؛ على النحو الموضح في الجدول 12 والشكل 10( بدأت قيمة OD في الزيادة بعد 2 ساعة من زراعة (Clostridium botulinum وعند 24 ساعة من الزراعة» أوضحت المزرعة 0 تبلغ 3.5465 و 000600007 تبلغ 3.0695. ثم؛ انخفضت OD dad بالتدريج؛ وعند 48 ساعة من cel) أوضحت المزرعة 00540017 تبلغ 0.792 5 OD600NM تبلغ 5 0.7224. بدأ تركيز السم في المادة الطافية من Clostridium botulinum started في الزيادة بعد 24 ساعة من الزراعة وأوضح قيمة نهائية تبلغ 31.41 ميكرو جرام/ مل. عند قياس تركيز السم بعد تمزق البكتربا؛ تم الاحتفاظ بالسم الذي بدأ إنتاجه بعد 5 ساعات من الزراعة؛ واستمر تركيز السم في الزيادة؛ عند مستوى منتظم بعد 28 ساعة من الزراعة؛ وأوضح قيمة نهائية تبلغ 9 ميكرو جرام/ مل. (lid يتم تلخيص تركيبة APF المختار في النهائية (وسط خالي من 0 بروتين حيواني) التي تم تحديدها ply على نتائج الأمثلة 1 إلى 10 في الجدول 13. مصدر نيتروجين Hy-Pea™ 7404 | source of 10007 (ببتون نبات 2 ض 7 HyPep™ 46011
— 9 5 — معدن K2HPO4 Na2HPO4 المثال 11: اختيار تركيبة وسط يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات وناتج تحلل كازين casein hydrolysate أوضحت تركيبة وسط APF التي تم تحديدها بناءً على نتائج الأمثلة 1 إلى 10 معدل نمو متزايد للبكتريا مقارنة ب الوسط المستخدم حالياً ( الوسط of a) ولكن أيضاً تمت مراعاة إضافة مكون وسط يعمل أيضاً على زيادة معدل نمو البكتريا growth rate of the bacterium مع عدم وجود مخاطر عدوى ب TSE أو ما شابه ذلك. كنتيجة لذلك؛ تمت إضافة ناتج تحلل كازين Ma من TSE (على سبيل المثال؛ ناتج تحلل كازين معتمد- (TSE إلى الوسط APF وتم فحص نمو البكتريا في الوسط. تمت إضافة 1 أو 2 من نواتج تحلل كازين خالي من TSE إلى الوسط APF الذي تم تحديده بناءً 0 على mm الأمثلة 1 إلى 10. على وجه التحديدء تمت زراعة Clostridium botulinum في الوسط A (تم الحصول عليه بواسطة إضافة ناتج تحلل الكازين N=Z-Amine A إلى تركيبة الوسط الذي يحتوي على الببتونات المشتقة من نبات )؛ أو الوسط 8(الذي تم الحصول عليه بواسطة إضافة N-Z- Case TT إلى تركيبة الوسط )؛ أو الوسط © (تم الحصول عليه بواسطة إضافة حمض أميني 5 إلى تركيبة الوسط)؛ أو الوسط D (تم الحصول عليه بواسطة إضافة تريبتون إلى تركيبة الوسط ) لمدة 24 ساعة و48 ساعة؛ وتم فحص نمو البكتريا بواسطة قياس قيم OD )540 نانو مترء 0 نانو متر) أثناء المزرعة (الجدول 14). بالإضافة إلى ذلك؛ تم إخضاع نتائج القياس إلى تحليل إحصائي باستخدام برنامج إحصائص؛ بذلك اختيار تركيبة وسط توضح أعلى نمو عند 24 ساعة من مزرعة البكتريا. يوضح الجدول 14 :
نتائج النموذج المعتمد على الزمن ل Clostridium botulinum في تركيبات الوسط يحتوي على نواتج تحلل الكازين بالإضافة إلى الببتونات المشتقة من نبات. 14 الجدول (حمض كاز 8 Al الترتيب اترتيب
IEE
1
I
IE سد BE IE I I كك IE EE
I
_ 1 6 _ 0.666666667| 0.666656667| 1| 11 |0.66666666 7 BE 0.666666667| 0.666666667 3 5 |0.666666667 0.66666666 7 0.666666667 14 |0.66666666 7 تابع الجدول 14 القياسي . 0 نانو 600 نانو ]540 نانو ]600 نانو متر متر - أمتر - أمتر vol 0 0 4.0620 2.3385 2.0715 dso 0 00 0 3 4.1540 1.2785 1.1525 3 0 0 700 4.1140 1.7340 |1.5510 4 0-20 04م 3.8620 |1.1890 ]1.0710 SC 0 5 4.540 .1.5360 1.3720 EEE 4.2900 ]2.0780 1.8460 7 ل 7200 4.0700 ]1.2785 1.1475
— 2 6 — BEE 4.8410 4.1700 1.5390 |1.3735 EEE 4.8060 ]4.1370 1.2260 |1.1075 .5690 ]3.9220 ]1.3800 |1.2375 qu 5.3350 4.5990 ]1 5385 |1.3880 12 0-66 4.9790 4.2380 1.3570 ]1.2035 7 13 0-66 4.9020 |4.2160 ]1.7280 ]1.5575 7 14 0-6 4.9920 4.2820 1.5305 ]1.3670 7 4.8500 4.1860 1.4845 !1.3250 في هذه الأثناء؛ كما تم توضيحه في الشكل 11( لإيجاد ظروف توضح أعلى نمو عند 24 ساعة من مزرعة البكترياء تم رسم مخططات خليط محيطية لأقل إعدادات ارتباط وظروف إعداد متوسطة. كنتيجة لذلك؛ يمكن أن يتضح أن Clostridium botulinum أوضح أعلى نمو في منطقة يوجد فيها الوسط A والوسط 8 ويوضح الوسط © والوسط 0 قيمة تبلغ صفر. بالإضافة إلى ذلك؛ كما تم توضيحه في الشكل 12؛ تم وصف ظروف توضح أعلى نمو للبكتريا؛ وكنتيجة sll اتضح أن البكتريا أوضحت أعلى نمو تحت الظروف التالية : =A 80.8725 = 1.1275( ©- 0« و0- 315.0 على هذه النتائج, تم في النهاية اختيار الوسط A (N-Z- Amine A) والوسط (N-Z-Case TT) 8 من بين 4 مكونات وسط. المثال 12: اختيار نهائي لتركيز وسط يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات وناتج تحليل كازين
— 3 6 — لتحديد تركيبة الوسط JY لاثنين من مكونات وسط ناتج تحلل كازين casein hydrolysate المختارة في المثال 11؛ تك إجراء تجرية سطح استجابة باستخدام تصميم CCF (مركب مركزي موجه). الجدول 15 يوضح نتائج تحليل النموذج المعتمد على الزمن Clostridium botulinum في تركيبة الوسط الذي يحتوي على الببتونات المشتقة من نبات ونواتج تحلل الكازين باستخدام طريقة سطح استجابة CCF الجدول 15 القياسي الدورة 540١ N-Z-)| NZ-AMINE 8: نانوا600 نانو |540 نانو |600 CASE (A) متر متر متر نانو متر (TT 1 3 3.4850 |1.211]1.4095|2.9430 0 2 2 2 2.088(2.3800(4.4030(5.1410 0 3 2 9.10 1.1411.35904.4020 5 4 7 22 2 17715|4.5560|(5.2690 1.542 0 5 11 1 4.2000 |0.607|0.6885|3.5680 5
-4 6 — 10 2 1 0 4.6280 1.7055 1.493 0 EEE 0 ]33.3190 752.8|2370 13 11 2 12905|4.4140(5.1380 ]1.133 0 2 11 1 1.338]1.5585|4.4520(5.1850 0 10 1 1 5.380 24.6390 2.63019825 0 11 1 1 0.712|0.8165|4.21504.9080
12 1 1 1 1.272]1.4515|4.3910(5.1150 5 13 4 1 1 2.340(2.6785|4.4710(5.2110 5 كنتيجة alll كما تم توضيحه في الجدول 15» وجد أن Clostridium botulinum ينمو. في الوقت cA) تم رسم مخطط محيطي z J gail تم ضبطه باستخد ام برنامج إحصائي ٠. كما تم توضيحه في الشكل 13()؛ al مكون الوسط A خارج النطاق التجرببي؛ الذي يشير إلى أنه يوجد ظروف أمثل. لتأكيدها؛ تم مد نطاق مكون الوسط A (N-Z-Amine A) خارج النطاق التجريبي 5 باستخدام برنامج إحصائي؛ وتم رسم مخطط محيطي. كنتيجة لذلك؛ كما تم توضيحه في الشكل 3ب)؛ زاد نمو البكتريا بزيادة تركيز مكون الوسط A مع ذلك؛ بسبب أن زيادة (sine ناتج
— 5 6 — تحلل الكازين يمكن أن تسبب مشكلة تتعلق بقابلية الذويان؛ تم اختيار ظروف أمثل داخل النطاقات التجريبية. كنتيجة لذلك» أوضحت البكتريا ef نمو عند 24 ساعة من الزراعة تحت الظروف التالية: =A 2.0 و8 1.1402. بناءً على هذه النتائج؛ تم تحديد تركيبة وسط يحتوي على ناتج تحلل الكازين إلى وسط خالي من البروتين الحيواني (APF) والذي يوضح أعلى نمو ل Clostridium botulinum كما تم توضيحه في الجدول 16. الجدول 16 / لتر مصدر carbon eS اجلوكوز 10 source مصدر نيتروجين Hy-Pea™ 7404| source of nitrogen (ببتون نباتي) UltraPep™ Cotton HyPep™ 46011 مصدر نيتروجين (ناتج تحلل N-Z-AMINE A| 20 كازيين casein (hydrolysate N-Z-CASE TT
— 6 6 — المثال 13: نمط نمو Clostridium botulinum في وسط يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ونواتج تحليل كازين باستخدام تركيبة الوسط الذي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات و/ أو نواتج تحليل كازيين؛ التي تم تحديدها بناءً على نتائج الأمثلة 1 إلى 10؛ تمت زراعة «Clostridium botulinum وتم فحص نمط نمو البكتريا. الجدول 17 يوضح OD ad تعتمد على الزمن Clostridium botulinum seid بين وسط يستخدم حالياً؛ ووسط يحتوي على ببتون مشتق من نبات (الوسط «(APF ووسط نهائي يحتوي على ببتونات مشتقة من نبات ونواتج تحليل كازيين casein hydrolysate (الوسط +APF كازين) . 0 الجدول 17
زمنالمزرعة ]540 56 |600 نانو ]540 نانو ]516600 ]540 نانو |600 نانو
( ساعة) متر - أمتر أمتر EE - أمتر - أمتر
]0.655 0.2156 0.1821( 2064 0| 0.0059 4
2.5015 2.8395 0.9296 1.0552( 0.0608 3
3.92 5451 1.5895 1.85( 4204 0 -.0 21
1952
— 6 7 —
551 4| 5.244] 472 2| 2.8595] 09954] 2382 1
- 3 | ي 7 3 i | . 5
4.489 5.188: 2.994] 3.526 2.416 5
3.396 3.838] 2.911] 3.361| 2.838 3.324
29453] 2.3 2.5185] 2.9255 894 2| 3.384 39
25
2.778] 2.9725 1.712 1.968| 2.6415] 3.1105
5641] 1.9788] 0.684 1.8164 2.1484 BE كنتيجة لذلك؛؛ كما تم توضيحه في الجدول 17 و الشكل 115( أوضح الوسط المستخدم حالياً وأوضح قيمة قمة Clostridium botulinum زيادة في معدل النمو بعد 24 ساعة من زراعة الذي يحتوي على APF عند 39 ساعة من المزرعة. أوضح الوسط 3.384 als OD540nm ببتونات مشتقة من نبات زيادة في معدل النمو بعد 18 ساعة من المزرعة وأوضح قيمة قمة
0054000 تبلغ 3.526 عند 28 ساعة من المزرعة. بالإضافة إلى cally أوضح الوسط APF الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات + ناتج تحلل كازين زيادة في معدل النمو بعد 18 ساعة من المزرعة وأوضح قيمة قمة 00540017 تبلغ 5.628 عند 26 ساعة من المزرعة. عند مقارنة OD540nm dard عند 24 ساعة من المزرعة؛ أوضح الوسط المستخدم حالياً قيمة 00540007 تبلغ ¢1.2382 أوضح الوسط APF الذي 0 يحتوي على ببتون مشتق من نبات dad 00540017 تبلغ 5¢2.8595 أوضح الوسط APF الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات + ناتج Mas كازين dad 0054001 تبلغ 5.244. بالتالي» كانت قيمة OD للوسط APF الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات + ناتج تحلل كازين عند 24 ساعة من المزرعة 4.23 مرة أكبر من تلك الخاصة بالوسط المستخدم Ulla ونحو 3 مرة أكبر من الوسط APF الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات. علاوة على ذلك؛
— 6 8 —
بلغت قيمة القمة OD للوسط APF الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات + ناتج تحليل كازين
نحو 1.6 مرة أكبر من تلك الخاصة بالوسط APF الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات.
قابلية التطبيق الصناعى
كما تم وصفه أعلاه؛ عند استخدام الوسط وفقاً للاختراع الحالي؛ الذي يحتوي على ببتون مشتق من
نبات ومعدن» لزراعة «Clostridium botulinum يكون معدل نمو البكتريا growth rate of
the bacterium في الوسط أكبر من ذلك الموجود في كل من الوسط المستخدم Ulla والوسط
الذي يحتوي على ببتون مشتق من نبات بمفرده. بالإضافة إلى ذلك؛ عند استخدام الوسط من
الاختراع الحالي» يمكن إنتاج تركيز مرتفع من سم البتيلينيوم بواسطة زراعة UC بطريقة آمنة.
على الرغم من وصف الاختراع الحالي بالتفصيل بالإشارة إلى الأشكال المحددة؛ يتضح لهؤلاء المهرة 0 في الفن أن هذا الوصف يوجد فقط لنموذج مفضل ولا يقيد نطاق الاختراع الحالي. بالتالي؛ يتم تحديد
النطاق الجوهري للاختراع al في عناصر لحماية المرفقة ومكافئاتها
Claims (3)
- عناصر الحماية 1- تركيبة وسط لزراعة «Clostridium botulinum تشتمل تركيبة الوسط medium ie composition ببتون مشتق من نبات plant-derived peptones يشمل ناتج تحلل البازلاء garden pea 086 ؛ ناتج تحلل بذرة القطن cotton seed hydrolysate وناتج تحلل جلوتين القمح gluten hydrolysate بنسبة 1: 0.68- 14.46: 0.09- 9.87 بالوزن؛ و ناتج تحلل كازين casein hydrolysate . 2- تركيبة الوسط medium composition وفقاً لعنصر الحماية رقم 1 حيث يوجد المحتوى الإجمالي لببتون مشتق من نبات plant-derived peptones في الوسط المذكور بمحتوى من 0 10-0.1 7 بالوزن لكل حجم. 3- تركيبة الوسط medium composition وفقاً لعنصر الحماية رقم 1 حيث يوجد ناتج تحلل كازين casein hydrolysate في تركيبة الوسط Medium composition بمحتوى من
- 2.- 15.5 7 بالوزن لكل حجم. 4- تركيبة الوسط medium composition وفقاً لعنصر الحماية رقم 1؛ حيث يتم إخضاع الببتون المشتق من النبات plant-derived peptones وناتج تحلل الكازين casein hydrolysate إلى المعالجة بالإنزيم enzyme treatment . 0 5- تركيبة الوسط medium composition وفقاً لعنصر الحماية رقم 1؛ تشتمل أيضاً على مصدر كريون carbon source ؛ ومعدن mineral يُختار من المجموعة التي تتكون من داي بوتاسيوم فوسفات ((K2HPO4) dipotassium phosphate داي صوديوم فوسفات (Na2ZHPO4) disodium phosphate و مونو بوتاسيوم فوسفات monopotassium.(KH2PO4)phosphate— 0 7 — 6 تركيبة الوسط medium composition وفقاً لعنصر الحماية رقم 5؛ حيث يوجد المعدن في تركيبة الوسط medium composition بمحتوى من 3.5-0.05 7 بالوزن لكل حجم. 7- طريقة لإنتاج سم البتيلينيوم botulinum toxin ؛ تشتمل على الخطوات التالية: () زراعة Clostridium botulinum باستخدام تركيبة الوسط medium composition وفقاً لعنصر الحماية رقم 1 لإنتاج سم البتيلينيوم botulinum toxin ؛ و (ب) استخلاص سم البتيلينيوم botulinum toxin الناتج. 8- الطريقة وفقاً لعنصر الحماية رقم 7 حيث يتم إجراء المزرعة تحت ظروف لا هوائية.anaerobic 0 9- الطريقة وفقاً لعنصر الحماية رقم 7 Gus يُختار سم البتيلينيوم botulinum toxin من المجموعة التي تتكون من الأنواع المصلية awl البتيلينيوم «ED 0 8 «A botulinum toxin GF le وسط اصلي عيتة مقارنة سلبية ا = = = 444 es - gl - ساعة ٠ اا ا ا a LU = ١ شكل WY الوسط المستخدم APF bug APF Bas مكونات اخرى APF =A الس لل - = فلحت ب لد _ ااا ا BR = nn _ = Be Bul Ic fla- . ا از - - EE شكل ؟— 2 7 — Se مشثق من تباث + Sse مشتق من تباث + يبثتون مشتق من Fs ببلون مشتق من نبات + ded plas بعد التطعيم + Ad pea + إضافة فيتامين By اضافة معدن خض het + اضافة Opi Zhou متام —— HE قينامين NE AN Tha ا MN a 3 Na TT 8 Ew ng > ا 0 a Nid 5 ذا ؟ Sa NE i ae > As 4 No a Ee LY EE AB a ب ب | ةا ا ب ا 0( .5 am ا ا بس ا كب٠ 7 3 ٠ pig 0 Y $ a 1 الوسط EZ NS S JR NE تمس ys ا ا ان لبه yl 1 BR 1 1 3 ا Aa Naa EE Ey EL ey BB B44 Ya a =B._. .= 22 Ny لو ق- وق اج a AMER N X NN ل الاب 0 داب EA يني الترسيب gladly A 1 Ye $4 YY الوسط NN ا تي 8 i Tr rr! BR EIEN RE NN N RRR 8 1 NE EE : ااا hem © 1 م ااا ا B= ٠ : LR = RN 2 kB > B= BB a. a .= IXAY AX 0 NX) ئها 0 الترسيب شكل +-7 4-r 0 0 5 ًُ = سير ا ا 0 : 0 0 ِ وم a 3x = 2 BB _. الج ا الوا حوصن X mmo Xx النمويذ ب A 5 Ya 7 اط Day 0 = > مسي انواع الو C ب Wn na الي = م انا - Dues ا ااال 3 a1 ال ااا لوو X X X X.X iy fy النموشكل *٠ 7 5 — : TTI اس he > = Fr : الل ل ' 0 "- للخ AE سس AEE © —e aa 7 هنا 0 TBs Nn 2 7 wu a " 6 له 5 wl. | ~ ات AP Dasma HE " لا 8 RE you i Lo 32 373 1 شكل >٠ 7 6 ٠ ا ص RY mm ) ساعة (0 6 تقو ا 1 ان = == مر 2 59 0" ب ا 32 3١0 0 BB» ~ m= 5 Ry - BEB " د - - ا ا ا “Co . قيم الثبات " اد ِ 1 فر : — > \ 10 04 1 * 2 kHPYPO:« Pv شكل— 7 7 — oO SSS : ay ow : 4؟ ساعة ( 36 ناتوهتر) د << صقر ©تس Saal ke م iy EEE > cL لغ د 3 »م umT Ll Nt san قتAd Ey ج٠ لإ ; Naa \ ¥ oF Nhe ا ¥ i & Nae ¥ اسال ا ؟< | a + Thi Na Sibi > 0 ا NL ad ee Yoni N aaa NE Sa : gu !Po Nn kHPsPOg: #7 As ¥ rr ؟؛| @ kHP:PO¢ i 0 EJ شكل أ ب— 7 8 — ll { Fa pid Tr FO برب Lee. ee nA سر 2 ¢ Le - JS ! ; Mee fd - a v Aaa Lo . LL : Ne A -T . ‘ » Yi . p— £< 2 أ aS a قم = | kHPYPO! ia io Lo Le ا صفر 0 r pS 2 kHPYPO¢ gv شكل— 7 9 — KHPYPO! KHPYPO! Nar بوم امثل Ad pa ف و58 ولا EB] Cur {1} {#22} {2:4} PNAS بل متخفض م 3 \ | إ: الرغية في > rd yd مركبة Bala AY ra yd LY Rede AN J J No J 3 ل ps Pe يي OD ict Te =, ye as 3 a ~~ Ps oe X A 2 سح 271+ = 6 ya ; SYA zd ب“ yd pre Rd > ay شكل be TET & oan ل الم a 3 3 ال تانو مش { ا 5 « 0 Ade ؟ ,أ | ا خخ ==» #3 ا رب SEE شر مل ¥ Ta VEE 4 NCTE T Na re ENE 2 Nee Le 1 88 TED Ne * " i HE HET 288 ا vo < ا وش بش CRE فشو ا Na قيم الثياث Fo LL Gi + مي 04 اضفر 4 TY ££ 0» 34 + (04 A شكل— 8 1 — go مس tog got Ear y a { نانومتر © 5 al YE ee sy , 0 ا ال يس SE-. Eu I Lee Te 3 =f NM WN x ly ¥ : 1 " ا i 7 ا مام Nee So . 1 00 Nee veNa. Ce = قيم الثبات ا ااا 0 5 2 اا صقر NNN ا Aa ١ ؟ TY ب 2 0؟؛ 0 A شكل— 2 8 — aaa ساعة 01( © نانومتر) ا Ve 0 قي - == اليه SN 44 By oy DN Ne ¥ 8 - و B= ا a: " 1 . 2 ax ا إل Borers قيم الثتبات الم عا ا ا ا 8ه 0؛ * ؟ 0 ١0 صقر KYHPO: EARS— 8 3 — kHPYPO! kHPYPOt Nay HPO« Sw Ter i Tu مرتقع fo D Cur {+>} (5:2) {FATT} متنخفضض ري . hh _ hil ldST 7 إٍْ م م i N 0 3 1 0 / 0 ا اAg lt ١ 1 / 1 \ في} / / |{ مادة مركبة[3 H 1In \iedvr || / / : 0 0 i ل 1 { انس يتنا TT TT TT TT الم انا لا TTT ال TT م TT TT Ta TT TT ee - H oo ال إٍْ ~~ ve >م pd ب | +؟ ساعة00 6 م 0 اللا | Easy 7 ص ااا 'ّ P-L ص ا ا dg | 7 = ا i 7 شكل + ذ— 8 4 — ساعة © # نانومتر متوسطة ve << he مقادير المكون : EEE ! i a | ’ 3 AN Y,e لت Fon FY & | Yoo - ه* ا RY x + § Ns 0: 003 ay ١ صفر رتص ThE > مر , |١ \ ١ - i AID y 3 0 4 ا y aad Sa om. ب Sa <3 . a : - قيم الثيات Poy = با ١ ١ \ A £8 [a A . 4 ا , \ SN C= صفر 4 يي صق 3 + ه١ » + #8 LN ١ ١ ١ ١ & 3 z 4 Pe شكل٠ 8 5 — Ye ساعة .26 agi 1 Fa gill متوسطة د < يم — ae اا مقادير المكون م ال ا ! أ v NE v R B ” . ¥N . . ١ 5 م »* - ا = EN ا , ذا ل y Saad م % EER LL ١ £ ١ - م نك ؟ fa ؟ ؟5 صفر ؟ قيم الثبات = د ِ صفر صقر لي ب . ¥ 5 Aa ج 8 A ١ ٍ \ FT صفر د مأ انا ىا y ١ 7 + | ' AA £0 " | صف * ؟ | صفر ؟ 3 صفر z 3 z q 1 i BR ب: حفن لبا 1 £4 } { جا ّ 5 : Bi 3 1 at red 7 » + { } - 3 ¥ نقع : 0 * {os X.D Cur iA or i E 5 . ررد دح 1 ا } : Ey + تتم يا ¥ + ب« i yada 1 *ٍ * A 3 A } { % *ج + % £ } { ¥ op ¥ } » » x By Ww + . + * 2 > 1 إٍْ 0" 8 i H H H i § i : 1 I H 5 bl H 1 : i i 1 1 1 i i i Toa إٍْ 1 ل i i الرغية فى 1 i 1 i i 7 0 م Id > Cn 11 إٍْ oa 0 8 1 Ii VE H NERY مركية Bile ETH ii ْ م = ا a 1 HE Vo fi 1 Pol CTV ii i 1 EER 7! 11 Pit Hi Por نا VY INU 1 I SS امسا Lo 1 ححا ام أ لاح AA عا يجيد VA (A SE 3 6 08 بات له حي الي اح عم ا اللا ba ha مرا 2 EAE BN H H HN i \, 2 : ا i > : 2 1 1 1 > اا + | ا 1 اث TS 8 0: ل H 3 H 1 \ FA لل ل <“ HE SAN i 5 ل ب 1 م {id \ . a ا ب i 3 . H 26 *؟ ساعة00 1 : fo Ve “1 % { i ! “> 0: ai i N 0 1 1 بن i 3 إْ : | ؟ ا بحد أقصى NEO 5 » N 8 H 3 0 H > : i > i H H H HN bY FAYE لات \ uk ب إْ ’ Ld 1 ل إ إ AVY = d > شكل 4 جع © جا ا ا EE £ ب H 0 3 i sell : i : 1 ) J ب سس سوسس ,سا #١ اها ل 8 4 5 By & Nissin i oo Ete H تركيز الضع في D ATR ; La BR 1 4 ا SU.JUN.UU | RE أ ااا الع أميكر وجراداملة LAO Nl 0 Lor i en ) ; ا : 5 مس ; 8 X بض ان الل ب 1 الست سحت سيد لس سس اا 4 لاه الا للك 3 NR 1 5 لخ JG ? : Sh تر كير meal الإجمال به مزل اي +*- 8 3 ل : 4 be g aan h = 8 3 3 مع wn NS Nod i ag Jb & i oy SUIS.SII.
- 3. SI.Lh 8 جا k 3 hE 0 اا ا ام ny I 8 : ا يثرن جرال YOR ب" 8 إٍْ 5 م § R.A 8 : : حل TF 8 8 1 3 £3 NE WF EY 3 SE a rk 3 0 FE ow) sages SIN ادن 2 : “> & Nod pS RY Ne FL he Ra a ماي % & Nl أ و 40 Ci Eg Rn 3 7% “he i $F & X i i NF & X i > #4 ا x & وي : ل ا ااا اا ااا اد اد وا الل x 3 EWN “83 be i NEN ENS H ED Los : Fn RTs Nog ® JAN H * Sa be 3 Usd & i . Log اماي da Bo ¥a LS Sha + بيه امع اذب احا oR زمن الاستنبات(بالساعة 8 0 ٠١ BAN— 8 8 — نانومتر ete محيطي ل kyl تانومتر مخطط 86 { مقادير. المكون 1 SAR N : ا 7 yw © اد A yo \ abel, ey ee B . BO g « My IEaEe j Bere \ ; i ay <I. صفر . / i > د ss cis قيم T FRE AND { صفر-. : z صفر ب ؟ صقر g Ae La Pay شكل— 8 9 — نانومتر ets تالومتر مخطط خليط محيطي ل ok 0“ ل > سس مقادير المكون إ ١ ا Eh = لارة 8 1 ww 4 3 Ny A ER م صقر WW | 8 WE يا ' د “م صفر هنا "ا | ١ ' ةا صقر جو ay و8 0 ا = 9 3 ys Lo) 1 ل ا 2.5 = 5 iy ea z 1 صفر : > el | fa . 2 م ؟ ل y X i Ll ers d i RRR 5 1 ١ ا ١ »"_" Sa ON ea i اذك . Dll قيم By / y ٠ a Po a © ow ٠ ف k ١ دي 3 z صقر z Aa z ١ J 3 ب 1١ شكل٠ 9 0 ٠ مرتفغ - أمثل D Cur 3 0 منخفض 3 جب«.»م + an ol إ "0 \ 0 الرغية ة الرغية في ١ Poi + | 1 عادة مركية 0 ١٠ !ّ )ِ \ ١ : | ١ ١ Youve i 1 § EEE 1 | 10 إ: إٍْ ا اسم تست د ل ا ef i ; 2ب ب > ص أ EAN 7 > ب 0 ا VA EA A AN EN \ i إْ \ { \ : مال 0 بخداقصى | AN \ ' ' \ | ؛ الا جحي | ' vi > > 1 1 VS . 3 cre = od 1 1 7 ANY YY شكل¥ BR eee] Le ا تاتو متر Ss AN a Ea EEE EERE <r. اا ae Na Boe Nae Soe -Hh. DD NL Ee NE f= EEE EEN —— TTR ON NL EE Ni. EE REE اش اد N Nay Lo NE yon Ln LI ند ¥,« i (MLR) مخطط استجاية محيطي 0 ¥ i hy . ا 0 Bl ل ال 2 0 aE“wi... 0 ل ل SEE EEE ER ax. I ا ا A EE a EF CC Co 0 GA ا 0 اه اا لاه MM aSs... WW 0 WE قد 0 اللا = ا الل أل 0 LY N ¢ « اي ال 0 \ ا ال 1 ا ا ا اا الما صفر , To : Lo so: & 2 A vy 2 } ند K Ye T ¥,e t vo i fr شكلب i La ¥ .اج *)1.1807( (..) مرتفع امثل D Cur 0 0 جاح متخفكن ريك الرغبة في مادة مركبة عجرا als 5 £ hd ANa. 3837 = ¥ يج = Leer شكل ٠6+. الاب إل deere : : مور لبي 2 ل 1 اللي o Tr ER : اما ا زنوت Yio i: [EN en تومير SNS .ااا PO a Sa gd Vey : Bags ٠ مستسههة Seg To i EN i. 1 ام N ED we Sagi BE 8 § EY EET ات سا 0 [I » IN EE لاست ل ال TIT : TN RO ST . Nine + :8 رن :الا N ? EE SI: tl R Ny, | J EE I — ? 8 8 3 ا "0RS. ل“ & : . اس م صر il 2 0 a RR TERRY LE R 5 اااي re الاج Aa Yu 5 1. Bed $a as د So ) ) i H ؟ 3 بالساعة زمن المزرعة بالساعة من agp Jad بالساعة (من المزرغةء is 3 التفارنة عند ( <> 2 نالو مترع المقازنة علد ل {fgets ا : ag ل الي د الرسط EE هي الت لا م يتا اتوي 1 ب H ااام ااا ام لاطا a ا Frm 0 ATE : يط APF ل 1“ 8 i الالال الا ا م م ل 3 سي ا سأيي : eres ل Seal ل i Fae Rohs - i. EN RN SI ا 1 ال حت > i EER Ng :ٍ ااا 4 Casin + ضرم Sg TR ااا تتا 6855© + 305 70 المت تت ا ه لاط ١ د ل FE 0 Ss. ; TOE) ren Te HE Ng H le RR 0 I, EE kL Lu wey فر Sha ve I Ne as vs I AF :من المزرعة بالضاعة زمن المزرعة بالساعية شكل yoلاله الهيلة السعودية الملضية الفكرية ا Sued Authority for intallentual Property RE .¥ + \ ا 0 § 8 Ss o + < م SNE اج > عي كي الج TE I UN BE Ca a ةا ww جيثة > Ld Ed H Ed - 2 Ld وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها of سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. Ad صادرة عن + ب ب ٠. ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > فهذا ص ب 101١ .| لريا 1*١ v= ؛ المملكة | لعربية | لسعودية SAIP@SAIP.GOV.SA
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150059655A KR101729251B1 (ko) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| PCT/KR2016/004431 WO2016175566A1 (en) | 2015-04-28 | 2016-04-28 | Medium composition for preparing botulinum toxin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SA517381722B1 true SA517381722B1 (ar) | 2021-03-07 |
Family
ID=57199640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SA517381722A SA517381722B1 (ar) | 2015-04-28 | 2017-06-14 | تركيبة وسط لتحضير سم البتيلينيوم |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10117927B2 (ar) |
| EP (1) | EP3289070B1 (ar) |
| JP (2) | JP2018506262A (ar) |
| KR (1) | KR101729251B1 (ar) |
| CN (1) | CN107109353A (ar) |
| AR (1) | AR104676A1 (ar) |
| AU (1) | AU2016253789B2 (ar) |
| BR (1) | BR112017012889A2 (ar) |
| CA (1) | CA2968044C (ar) |
| DK (1) | DK3289070T3 (ar) |
| ES (1) | ES2805726T3 (ar) |
| HR (1) | HRP20201067T1 (ar) |
| HU (1) | HUE050244T2 (ar) |
| MX (1) | MX2017008199A (ar) |
| PL (1) | PL3289070T3 (ar) |
| PT (1) | PT3289070T (ar) |
| RU (1) | RU2689705C2 (ar) |
| SA (1) | SA517381722B1 (ar) |
| TW (1) | TWI592485B (ar) |
| WO (1) | WO2016175566A1 (ar) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101723168B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| KR101723167B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| KR102209159B1 (ko) * | 2019-03-29 | 2021-01-29 | (주)제테마 | 독소의 제조방법 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB790521A (en) * | 1955-11-15 | 1958-02-12 | Bristol Lab Inc | Improvements in or relating to antibiotics |
| TR200003828T2 (tr) * | 1998-07-03 | 2001-06-21 | Dsm N.V. | Düşük bir serbest amino asiti konsantrasyonunda klavülanik asitin üretilmesi için fermentasyon işlemi |
| US6558926B1 (en) | 1999-07-16 | 2003-05-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal products |
| RU2230325C2 (ru) * | 2002-08-15 | 2004-06-10 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а |
| US7160699B2 (en) | 2003-09-25 | 2007-01-09 | Allergan, Inc. | Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin |
| US7148041B2 (en) * | 2003-09-25 | 2006-12-12 | Allergan, Inc. | Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin |
| CN1867664A (zh) * | 2003-10-17 | 2006-11-22 | 兰贝克赛实验室有限公司 | 使用新的链霉菌菌种生产他克莫司(fk－506) |
| WO2006042542A2 (en) | 2004-10-19 | 2006-04-27 | Statens Serum Institut | Production of tetanus, diphtheria, and pertussis toxins and toxoids using fermentation media containing no components of animal or soy origin |
| ES2509872T3 (es) * | 2005-03-03 | 2014-10-20 | Allergan, Inc. | Procedimientos para obtener una toxina clostrídica |
| FR2918671B1 (fr) * | 2007-07-10 | 2010-10-15 | Sanofi Pasteur | Milieu de culture d'haemophilus influenzae type b. |
| CN101698826A (zh) * | 2007-12-19 | 2010-04-28 | 杨宇 | 胰酪胨肉毒梭菌增菌肉汤 |
| KR20090120222A (ko) | 2008-05-19 | 2009-11-24 | (주)메디톡스 | 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 |
| US8236356B2 (en) * | 2008-06-11 | 2012-08-07 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Growth medium for Clostridium histolyticum |
| US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
| US10119131B2 (en) | 2011-03-16 | 2018-11-06 | Biospecifics Technologies Corp. | Compositions and methods for producing clostridial collagenases |
| BR122016023101B1 (pt) | 2012-10-21 | 2022-03-22 | Pfizer Inc | Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile |
| CN103215310B (zh) * | 2013-03-27 | 2015-01-21 | 中棉紫光生物科技（上海）有限公司 | 用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用 |
| KR101339349B1 (ko) | 2013-08-02 | 2013-12-09 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조방법 |
-
2015
- 2015-04-28 KR KR1020150059655A patent/KR101729251B1/ko active IP Right Grant
-
2016
- 2016-04-27 TW TW105113081A patent/TWI592485B/zh active
- 2016-04-27 AR ARP160101184A patent/AR104676A1/es unknown
- 2016-04-28 DK DK16786752.2T patent/DK3289070T3/da active
- 2016-04-28 US US15/521,833 patent/US10117927B2/en active Active
- 2016-04-28 BR BR112017012889A patent/BR112017012889A2/pt active Search and Examination
- 2016-04-28 AU AU2016253789A patent/AU2016253789B2/en active Active
- 2016-04-28 HU HUE16786752A patent/HUE050244T2/hu unknown
- 2016-04-28 WO PCT/KR2016/004431 patent/WO2016175566A1/en active Application Filing
- 2016-04-28 JP JP2017524477A patent/JP2018506262A/ja active Pending
- 2016-04-28 EP EP16786752.2A patent/EP3289070B1/en active Active
- 2016-04-28 CN CN201680004193.5A patent/CN107109353A/zh active Pending
- 2016-04-28 PL PL16786752T patent/PL3289070T3/pl unknown
- 2016-04-28 RU RU2017120813A patent/RU2689705C2/ru active
- 2016-04-28 PT PT167867522T patent/PT3289070T/pt unknown
- 2016-04-28 MX MX2017008199A patent/MX2017008199A/es unknown
- 2016-04-28 ES ES16786752T patent/ES2805726T3/es active Active
- 2016-04-28 CA CA2968044A patent/CA2968044C/en active Active
-
2017
- 2017-06-14 SA SA517381722A patent/SA517381722B1/ar unknown
-
2019
- 2019-06-26 JP JP2019118235A patent/JP6887467B2/ja active Active
-
2020
- 2020-07-07 HR HRP20201067TT patent/HRP20201067T1/hr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20170252431A1 (en) | 2017-09-07 |
| KR20160127998A (ko) | 2016-11-07 |
| AU2016253789B2 (en) | 2018-12-06 |
| AU2016253789A1 (en) | 2017-06-01 |
| RU2017120813A3 (ar) | 2018-12-14 |
| ES2805726T3 (es) | 2021-02-15 |
| JP2020072649A (ja) | 2020-05-14 |
| CA2968044C (en) | 2022-08-09 |
| BR112017012889A2 (pt) | 2018-01-30 |
| RU2017120813A (ru) | 2018-12-14 |
| WO2016175566A1 (en) | 2016-11-03 |
| US10117927B2 (en) | 2018-11-06 |
| MX2017008199A (es) | 2017-12-04 |
| JP2018506262A (ja) | 2018-03-08 |
| RU2689705C2 (ru) | 2019-05-28 |
| EP3289070B1 (en) | 2020-05-06 |
| EP3289070A4 (en) | 2018-09-26 |
| AR104676A1 (es) | 2017-08-09 |
| JP6887467B2 (ja) | 2021-06-16 |
| EP3289070A1 (en) | 2018-03-07 |
| DK3289070T3 (da) | 2020-07-27 |
| PL3289070T3 (pl) | 2020-11-16 |
| KR101729251B1 (ko) | 2017-04-21 |
| PT3289070T (pt) | 2020-07-16 |
| TWI592485B (zh) | 2017-07-21 |
| HRP20201067T1 (hr) | 2021-02-05 |
| TW201638329A (zh) | 2016-11-01 |
| CA2968044A1 (en) | 2016-11-03 |
| HUE050244T2 (hu) | 2020-11-30 |
| CN107109353A (zh) | 2017-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SA517381722B1 (ar) | تركيبة وسط لتحضير سم البتيلينيوم | |
| US10465179B2 (en) | Medium composition for preparing botulinum toxin | |
| JP2020022436A (ja) | ボツリヌス毒素の製造のための培地組成物 |