RU2784971C1 - Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане - Google Patents
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784971C1 RU2784971C1 RU2021137178A RU2021137178A RU2784971C1 RU 2784971 C1 RU2784971 C1 RU 2784971C1 RU 2021137178 A RU2021137178 A RU 2021137178A RU 2021137178 A RU2021137178 A RU 2021137178A RU 2784971 C1 RU2784971 C1 RU 2784971C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- association
- methanotrophic
- stable
- cultivation
- obtaining
- Prior art date
Links
- 230000001450 methanotrophic Effects 0.000 title claims abstract description 19
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000003287 optical Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000001186 cumulative Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000005429 turbidity Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 241001515176 Hydrotalea Species 0.000 claims description 6
- 241000589345 Methylococcus Species 0.000 claims description 6
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 4
- 241001029950 Chitinophagales Species 0.000 claims description 3
- 241000354141 Edaphobaculum Species 0.000 claims description 3
- 241000862974 Hyphomicrobium Species 0.000 claims description 3
- 241000863391 Methylophilus Species 0.000 claims description 3
- 241001141544 Sphingobacteriales Species 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 abstract description 10
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 5
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241000580482 Acidobacteria Species 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 241000099082 Aneurinibacillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000949061 Armatimonadetes Species 0.000 description 1
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 description 1
- 241000498637 Brevibacillus agri Species 0.000 description 1
- 241001260034 Candidatus Latescibacteria Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241001142109 Chloroflexi Species 0.000 description 1
- 241001634906 Cupriavidus gilardii Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241001265526 Gemmatimonadetes <phylum> Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000589346 Methylococcus capsulatus Species 0.000 description 1
- 241000121237 Nitrospirae Species 0.000 description 1
- 241001180199 Planctomycetes Species 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 1
- 241000529919 Ralstonia sp. Species 0.000 description 1
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 1
- 241000610448 Stenotrophomonas acidaminiphila Species 0.000 description 1
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 1
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000018867 autolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000010841 municipal wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, включающий двухэтапное культивирование природного образца, в качестве которого применяют активный ил или осадок пресноводных водоемов, в полуторалитровом ферментере с объемом минеральной среды 1 л общей длительностью от нескольких недель до одного месяца: первый этап - накопительный рост до достижения мутности культуры оптической плотности OD600 0.5-4; второй этап - проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч-1 с последующим увеличением скорости потока ступенчато с шагом 0.05 ч-1 до достижения 0.2 ч-1, и дальнейшее культивирование в течение от 14 до 40 дней со средней оптической плотностью OD600=2.5-3. Изобретение обеспечивает получение стабильно растущей метанотрофной ассоциации бактерий с устойчивыми метаболическими связями между ее компонентами с преобладанием метанотрофных штаммов-продуцентов и снижением доли неметанотрофных представителей с использованием широкого разнообразия бактерий, населяющих природные или антропогенные местообитания. 2 з.п. ф-лы, 2 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологической области, а именно, к способу получения стабильно растущей метанотрофной ассоциации с устойчивыми метаболическими связями для производства кормового белка на метане. В основе способа лежит длительное культивирование многокомпонентного природного сообщества в проточном режиме с использованием метана в качестве субстрата.
Перспективным путем получения полноценного белкового кормового продукта является культивирование метанотрофных бактерий в ферментерах. Метанотрофные бактерии в оптимальных условиях активно перерабатывают природный газ, быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами.
Использование метана для получения кормового белка имеет ряд преимуществ, в числе которых большие запасы природного газа, его хорошая транспортабельность, возможность получения готового продукта без дополнительной очистки от субстрата.
Используемая в качестве кормовой добавки бактериальная биомасса производится за счет культивирования в ферментере штамма метанотрофа-продуцента и нескольких бактерий, образующих ассоциацию. Пример такой ассоциации фигурирует в международной заявке WO 01/60974: Methylococcus capsulatus (Bath) (штамм NCIMB 11132), Ralstonia sp. DB3 (штамм NCIMB 13287), Aneurinibacillus sp. DB4 (штамм NCIMB 13288) и Brevibacillus agri DB5 (штамм NCIMB 13289). Также в качестве ассоциантов в патентах и патентных заявках предлагаются следующие виды бактерий: Stenotrophomonas acidaminiphila GBS-15-2 (патент РФ RU 2687136 C1), Сupriavidus gilardii GBS-15-1 (Евразийская заявка EA 201900121 А), Klebsiella pneumonia 1-17 (патент РФ RU 2687137 C1). В этих документах, однако, не приводится полный состав ассоциации, а характеризуются лишь отдельные бактериальные спутники. Биомасса бактериальной культуры может использоваться как конечный продукт (хотя в основном после обезвоживания и стерилизации), или она может быть вначале переработана с целью разрушения бактериальных клеток, например, путем гомогенизации, гидролиза или автолиза. Такие виды обработки описаны в международных заявках WO 01/60974, PCT/GB03/000610 и PCT/GB03/000640, поданных 12 февраля 2003 г.
Природные сообщества значительно более стабильны, чем искусственно созданные. Из уровня техники известен исходный состав многокомпонентного сообщества активного ила (Ning Xie, Liping Zhong, Liao Ouyang, Wang Xu, Qinghuai Zeng, Keju Wang , Madiha Zaynab, Huirong Chen, Fangfang Xu, Shuangfei Li. Community Composition and Function of Bacteria in Activated Sludge of Municipal Wastewater Treatment Plants. Water (2021) 13:852).
Существующие подходы к формированию микробной ассоциации для производства кормового белка на метане включают культивирование метанотрофа-продуцента в режиме незащищенной ферментации и/или подсев чистых культур бактериальных спутников с целью их закрепления в составе микробного сообщества. Недостатком обоих подходов является отсутствие экспериментально верифицированных данных о метаболической совместимости бактериальных спутников с метанотрофным штаммом-продуцентом. Стабильность бактериальной ассоциации может не достигаться при искусственном объединении индивидуальных изолятов-спутников. Постоянство состава ранее предложенных ассоциаций и возможность закрепления индивидуальных бактерий-спутников в составе ассоциаций никогда ранее не контролировалось.
Более эффективным подходом может являться формирование устойчивой ассоциации на основе микробных сообществ как из природных, так и антропогенных местообитаний. Такие сообщества, как правило, отличаются высоким микробным разнообразием. Например, сообщество из приведенной выше публикации по анализу сообщества из активного ила включало представителей следующих крупных бактериальных групп Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Firmicutes, Nitrospirae, Chloroflexi, Actinobacteria, Candidatus Latescibacteria, Gemmatimonadetes, Spirochaetes, Armatimonadetes, Planctomycetes, Cyanobacteria, Candidatus Saccharibacteria, Euryarchaeota с общим числом видов от 1253 до 2399.
Задачей настоящего изобретения является получение стабильно растущей метанотрофной ассоциации с устойчивыми метаболическими связями между ее компонентами с использованием широкого разнообразия бактерий, населяющих природные или антропогенные местообитания.
Настоящая задача достигается за счет инокулирования ферментера природным образцом с последующим культивированием в накопительном и проточном режимах. Скорость разбавления культуры в проточном режиме следует повышать ступенчато (с шагом до 0.05 ч-1) с целью закрепления микробных компонентов в составе ассоциации на каждом из этапов культивирования. Точный состав ассоциации был определен путем секвенирования фрагментов последовательностей генов 16S рРНК микроорганизмов, слагающих метанокисляющую ассоциацию.
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся двухэтапным культивированием природного образца в полуторалитровом ферментере с объемом минеральной среды 1 л общей длительностью от нескольких недель до одного месяца. Первый этап представляет собой накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующий величине оптической плотности OD600 0.5-4, на втором этапе осуществляется переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч-1, с последующим увеличением скорости потока ступенчато с шагом 0.05 ч-1 до достижения 0.2 ч-1, при этой скорости культивирование проводится в течение периода времени от 14 до 40 дней со средней оптической плотностью OD600=2.5-3, с получением стабильной малокомпонентной ассоциации.
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся тем, что в качестве природного образца может применяться активный ил или осадок пресноводных водоемов.
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся тем, что компонентами стабильной малокомпонентной ассоциации являются бактерии рода Methylococcus (55%), неохарактеризованные бактерии порядка Sphingobacteriales (22%), а также представители родов Hydrotalea (19%) и Hyphomicrobium (4%).
Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся тем, что компонентами стабильной малокомпонентной ассоциацией являются бактерии родов Methylococcus (25%), Hydrotalea (30%), Methylophilus (20%), Edaphobaculum (12%), а также неохарактеризованные представители семейства Pleomorphomonadaceae (11%) и порядка Chitinophagales (2%).
Пример 1
В данном примере ферментер был инокулирован образцом активного ила из локации в г. Москве. Культивирование проводили в два этапа, первый из которых представлял накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующей величине оптической плотности OD600 = 0.5. На втором этапе был осуществлен переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч-1. Далее скорость протока увеличивали ступенчато с шагом 0.05 ч-1 до достижения 0.2 ч-1. С этой скоростью проводили культивирование в течение 5 дней со средней оптической плотностью 3.1.
Длительность культивирования – 16 дней.
По истечении двух недель культивирования было выполнено профилирование состава ассоциации за счет молекулярного анализа гена 16S рРНК. В составе ассоциации были идентифицированы представители родов Methylococcus (25%), Hydrotalea (30%), Methylophilus (20%), Edaphobaculum (12%), а также неохарактеризованные представители семейства Pleomorphomonadaceae и (11%) и порядка Chitinophagales (2%).
Применение данного способа культивирования позволило получить стабильное малокомпонентное сообщество, способное к устойчивому и эффективному росту на метане.
Пример 2
В данном примере ферментер был инокулирован образцом активного ила из локации в г. Иркутске. Культивирование проводили в два этапа, первый из которых представлял накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующей величине оптической плотности OD600 = 4. На втором этапе был осуществлен переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч-1. Далее скорость протока увеличивали ступенчато с шагом 0.05 ч-1 до достижения 0.2 ч-1. С этой скоростью проводили культивирование в течение 11 дней со средней оптической плотностью 2.6.
Длительность культивирования – 36 дней.
По истечении месяца культивирования было выполнено профилирование состава ассоциации с помощью молекулярного анализа гена 16S рРНК. В составе ассоциации были идентифицированы бактерии рода Methylococcus (55%), неохарактеризованные бактерии порядка Sphingobacteriales (22%), а также представители родов Hydrotalea (19%) и Hyphomicrobium (4%).
Данный способ отличался переходом в проточный режим при более высоких значениях оптической плотности и в 2 раза более долгим периодом культивирования. В результате в составе сообщества была выше доля метанотрофных бактерий, в то время как число неметанотрофоных представителей было меньше.
Выводы:
Более длительное культивирование в проточном режиме (в течение месяца, как в примере 2 способствует формированию малокомпонентной бактериальной ассоциации, в которой доминирует метанотрофный штамм-продуцент, а остальные бактерии в составе ассоциации представлены всего несколькими спутниками.
Claims (3)
1. Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, характеризующийся двухэтапным культивированием природного образца, в качестве которого применяют активный ил или осадок пресноводных водоемов, в полуторалитровом ферментере с объемом минеральной среды 1 л общей длительностью от нескольких недель до одного месяца, первый из этапов представляет собой накопительный рост до достижения мутности культуры, соответствующий величине оптической плотности OD600 0.5-4, на втором этапе осуществляют переход в проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч-1, с последующим увеличением скорости потока ступенчато с шагом 0.05 ч-1 до достижения 0.2 ч-1, при этой скорости культивирование проводят в течение периода времени от 14 до 40 дней со средней оптической плотностью OD600=2.5-3, с получением стабильной малокомпонентной ассоциации.
2. Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане по п.1, характеризующийся тем, что стабильной малокомпонентной ассоциацией является: бактерии рода Methylococcus 55%, неохарактеризованные бактерии порядка Sphingobacteriales 22%, а также представители родов Hydrotalea 19% и Hyphomicrobium 4%.
3. Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане по п.1, характеризующийся тем, что стабильной малокомпонентной ассоциацией является: Methylococcus 25%, Hydrotalea 30%, Methylophilus 20%, Edaphobaculum 12%, а также неохарактеризованные представители семейства Pleomorphomonadaceae 11% и порядка Chitinophagales 2%.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2784971C1 true RU2784971C1 (ru) | 2022-12-01 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687136C1 (ru) * | 2018-10-11 | 2019-05-07 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Штамм гетеротрофных бактерий Stenotrophomonas acidaminiphila GBS-15-2 - ассоциант для получения микробной белковой массы |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687136C1 (ru) * | 2018-10-11 | 2019-05-07 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Штамм гетеротрофных бактерий Stenotrophomonas acidaminiphila GBS-15-2 - ассоциант для получения микробной белковой массы |
Non-Patent Citations (1)
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2924126A1 (fr) | Nouveau procede de culture d'une microalgue heterotrophe | |
| CN107287125B (zh) | 一种蛋白核小球藻的培养方法 | |
| CN109082396B (zh) | 一种dsf群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用 | |
| CN104830712B (zh) | 一种产高纯度2‑酮基‑d‑葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株 | |
| CN106701627A (zh) | 一种高产褐藻胶裂解酶的海洋弧菌及其应用 | |
| CN106282041A (zh) | 一株高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株及利用该突变株进行半固态发酵生产表面素的方法 | |
| CN109929897A (zh) | 一种促进hau-m1光合细菌菌群产氢的培养基及其应用 | |
| CN110564580B (zh) | 一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法 | |
| TWI537388B (zh) | 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法 | |
| CN112080435A (zh) | 一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用 | |
| CN105219667B (zh) | 用于木糖发酵制氢的菌株及制氢方法 | |
| CN103911315B (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用 | |
| RU2784971C1 (ru) | Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане | |
| CN114645001A (zh) | 一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用 | |
| CN1274803C (zh) | 口腔生物膜模型装置及其形成口腔生物膜的方法 | |
| JP5374750B2 (ja) | 難培養性微生物の培養方法 | |
| Dorofeev et al. | Approaches to cultivation of “nonculturable” bacteria: Cyclic cultures | |
| RU2523606C1 (ru) | ШТАММ Gluconacetobacter sucrofermentans -ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ | |
| CN105779349B (zh) | 一种溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株jzbc1及其应用 | |
| CN109517780A (zh) | 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法 | |
| CN112646740B (zh) | 甲酸基单细胞蛋白菌株ma5及其应用 | |
| CN1177925C (zh) | 发酵培养生产虫草素的方法 | |
| CN113373069A (zh) | 一株秸秆腐生真菌及其应用 | |
| CN109554321B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 | |
| Bhattacharjya et al. | Depiction of growth specific changes in concentration of storage products in centric marine diatom Chaetoceros gracilis |