RU2810467C1 - Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин - Google Patents
Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810467C1 RU2810467C1 RU2022121553A RU2022121553A RU2810467C1 RU 2810467 C1 RU2810467 C1 RU 2810467C1 RU 2022121553 A RU2022121553 A RU 2022121553A RU 2022121553 A RU2022121553 A RU 2022121553A RU 2810467 C1 RU2810467 C1 RU 2810467C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- testicular tissue
- testicular
- vortex
- added
- Prior art date
Links
- 230000002381 testicular Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000036512 infertility Effects 0.000 abstract description 10
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract description 2
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 5
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 5
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 102000008371 intracellularly ATP-gated chloride channel activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 2
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000495778 Escherichia faecalis Species 0.000 description 1
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 description 1
- 101000873446 Homo sapiens Selenoprotein S Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001324870 Lactobacillus iners Species 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102100034940 Selenoprotein S Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к урологии в разделе хирургической андрологии с использованием методологии молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики, и может быть использовано в центрах вспомогательных репродуктивных технологий с целью лечения бесплодия у инфертильных мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза. Осуществляют забор образца тестикулярной ткани яичка интраоперационно путем биопсии яичка, с последующим забором образца из уретры, и обрабатывают в физиологическом растворе в стерильных условиях и криоконсервируют при температуре не более -30°С. Проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, выделяя пробу интактной ДНК с использованием мини-колонок в настольной микроцентрифуге. Добавляют к образцу тестикулярной ткани 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, тщательно перемешивают, вортексируют, инкубируют при 37°С 1-2 часа. Добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 200 мкл Лизис-буфера, вортексируют 10 секунд. Вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 250 мкл связывающего буфера (ВВА), вортексируют 1 минуту и центрифугируют. Мини-колонки помещают внутрь пробирки для образца и переносят жидкость на колонку, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 об. в 1 мин и добавляют 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD,) центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость. Колонку переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют. Полученный элюят бактериальной ДНК тестикулярной ткани и образец мазка из уретры криоконсервируют для последующего анализа. Способ позволяет сократить трудоемкость, совершенствовать прогнозирование результатов диагностики репродуктивного потенциала, а также обоснованность программы выбора алгоритма лечения и повышения медико-социальной реабилитации в более короткий срок. 2 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к урологии в разделе хирургической андрологии с использованием методологии молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики, и может быть использовано в центрах вспомогательных репродуктивных технологий с целью лечения бесплодия у инфертильных мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза.
Разработка новой стратегии скрининга мужской инфертильности на основе молекулярных инструментов представляет собой насущную потребность. Действительно, экспрессия генов стала важным инструментом для диагностики, прогноза и стратегии лечения пациентов с данной патологией. Разработан и изложен способ выделения бактериальной ДНК из биоптата яичка с целью определения тестикулярного микробиома у инфертильных пациентов, которая доказывает свою актуальность при диагностике факторов мужского бесплодия. В яичках мужчин могут содержаться собственные бактерии, которые различаются в зависимости от степени фертильности. Такое открытие совершили ученые из Италии. Длительное время мужские яички считались абсолютно стерильными, но теперь оказалось, что у них тоже имеется собственный микробиом. По словам экспертов, проживающие естественным образом в яичках микроорганизмы образуют характерную среду, по содержанию которой можно сказать с определенной степенью вероятности о том, насколько легко мужчина сможет заводить детей. При наличии определенной разновидности бактерий шансы на потомство у мужчины более высокие, а если этой разновидности не хватает, то мужчина может столкнуться с угрозой бесплодия из-за низкого количества сперматозоидов.
Микробиом человека представляет собой совокупность всех микробиот, которые находятся на тканях и биологических жидкостях человека или внутри них, вместе с соответствующими анатомическими участками, в которых они находятся, включая кожу, молочные железы, плаценту, семенную жидкость, матку, фолликулы яичников, легкие, слюну, слизистую оболочку полости рта, конъюнктиву, желчевыводящие пути и желудочно-кишечный тракт (Marchesi JR, Ravel J (2015). "The vocabulary of microbiome research: a proposal". Microbiome. 3: 31. doi:10.1186/s40168-015-0094-5).
He остается без внимания и урогенитальный тракт инфертильных пациентов, в частности мужское население земного шара населяет около 20 процентов инфертильных мужчин, из которых до 1 процента случаев приходится на азооспермию - полное отсутствие сперматозоидов в эякуляте (Не Y., Zou Q., Li В., Chen Н., Du X., Weng S., Luo T. and Zeng X.: Ketamine inhibits human sperm function by Ca(2+) related mechanism. Biochem Biophys Res Commun 478: 501 506, 2016). Предыдущие исследования показали, что генетические факторы, включая хромосомные аномалии, ответственны за азооспермию (Myandina G. I., Kulchenko N. G., Alhejoj H. Polymorphism G-105A SEPS1 geneandmens' infertility. Medical New sof NorthCaucasus. 2018; 13(3):488-490 https://doi.org/10.14300/mnnc.2018.13085). Микробиомы в уретре играют важную роль в здоровье человека, заболеваниях других этиологий (Кадыров З.А., Степанов В.Н., Фаниев М.В., Рамишвили Ш.В. Микробиота органов урогенитальной системы. Урология, 2020; 1: 116-120/ Kadyrov Z.A., Stepanov V.N., Faniev M.V., Ramishvili Sh.V. Microbiota of the urogenital system organs. Urologiya. 2020; 1: 116-120. DOI: https://dx.doi.org/10.18565/urology.2020.L116-120). Сообщалось, что некоторые бактерии, в том числе Lactobacillusiners, Gardnerella vaginalis, Escherichia faecalis, E.coli и Staphylococcus aureus, связаны непосредственно с мужским фактором бесплодия, что было продемонстрировано с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или методов, основанных на культуре бактерий (De Croo I., Van der Elst J., Everaert K., De Sutter P. and Dhont M.: Fertilization, pregnancy and embryo implantation rates after ICSI in cases of obstructive and non obstructive azoospermia. Hum Reprod 15: 1383 1388, 2000).
В течение последнего десятилетия исследования показали, что помимо известных прогностических факторов, таких как продолжительность субфертильности, возраст мужчины, индекс массы тела, также микробиом может влиять на фертильность. Присутствие определенной микробиоты во время вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) оказывает положительное влияние на результат. Это первое исследование, в котором подчеркивается, что тестикулярные ткани пациентов с мужским фактором бесплодия содержат ассоциированные с тканями комменсальные бактерии. Заявителями выявлен единственный источник информации, касающийся лишь названия данного объекта, который принят за аналог «Testicular microbiomeinazoospermicmen-first evidence of the impact of analtered microenvironment» / Massimo Alfano, Roberto Ferrarese, Irene Locatelli, Eugenio Ventimiglia, Silvia Ippolito, Pierangela Gallina, Daniela Cesana, Filippo Canducci, Luca Pagliardini, Paola Vigano, Massimo Clementi, Manuela Nebuloni, Francesco Montorsi, and Andrea Salonia. / Human Reproduction, Vol. 33, No.7 pp. 1212-1217, 2018 Advanced Access publication on May 30, 2018 doi:10.1093/humrep/dey116/. Недостатком в работе неполное описание непосредственно подготовительной фазы выделения бактериальной ДНК, из нативного биоптата ткани яичка пригодной для проведения NGS-секвенирования, что вызывает дополнительные трудности при проведении данной работы. В первой фазе подготовки биологического материала не указаны среды и использованные буферные растворы, их концентрация, время экспозиции и режимы центрифугирования для получения необходимого количества бактериальной ДНК из тестикулярного материала, и таким образом способ практически не выполним. Большинство современных методов выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения состоят из последующих этапов: разрушение клеточных стенок; лизис клеточных мембран; очистка от ингибиторов ферментативных реакций (ПЦР, рестрикции) Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота.
Задачи: Снижение трудоемкости способа выделения бактериальной ДНК и повышение результативности при диагностике нарушения фертильности у мужчин с различными формами бесплодия, в дальнейшем улучшение тактики ведения и прогнозирования результатов лечения, сокращение времени реабилитации после проведения малоинвазивного диагностического обследования.
Сущность заключается в том, что способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК у инфертильных мужчин забор образца тестикулярной ткани яичка осуществляют интраоперационно путем биопсии яичка, с последующем забором образца из уретры и обрабатывают в физиологическом растворе в стерильных условиях и крио консервируют при температуре не менее -30°С, после чего проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega (Promega Corporation ⋅ 2800 Woods Hollow Road ⋅ Madison, WI 53711-5399 USA TM345 ⋅ Revised 8/13 www.promega.com), выделяя пробу интактной ДНК с использованием миниколонок в настольной микроцентрифуге, добавляют к образцу тестикулярной ткани 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, тщательно перемешивают, вортексируют, инкубируют при 37°С 1-2 часа, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К (РК) и 200 мкл Лизис-буфера, вортексируют 10 секунд, вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 250 мкл связывающего буфера (ВВА), вортексируют 1 минуту и центрифугируют, мини колонки помещают внутрь пробирки для образца и переносят жидкость на колонку, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 в 1 мин и добавляют 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD,) центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость, колонку переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюят бактериальной ДНК тестикулярной ткани и образец мазка из уретры криоконсервируют для последующего анализа.
В предлагаемом способе использована предварительная инкубация лизоцимом в ТЕ буфере для разрушения бактериальной клеточной стенки, что является новизной при таком подходе. Лизоцим вносили в объеме 20 мкл из стокового раствора с концентрацией 50 мг/мл согласно методу Бирнбойма-Доли / Birnboin Н.С., Doly J. Rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA// Nucl. Acid Res. 1979. 7. 1513-1522. / к образцу, содержащему 160 мкл ТЕ-буфера. Далее проводили инкубирование в шейкере-термостате при 37°С в течение 1-2 часов при помешивании. Обработка лизоцимом способствует увеличению выхода бактериальной ДНК. Последующие этапы проводили по стандартному протоколу выделения ДНК из животных тканей. Данный способ был впервые применен в отношении тестикулярной ткани человека с целью выделения бактериальной ДНК пригодной для последующего секвенирования методом NGS.
Технический результат достигается тем, что предложенный комплекс мероприятий позволил сократить трудоемкость, совершенствовать прогнозирование результатов диагностики репродуктивного потенциала, а также обоснованность программы выбора алгоритма лечения и повышения медико-социальной реабилитации в более короткий срок.
Способ апробирован на материале 46 инфертильных пациентов с азооспермией, использованием биологического материала / тестикулярная ткань и мазок слизистой уретры / подвергнутых секвенированию методом NGS. Данный способ апробирован в течение последних 3-х лет и зарекомендовал себя как надежный способ получения бактериальной ДНК для тестикулярного микробиома.
Способ осуществляют следующим образом.
В операционных условиях, по стандартной методике биопсии яичка производят забор тестикулярной ткани у пациентов. Ткань помещают в стерильный физиологический раствор интраоперационно и обрабатывают для хранения в стерильных условиях в течение 30 минут при температуре криодиссекции не более -30°. Все процедуры выполнялись в стерильных условиях, с использованием одноразовых материалов и оборудования. По завершении оперативного пособия проводят забор образца отделяемого слизистой оболочки уретры (мазки) у данного пациента, используя стабилизационный буфер и комплект для выделения ДНК из эпителия уретры.
Следующим этапом проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega (США), что обеспечивает быструю и простую очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани. Образцы выделяют с использованием мини-колонок в настольной микроцентрифуге.
Геномная ДНК, выделенная таким способом, имеет высокое качество и может быть использована в ПЦР-анализе. К каждому образцу тестикулярного биоптата добавляют 160 мкл ТЕ-буфера, затем 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе и осаждают путем краткого центрифугирования. Затем инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 1-2 часов.
К гомогенизированному образцу добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К (РК) и 200 мкл Лизис-буфера с целью лизиса клеток в пробирке и перемешивают на вортексе в течение 10 секунд. Затем вновь инкубируют при 56°С в течение 2 часов. После чего добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А к каждому образцу и перемешивали на вортексе в течение 10 секунд с последующим инкубированием в термостате при 56°С в течение 10 минут. Следующим этапом добавляли в извлеченные пробирки из термостата 250 мкл связывающего буфера (ВВА) и вортексируют в течение 1 минуты с последующим кратким центрифугированием.
Связывающие колонки помещают внутрь пробирки для каждого образца и переносят часть жидкости образца на связывающую колонку, с последующим центрифугированием в течение 1 минуты на скорости 3000 оборотов в минуту. При наличии лизата сверху на мембране, центрифугируют колонки в течение 1 минуты. Затем извлекают пробирки с протекшей жидкостью и перемещали связывающую колонку в новую пробирку с последующим добавлением 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD) в колонку, центрифугируют в течение 2 минут на скорости 3000 оборотов в минуту, затем отделяют протекшую жидкость. Данный этап повторяют дважды, после чего помещали колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавляют 50 мкл воды без нуклеаз в колонку, центрифугировав 1 минуту на максимальной скорости. Удалив связывающую колонку, сохраняют элюат с целью последующего секвенирования методом NGS (секвенирования следующего поколения).
Нельзя использовать повторно колонки или пробирки. Геномная ДНК может недолго храниться при 4°С или длительно при не более -30°С. Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:
Пример 1
Пациент С-ов, 1982 г.р., обратился в Центр Репродукции с жалобами на отсутствие наступления беременности у супруги более 7 лет без применения средств контрацепции. В первом браке один ребенок. Супруга - 29 лет. 1-я попытка ЭКО - без успеха. Анамнез жизни - перенесенные заболевания - отрицает. Проф. Вредности - отрицает. Половая жизнь с 15 лет. В настоящее время регулярная. Посещение бани - редко, СА + внутренние войска. Ранее по поводу бесплодия неоднократно лечился, без успеха. При проведении обследования по стандарту центра ВРТ в спермограмме - азооспермия. AZF. CFTR - мутаций не выявлено, кариотипирование -46ХУ. Нормальный. !!!. Исследование эякулята на бактериальную флору - микрофлора не выделена. Бактериальный посев секрета простаты - микрофлора не выделена. ПЦР на ЗППП - микрофлора не выделена ДИАГНОЗ. Мужской фактор бесплодия. Необструктивная азооспермия Хр. простатит в стадии латентного воспаления. В операционных условиях, по стандартной методике биопсии яичка произвели забор тестикулярной ткани у пациента. Ткань поместили в стерильный физиологический раствор интраоперационно и обработали для хранения в стерильных условиях в течение 30 минут при температуре криодиссекции - 30°. Все процедуры выполняли в стерильных условиях, с использованием одноразовых материалов и оборудования. По завершению оперативного пособия провели забор образца отделяемого слизистой оболочки уретры (мазки), используя стабилизационный буфер и комплект для выделения ДНК из эпителия уретры. Следующим этапом провели очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega (Promega Corporation ⋅ 2800 Woods Hollow Road ⋅ Madison, WI 53711-5399 USA TM345 ⋅ Revised 8/13 что обеспечило быструю и простую очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани. Образцы выделяли с использованием мини колонок в настольной микроцентрифуге.
Геномная ДНК, выделенная таким способом, имеет высокое качество и может быть использована в ПЦР-анализе. К каждому образцу тестикулярного биоптата добавили 160 мкл ТЕ-буфера, затем 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл. Содержимое пробирок тщательно перемешали на вортексе и осадили путем краткого центрифугирования затем инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа.
К гомогенизированному образцу добавили 20 мкл раствора Протеиназы К (РК) и 200 мкл Лизис-буфера с целью лизиса клеток в пробирке и перемешали на вортексе в течение 10 секунд. Затем вновь инкубируют при 56°С в течение 2 часов. После чего добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А к каждому образцу и перемешали на вортексе в течение 10 секунд с последующим инкубированием в термостате при 56°С в течение 10 минут. Следующим этапом добавили в извлеченные пробирки из термостата 250 мкл связывающего буфера (ВВА) и вортексировали в течение 1 минуты с последующим центрифугированием. Мини колонки поместили внутрь пробирки для образца и перенесли жидкость на колонку, с последующим центрифугированием в течение 1 минуты на 3000 оборотов в 1 мин. Затем извлекли пробирку с протекшей жидкостью и переместили связывающую колонку в другую пробирку с последующим добавлением 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD), центрифугировали в течение 2 минут при скорости 3000 об/1 мин, затем отделили протекшую жидкость. Данный этап повторили дважды, после чего поместили колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавили 50 мкл воды без нуклеаз в колонку, центрифугировав 1 минуту. Удалив связывающую колонку, сохранили элюат с целью последующего секвенирования. В результате чего была получена разновидность 146 таксонов микробиоты урогенитального тракта из тестикулярной ткани и уретры, при наличии стерильных посевов, проведенных по стандартным методикам. Данная ситуация позволила поменять лечебный алгоритм и провести санацию урогенитального тракта мужчины антибактериальной химиотерапией. Впоследствии применение данного способа обеспечило правильный выбор тактики и определения прогноза результативности протокола ЭКО, что позволило сократить время лечения, реабилитации и получить положительный результат протокола ВРТ.
Пример 2
Пациент К-ев, 1982 г.р., обратился в Центр Репродукции с жалобами на бесплодный брак более 3 лет. Предыдущие 2 попытки ЭКО без успеха. Пара готовится вновь для проведения протокола ЭКО - по мужскому фактору. Анамнестически: Брак 1. Детей в браках ранее не было. Супруга - 27 лет, беременностей не было. Перенесенные заболевания ИПП - клинически санированы. Проф. вредности - отрицает. Половая жизнь с 16 лет. В СА не служил. В настоящее время половая жизнь регулярная без применения средств контрацепции. (2-3+ в неделю) Посещение бани - редко. Ранее по поводу бесплодия лечился - без эффекта с диагнозом МБ-1. Азооспермия. Результаты обследования: Спермограмма - азооспермия. AZF.CFTR-мутаций не выявлено. Гормоны крови: Тс, ЛГ, ФСГ, пролактин вариант нормы. Ингибин В-319 пг/мл-норма. Исследование эякулята на бактериальную флору - микрофлора не выделена. Бактериальный посев секрета простаты - микрофлора не выделена. При проведении забора биологического материала из тестикулярной ткани и уретры используя способ описанный в примере 1, при условии инкубирования в термостате при температуре 37°С в течение 2 часов. Выявлено наличие инфекции, передаваемое половым путем в невысоком бактериальном титре Urea./ul. и неспецифической инфекции Е. coli в минимальном титре, а также 191 таксон разновидности урогенитального микробиома. Данная клиническая картина потребовала дополнительной предоперационной подготовки и изменила тактику и стратегию ведения пациента, что позволило в последующем сократить экономические затраты и срок реабилитации. В результате проведения протокола ВРТ получена не только прогрессирующая беременность, но и возможность криоконсервации здоровых эмбрионов.
Claims (1)
- Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин, заключающийся в том, что забор образца тестикулярной ткани яичка осуществляют интраоперационно путем биопсии яичка с последующим забором образца из уретры и обрабатывают в физиологическом растворе в стерильных условиях и криоконсервируют при температуре не более -30°С, после чего проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, выделяя пробу интактной ДНК с использованием мини-колонок в настольной микроцентрифуге, добавляют к образцу тестикулярной ткани 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, тщательно перемешивают, вортексируют, инкубируют при 37°С 1-2 часа, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 200 мкл Лизис-буфера, вортексируют 10 секунд, вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 250 мкл связывающего буфера, вортексируют 1 минуту и центрифугируют, мини-колонки помещают внутрь пробирки для образца и переносят жидкость на колонку, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 в 1 мин и добавляют 500 мкл раствора для промывки колонок, центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость, колонку переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюят бактериальной ДНК тестикулярной ткани и образец мазка из уретры криоконсервируют для последующего анализа.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810467C1 true RU2810467C1 (ru) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2232768C2 (ru) * | 2002-10-02 | 2004-07-20 | Лактионов Павел Петрович | Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот |
| RU2485178C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2013-06-20 | Олег Евгеньевич Аникеев | Способ выделения днк |
| WO2014052551A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Cepheid | Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples |
| RU2584346C2 (ru) * | 2014-06-17 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет | Способ выделения нуклеиновых кислот |
| RU2637360C1 (ru) * | 2016-12-02 | 2017-12-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2232768C2 (ru) * | 2002-10-02 | 2004-07-20 | Лактионов Павел Петрович | Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот |
| RU2485178C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2013-06-20 | Олег Евгеньевич Аникеев | Способ выделения днк |
| WO2014052551A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Cepheid | Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples |
| RU2584346C2 (ru) * | 2014-06-17 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет | Способ выделения нуклеиновых кислот |
| RU2637360C1 (ru) * | 2016-12-02 | 2017-12-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| А.С. ГУЛЯЕВ. Способы выделения ДНК из тканей печеночных сосальщиков для последующего использования в ПЦР. Методические положения. 22 марта 2012 г., Протокол N 1. с. 128-129. Каюмов А.Р. Практикум по молекулярной генетике. Учебно-методическое пособие / А.Р. Каюмов, О.А. Гимадутдинов - Казань: Казань, КФУ, 2016. - 36 с.. Marie-Theres Weber et al. Quantification of Bacterial DNA from Infected Human Root Canals Using qPCR and DAPI after Disinfection with Established and Novel Irrigation Protocols. Materials (Basel). 2022 Mar; 15(5): 1911. HONG CHEN et al. Evaluation of Five Methods for Total DNA Extraction from Western Corn Rootworm Beetles. August 2010. Vol. 5. Is. 8. e11963. Pр. 1-6. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Miyaoka et al. | Predictive factors for sperm retrieval and sperm injection outcomes in obstructive azoospermia: do etiology, retrieval techniques and gamete source play a role? | |
| Vicdan et al. | Outcome of intracytoplasmic sperm injection using fresh and cryopreserved‐thawed testıcular spermatozoa in 83 azoospermic men with Klinefelter syndrome | |
| Mohammadi-Sangcheshmeh et al. | G6PDH-activity in equine oocytes correlates with morphology, expression of candidate genes for viability, and preimplantative in vitro development | |
| US10161005B2 (en) | Method for detecting telomerase via washing-free anchored-extension and telomeric-binding amplification, and kit | |
| Schlegel et al. | Cystic fibrosis gene mutations do not affect sperm function during in vitro fertilization with micromanipulation for men with bilateral congenital absence of vas deferens | |
| US20110183332A1 (en) | Method for recovering nucleic acid from stool sample, nucleic acid analysis method and stool sample processing apparatus | |
| Chen et al. | ART strategies in Klinefelter syndrome | |
| RU2810467C1 (ru) | Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин | |
| Wilding et al. | Thaw, biopsy and refreeze strategy for PGT-A on previously cryopreserved embryos | |
| Ocampo et al. | Assessment of Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2 and Versican gene expression profile from the cumulus cells: association with better in vitro fertilization outcomes | |
| Ahmadi et al. | Prevalence of Chlamydia trachomatis, Ureaplasma parvum and Mycoplasma genitalium in infertile couples and the effect on semen parameters | |
| El-Gayar et al. | Transfer of sexed caprine blastocysts freshly collected or derived from cultured morulae | |
| CN114058722A (zh) | 隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法 | |
| Yano | Sexing ofin vitro-fertilized preimplantation mouse embryos by the PCR method | |
| Ghoraeian et al. | Cell-free seminal mRNA of DDX4 and TNP1 genes as potential biomarkers of the presence of sperm in the testicular tissue | |
| Yang et al. | Sample collection methods in upper gastrointestinal research | |
| JP6854024B2 (ja) | 反芻動物の妊娠判定方法 | |
| Lu et al. | Rapid mapping of chromosomal breakpoints: from blood to BAC in 20 days. | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| JP2000264898A (ja) | Ｒｎａの抽出及び長期保存方法 | |
| Homa | Handling unhealthy or poor-quality sperm samples in a medically assisted reproduction laboratory | |
| RU2724856C1 (ru) | Способ подготовки и посева атеросклеротической бляшки для микробиологического исследования | |
| CN113528619A (zh) | 一种提取肺泡灌洗液全核酸的方法 | |
| Tadevosyan et al. | P-074 Sperm deoxyribonucleic acid integrity decreases with age and exhibits a rapid decline beyond the age of 35: a retrospective evaluation of 3446 semen samples | |
| Wildy et al. | The development of a simplified swim-up method for sperm processing |