CN116194597A - 用于耐药性筛选的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及新型引物,以及它们用于检测来自疑似或确诊结核病的受试者的样品中的耐药突变的存在的用途。
Description
技术领域
本申请所涉及的发明是一种新的诊断方法和引物和/或药物敏感性测试(DST)试验。尤其地,本发明涉及新型引物和它们在识别和/或检测来自疑似或确诊结核病的受试者的样品中的耐药性突变的存在的方法中的用途。
背景技术
分枝杆菌和结核病
主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)1,2导致的结核病(TB)是对全球健康有影响的疾病3–5。在结核分枝杆菌复合群(MTBc)中结核分枝杆菌和相关细菌出现于至少11000年前,并且自那时起一直与它们的宿主共同进化6,7。这一历史导致了高传染性细菌分类群,其在它们的宿主中长期存在并且具有先进的免疫系统逃逸方法7。
由于这种共同进化,现代结核分枝杆菌(M.tuberculosis)和MTBc的成员共有许多特征,并且与非结核分枝杆菌(NTM)群7,8的成员共同存在于每个已知环境中(极地区域除外)。MTBc由10种能够在它们的宿主中导致TB或类似TB的疾病的分枝杆菌组成,其中三种专属人类的TB物种是狭义结核分枝杆菌、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canettii)和非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)1,7,9。此外,从牛(牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis))、山羊和绵羊(Mycobacterium caprae)、海豹和海狮(Mycobacterium pinnipedii)和啮齿动物(田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti))传播到人类,反之亦然的人畜共患TB的传播被充分证实4,6,7。目前,新增了三个物种,牛和羚羊中的Mycobacterium orygis7 ,10、狐獴中的Mycobacterium suricattae7,11和獴科中的Mycobacterium mungi7,12。
目前的研究发现,MTBc成员是高度基因同质的,具有高达99.7%的核苷酸同源性,并且具有相同的16S序列7。MTBc成员主要是克隆的,具有较少水平基因转移,这使得在遗传水平上很难区分不同物种,也不可能采用显微镜法2,4,6,13。
分枝杆菌是革兰氏阳性抗酸杆菌,约2μm长,其主要通过气溶胶传播;它们是完全在细胞内的,并且在它们特有的宿主之外没有已知的环境库1,7,14。富含脂质的细胞壁和肽聚糖层、脂聚糖层、分枝菌酸层和蜡质层形成极其顽强的微生物7,14。许多分枝杆菌和MTBc的全部成员的典型特征是在培养基中和体内挑剔并且生长速度缓慢2,6,15,16。
结核病最常表现为肺部疾病(约80%的情况),尽管肺外和弥散性疾病的形式也有发生1,2,17。分枝杆菌疾病对全球中低收入和发展中国家(LMICs)造成高疾病负担3,6,18。据世界卫生组织(WHO)估计,三分之一的人口携带潜伏性TB(LTBI),每年有900万至1100万例TB病例19。全球每年死于TB的人数估计在150万至200万,这使得TB成为感染相关死亡的最大单一威胁6,20,21。
分枝杆菌耐药性
WHO定义耐药性为微生物对曾经能够治疗该微生物感染的抗菌药物的抵抗力。TB的耐药性(DR)菌株的出现很大程度上是治疗方案的不一致实践、延迟治疗和/或患者在长期治疗过程中违约的结果,这导致耐药性的阳性选择和宿主间抗性菌株转移的更高发生率3,22,23。
目前有几种类型的耐药性TB:多重耐药(MDR)型,其至少对利福平和异烟肼有耐药性;广泛耐药(XDR)型,其增加了对任何氟喹诺酮类药物和至少一种二线注射用药有耐药性,超出了在MDR中发现的耐药性;极端耐药(XXDR)型,其对所有一线和二线药物有耐药性;和全耐药(TDR)型,其对目前所有TB药物有耐药性16,24。此外,在MTBc中的一些物种具有谱系特有的内在耐药性,例如牛分枝杆菌(M.bovis)和卡氏分枝杆菌(M.canettii),如果其被误诊会使得控制耐药性的方法复杂化2,22,24。
耐药性TB(DR-TB)随着发病率的增加成为全球日益严重的问题21,22,25。令人担忧的是,耐药菌株将逆转在消灭TB方面取得的进展6,22,23。过去十年,全球范围内耐药TB的发病率增加了至少10倍,2009年仅4.9%的患者表现出耐药性,而2018年为51%19。在2018年,全球约1050万TB病例有近500000例是MDR,并且其中有31000(6.2%)是XDR19。
MDR-TB是最常见的耐药性类型16,24。MDR被定义为对异烟肼和利福平有耐药性的TB菌株25。MDR-TB菌株通常采用WHO认可的传统药物方案治疗,该方案需要6个月的一线和二线抗生素疗程。XDR-TB是增加对任何氟喹诺酮类和阿米卡星、卷曲霉素或卡那霉素的二线药物的耐药性的MDR菌株25,26。治疗XDR-TB的具体方案的选择可以在可行的情况下通过培养基或分子(例如基因型MTBDRsl-Bruker)药物敏感性测试(DST)试验6,26,27进行指导。由于在诊断和治疗TB的MDR菌株和XDR菌株中的困难,这些病例的死亡率很高,MDR的死亡率约为50%,XDR-TB感染的死亡率超过70%25。
针对TB的一线治疗是抗生素的组合;利福平、异烟肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺使用超过6个月。对这些抗生素治疗方法的耐药性导致二线抗生素的使用(氟喹诺酮类药物、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素),其效果更差并且毒性更大24,25。这些治疗方法通常需要注射,这需要更先进的医疗设备和对治疗的监督24。
分枝杆菌中的耐药性是突变的,而不是可转移的,在过去十年中,许多单核苷酸多态性(SNP)已经被报道与耐药性相关。然而,不是所有都在文献中有充足的证据来支持这种关联。世界卫生组织(WHO)和其他组织将已经报道的耐药性SNP分为高、中和低置信等级28,29。
下一代靶向测序
WHO宣布了到2035年有效消灭TB的目标,并发布了如何在2015年实现这一目标的指导方针22,23,25,30。WHO确定的消灭战略的核心是呼吁采用新的诊断技术和更快速的药物敏感性测试(DST)能力23,30–32。进一步的要求是这些技术能够有效用于TB负担很高并且普遍缺乏医疗基础设施的高发病率、资源匮乏的国家6,21,30。
用于MTb检测和抗生素耐药性研究的非分子“金标准”是培养来自患者的样品。但是,培养需要训练有素的实验技术人员并且通常非常缓慢。目前用于MTb检测和利福平(RIF)耐药性研究(MDR-TB的替代指标)的“金标准”分子试验是Xpert MTb/RIF测定法,这是一种能够快速给出结果的基于盒(cartridge-based)的核酸扩增测试。这个测试容易使用,但是它只能识别RIF耐药性,因此不能诊断XDR-TB33。
FIND(创新诊断基金会)Seq&Treat项目(https://www.finddx.org/tb/seq-treat/)特别呼吁开发基于下一代靶向测序(tNGS)的DR-TB测试,该测试可以由FIND评估并且有可能被WHO认可。基于测序的测试具有检测所有耐药性相关的SNP的潜力,从而确定哪种药物对感染患者的MTB菌株最有效(Kayomo et al.Sci Rep 10,10786(2020).https://doi.org/10.1038/s41598-020-67479-4)。
tNGS能够采用下一代测序对基因组的特定区域进行测序,以检测感兴趣区域中的变异。有不同方法进行靶向测序,最常见的是扩增子测序,其使用PCR引物以扩增感兴趣的序列。
当待靶向多个基因时,多重聚合酶链式反应(多重PCR)可用于同时扩增几个不同DNA靶标序列。这个过程在热循环仪中采用多重引物和温度调控的DNA聚合酶在样品中来扩增DNA。
由于耐药性SNP存在于整个基因组的多个位点上,多个区域需要通过PCR被靶向。多重PCR对在单独反应中单个区域的扩增提供巨大优势,包括更高通量、节约成本(更少的脱氧核苷酸三磷酸腺苷、酶和其他所需消耗品)、周转时间和从有限的起始材料产生更多数据。
但是,多重PCR的引物设计是复杂的。引物必须具有相同的退火温度,每一对都需要对其靶标是特定的,并且引物对应扩增相同大小的PCR产物以保证在反应中多个靶标之间相同的扩增效率。此外,由于多重反应中引物之间的相互作用会降低扩增效率,反应中的引物越多,这种情况越可能发生。设计高效、灵敏且特异的多重PCR是富有挑战的,并且不能保证成功。
由Genoscreen开发的Myc-TB是基于Illumina短读测序34,35,用于预测对15种抗结核病药物的耐药性的靶向DR-TB测试的一个示例(已经开发了其他测试,但全部具有相似的灵敏度和周转时间)。这个测试花费约2天来进行并具有约1000个MTB细胞的检测限制。目前仍需要更快速且灵敏的测试。
本发明的目的在于解决上述问题并且满足上述需求。因此,本发明的目的在于提供一种使用tNGS以快速且准确地检测和/或识别来自疑似或确诊TB的受试者的样品中耐药性突变的存在的方法。进一步的目的在于开发用于实现该目标的引物,聚焦于开发用于多重PCR的引物。本发明的另一个目的在于提供解决上述问题的试验或试剂盒。
发明内容
选择了已知赋予对一线和二线抗TB药物的耐药性的单核苷酸多态性(SNP),并且针对所选靶标开发了引物并优化了其在多重PCR中的使用。基因靶标是eis、embB、rrs、rv0678、fabG1、gyrA、rpoB、ethA、rplC、katG、gidB、inhA、rrl、pncA、rpsL、tlyA。
因此,第一方面,提供了一种或多种寡核苷酸引物集,所述一种或多种寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌复合群(M.tuberculosis complex)中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分,所述一种或多种基因选自包括或由eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种组成的组,其中,每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物,其中,每个引物具有如在SEQ ID No.1-33所示的序列。优选地,所述一种或多种引物集选自SEQ ID No.1-32。
在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成:SEQ IDNo.1和2;3和4;5和6;7和8;9和10;11和12;13和14;15和16;17和18;19和20;21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;31和32;和19和33中的一种或多种。
在一些实施方式中,所述一种或多种基因的部分包括一种或多种突变,优选地,赋予耐药性的一种或多种突变,优选地其中,所述一种或多种突变是一种或多种赋予抗生素耐药性的单核苷酸多态性。在一些实施方式中,所述抗生素耐药性是对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的耐药性。
在一些实施方式中,所述一种或多种基因来自MTBc。
在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集可用于多重PCR。因此引物集可分为多重组。在一些实施方式中,可以形成一个或多个多重组。在一些实施方式中,可以形成多重组,每个多重组都包括如SEQ ID No.1-33中,优选地SEQ ID No.1-32所示的一个或多个寡核苷酸引物集。在一些实施方式中,可以形成一个或多个多重组,每个多重组都包括寡核苷酸引物集,所述寡核苷酸引物集包括或由SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;9和10;11和12;13和14;15和16;17和18;19和20;21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;31和32;和19和33中的一种或多种组成。
在一些实施方式中,多重组可包括用于扩增eis、embB、rrs、rv0678和fabG1(第1组)的部分的寡核苷酸引物集。在另一个实施方式中,多重组可包括用于扩增gyrA、rpoB、ethA、rplC和katG(第2组)的部分的寡核苷酸引物集。在另一个实施方式中,多重组可包括用于扩增gidB、inhA、rrl、pncA、rpsL和tlyA(第3组)的部分的核苷酸引物集。因此,在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集的组包括以下项或由以下项组成:SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。
因此,在一个实施方式中,提供寡核苷酸引物集的一个或多个多重组,所述寡核苷酸引物集用于扩增来自MTBc中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的基因的部分,所述基因选自包括以下项的作用或由以下项组成的组:eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种,其中,每个寡核苷酸引物集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物或由特异于所述部分的一对正向和反向引物组成,其中,所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成或由SEQ IDNo.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。
在一些这种实施方式中,所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成:SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ IDNo.11和12;13和14;15和16;17和18;以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成SEQID No.1和2;3和4;5和6;7和8;以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种。在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成SEQ ID No.11和12;13和14;15和16;17和18;以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种。在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集的多重组包括以下项或由以下项组成SEQ ID No.21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。
第二方面,提供一种多重PCR反应混合物,所述混合物包括寡核苷酸引物集的一个或多个组,所述寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分,所述一种或多种基因选自包括以下项的组或由以下项组成的组:eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种,其中,每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物,其中,所述寡核苷酸引物集的组包括以下项或由以下项组成:SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。
在一些实施方式中,多重PCR反应混合物包括寡核苷酸引物集的组,所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成:SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ ID No.11和12;13和14;15和16;17和18;以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。在一个实施方式中,多重PCR反应混合物包括寡核苷酸引物集的组,所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成:SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;以及9和10(表7中的第1组)。在另一个实施方式中,多重PCR反应混合物包括寡核苷酸引物集的组,所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成SEQ ID No.11和12;13和14;15和16;17和18;以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种。在另一个实施方式中,多重PCR反应混合物包括寡核苷酸引物集的组,所述寡核苷酸引物集包括以下项或由以下项组成SEQ ID No.21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;以及31和32(表7中的第3组)。
多重PCR反应混合物可包括进行多重PCR所需的其他成分和试剂,例如缓冲液、碱磷酸去氧核苷酸(dNTP)、DMSO、水和DNA聚合酶。
在多个实施方式中,所述引物可混合为0.2μM的工作浓度。此外,为了一致的靶标扩增,通常需要0.3μM的工作浓度的tlyA除外。
在一些实施例中,来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的所述一种或多种基因的部分从来自疑似或确诊TB的受试者的样品中获得。样品可以是从受试者获得的一种或多种组织和/或体液,包括痰液;尿液;血液;血浆;血清;滑液;脓;脑脊液;胸膜液;心包液;腹水;汗液;唾液;泪液;阴道分泌物;精液;组织间液;支气管肺泡灌洗液;支气管冲洗液;胃灌洗液;胃冲洗液;经气管或支气管细针抽吸液;骨髓;胸膜组织;来自淋巴结、纵隔镜检查、胸腔镜检查或经支气管活检的组织中的一种或多种;或它们的组合;或从疑似有或确诊有TB的受试者获得的一种或多种组织和/或体液的培养标本。通常,样品包括来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的细胞和/或DNA。
第三方面,提供一种检测和/或识别在包括来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的DNA的样品中一种或多种突变的存在的方法,所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性,所述方法包括以下步骤:
(a)从所述样品中分离或提取DNA;
(b)采用根据第一方面所述的寡核苷酸引物集的一个或多个组通过多重聚合酶链式反应来扩增相关基因区域或扩增子;
(c)将扩增的基因区域或扩增子进行DNA测序;以及检测一种或多种突变。
在一些实施方式中,所述突变发生在选自由eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种组成的组的一种或多种基因中。
在一些实施方式中,所述突变是一种或多种单核苷酸多态性。
在一些实施方式中,所述抗生素耐药性是对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的耐药性。
扩增步骤使用寡核苷酸引物集的一个或多个组。在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集的组包括一种或多种正向和反向引物对或由一种或多种正向和反向引物对组成,所述一种或多种正向和反向引物对选自SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;9和10;11和12;13和14;15和16;17和18;19和20;21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;31和32以及19和33。
在一些实施方式中,所述寡核苷酸引物集的一个或多个组包括以下项或由以下项组成:SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ IDNo.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。在一些实施方式中,所述扩增步骤使用由SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(第1组)组成的寡核苷酸引物集的组。在一些实施方式中,所述扩增步骤使用由SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(第2组)组成的寡核苷酸引物集的组。在一些实施方式中,所述扩增步骤使用由SEQ IDNo.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(第3组)组成的寡核苷酸引物集的组。
检测到突变表明有抗生素耐药性。识别所述突变告知或允许对抗生素耐药性的性质的识别(即细菌对抗生素有耐药性)。
因此,第四方面,提供预测结核病患者是否会对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺和莫西沙星中的一种或多种的治疗产生反应的方法,所述方法包括在一种或多种基因中检测一种或多种耐药突变的存在的步骤,所述一种或多种基因选自包括来自所述患者的样品中获得的DNA中的eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种的组,所述方法包括:
(a)从所述样品中分离或提取DNA;
(b)采用根据第一方面所述的寡核苷酸引物集的一个或多个组通过多重聚合酶链式反应来扩增相关基因区域或扩增子;
(c)将扩增的基因区域或扩增子进行DNA测序;以及
检测所述一种或多种突变。
在一些实施方式中,所述方法是用于预测结核病患者是否对乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素中的一种或多种的治疗产生反应,其中所述一种或多种基因是eis、embB、rrs、rv0678和fabG1;以及所述寡核苷酸引物集的组由SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)组成。
在一些实施方式中,所述方法是用于预测结核病患者是否对异烟肼、利福平、环丙沙星、乙硫异烟胺、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的治疗产生反应,其中所述一种或多种基因是gyrA、rpoB、ethA、rplC和katG;以及所述寡核苷酸引物集的组由SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)组成。
在一些实施方式中,所述方法是用于预测结核病患者是否对吡嗪酰胺、链霉素、卷曲霉素和乙硫异烟胺中的一种或多种的治疗产生反应,其中所述一种或多种基因是gidB、inhA、rrl、pncA、rpsL和tlyA;以及所述寡核苷酸引物集的组由SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)组成。
在根据第三或第四方面的一些实施方式中,所述DNA来自结核分枝杆菌。
在根据第三或第四方面的一些实施方式中,所述样品是临床样品。所属样品可以是从疑似有或确诊有TB的受试者获得的一种或多种组织和/或体液,包括痰液;尿液;血液;血浆;血清;滑液;脓;脑脊液;胸膜液;心包液;腹水;汗液;唾液;泪液;阴道分泌物;精液;组织间液;支气管肺泡灌洗液;支气管冲洗液;胃灌洗液;胃冲洗液;经气管或支气管细针抽吸液;骨髓;胸膜组织;来自淋巴结、纵隔镜检查、胸腔镜检查或经支气管活检的组织中的一种或多种;或它们的组合;或从疑似有或确诊有TB的受试者获得的一种或多种组织和/或体液的培养标本。通常,样品包括来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的细胞和/或DNA。在一些实施方式中,所述样品是来自疑似或确诊有TB的受试者的痰液样品。
在一些实施方式中,样品经历机械破碎以破坏样品中的细胞并且实现细胞裂解。任何合适的方法都可以使用,例如珠磨破碎(bead beating)。
从样品中分离和提取DNA的步骤可通过任何合适的方法进行,包括使用给定或标准方法来使用合适的试剂盒。例如,来自Promega AS1660的具有使用说明书的Maxwell RSC纯食品病原体试剂盒(Maxwell RSC PureFood Pathogen Kit)。在一些实施方式中,可以使用来自Promega AS1660的Maxwell RSC纯食品病原体试剂盒。在一些这种实施方式中,根据试剂盒说明书进行了以下调整:试剂盒教导使用800μl样品;在一些实施方式中,使用400μl珠磨破碎后的样品。试剂盒教导加入200μl裂解缓冲液A并且在56℃下伴随震荡孵育4min;在一些实施方式中,加入200μl裂解缓冲液A和40μl蛋白酶k,在65℃下孵育10min。试剂盒教导加入300μl裂解缓冲液,然后将样品放置在自动操作装置中;在一些实施方式中,加入300μl裂解缓冲液和400μl的PBS,然后将样品放置在自动操作装置中。
在根据第三和第四方面的实施方式中,其中多于一组的引物集用于扩增步骤,每组都可以作为单独的多重组模板运行。
标记的核苷酸或标记的引物可用于DNA扩增,例如用于质量控制。例如,可以加入荧光DNA结合染料,从而能够进行DNA定量。可以使用任何合适的染料或具有染料的探针,例如具有荧光染料的探针,例如使用诸如Roche480SYBR Green I master的sybrgreen试验。
在其中多于一组的引物集用于扩增步骤并且每组都可以作为单独的多重组模板运行的实施方式中,一种或多种多重组模板可以合并以制作用于DNA定量和/或测序的单个模板。
然后样品可经历条形码连接(barcode ligation)和适配子连接(adaptorligation)以创造用于测序的库。当每个样品需要的数据的量小于可以产生的数据总量时,可以使用条形码:这能够合并多个样品并且将它们一起测序。可以使用任何合适的方法,包括使用给定或标准方案来使用条形码试剂盒。例如,牛津纳米孔科技(Oxford NanoporeTechnologies)提供具有无扩增条形码扩展试剂盒96(EXP-NBD196和SQK-LSK109)的扩增子条形码,其包括使用说明书。在一些实施方式中,可以按照所提供的使用说明书使用具有无扩增条形码扩展试剂盒96(EXP-NBD196和SQK-LSK109)的牛津纳米孔科技扩增子条形码。
DNA测序步骤可以通过任何合适的方法进行。在优选实施方式中,DNA测序是tNGS或第三代测序(也被称为长读测序)。第三代测序可以使用牛津纳米孔科技的MinION或PacBio的单分子实时测序平台(SMRT)来进行。牛津纳米孔的测序技术是基于检测DNA片段移动经过纳米孔时通过纳米孔的电流变化。电流随着碱基G、A、T和C以不同组合经过该孔产生可测量的变化。SMRT是基于零模波导的特性。每个核苷酸以荧光发射的形式发出的信号通过被绑定在zL孔底部的DNA聚合酶合并。在优选实施方式中,所述测序是长读纳米孔测序。
检测一种或多种突变的步骤可以通过任何合适的方法进行,例如合适的生物信息学工具和程序。在一些实施方式中,牛津纳米孔科技的TB工作流可在带有FASTQ TBRESISTANCE PROFILE v2020.03.11的桌面软件EPI2ME中使用。
第一方面的寡核苷酸引物集、第二方面的PCR反应混合物和/或第三方面的方法可用于识别来自特定受试者的TB细菌的基因中耐药性突变的存在和身份。这些信息为关于药物管理的决策提供依据并且能够基于识别的突变为患者确定量身定制的治疗方案。
同样地,第五方面,提供一种用于为结核病患者确定合适的抗生素治疗方案的方法,所述方法包括根据第三方面检测和/或识别在来自患者的样品中一种或多种突变的存在,所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性,以及基于检测/识别的突变确定合适的抗生素方案。本公开还提供一种为结核病患者安排一定数量的治疗途径中的一种,所述方法包括使用根据第三方面的方法检测和/或识别在来自患者的样品中一种或多种突变的存在,所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性,以及基于检测/识别的突变为患者安排治疗方案。
第六方面,提供一种试剂盒,所述试剂盒包括根据第一方面的一种或多种寡核苷酸引物集或寡核苷酸引物集的组。所述试剂盒可用于执行根据第三方面的步骤(a)、(b)或(c)中的一种或多种的方法。所述试剂盒还可包括执行根据第三方面的步骤(a)、(b)或(c)中的一种或多种的方法所需的成分和试剂,包括缓冲液、DNA聚合酶和核苷酸。在一些实施方式中,所述试剂盒还包括扩增引物中基因区域所需的试剂。所述试剂盒还可包括用于收集样品的样品收集容器。可根据第三方面的方法立即处理样品,或者可将它们在低温下储存,例如在进行该方法之前储存在冰箱或冰柜中。在进行该方法之前,可处理样品。例如,可进行沉降试验,和/或加入防腐剂和/或稀释剂。因此,样品收集容器可含有合适的处理溶液,例如缓冲液、防腐剂和稀释剂。
根据本公开的基因靶标和它们对应的引物对示于表1。
表1
附图说明
为了更好地理解本发明并且展示如何有效进行本发明的实施例,现将以示例的方式参考附图,其中:
图1:显示多重引物的巢式qPCR扩增的qPCR曲线;
图2:每个三重反应中产生的扩增子的片段大小分析。A1-梯度,B1-三重组1,C1-三重组2,D1-三重组3,E1-三重组4和F1-三重组5;
图3:在多重版本4第1组中测试单个基因靶标的扩增效率的巢式qPCR结果的示例;
图4:五重PCR产物的TapeStation图像;
图5:在多重组配方7中基因靶标的巢式qPCR结果;
图6:在多重组配方9的第2组中的基因靶标的巢式qPCR结果。
具体实施方式
可检测的耐药性SNP
所选的靶标单核苷酸多态性(SNP)赋予对一线和二线抗TB药物的耐药性,其主要选自WHO下一代测序技术指南中发表的WHO/FIND依据36。针对rpsL的靶标选自先前Karimi等人和Meier等人37,38的文献。针对gidB的靶标是根据Villellas等人39的依据来选择的。针对ethA的靶标是根据Morlock等人40的依据来选择的。针对embB的靶标是根据Zhao等人41的依据来选择的。最后,针对tlyA的靶标选自先前Maus等人42的文献。
碱基位置和所列出来的基因基于可从NCBI数据库(NC_000962.3)中获得的结核分枝杆菌H37Rv菌株参考基因组43。靶向突变被识别为它们的密码子位置或它们的核苷酸位置。当SPN出现在注释基因区域时,通过被它们影响的密码子来识别突变,并且先前的文献明确阐述了被改变的氨基酸。如果靶标出现在基因启动子区域时,或者支撑文献没有明确识别氨基酸突变,则通过核苷酸突变来列出靶标。这些启动子区域SNP进一步通过在其位置之前的“-”来识别,表明它在注释基因之前出现。突变碱基的影响也包括在内;例如天冬酰胺到组氨酸或核苷酸A到核苷酸C(附件表A)
多重组优化
针对所选的基因/启动子靶标(n=16;表2)开发引物,其扩增了包括感兴趣的靶标的SNP在内的约1000bp区域。如上所讨论的,在多重反应中引物间的相互作用可降低扩增效率,并且在反应中引物越多,这种情况越可能发生。因此,设计高效、敏感且特定的多重PCR是复杂的。
表2:赋予耐药性的基因的详情
下列基因在DR-TB测序试验中被靶向:eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678、tlyA。最初,基因靶标引物对被分为5个集,每集3个(表3)。DNA从牛分枝杆菌中提取,并且用于测试三重试验的特异性和灵敏度。
表3:每个三重组的基因靶标
基因靶标1 | 基因靶标2 | 基因靶标3 | |
三重组1 | Eis | ethA | embB |
三重组2 | pncA | gyrA | rpoB |
三重组3 | fabG1/inhA | rrs | gidB |
三重组4 | rv0678 | rplC | katG |
三重组5 | tlyA | rpsL | rrl |
多重PCR按照以下方式进行:
每个反应:
5μl DNA(浓度约20ng)
25μl Qiagen 2x Multiplex Master Mix
10μL Qiagen 5x Q-Solution
2.5μl(10μM,最终浓度0.2μM)正向多重引物
2.5μl(10μM,最终浓度0.2μM)反向多重引物
5μl分子H2O
PCR条件:
在来自多重PCR的扩增产物上进行巢式qPCR以评估所有靶标的扩增。对所有扩增产物的巢式PCR产生了非常相似的Ct值,表明所有引物的扩增效率相同(图1)。预计在约1000bp的多重PCR扩增子的片段大小分析显示仅在三重组2和三重组5中看到具有附加扩增子带的最小非特异性扩增(图2:A1-梯度,B1-三重组1,C1-三重组2,D1-三重组3,E1-三重组4和F1-三重组5)。
当三重实验很好地运行时,对于tNGS试验,5个PCR反应的要求被认为过于费力和昂贵。因此,将引物对以新的形式组合来形成3个组(两个5重反应和一个6重反应),从而简化该试验。再次通过巢式qPCR来测量多重效率(图3:Ct值在8-18范围内,表明由引物相互作用导致的一些靶标的扩增效率低),以及采用片段大小分析来显示任何非特异性扩增(图4:结果显示第2组(C1)中的非特异性扩增,没有预期大小(约1000bp)的可视条带。第1组和第3组显示很少的非特异性扩增,但qPCR结果显示一些靶标的扩增效率低)。由于引物相互作用导致每个多重组中一个或多个靶标的扩增效率低,多个多重引物组合必须进行测试。总计,测试了9种不同组合(表4)。在版本3中引入了一种用于识别分枝杆菌种类的新的靶标hsp65。这是为了在样品中MTBC为阴性的情况下提供更多的信息。
表4:在优化过程中测试的多重组配方的版本
配方1-6有多个滞后的Ct和/或总遗漏,表明在多重组中的抑制和竞争。版本7显示多重组2和多重组3的Ct范围<1.5,而组1的范围约为15Ct(图5)。随后优化产生多于2个版本,导致在具有所有多重组的最终版本9的Ct范围<2(图6)。
最终引物设计
同时优化组配方,重新设计各种引物以克服引物相互作用。在确定优化的序列之前,总计有48个多重引物组合,具有>300个引物设计(表5)。
在实验室验证研究(如下所述)中测试了由FIND提供的约400个样品之后,需要重新设计katG反向引物以避免在引物结合位点上常见的非耐药性赋予SNP。为了克服这种情况,测试了5种新的反向引物,其中每个引物向3’一次移动1bp(最多移动5bp)(表6)。选择了选项5用于最终实验,因为其避免了突变位点,并且实验的表现没有负面受到影响。
表6:重新设计的katG引物选项(加粗的为非耐药性赋予SNP)
碱基对位置移动至3’端 | 引物序列(5’-3’) |
原始引物 | TGCCCGGATCTGGCTCTTA |
1 | GCCCGGATCTGGCTCTTAA |
2 | CCCGGATCTGGCTCTTAAGG |
3 | CCGGATCTGGCTCTTAAGGC |
4 | CGGATCTGGCTCTTAAGGCTG |
5 | GGATCTGGCTCTTAAGGCTGG |
最终优化迭代的引物由两个五重组和一个六重组组成(表7)。
表7:引物序列
基因靶标区域
可视的靶标区域显示为母链或互补链,这取决于基因方向。靶标区域被设计为长度为900-1100bp,因为这对于PCR和纳米孔测序来说是很好的大小。保持PCR产物大小一致可减少多重PCR和测序反应中对某些靶标的偏向。
Eis
embB
rrs
rv0678
fabG1
fabG1靶标区域覆盖在母链上沿基因启动子区域(标记)的744bp fabG1基因,靶向位于其中的高置信度SNP,以及位于3’端的一些基因间隔序列。注释基因外的序列以灰色高亮。正向和反向引物位置以/>书写。
gyrA
rpoB
ethA
ethA靶标区域覆盖在互补链上的1470个碱基对ethA基因的子集。选择这个片段以覆盖位于5’端的基因中的高置信度SNP。注释基因外的序列有下划线。正向和反向引物位置以斜体书写。
rplC
katG(初始引物对)
katG–重新设计
gidB
inhA
rrl
pncA
rpsL
tlyA
有益效果
本公开提供准确且快速识别来自疑似或确诊结核病患者的样品中多种耐药性突变的存在的方法。这些信息为关于药物管理的决策提供信息,并且能够基于识别的突变为患者确定量身定制的治疗方案。此外,所公开的方法可成功地在直接取自患者的样品,例如痰液上进行,从而增加了它们在中低收入和发展中国家使用的潜力。出于这个目的开发优化的引物意味着可以实现使用多重试验的优点。所公开的方法是高度灵敏的(<100MTB细胞)、快速的(花费约8小时),并且可以检测宽范围的突变,因此代表了当前培养基、分子(基因型MTBDRsl线探针试验)和基于tNGS的测试的重大发展。这能够确定正确的治疗途径,并且能够让患者迅速开始治疗而不会丢失后续治疗(发展中国家的主要问题)。这减少了疾病的传播并且有助于防止耐药性细菌菌株的发展。
概述
当本文使用术语“包括”时,也考虑备选项,其中使用术语“由……组成”或“主要由……组成”时,不考虑备选项。此外,本文所描述的任何及所有液态组合物可以是水性溶液。还需要注意的是,当短语“一种或多种”用于表示范围时,例如与若干序列W、X、Y和Z有关(SEQ ID No.W、X、Y和Z中的一种或多种)时,这是单独公开了每一个值(SEQ ID No.W、SEQID No.X、SEQ ID No.Y和SEQ ID No.Z)和它们的组合(例如SEQ ID No.W和X,和SEQ IDNo.Y和Z)。同样的,当短语“一种或多种”用于与一系列对有关时,例如与若干序列对(SEQID No.W和X;以及Y和Z中的一种或多种)有关,这是单独公开了每一对(SEQ ID No.W和X)或它们的组合(例如SEQ ID No.W和X和SEQ ID No.Y和Z)。
提供下列实施例来阐述本发明的实施方式,并且不应被解释为对它们的限制。
实施例1
采用掺有表征好的结合分枝杆菌分离株(全基因组测序并且培养确定耐药性谱)来进行研究,以评估所开发的引物和方法。如下所述,在MagNA Pure Compact上提取DNA,每个样品在三重反应中进行PCR扩增,以80个一批在MinION上进行合并、清洗、条形码化以及测序。
DNA提取:
1、在微生物II级安全柜(Microbiological Class II Safety Cabinet,MSC-II)中打开液态临床样品,等分成750μL加入到的新的1.5mL带螺帽的Eppendorf管中。
2、在MSC-II中,将样品Eppendorf管放置到气溶胶密封的离心机转子中。
3、将750μL临床痰液样品在15000g下离心5min,然后将离心转子放回到MSC-II中并取出样品。
4、在MSC-II中,小心地去除上清液并且将沉淀物在700μL MagNA纯细胞裂解缓冲液(MagNA Pure Bacterial Lysis Buffer,BLB)[罗氏生命科学]中重悬。
5、在MSC-II中,将700μL的重悬样品转移至带螺帽的珠磨破碎管中(购自MPBiomedical的裂解介质E管)。
6、在MSC-II中,将样品在FastPrep均质器中以最大速度珠磨破碎45秒。
7、重复步骤6。
8、在MSC-II中,将珠磨破碎管放置到气溶胶密封的离心机转子中。
9、以最大速度将珠磨破碎管旋转2分钟。
10、将离心机转子放回到MSC-II,并且缓慢地移出珠磨破碎管。
11、在MSC-II中,将230μL干净的上清液分两批200μL转移到干净的MagNA纯样品管中。将20μL蛋白酶K加入到样品中。
12、在MSC-II中,在65℃的加热块上孵育样品5分钟,在MSC-II中每30秒旋转一次。
13、将经孵育的样品转移到MagNA Pure compact上,并且进行自动化提取。
14、在自动化提取完成时后,将洗提管放回到MSC-II中用于多重PCR准备。
多重PCR:
1、准备如下3个多重10种引物混合物:
2、在MSC-II中,将PCR Master Mix(Qiagen多重PCR试剂盒)以下列每种样品的比例混合,用于每个多重引物组:
试剂 | 每种样品的体积(μL) |
2x Qiagen Multiplex Master Mix | 25 |
10种引物混合物 | 5 |
5x Q-Solution | 10 |
无核酸酶H2O | 5 |
3、在MSC-II中,将45μL反应混合物加入到0.2mL薄壁PCR管中。
a.每个样品需要3个管,一个管用于一个多重引物组。
4、在MSC-II中,小心地将5μL提取的DNA加入到PCR管中。
5、在MSC-II中,将PCR管紧紧密封并旋涡震荡。
6、在MSC-II中,短暂地旋转PCR管并去除泡沫。
7、将PCR管装载到热循环仪中并根据下列参数运行扩增程序:
步骤 | 时间(mm:ss) | 温度(℃) | 循环数 |
热活化 | 20:00 | 95 | 1 |
变性 | 00:30 | 95 | 35 |
退火 | 01:30 | 60 | a. |
延伸 | 01:30 | 72 | a. |
最终延伸 | 10:00 | 72 | 1 |
8、小心地移出PCR管并放回至MSC-II。
9、在MSC-II中,将PCR产物转移到干净的PCR管中。
10、将干净的PCR管浸没在1:16稀释的Bioguard中最少30秒,以从CL3中取出。
然后将每个样品的三重反应如下进行合并:
1、对于每个样品多重组,将Qubit高灵敏度试验缓冲液根据生产商的说明书混合。
a.每个样品是200μL Qubit缓冲液+1μL Qubit染料
2、在干净的平底96孔培养板中,在每孔中等分198μL的混合的Qubit溶液。
3、加入2μL的每种多重组模板,使得每个孔具有单个模板。
4、在Promega QuantiFlor或类似的平板读取器中分析培养板。
5、采用量化结果,将等摩尔浓度的3个样品多重组合并成总计1μg。
a.在合并的样品总体积小于45μL的情况下,使用无核酸酶H2O将所有样品的体积标准化至100μL
b.如果合并的总计1μg的溶液中DNA不足,则以较低的浓度等摩尔混合,但最大体积为100μl
然后合并的样品准备用于如下纳米孔测序:
末端制备
1、将45μL合并的DNA转移到薄壁PCR培养板中
2、将下列试剂加入到DNA中
试剂 | 每个样品体积(μL) |
模板DNA(<1000ng) | 45 |
Ultra II End-Prep缓冲液 | 7 |
Ultra II End-Prep混合酶 | 3 |
无核酸酶H2O | 5 |
总计 | 60 |
3、采用移液器混合
4、旋转管并且在20℃下孵育5分钟,随后在65℃下孵育5分钟
5、将样品转移到干净的96孔培养板
6、通过加入60μL AMPure XP珠进行1次珠清洗
7、在hula混合器中孵育样品5分钟
8、短暂地旋转培养板
9、将培养板放置在磁力架上并且孵育5分钟
10、去除上清液
11、采用180μL 70%乙醇清洗珠沉淀物
12、去除上清液
13、采用180μL 70%乙醇清洗珠沉淀物
14、去除上清液
15、短暂地旋转培养板并放回至磁力架
16、去除残留的上清液
17、空气干燥珠约30秒
18、将沉淀物在31μL无核酸酶H2O中重悬
19、在室温下孵育样品2分钟
20、将培养板放回磁力架并沉淀珠2分钟21、小心地去除洗脱的上清液并转移30μL至干净的96孔培养板条形码适配子连接
1、在新的培养板中依次在每个样品中加入下列试剂。
a.15μL末端制备的DNA
b.10μL条形码适配子(BCA)
c.25μL Blunt/TA Ligase Master Mix
2、通过移液器混合
3、短暂地旋转培养板。
4、室温下孵育10分钟
5、使用如上所述的AMPure XP珠进行0.8倍珠清洗(30μL)
6、将沉淀物在25μL无核酸酶H2O中重悬
7、室温下孵育样品2分钟
8、将培养板放回磁力架并且沉淀珠2分钟
9、小心地去除洗脱的上清液并转移至干净的96孔培养板条形码化PCR
1、在薄壁PCR培养板中组合下列各项:
2、短暂地漩涡震荡
3、旋转样品
4、采用以下循环条件进行PCR扩增
5、采用如上所述的AMPure XP珠进行0.8倍珠清洗(40μL)
6、将沉淀物在45μL无核酸酶H2O中重悬
7、在室温下孵育样品2分钟
8、将培养板放回磁力架并且沉淀珠2分钟
9、小心地去除洗脱的上清液并转移至干净的96孔培养板
12、如上所描述的进行量化
11、将每个等摩尔浓度的条形码化的样品合并到1.5mL Eppendorf管中
12、在合并的样品上采用AMPure XP珠进行如上所述的0.8倍珠清洗并且在45μL无核酸酶H2O中重悬
DNA末端制备
1、在0.2mL薄壁PCR管中组合下列各项:
试剂 | 体积(μL) |
合并的条形码化的DNA(1000ng)+无核酸酶H2O | 50 |
Ultra II End-Prep缓冲液 | 7 |
Ultra II End-Prep混合酶 | 3 |
总计 | 60 |
2、漩涡震荡并短暂地旋转
3、在20℃下孵育5分钟随后在65℃下孵育5分钟
4、将样品转移到干净的1.5mL Eppendorf管中
5、采用AMPure XP珠进行如上所述的0.8x珠清洗(48μL)
6、将沉淀物在61μL无核酸酶H2O中重悬
7、在室温下孵育样品2分钟
8、将培养板放回磁力架并且沉淀珠2分钟
9、小心地去除洗脱的上清液并转移至干净的1.5mL Eppendorf管中。
适配子连接
1、解冻并且旋转适配子混合物(AMX)、T4连接酶、连接缓冲液(LNB)和洗脱缓冲液(EB)(牛津孔纳米科技连接测序试剂盒SQK-LSK109)
2、将解冻并经漩涡震荡的试剂放置在冰上
3、在室温下解冻一管短片段缓冲液(SFB)
a.在放置在冰上之前漩涡震荡并旋转
4、将下列各项在1.5mL Eppendorf管中依次混合:
试剂 | 体积(μL) |
末端制备的DNA | 60 |
连接缓冲液(LNB) | 25 |
NEBNext Quick T4 DNA连接酶 | 10 |
适配子混合物(AMX) | 5 |
总计 | 100 |
5、通过轻弹和旋转轻轻地混合管
6、在室温下孵育10分钟
7、采用AMPure XP珠进行0.6倍珠清洗(60μL)
8、在hula混合器中孵育样品5分钟
9、短暂地旋转样品
10、将管放置在磁力架上并孵育5分钟
11、去除上清液
12、将沉淀物在125μL SFB中重悬
13、将管放置在磁力架上并孵育10分钟
14、小心地去除上清液
15、将沉淀物在125μL SFB中重悬
16、将管放置在磁力架上并使其培养10分钟
17、小心地去除上清液
18、短暂地旋转管并放回至磁力架
19、去除残留的上清液
20、空气干燥沉淀物约30秒
21、将沉淀物在15μL EB中重悬
22、在室温下孵育10分钟
23、将管放置在磁力架上直至洗脱液是透明无色的
24、小心地去除并保留15μL洗脱的上清液在干净的1.5mL Eppendorf管中
25、在1μL洗脱物中进行Qubit HS试验
在MinION上装载测序库
1、根据牛津孔纳米制造商的程序进行MinION装载
a.采用Qubit量化装载如所计算的100-150fmol的DNA
i.根据以下网址可以容易地从ng计算fmol:http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
采用ONT Epi2Me FastQ TB耐药性谱系统可以识别一线和二线抗TB药物的耐药性。对于与在PCR产物fastQ序列中检测到的SNP位点有关的所有耐药性均报道了野生型和突变的核苷酸。在特定靶标基因中SNP的存在现实对特定抗TB药物的耐药性(表8)。
通过比较野生型的读长相对数量相较于对突变的读长数量,该方法还能够用于识别异质耐药性(表9),当检测到>15%和<80%的突变碱基时,称为异质耐药性。
如果需要,原始读数也可以可视化来提供更详细的分析(表10)。这些结果显示注释基因中的密码子或核苷酸位置,以及在该位置记录的野生型或突变型碱基的数量。
表10:通过Epi2Me分析提供的两种测序的样品的原始数据的示例
实施例2
根据实施例1,采用改变的DNA提取和简化的库制备方法来处理一系列样品。此处,替换使用带有纯食品病原体试剂盒的Promega Maxwell RSC 48来提取DNA,并在库的制备中,对末端制备和条形码/适配子连接反应进行改变。
DNA提取:
1、在微生物II级安全柜(MSC-II)中在3级控制设备(CL3)中打开液态临床样品,并等分成750μL加入到的新的1.5mL带螺帽的Eppendorf管中。
2、在MSC-II中,将样品Eppendorf管放置到气溶胶密封的离心机转子中。
3、将750μL临床痰液样品在15000xg下离心5min,然后将离心转子放回到MSC-II中并取出样品。
4、在MSC-II中,小心地将移出上清液并且将沉淀物在700μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)中重悬。
5、在MSC-II中,将700μL的重悬样品转移至带螺帽的珠磨破碎管中(购自MPBiomedical的裂解介质E管)。
6、在MSC-II中,将样品在FastPrep均质器中以最大速度珠磨破碎45秒。
7、重复步骤6。
8、在MSC-II中,将珠磨破碎管放置到气溶胶密封的离心机转子中。
9、以最大速度旋转珠磨破碎管3分钟。
10、将离心机转子放回到MSC-II,并且缓慢地取出珠磨破碎管。
11、在MSC-II中,将400μL干净的上清液分两批200μL等分量转移到2ml带螺帽的样品管中。将40μL蛋白酶K加入到样品中。
12、在MSC-II中,加入来自Maxwell RSC纯食品病原体试剂盒[Promega]中的200μL裂解缓冲液A。
13、在MSC-II中,在加热块上在65℃下孵育样品10分钟,在MSC-II中每30秒旋转一次。
14、在MSC-II中,加入来自Maxwell RSC纯食品病原体试剂盒[Promega]中400μLPBS和300μL裂解缓冲液。
15、将样品转移至Maxwell RSC样品孔中,并根据制造商的说明书准备自动化提取。
16、当自动化提取完成时,将洗脱管放回至MSC-II以用于多重PCR准备。
末端制备
1、转移12.5μL(<450ng)的合并的DNA至薄壁PCR培养板中
2、加入下列试剂到DNA中
试剂 | 每个样品体积(μL) |
Ultra II End-Prep缓冲液 | 1.75 |
Ultra II End-Prep混合酶 | 0.75 |
DNA总和 | 15 |
3、通过移液器混合
4、旋转试管并在20℃下孵育5分钟,随后在65℃下孵育5分钟。
条形码连接
5、在新的96孔培养板中在每个样品中依次加入下列试剂。
a.3μL无核酸酶H2O
b.0.75μL末端制备的DNA
c.1.25μL无扩增条形码(每个样品中1个)
d.5μL Blunt/TA Ligase Master Mix
6、通过移液器混合并短暂地旋转培养板。
7、在20℃下孵育20分钟,随后在65℃下孵育10分钟
8、在干净的Eppendorf管中合并所有样品,并且取480μL继续
e.如果合并体积<480,则使用总体积代替
9、进行0.4倍珠清洗
f、192μL的重悬AMPure XP珠用于480μL的合并样品
10、在Hula混合器中在室温下孵育样品10分钟
11、将样品放置在磁力架上并孵育5分钟
12、小心地去除上清液并将珠沉淀物在700μL短片段缓冲液(SFB)[牛津纳米孔]中重悬。
13、将样品放回至磁力架上并孵育15分钟
14、重复步骤12和13
15、小心地去除上清液,并且将管留在磁力架上,采用100μL 70%的乙醇清洗珠沉淀物
16、去除上清液并在将其放置在磁力架上之前短暂地旋转管
17、采用p10去除任何残留的上清液,并且使沉淀物空气干燥约30秒
a.注意不要使沉淀物破裂
18、将沉淀物在35μL无核酸酶H2O中重悬,并且在室温下孵育2分钟
19、将管放回至磁力架上并孵育2分钟,小心地转移35μL上清液至干净的Eppendorf中。
适配子连接:
20、解冻并旋转适配子混合物(AMII)[ONT]、快速连接缓冲液(LNB)[NEB]、快速T4连接酶和洗脱缓冲液[NEB],以及洗脱缓冲液(EB)[ONT]和SFB[ONT]。
21、将解冻并漩涡震荡的试剂放置在冰上
22、将下列各项在1.5mL Eppendorf管中依次混合:
试剂 | 体积(μL) |
末端制备的DNA | 30 |
快速连接反应缓冲液 | 10 |
NEBNext Quick T4 DNA连接酶 | 5 |
适配子混合物(AMII) | 5 |
总计 | 50 |
23、通过轻弹和旋转轻轻地混合管
24、在室温下孵育20分钟
25、采用重悬的AMPure XP珠进行0.4倍珠清洗(20μL)
26、在hula混合器中孵育样品10分钟
27、短暂地旋转样品并将管放置在磁力架上孵育5分钟
28、小心地去除上清液并且将沉淀物在125μL SFB中重悬。
29、将管放置在磁力架上并孵育5分钟
30、重复步骤28和29
31、短暂地旋转管并放回至磁力架
32、使用p10去除残留上清液
33、空气干燥沉淀物约30秒
a.小心不要使沉淀物破裂
34、将沉淀物在15μL EB重悬并且在室温下孵育10分钟
35、将管放置在磁力架上直至洗脱液是透明无色的
36、小心地去除并保留15μL洗脱的上清液在干净的1.5mL Eppendorf管中
37、在1μL洗脱物中进行Qubit HS试验。
采用ONT Epi2Me FastQ TB耐药性属性系统识别对一线和二线抗TB药物的耐药性。对于与在PCR产物fastQ序列中检测到的SNP位点有关的所有耐药性均报道了野生型和突变的核苷酸。在特定靶标基因中SNP的存在(>15%突变碱基)显示对特定抗TB药物的耐药性(表11)。
表11:采用所开发的方法测序的两种样品的示例耐药性属性
样品 | 乙胺丁醇 | 异烟肼 | 吡嗪酰胺 | 利福平 | 链霉素 | 阿米卡星 |
1 | 耐药 | 耐药 | 易感 | 耐药 | 易感 | 耐药 |
2 | 耐药 | 耐药 | 易感 | 耐药 | 耐药 | 易感 |
样品 | 贝达喹啉 | 卷曲霉素 | 环丙沙星 | 氯苯吩嗪 | 乙硫异烟胺 | 卡那霉素 |
1 | 易感 | 耐药 | 易感 | 易感 | 易感 | 耐药 |
2 | 易感 | 易感 | 易感 | 易感 | 易感 | 易感 |
样品 | 利奈唑胺 | 莫西沙星 | 氧氟沙星 | 喹诺酮类 |
1 | 易感 | 耐药 | 耐药 | 耐药 |
2 | 易感 | 易感 | 易感 | 耐药 |
如果需要,原始读长数也可以可视化来提供更详细的分析(表12),例如识别异质耐药性。这些结果显示注释基因中的密码子或核苷酸位置,以及在该位置记录的野生型或突变型碱基的数量。
表12:通过Epi2Me分析提供的两种测序的样品的原始数据的示例
从两个结果表中可以看出,方法上的改变不会改变该样品的耐药性谱。因此,优化的方法(使用Promega Maxwell和简化的库制备)将是为该实验选择的方法。
表13:采用方法1(实施例1)和方法2(实施例2)测序的样品的耐药性谱
表14:对比方法1(实施例1)和方法2(实施例2)的样品通过Epi2Me分析提供的原始数据的示例
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序列表
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<120> 用于耐药性筛选的方法和组合物
<130> 1811067P/PCT
<150> GB2013928.3
<151> 2020-09-04
<160> 33
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eis正向引物
<400> 1
tgtcgggtac ctttcgagc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eis反向引物
<400> 2
tccatgtaca gcgccatcc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> embB正向引物
<400> 3
cgccgtggtg atattcggc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> embB反向引物
<400> 4
gcacaccgta gctggagac 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rrs正向引物
<400> 5
ctctgggcag taactgacgc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rrs反向引物
<400> 6
gagtgttgcc tcaggaccc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rv0678正向引物
<400> 7
gctcgtcctt cacttcgcc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rv0678反向引物
<400> 8
atcagtcgtc ctctccggt 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fabG1正向引物
<400> 9
cttttgcacg caattgcgc 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fabG1反向引物
<400> 10
agcagtcctg tcatgtgcg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrA正向引物
<400> 11
tgacagacac gacgttgcc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrA反向引物
<400> 12
cgatcgctag catgttggc 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB正向引物
<400> 13
tcatcatcaa cgggaccgag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB反向引物
<400> 14
acacgatctc gtcgctaacc 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ethA正向引物
<400> 15
tggatccatg accgagcac 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eth A反向引物
<400> 16
gtccaggagg cattggtgt 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rplC正向引物
<400> 17
agtacaagga ctcgcggga 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rplC反向引物
<400> 18
tcgagtgggt accctggc 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KatG正向引物
<400> 19
ctgtggccgg tcaagaaga 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重新设计的KatG反向引物
<400> 20
ggatctggct cttaaggctg g 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gidB正向引物
<400> 21
tgacacagac ctcacgagc 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gidB反向引物
<400> 22
gcccttctga ttcgcgatg 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> inhA正向引物
<400> 23
gggcgctgca atttatccc 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> inhA反向引物
<400> 24
ggcgtagatg atgtcaccc 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rrl正向引物
<400> 25
ggtccgtgcg aagtcgc 17
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rrl反向引物
<400> 26
tgaacccgtg ttctgcgg 18
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pncA正向引物
<400> 27
tcaccggacg gatttgtcg 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pncA反向引物
<400> 28
tccagatcgc gatggaacg 19
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpsL正向引物
<400> 29
gcggcgggta ttgtggtt 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpsL反向引物
<400> 30
taaccggcgc ttctcacc 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tlyA正向引物
<400> 31
cgttgatgcg cagcgatc 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tlyA反向引物
<400> 32
ggtctcggtg gcttcgtc 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 原始KatG反向引物
<400> 33
tgcccggatc tggctctta 19
Claims (16)
1.一种或多种寡核苷酸引物集,所述一种或多种寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分,所述一种或多种基因选自包括eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种的组,其中,每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物,其中,每个引物具有如在SEQ ID No.1-32所示的序列。
2.根据权利要求1所述的一种或多种寡核苷酸引物集,所述一种或多种寡核苷酸引物集用于多重PCR,其中,所述引物集被分为一个或多个多重组,其中,所述多重组包括用于扩增以下项的部分的正向和反向引物对:
(a)eis、embB、rrs、rv0678和fabG1;
(b)gyrA、rpoB、ethA、rplC和katG;和/或
(c)gidB、inhA、rrl、pncA、rpsL和tlyA。
3.根据权利要求1或2所述的一种或多种寡核苷酸引物集,所述一种或多种寡核苷酸引物集用于多重PCR并且被分为一个或多个多重组,其中,所述一个或多个多重组包括:
(a)SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;
(b)SEQ ID No.11和12;13和14;15和16;17和18;以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或
(c)SEQ ID No.21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的用于多重PCR的寡核苷酸引物集组,其由SEQ ID No.1和2;3和4;5和6;7和8;以及9和10(表7中的第1组)组成。
5.根据权利要求3所述的用于多重PCR的寡核苷酸引物集组,其由SEQ ID No.11和12;13和14;15和16;17和18;以及19和20(表7中的第2组)组成。
6.根据权利要求3所述的用于多重PCR的寡核苷酸引物集组,由SEQ ID No.21和22;23和24;25和26;27和28;29和30;以及31和32(表7中的第3组)组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的一种或多种寡核苷酸引物集或寡核苷酸引物集组,其中,所述一种或多种基因的部分含有一种或多种突变,所述一种或多种突变赋予对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种抗生素的耐药性,优选地其中,所述一种或多种突变是一种或多种单核苷酸多态性。
8.一种多重PCR反应混合物,所述混合物包括寡核苷酸引物集的一个或多个组,所述寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分,所述一种或多种基因选自包括以下项的组或由以下项组成的组:eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种,其中,每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物,其中,所述寡核苷酸引物集的组包括SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种;SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种;和/或SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的多重PCR反应混合物,其包括由以下项组成的寡核苷酸引物集的组:
(a)SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组);
(b)SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组);或
(c)SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)。
10.检测和/或识别在含来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的DNA的样品中一种或多种突变的存在的方法,所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性,所述方法包括以下步骤:
(a)从所述样品中分离或提取DNA;
(b)使用根据权利要求2-7中任一项所述的寡核苷酸引物集的一个或多个组通过多重聚合酶链式反应来扩增相关基因区域或扩增子;
(c)将扩增的基因区域或扩增子进行DNA测序;以及检测一种或多种突变。
11.预测结核病患者是否会对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类的一种或多种的治疗产生反应的方法,所述方法包括在一种或多种基因中检测一种或多种耐药突变的存在的步骤,所述一种或多种基因选自包括来自所述患者的样品中获得的DNA中的eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种的组,所述方法包括:
(a)从所述样品中分离或提取DNA;
(b)使用根据权利要求2-7中任一项所述的寡核苷酸引物集的一个或多个组通过多重聚合酶链式反应来扩增相关基因区域或扩增子;
(c)将扩增的基因区域或扩增子进行DNA测序;以及检测所述一种或多种突变。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,
(a)所述方法是用于预测结核病患者是否对乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素中的一种或多种的治疗产生反应,并且所述一种或多种基因是eis、embB、rrs、rv0678和fabG1;并且所述寡核苷酸引物集的组由SEQID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)组成;
(b)所述方法是用于预测结核病患者是否对异烟肼、利福平、环丙沙星、乙硫异烟胺、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种的治疗产生反应,其中所述一种或多种基因是gyrA、rpoB、ethA、rplC和katG;并且所述寡核苷酸引物集的组由SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)组成;和/或
(c)所述方法是用于预测结核病患者是否对吡嗪酰胺、链霉素、卷曲霉素和乙硫异烟胺中的一种或多种的治疗产生反应,其中所述一种或多种基因是gidB、inhA、rrl、pncA、rpsL和tlyA;并且所述寡核苷酸引物集的组由SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)组成。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法,其中,所述样品是从疑似有或确诊有TB的受试者获得的一种或多种组织和/或体液,可选地其中,所述样品是痰液;尿液;血液;血浆;血清;滑液;脓;脑脊液;胸膜液;心包液;腹水;汗液;唾液;泪液;阴道分泌物;精液;组织间液;支气管肺泡灌洗液;支气管冲洗液;胃灌洗液;胃冲洗液;经气管或支气管细针抽吸液;骨髓;胸膜组织;来自淋巴结、纵隔镜检查、胸腔镜检查或经支气管活检的组织;或它们的组合;或从疑似有或确诊有TB的受试者获得的一种或多种组织和/或体液的培养标本。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的方法,其中,当寡核苷酸引物集的多于一组引物用于所述扩增步骤(步骤(b))时,每组作为单独的多重组模板运行,优选地其中,然后将一种或多种所述多重组模板在步骤(c)之前合并,以制作用于DNA测序和突变检测的单个模板。
15.用于为结核病患者确定合适的抗生素治疗方案的方法,包括采用根据权利要求10-14中任一项所述的方法在来自受试者的样品中检测和/或识别一种或多种突变的存在,所述一种或多种突变赋予抗生素耐药性,以及基于所检测/识别的突变确定合适的抗生素方案。
16.一种试剂盒,包括如权利要求1-7中任一项所述的一种或多种寡核苷酸引物集或寡核苷酸引物集组,或如权利要求8或权利要求9所述的多重PCR反应混合物。
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