RU2809735C1 - Способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis (МТБ) методом петлевой изотермической амплификации (LAMP). В реакции амплификации участка последовательности целевого гена используют набор олигонуклеотидных праймеров следующего нуклеотидного состава (5'→3'): (A) праймер 2341FIP TAGCTGCCGGTCCAGGTCTGGTGGTGCGGGCCACTGA, (B) праймер 2341BIP CAACCCAGTCCGGTGGTGTGCTTCGTCGACCGTGAACC, (C) праймер 2341F3 ACCGGACCCCTCGTGT, (D) праймер 2341В3 GATAGACCTGATCGACGCTG, (E) праймер 2341LF ACCCGTTGCCGTTGATC, (F) праймер 2341LB GTGGCACCTGCААСТТСС. Изобретение позволяет быстро и с хорошей чувствительностью определять МТБ в биологических образцах, которые могут содержать клетки микобактерий и которые прошли процедуру выделения и очистки микобактериальной ДНК. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, в частности, к медицинской диагностике. Предлагаемое изобретение может быть использовано для быстрого выявления в биологических образцах генетического материала (ДНК) Mycobacterium tuberculosis (МТБ) с помощью метода петлевой изотермической амплификации. С помощью разработанного набора праймеров можно решать различные научно-исследовательские задачи по эпидемиологическому мониторингу туберкулеза (ТБ), проводить качественный и количественный анализ бактериальной нагрузки в образцах, полученных от пациентов с диагнозом ТБ, для оценки эффективности назначенной схемы антибиотикотерапии. Разработанный способ может найти применение не только в диагностических лабораториях, оборудованных современными термоциклерами, но и в условиях полевых лабораторий при соблюдении необходимых санитарно-эпидемиологических требований. Разработанные олигонуклеотидные праймеры могут использоваться в качестве основного компонента тест-систем для молекулярной диагностики МТБ с помощью методов амплификации нуклеиновых кислот.

Предшествующий уровень техники

Усилия многих стран, направленные на снижение уровня заболеваемости ТБ и поддерживаемые Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), оказались в значительной степени недостаточными в последние несколько лет. В ежегодном отчете ВОЗ по ТБ приводятся сведения о том, что в 2019-2020 гг.из-за глобальной нагрузки на системы здравоохранения, вызванной коронавирусной инфекцией COVID-19, смертность от ТБ выросла на более чем 100 тысяч случаев (1). По самым последним данным ТБ стал причиной смерти примерно 1,6 миллионов человек в 2021 г., среди которых было 187 тысяч ВИЧ-инфицированных пациентов; в 2020 г. зарегистрировано до 1,5 миллионов смертей от ТБ; а в 2019 г. этот показатель был на уровне 1,4 миллионов случаев; таким образом, к настоящему времени количество случаев смерти от ТБ возвратилось к показателям 2017 г. (2). Российская Федерация входит в число десяти лидирующих стран, на долю которых приходится более 90% глобального сокращения числа случаев впервые диагностированного ТБ в 2020-2021 гг. по сравнению с 2019 г. (2). Дальнейшее сокращение заболеваемости и, как следствие, смертности от ТБ во многом зависит от эффективности мер, направленных на повышение доступности диагностики.

Принятым «золотым стандартом» в диагностике ТБ является комплекс классических микробиологических методов (3), включающих бактериологический посев отделяемого верхних дыхательных путей и культивирование МТБ на селективной плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена (не менее 30 дней), окраску микроскопических препаратов по методу Циля-Нильсена, а также определение спектра лекарственной устойчивости полученного изолята микобактерий. Внедрение новых способов культивирования МТБ на жидких питательных средах с помощью автоматизированной системы на основе технологии ВАСТЕС MGIT (BD, США) позволило сократить длительность исследования до 2 недель (4).

Несмотря на ценность классических методов, в диагностике микобактерий часто оказывается востребованным ряд молекулярно-генетических исследований, позволяющих выявить возбудителя и определить лекарственную устойчивость в течение одного дня. Выигранное время можно направить на планирование схемы терапии пациента, его раннее информирование о статусе инфицирования и заблаговременную изоляцию от здоровых людей. Такие меры могут значительно улучшить эпидемиологическую обстановку по ТБ в конкретном населенном пункте и снизить рост заболеваемости в мире.

Современные молекулярно-генетические методы диагностики МТБ основаны на технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Наиболее известными и широко применяемыми способами идентификации МТБ и определения спектра лекарственной устойчивости стали коммерческие тест-системы Xpert MTB/RIF и Xpert MTB/RIF Ultra (Cepheid, США), а также серия отечественных разработок: ТБ-ТЕСТ, ТБ-БИОЧИП-1, ТБ-БИОЧИП-2 (Биочип-ИМБ, Россия). Отметим, что в тест-системе Xpert MTB/RIF в качестве мишени для идентификации МТБ используется ген rpoB (синоним: rv0667), а последняя версия тест-системы Xpert MTB/RIF Ultra дополнительно определяет две другие мишени в мобильных генетических элементах IS6110 и IS1081, которые могут содержаться в геноме МТБ в нескольких копиях и поэтому используются для повышения чувствительности анализа (5). Российские тест-системы ТБ-ТЕСТ и обе модификации ТБ-БИОЧИП на этапе ПЦР-амплификации используют для идентификации МТБ последовательность IS6110, часто применяемую для дифференциации этого патогена от нетуберкулезных микобактерий (НТМ) (6). Преимуществом таких тест-систем является автоматизация некоторых этапов диагностики, высокая информативность анализа и его практическая значимость перед назначением антибактериальной терапии. К недостаткам можно отнести необходимость оснащения лаборатории дорогостоящим специальным оборудованием, а также высокую квалификацию персонала для проведения анализа. Поэтому такие тест-системы обычно применяются в крупных диагностических центрах.

Использование нуклеотидной последовательности IS6110 в качестве молекулярно-генетического маркера МТБ началось более 30 лет назад (7), когда технологии секвенирования генома различных штаммов микобактерий еще не были доступны. Более того, лишь в 2018 г. было окончательно определено систематическое положение всех известных на сегодняшний день разновидностей микобактерий (8). Теперь все изоляты микобактерий, способные вызывать у человека ТБ, относят к одному виду М. tuberculosis, объединяющему в себе несколько вариантов МТБ, рассматриваемых ранее в качестве отдельных видов: var. tuberculosis, africanum, bovis, BCG, caprae, microti, pinnipedii, canettii, mungi, orygis, suricattae, dassie и chimpanzee. Таким образом, была устранена необходимость называть эту группу бактерий термином «комплекс М. tuberculosis», что позволило поставить задачу поиска видоспецифичного маркера МТБ в рамках конкретного биологического таксона.

Именно в последние годы в открытых базах данных появились тысячи полных геномов МТБ и НТМ из самых различных регионов мира. Было проведено множество исследований с целью обнаружения новых генов-мишеней, применимых для диагностики.

Наиболее систематическим исследованием по этой проблеме стала работа по сравнительной геномике микобактерий (9), в которой был установлен ряд важных фактов для обнаружения МТБ методами амплификации. Во-первых, авторами было найдено 30 видоспецифичных молекулярно-генетических маркеров, позволяющих проводить идентификацию МТБ с высокой аналитической специфичностью и ранее не рассматриваемых в качестве мишеней для дифференциальной диагностики МТБ от НТМ. Во-вторых, на большой выборке полных геномов было показано, что мобильный элемент IS6110 не является видоспецифичной для МТБ нуклеотидной последовательностью и может присутствовать в геномах некоторых штаммов НТМ. В-третьих, были проанализированы другие гены, предложенные ранее в качестве видоспецифичных мишеней для диагностики МТБ, и показано их наличие в геномах некоторых штаммов НТМ. Следует заключить, что использование в клинической практике тест-систем, использующих в качестве основной мишени для идентификации МТБ последовательность мобильного элемента IS6110, является некорректным с точки зрения актуальности известных научных данных, поскольку может служить причиной как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов исследований. Последнее приобретает особую актуальность в свете обнаружения на территории Вьетнама, Индии, Ирака и Либерии штаммов МТБ, не имеющих в геноме мобильного элемента IS6110 (10). Штаммы МТБ без данного мобильного элемента могут быть выявлены только с применением альтернативных тест-систем, либо с помощью культивирования.

Таким образом, рациональная стратегия дизайна современных тест-систем для молекулярной диагностики МТБ должна включать в себя поиск новых видоспецифичных генов-мишеней, которые не будут встречаться в штаммах НТМ. Это может способствовать существенному повышению эффективности мер по борьбе с ТБ.

В недавнем обзоре, подготовленном при участии специалистов-фтизиатров ВОЗ (11), были названы характеристики, которым должна отвечать идеальная тест-система для диагностики ТБ: применимость для выявления легочной и внелегочной формы ТБ, минимальные требования к квалификации медицинского персонала, возможность эксплуатации тест-системы в отдаленных населенных пунктах, неприхотливость к оборудованию для проведения амплификации и анализа результатов, высокий уровень специфичности и чувствительности, а также время ожидания результата менее 20 мин.

Для ускоренной диагностики МТБ используют различные методы амплификации ДНК, в частности, метод петлевой изотермической амплификации (LAMP, от англ. loop-mediated isothermal amplification). Принцип метода детально описан в патенте Соединенных Штатов Америки №US 6410278 (опубл. 25.06.2002), патенте-аналоге Российской Федерации №RU 2252964 (опубл. 27.05.2005), а также в соответствующих научных публикациях (12, 13). В основе метода LAMP лежит возможность проведения амплификации ДНК при постоянной температуре с помощью ДНК-полимеразы, обладающей цепь-вытесняющей активностью, а также набора праймеров особой структуры. В процессе амплификации образуются одноцепочечные петлевые участки ДНК, содержащие в себе сайт для гибридизации так называемых внутренних праймеров (FIP и BIP). Внешние праймеры (F3 и В3) участвуют на первых этапах амплификации и позволяют ДНК-полимеразе снять с матрицы синтезированную с помощью внутренних праймеров одноцепочечную молекулу ДНК. Позже было предложено использовать дополнительную пару праймеров, называемых петлевыми (LF и LB), которые предназначены для ускорения реакции (14).

К преимуществам тест-систем на основе LAMP, которые напрямую исходят из технических характеристик данного способа амплификации, можно отнести доступность оборудования для проведения реакции (например, твердотельные термостаты, водяные бани и др.), высокую скорость реакции (30-60 мин), высокую специфичность детекции целевой нуклеотидной последовательности, а также относительную простоту эксплуатации медицинским персоналом, имеющем практический опыт в ПЦР-диагностике. Ниже приведены сведения о наиболее близких технических решениях для идентификации МТБ методом LAMP.

Первый известный способ идентификации МТБ методом LAMP был опубликован в 2003 г. (15) и усовершенствован в 2007 г. (16). Основой этого способа стал набор праймеров для амплификации участков гена gyrB (синоним: rv0005) и мобильного элемента IS6110, который позволял проводить амплификацию и идентификацию ДНК МТБ за 40 минут. Как следует из другой научной публикации (17), именно этот набор праймеров используется в единственной коммерческой тест-системе производства компании Eiken Chemical Co. LTD (Токио, Япония) для идентификации МТБ, получившей рекомендацию ВОЗ для использования в диагностике ТБ (18). В инструкции по эксплуатации данной тест-системы заявляемый предел детекции равен 0,38 геном-эквивалентов на реакцию (https://www.eiken.co.jp/en/ourfields/infection/tb_diagnosis).

По результатам патентного поиска, выполненного в базе Всемирной организации по интеллектуальной собственности PATENTSCOPE (https://patentscope.wipo.int; дата обращения: 09.11.2022), в настоящий момент раскрыто 24 способа идентификации микобактерий методом LAMP (поисковой запрос осуществлялся по ключевым словам: loop-mediated isothermal amplification AND mycobacterium tuberculosis), из которых только 10 основаны на детекции амплификации в режиме реального времени с помощью флуоресцентного красителя и поэтому являются аналогичными заявляемому способу. Ниже рассмотрены их основные характеристики и используемые мишени в геноме МТБ:

1) Известен патент Китая №CN 102154456 (опубл. 17.08.2011), раскрывающий набор праймеров для амплификации фрагмента мобильного элемента IS1081. Длительность амплификации: 60 мин; предел детекции: 100 копий плазмидной ДНК с целевым фрагментом на реакцию.

2) Известен патент Китая №CN 103937884 (опубл. 23.07.2014), в котором описан набор праймеров для амплификации фрагмента мобильного элемента IS6110. Длительность амплификации: 60 мин; предел детекции: 1 фг геномной ДНК МТБ на реакцию.

3) Известен патент Кореи №KR102146666 (опубл. 21.08.2020), содержащий описание набора праймеров для амплификации фрагмента гена gyrB (синоним: rv0005). Длительность амплификации: 75 мин; предел детекции: около 11 нг геномной ДНК МТБ на реакцию.

4) Известен патент Китая №CN111876511 (опубл. 03.11.2020), раскрывающий набор праймеров для амплификации фрагмента гена gyrB (синоним: rv0005). Длительность амплификации: 50 мин; предел детекции: 1 пг геномной ДНК МТБ на реакцию.

5) Известен патент Китая №CN 112126695 (опубл. 25.12.2020), описывающий набор праймеров для амплификации фрагмента мобильного элемента IS6110. Длительность амплификации: от 40 до 60 мин; предел детекции: 10 фг геномной ДНК МТБ на реакцию.

6) Известен патент Китая №CN112501324 (опубл. 16.03.2021), в котором описан набор праймеров для дифференциальной диагностики МТБ и НТМ на основе амплификации фрагментов мобильного элемента IS6110 и гена 16S рРНК (синоним: rrs). Длительность амплификации: от 45 мин; предел детекции: 100 КОЕ/мл.

7) Известен патент Китая №CN 112553350 (опубл. 26.03.2021), в котором для идентификации МТБ использована последовательность IS6110, а для идентификации НТМ следующие участки генома: мобильный элемент IS1245, участок между генами 16S и 23S рРНК, а также гены tuf (синоним: rv0685) и тки (синоним: rv0937c). Длительность амплификации: 60 мин; предел детекции: 10 фг геномной ДНК МТБ на реакцию.

8) Известен патент Кореи №KR 1020210097242 (опубл. 09.08.2021), раскрывающий наборы праймеров для одновременной идентификации МТБ и НТМ по нуклеотидным последовательностям rpoB (синоним: rv0667) и IS6110. Длительность амплификации: до 60 мин; предел детекции: до 0,01 нг геномной ДНК МТБ на реакцию.

9) Известен патент Китая №CN 113969321 (опубл. 25.01.2022), описывающий набор праймеров для идентификации ДНК МТБ с помощью детекции фрагмента гена тpb70 (синонимы: mpt70 и rv2875). Данный способ, в отличие от аналогов, требует цифрового формата амплификации и применения микрофлюидных технологий. Длительность амплификации: до 60 мин; предел детекции: 0,13 фг геномной ДНК МТБ на реакцию.

10) Известен патент Российской Федерации на изобретение №RU 2776163 (опубл. 14.07.2022), в котором описан набор праймеров для детекции консервативной области мобильного элемента IS6110. Длительность амплификации: 30-40 мин; предел детекции: 16 копий плазмидной ДНК на реакцию или 400 КОЕ/мл (определено на искусственной мокроте, контаминированной клетками МТБ).

Было экспериментально показано, что метод LAMP способен различать десятикратную разницу в концентрации гена-мишени (19), поэтому можно утверждать, что все тест-системы на основе LAMP, способные определять 10-99 геном-эквивалентов на реакцию, обладают сходной аналитической чувствительностью.

Основным недостатком описанных способов идентификации ДНК МТБ является продолжительность стадии амплификации, минимальное значение которой составляет 30 мин. Лишь три способа позволяют проводить идентификацию по однокопийному и консервативному гену (патенты Кореи №KR102146666, а также Китая №CN111876511 и №CN 113969321), однако на стадию амплификации в них требуется 50-75 мин.

Наиболее близким аналогом к заявляемому способу идентификации ДНК МТБ методом LAMP по всей совокупности характеристик (копийность мишени в геноме МТБ, длительность стадии амплификации и аналитическая чувствительность) является способ, описанный в патенте Китая №CN 113969321. Описываемый набор праймеров обладает максимальной аналитической чувствительностью, которая теоретически позволяет обнаруживать в одной реакции даже единичное количество геном-эквивалентов, что отчасти достигнуто с помощью цифрового формата проведения реакции и микрофлюидной платформы. Тем не менее, разработчиками данного способа не было предоставлено необходимых экспериментальных результатов, в частности, анализа кривых плавления, позволяющих определить специфичность реакции при малом количестве мишени и отличить возможный положительный сигнал от фоновой неспецифической амплификации. Кроме того, недостатком данного способа является длительность стадии амплификации, которая составляет 60 мин. Для специалиста в данной области техники является очевидным, что сравнимой длительностью амплификации обладают тест-системы для идентификации ДНК МТБ на основе метода ПЦР, которые требуют до 90 мин на проведение исследования. Поэтому можно заключить, что предложенный в данном аналоге способ не раскрывает основных возможностей экспресс-метода LAMP и способствует необходимости дальнейших попыток сокращения длительности стадии амплификации.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка быстрого и чувствительного способа идентификации ДНК МТБ в биологических образцах методом LAMP, применимого для качественной и количественной диагностики. Более точно задачей настоящего изобретения является подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом LAMP участка видоспецифичного и однокопийного гена, характерного только для вида МТБ и не встречающегося в других видах микобактерий и бактериях других таксонов.

Технический результат, достигаемый при использовании настоящего изобретения, заключается в быстром и чувствительном определении МТБ в биологических образцах, которые могут содержать клетки микобактерий и которые прошли процедуру выделения и очистки микобактериальной ДНК. Предлагаемое изобретение может использоваться в клинической лабораторной диагностике МТБ.

Поставленная задача решается благодаря использованию в качестве молекулярно-генетического маркера участка видоспецифичного однокопийного гена lppQ (синоним: rv2341; идентификатор в базе данных NCBI Gene: 886275). Видоспецифичность гена rv2341 в отношении бактерий МТБ ранее была подтверждена с помощью методов сравнительной геномики (9). Основное преимущество использования данного гена-мишени в возможности сократить длительность стадии амплификации LAMP до 15 минут. Наблюдаемый эффект повышения скорости амплификации, вероятно, связан с тем, что разработанные праймеры отжигаются на участок гена (194 п. н.) с минимальным гуанин-цитозиновым (ГЦ) составом, равным 64%. Предлагаемый набор праймеров, таким образом, может применяться для качественной экспресс-диагностики МТБ. Кроме того, благодаря использованию в качестве мишени однокопийного гена в геноме МТБ, становится возможным проведение количественного анализа биологического образца пациента с диагнозом ТБ с целью определения уровня его бактериальной нагрузки, что может найти применение в оценке эффективности схемы антибактериальной терапии.

Таким образом, аспектом настоящего изобретения является предоставление набора олигонуклеотидных праймеров для определения бактерии вида МТБ методом LAMP, имеющих следующую нуклеотидную последовательность (5'→3'):

(A) праймер 2341FIP TAGCTGCCGGTCCAGGTCTGGTGGTGCGGGCCACTGA, или его гомолог,

(B) праймер 2341BIP CAACCCAGTCCGGTGGTGTGCTTCGTCGACCGTGAACC, или его гомолог,

(C) праймер 2341F3 ACCGGACCCCTCGTGT, или его гомолог,

(D) праймер 2341 В3 GATAGACCTGATCGACGCTG, или его гомолог,

(E) праймер 2341LF ACCCGTTGCCGTTGATC, или его гомолог,

(F) праймер 2341 LB GTGGCACCTGCAACTTCC, или его гомолог.

Для специалиста в данной области техники известно, что любое изменение нуклеотидной последовательности праймеров с целью модификации их аналитических характеристик при сохранении возможности их гибридизации с предлагаемым в данном изобретении участком гена rv2341 не может считаться значительным и стать основой нового способа идентификации ДНК МТБ методами амплификации. Поэтому другим аспектом настоящего изобретения является предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что гомологами указанных праймеров являются олигонуклеотиды, сохраняющие уровень идентичности нуклеотидных последовательностей, достаточный для гибридизации с фрагментом целевого гена rv2341.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что указанный ранее фрагмент целевого гена rv2341 с молекулярной массой 194 п. н. имеет следующую нуклеотидную последовательность или гомологичную ей последовательность при условии, что такая гомологичная последовательность (5'→3') сохраняет возможность гибридизоваться с указанными выше праймерами:

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что указанная совокупность олигонуклеотидов представляет собой основу диагностического набора реагентов известным специалисту в данной области техники методом амплификации нуклеиновых кислот с целью выявления в биологических образцах ДНК МТБ.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Схематичное изображение нуклеотидной последовательности гена rv2341 с диаграммой распределения гуанин-цитозинового состава (%ГЦ), расположением предлагаемых олигонуклеотидных праймеров. Нуклеотидная последовательность гена-мишени извлечена из полного генома типового штамма МТБ H37R.V (идентификатор в базе NCBI Nucleotide: NC_000962.3). Молекулярная масса амплифицируемого фрагмента гена rv2341 (координаты в геноме штамма H37Rv: 2619767:2619960), фланкированного праймерами F3 и В3, составляет 194 п. н.; ГЦ-состав 64%.

Фигура 2. Измерение аналитической чувствительности разработанного набора праймеров для амплификации фрагмента гена rv2341 методом LAMP. Сокращения: ОЕФ, относительные единицы флуоресценции; ГЭ, геном-эквивалент; Т_пл, температура плавления. (А) Кривые накопления флуоресцентного сигнала в процессе амплификации при оценке аналитической чувствительности праймеров на серии десятикратных разведений геномной ДНК МТБ (от 400000 до 4 геном-эквивалентов на реакцию). Каждое разведение исследовалось в трех технических повторах (n=3). (Б) Кривые плавления финального продукта амплификации при оценке аналитической чувствительности праймеров на серии десятикратных разведений геномной ДНК МТБ.

Фигура 3. Стандартная кривая, построенная на основе регрессионного анализа экспериментальных данных, полученных на серии десятикратных разведений геномной ДНК МТБ. Сокращения: lg(ГЭ/PC), десятичный логарифм исходного количества копий геномной ДНК МТБ, или геном-эквивалентов, на реакционную смесь.

Фигура 4. Демонстрация применимости внешних праймеров (2341F3 и 2341 В3) для амплификации фрагмента гена rv2341 методом ПЦР. Сокращения: ОЕФ, относительные единицы флуоресценции; Т_пл, температура плавления. (А) Кривые накопления флуоресцентного сигнала в процессе амплификации. (Б) Кривые плавления финального продукта амплификации.

Описание способов осуществления изобретения

В качестве исходного материала для тестирования праймеров использовались образцы очищенной геномной ДНК различных штаммов МТБ (n=7) из коллекции Центра молекулярной медицины и диагностики ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России. Видовая принадлежность образцов геномной ДНК МТБ была подтверждена с помощью набора реагентов для ПЦР-амплификации ПОЛИТУБ (Литех, Россия). На основе данных образцов методом ПЦР с помощью набора реагентов Tersus Plus PCR Kit (Евроген, Россия) и внешних праймеров (2341F3 и 2341 В3) был получен целевой фрагмент гена rv2341 (194 п. н.), содержащий все сайты отжига для разработанного набора праймеров (Фигура 1). Далее проводили лигирование очищенного ПЦР-фрагмента с плазмидным вектором pAL2-T (Евроген, Россия) и проводили процедуру молекулярного клонирования. Полученная плазмидная ДНК с фрагментом гена rv2341 использовалась в промежуточных экспериментах в качестве ДНК-матрицы. Идентичность клонированной нуклеотидной последовательности соответствующему участку гена rv2341 подтверждали с помощью секвенирования плазмидной ДНК по Сэнгеру и сравнением с последовательностью гена rv2341 из полного генома штамма МТБ H37Rv (идентификатор в базе NCBI Nucleotide: NC_000962.3).

Определение бактерии вида МТБ осуществляют, выявляя образование продуктов реакции амплификации участка гена rv2341 или их отсутствие. Для детекции амплификации могут использоваться различные способы визуализации положительной реакции, известные специалисту в данной области техники (например, цветовые индикаторы концентрации различных ионов, агарозный гель-электрофорез, иммунохроматографические тест-полоски для детекции праймеров, меченных биотином и др.). В нижеследующих примерах для детекции амплификации использовали способ, основанный на измерении сигнала флуоресценции интеркалирующего красителя, возрастающего в процессе синтеза ДНК и отслеживаемого в реальном времени. При таком способе детекции не требуется открывать пробирку после реакции, чтобы добавить проявляющий реагент или извлечь амплификат из микропробирок, что означает меньший риск контаминации диагностической лаборатории и используемого оборудования. Более того, данный способ практически не имеет отличий в методиках приготовления реакционной смеси, проведения амплификации и анализа результатов в сравнении со стандартными методами ПЦР-диагностики, поэтому он потребует меньше времени на обучение медицинского персонала.

Пример 1

Аналитическую чувствительность и предел детекции предлагаемого набора праймеров для метода LAMP измеряли с помощью проведения амплификации на серии десятикратных разведений геномной ДНК МТБ (от 400000 до 4 геном-эквивалентов на реакцию). Каждое разведение исследовалось в трех технических повторах (n=3).

В экспериментах использовали следующий состав реакционной смеси и конечные концентрации всех компонентов (на объем реакции 25 мкл): 1 x Isothermal Amplification Buffer (NEB, США); 5 мМ MgSO₄ (NEB, США); 1,4 мМ дНТФ (Биосан, Россия); 0,5 х раствор интеркалирующего красителя EvaGreen (Biotium, США); по 1,6 мкМ внутренних праймеров (2341FIP и 2341BIP; Евроген, Россия); по 0,2 мкМ внешних праймеров (2341F3 и 2341 В3; Евроген, Россия); по 0,8 мкМ петлевых праймеров (2341LF и 2341LB; Евроген, Россия); 8 единиц активности ДНК-полимеразы Bst 2.0 WarmStart (NEB, США). Доводили оставшийся объем реакционной смеси добавлением стерильной деионизованной воды, свободной от нуклеаз (Евроген, Россия). Готовую реакционную смесь раскапывали по тонкостенным низкопрофильным микропробиркам, которые затем переносили в термоциклер с детекцией амплификации в режиме реального времени CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Амплификацию проводили при температуре инкубации 67°С в течение 15 мин с регистрацией сигнала флуоресценции по каналу FAM каждые 30 с, после чего следовала стадия термической инактивации ДНК-полимеразы при 95°С в течение 2 мин, а затем проводилась оценка специфичности амплификации с помощью анализа кривых плавления в диапазоне температур 65-100°С с шагом 0,2°С. Анализ результатов амплификации и все необходимые расчеты проводили с помощью программного обеспечения CFX Manager Software 3.1 (Bio-Rad, США).

Результаты амплификации (Фигура 2) демонстрировали высокую аналитическую чувствительность разработанного набора праймеров, что отражает полученное значение предела детекции в 40 геном-эквивалентов на реакцию. Уникальность предложенного способа идентификации ДНК МТБ заключается в рекордно минимальной длительности стадии амплификации, составляющей всего 15 минут. Специфичность амплификации демонстрировалась с помощью анализа кривых плавления и воспроизводимыми значениями температуры плавления финального амплификата (Т_пл=93,6°С). При детекции геномной ДНК МТБ всех исследуемых разведений сохранялось наличие только одного пика плавления, что указывает на высокую специфичность реакции.

С помощью построения стандартной кривой (Фигура 3) на основе полученных экспериментальных данных было установлено значение эффективности амплификации на основе разработанного набора праймеров, составившее 152,4% (R=0,977).

Пример 2

Некоторые фланкирующие пары праймеров из предлагаемого в настоящем изобретении набора и их сайты отжига могут использоваться не только для амплификации методом LAMP, но и методом ПЦР. Для данного эксперимента использовали набор реагентов Tersus Plus PCR Kit (Евроген, Россия) и готовили реакционную смесь согласно инструкции производителя, добавляя лишь 1х раствор интеркалирующего красителя EvaGreen (Biotium, США) и 0,4 мкМ каждого внешнего праймера (2341F3 и 2341 В3). Готовую реакционную смесь раскапывали по тонкостенным низкопрофильным микропробиркам, которые затем переносили в термоциклер с детекцией амплификации в режиме реального времени CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Амплификацию проводили по следующей программе: 95°С в течение 3 мин; 35 циклов: 95°С в течение 10 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 15 с. Затем проводилась оценка специфичности амплификации с помощью анализа кривых плавления в диапазоне температур 65-100°С с шагом 0,2°С. Каждая реакция амплификации проводилась в трех технических повторах (n=3). В качестве матрицы использовали очищенную геномную ДНК в концентрации 400000 геном-эквивалентов на реакцию. Таким образом, было показано, что пара внешних праймеров (2341F3 и 2341 В3) пригодна для специфичной ПЦР-амплификации участка гена rv2341, идентичного определяемому участку гена в методе LAMP (Фигура 4).

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучшие способы осуществления, для специалиста в данной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения в условиях реакции, а также в составе реакционной смеси, и что такие изменения не выходят за рамки настоящего изобретения. По совокупности озвученных характеристик данный способ идентификации ДНК МТБ методом LAMP не имеет аналогов в мире, ни по используемой нуклеотидной последовательности мишени в геноме МТБ, ни по длительности стадии амплификации, ни по аналитической чувствительности праймеров.

Источники информации

1. Global tuberculosis report 2021. // Geneva: World Health Organization. 2021. https://www.who.int/publications/i/item/9789240037021

2. Global tuberculosis report 2022. // Geneva: World Health Organization. 2022. https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2022

3. Wallace E., Hendrickson D., Tolli N., Mehaffy С, Репа M., Nick J.A., Knabenbaur P., Watkins J., Simpson A., Amin A.G., Chatterjee D., Dobos К.M., Lahiri R., Adams L., Strong M., Salfinger M., Bradford R., Stedman Т.Т., Riojas M.A., Hazbon M.H. // Methods Mol. Biol. 2021. V. 2314. P. 1-58.

4. Kontos F., Maniati M., Costopoulos C., Gitti Z., Nicolaou S., Petinaki E., Anagnostou S., Tselentis I., Maniatis A.N. // J. Microbiol. Methods. 2004. V. 56. P. 291-294.

5. Opota O., Mazza-Stalder J., Greub G., Jaton K. // Clin. Microbiol. Infect. 2019. V. 25. P. 1370-1376.

6. Nosova E.Y., Zimenkov D.V., Khakhalina A.A., Isakova A.I., Krylova L.Y., Makarova M.V., Galkina K.Y., Krasnova M.A., Safonova S.G., Litvinov V. I., Gryadunov D.A., Bogorodskaya E.M. // PLoS One. 2016. V. 11. P. e0167093.

7. Thierry D., Brisson-Noel A., Vincent-Levy-Frebault V., Nguyen S., Guesdon J. L., Gicquel B. // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 2668-2673.

8. Riojas M. A., McGough K. J., Rider-Riojas C.J., Rastogi N., Hazbon M.H. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2018. V. 68. P. 324-332.

9. Goig G.A., Torres-Puente M., Mariner-Llicer C, Villamayor L.M., Chiner-Oms A., Gil-Brusola A., Borras R., Comas Espadas I. // Bioinformatics. 2020. V. 36. P. 985-989.

10. Lok К.H., Benjamin W. H. Jr., Kimerling M.E., Pruitt V., Lathan M., Razeq J., Hooper N., Cronin W., Dunlap N.E. // Emerg. Infect. Dis. 2002. V. 8. P. 1310-1313.

11. Garcia-Basteiro A.L., DiNardo A., Saavedra В., Silva D.R., Palmero D., Gegia M., Migliori G.В., Duarte R., Mambuque E., Centis R., Cuevas L. E., Izco S., Theron G. // Pulmonology. 2018. V. 24. P. 73-85.

12. Notomi Т., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa Т., Watanabe K., Amino N., Hase T. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. e63.

13. Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T. // Nat. Protoc. 2008. V. 3. P. 877-882.

14. Nagamine K., Hase Т., Notomi T. // Mol. Cell. Probes. 2002. V. 16. P. 223-229.

15. Iwamoto Т., Sonobe Т., Hayashi K. // J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41. P. 2616-2622.

16. Boehme С.C., Nabeta P., Henostroza G., Raqib R., Rahim Z., Gerhardt M., Sanga E., Hoelscher M., Notomi Т., Hase Т., Perkins M.D. // J. Clin. Microbiol. 2007. V. 45. P. 1936-1940.

17. Rakotosamimanana N., Lapierre S.G., Raharimanga V., Raherison M.S., Knoblauch A.M., Raherinandrasana A.H., Rakotoson A., Rakotonirina J., Rasolofo V. // BMC Infect. Dis. 2019. V. 19. P. 542.

18. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: diagnosis - rapid diagnostics for tuberculosis detection. // Geneva: World Health Organization. 2021. https://www.who.int/publications/i/item/9789240029415

19. Schoepp N.G., Schlappi T.S., Curtis M.S., Butkovich S.S., Miller S., Humphries R.M., Ismagilov R.F. // Sci. Transl. Med. 2017. V. 9. P. eaa13693.

Claims (10)

1. Способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), отличающийся тем, что в реакции амплификации участка последовательности целевого гена используют набор олигонуклеотидных праймеров следующего нуклеотидного состава (5'→3'):

(A) праймер 2341FIP TAGCTGCCGGTCCAGGTCTGGTGGTGCGGGCCACTGA,

(B) праймер 2341BIP CAACCCAGTCCGGTGGTGTGCTTCGTCGACCGTGAACC,

(C) праймер 2341F3 ACCGGACCCCTCGTGT,

(D) праймер 2341В3 GATAGACCTGATCGACGCTG,

(E) праймер 2341LF ACCCGTTGCCGTTGATC,

(F) праймер 2341LB GTGGCACCTGCААСТТСС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагмент целевого гена rv2341 кодируется следующей нуклеотидной последовательностью (5'→3'):

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным способом определяют бактерию вида Mycobacterium tuberculosis в биологических образцах, содержащих бактериальную геномную ДНК, таких как мокрота, бронхоальвеолярный лаваж и биоптат легкого.