RU2730021C1 - Средство местного применения для лечения инфекционных вагинитов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам местного применения для лечения инфекционных вагинитов. Предлагается средство местного применения для лечения инфекционных вагинитов, содержащее 0,1% (масс.) биоцидного пептида формулы HN-(CH)-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NHи 1,5% (масс.) гидроксиэтилцеллюлозы в 0,15 М лактатном буферном растворе. Изобретение позволяет получить средство с однородной и пластичной гелевой основой, выходом активного действующего вещества не менее 75%, поддерживающее рН 3,5-4,5. 6 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности, к средствам местного применения для лечения инфекционных вагинитов.

Ранее нами был разработан новый пептид, обладающий биоцидными, в частности, антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами, получивший название пентадефенин (патент РФ №2678985).

В связи с ростом инфекционных заболеваний мочеполовой системы, в частности вагинитов, и отсутствием эффективных средств для их лечения, которые не вызывают резистентности у патогенной микрофлоры, а также не нарушают нормальную микрофлору влагалища, актуальной является задача разработки готовой лекарственной формы, содержащей пентадефенин (биоцидный пептид формулы H₂N-(CH₂)₁₀-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH₂).

Лидирующее положение среди готовых лекарственных форм (ГЛФ) для лечения вагинитов, занимают мягкие готовые лекарственные формы (МГЛФ)

- мази, гели, кремы, медицинские карандаши. МГЛФ имеют ряд преимуществ перед другими лекарственными формами:

- возможность локального применения лекарственных веществ;

- возможность введения лекарственных веществ в патологически измененную область, минуя разрушающие воздействия в желудочно-кишечном тракте;

- снижение выраженности побочных эффектов лекарственных веществ, например, ослабление аллергических реакций;

- возможность использования веществ, имеющих неприятные органолептические свойства;

- простота и безболезненность использования;

- быстрота наступления лечебного эффекта, что обусловлено высокой скоростью всасывания лекарственных веществ через слизистые оболочки и кожные покровы.

По-видимому, для терапии вагинитов оптимальным явилось бы лекарственное средство, способное полностью заполнить внутреннее пространство влагалища. Поэтому целесообразно было разработать на МГЛФ в форме геля или мази со следующими основными требованиями к разрабатываемой готовой лекарственной форме:

- Совместимость с активным фармацевтическим ингредиентом (АФИ):

- обеспечивает растворимость АФИ

- обеспечивает стабильность АФИ при хранении и использовании

- Безопасность:

- нетоксичен

- не обладает раздражающим действием на ткани влагалища

- не вызывает аллергии

- никакой из компонентов геля не усугубляет течения инфекции

- не является средой для патогенной микрофлоры

- Обеспечение эффективного применения АФИ:

- обеспечивает максимальный выход АФИ

- обеспечивает подходящую среду для работы АФИ

- распределяется во влагалище, покрывая максимальную площадь поверхности

- удерживается во влагалище время, достаточное для действия АФИ

- Удобство использования:

- не вытекает

- не оставляет пятен

- может быть гигиенично нанесен без помощи врача или специальных инструментов

- Простота и дешевизна производства

- Соответствие требованиям к ЛС Фармакопеи РФ

Современные основы для МГЛФ можно разделить на 3 группы. Это мази на жировой основе (вазелин, воск и т.д.), гели на водной основе и эмульсии. Поскольку пентадефенин хорошо растворим в воде и физиологическом растворе, практически нерастворим в органических растворителях, в качестве основы был выбран гидрогель.

Гидрогели активно применяются в дерматологии из-за их способности при нанесении на кожу образовывать тонкие пленки, удерживать значительное количество активных компонентов, обеспечивать равномерное и полное высвобождение активных субстанций, не нарушать физиологические свойства кожи, не оказывать токсического, кумулятивного и раздражающего действия.

Кроме того, для создания вагинальных МГЛФ использование гидрогеля в качестве основы оптимально как с функциональной, так и с технологической стороны. Жирная основа малопригодна для изготовления вагинального геля, поскольку существенно меняет свойства среды влагалища. Эмульсионная форма, как правило, сложнее в изготовлении, дороже и менее устойчива при хранении, чем гидрогель.

К недостаткам гидрофильных основ можно отнести микробную контаминацию и быстрое высыхание, а также несовместимость с рядом лекарственных веществ и подверженность синерезису - явлению, при котором выделяется жидкая фаза.

Наиболее широко используют следующие гелеобразователи:

Полиэтиленоксиды. В зависимости от молекулярной массы полиэтиленоксиды можно условно разделить на низкомолекулярные и высокомолекулярные соединения, различающиеся по своим свойствам. Полиэтиленоксиды с массой до 1000 представляют собой жидкие вещества, полностью растворимые в воде, полиэтиленгликоли с более высокой молекулярной массой являются воскоподобными веществами с высокой плотностью.

Преимуществами полиэтиленгликолевых гидрофильных основ является их стабильность при хранении, отсутствие микробной контаминации, способность инкорпорировать гидрофильные и гидрофобные вещества, достаточная адгезия к коже и слизистым оболочкам, экономическая доступность. Полиэтиленоксиды замедляют процесс высвобождения веществ из лекарственной формы и подходят для создания пролонгированных препаратов. Вместе с тем гели на основе этих полимеров обладают высокой гигроскопичностью и могут приводить к обезвоживанию слизистых оболочек. К недостаткам полиэтиленгликолевых основ относятся несовместимость с целым рядом фармакологически активных веществ. Наши собственные данные показали, что в гелях на основе полиэтиленгликоля пентадефенин однородно распределен и полностью высвобождается в водную фазу уже в течение часа выдержки в геля в воде. Однако рН водных извлечений образцов гелей лежат в области от 5,8-5,9. Обеспечить поддержание рН на физиологически приемлемом уровне 4,0 в гелях на основе ПЭГ оказалось невозможным. Причина этого в наличии собственного заряда у ПЭГ и незначительного содержания воды в гелях на их основе. Поэтому, несмотря на пригодность ПЭГ в качестве основы вагинального геля по другим параметрам, он непригоден для использования.

Производные акриловой кислоты. Наиболее широкое применение в технологии нашли карбополы, называемые также карбомерами по Международной классификации. Нормативная документация для этих групп полимеров включена в ведущие Фаркакопеи мира. В сухом виде макромолекулы кросс-сополимера содержат нейтральные СООН-группы и представляют собой свернутую беспорядочным образом пространственную сетку. Взаимодействие с водой приводит к гидратации молекулы, сетка растягивается и увеличивается в размерах (рН 3-4). Механизм гелеобразования карбополов основан на нейтрализации, т.е., превращении кислоты в соответствующую соль. При добавлении нейтрализующего агента (щелочи, триэтаноламина) свернутая в клубок молекула полимера разворачивается, что вызывает немедленное загущение системы. Карбомеры обладают пластическим типом течения. Они не обладают текучестью при низких значениях напряжения сдвига и начинают течь только при прохождении первого предела текучести. При пластическом течении вязкость является постоянной величиной, не зависящей от величины прилагаемого напряжения.

Карбопол дает стабильные рецептуры: гель с карбополом не расслаивается, не высыхает, не комкается, не меняет цвет. Такие гели хорошо растворяются в воде, легко смешиваются с любыми активными ингредиентами. Акрилаты обеспечивают достаточно полное высвобождение лекарственных веществ из готовой лекарственной формы. По нашим собственным данным, недостатком ГЛФ на основе карбополов является низкий выход пентадефенила. Приемлемого выхода пентадефенина из гелей на основе карбопола достичь не удалось, что, по-видимому, обусловлено связыванием пептида с гелевой основой. Кроме того, гели оказались нестабильны при рН на уровне 4,0.

Эфиры целлюлозы представляют собой продукты замещения атома водорода в гидроксильных группах целлюлозы различными ацильными или алкильными радикалами. Молекулярная масса заместителей, степень этерификации, полимеризации эфира, а также степень его замещения определяют свойства полимера. К производным целлюлозы относят метилцеллюлозу (МЦ), натрий карбоксиметилцеллюлозу (NaКМЦ), гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ) и др. С технологической точки зрения гели на

основе производных целлюлозы достаточно трудоемки в изготовлении и в зависимости от марки имеют ряд особенностей. Так, МЦ и NaКМЦ, достаточно хорошо и быстро растворимы в воде. ГЭЦ медленно растворяется в холодной воде и при комнатной температуре; лучше растворяется в воде при температуре около 45-50°С. Достоинством гелей на основе эфиров целлюлозы является отсутствие раздражающего и сенсибилизирующего действия, безвредность.

Кроме выбора гелеобразователя, не менее важное значение при разработке МГЛФ имеет правильный выбор вспомогательных веществ. До недавнего времени вспомогательные вещества рассматривались только как индифферентные формообразователи, значение которых сводились к приданию соответствующей формы и объема лекарственного вещества с целью удобства его приема, транспортировки, хранения. Однако открытия последних десятилетий привели к осознанию биологической роли вспомогательных веществ. Они могут усиливать или снижать действие лекарственных веществ, изменять его физико-химические и фармакологические свойства, например, за счет комплексообразования.

Технической задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание гелевой основы для ГЛФ с пентадефенином для интравагинального применения, обладающей следующими свойствами:

- однородность и пластичность гелевой основы;

- выход пентадефенина не менее 75%;

- рН 3,5-4,5.

Техническая задача решалась получением ГЛФ следующего состава: гидрокисиэтилцеллюлоза 1,5%, пентадефенин 0,1%, 0,15 М лактатный буферный раствор.

Пентадефенин практически полностью выходит в водный раствор из геля уже в первый час наблюдения. Антимикробная активность гелей соответствует выходу пептида. Гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы стабилен при рН 4,0, в отличие от геля на основе карбоксиметилцеллюлозы, которая выпадает в осадок при рН 3,5-4,5. Кроме того, в геле по настоящему изобретению отсутствуют ДМСО и Твин-80, поскольку гель имеет требуемые свойства и без них. Также, поскольку молочная кислота -естественный для влагалища буферизующий агент, а также нормализация рН влагалища является одним из подходов к терапии вагинитов [Palmeira-de-Oliveira R. New strategies for local treatment of vaginal infections / R. Palmeira-de-Oliveira, A. Palmeira-de-Oliveira, J. Martinez-de-Oliveira // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2015. - T. 92 - 105-122], гелевая основа такого состава предположительно может обладать самостоятельным дополнительным терапевтическим действием.

Сущность и промышленная применимость изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Исследования гелей на основе производных целлюлозы.

В ходе выполнения фармацевтической разработки были исследованы свойства гелей на основе карбоксиметилцеллюлозы и гидрокисиэтилцеллюлозы. Их состав приведен в Таблице 1.

Гели были однородными, прозрачными и не имели видимых частиц включения.

Пентадефенин практически полностью выходит в водный раствор из обоих гелей уже в первый час наблюдения (Таблица 2).

Если карбоксиметилцеллюлоза выпадала в осадок при рН 3,5-4,5 и стабильный гель формировался только при нейтральных рН, то гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы был стабилен при рН 4,0 (Таблица 3).

В результате проведенных исследований было установлено, что только гели на основе ГЭЦ соответствовали всем предъявляемым требованиям. Поэтому в качестве основы для готовой лекарственной формы пептида пентадефенина была выбрана гидроксиэтилцеллюлоза. Влияние ДМСО и Твин-80 на свойства этого геля не оценивали, т.к. гель имел требуемые свойства и без них.

Принимая во внимание, что:

- нормальный рН среды влагалища от 3,5 до 4,5;

- рН обеспечивается за счет присутствия молочной кислоты, которая является продуктом метаболизма молочнокислых бактерий - нормальной микрофлоры влагалища [Palmeira-de-Oliveira R. New strategies for local treatment of vaginal infections / R. Palmeira-de-Oliveira, A. Palmeira-de-Oliveira, J. Martinez-de-Oliveira // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2015. - T. 92 -105-122];

- секрет влагалища в норме изотоничен крови,

0,05 М цитратный буферный раствор в составе геля был заменен на 0,15 М лактатный буферный раствор. Учитывая, что ГЭЦ не электролит, а пептид дает только небольшой вклад в тоничность получаемого раствора, изотоничный гель был получен при введении в его состав молочной кислоты до 0,15 М. При этом молочная кислота естественный для влагалища буферизующий агент, а поскольку нормализация рН влагалища является одним из подходов к терапии вагинитов [там же], гелевая основа такого состава предположительно может обладать самостоятельным дополнительным терапевтическим действием.

Данные по выходу активного вещества и антимикробная активность геля приведены в Таблице 4.

Для эффективного интравагинального применения гелей необходима оптимальная вязкость гелей. С одной стороны она должна быть достаточна для удержания геля внутри влагалища. С другой стороны не слишком высока, чтобы обеспечивать эффективное распределение геля внутри влагалища. Сравнение вязкости с эталонной позволяет оценить перспективность применения конкретного геля.

Для гидроксиэтилцеллюлозных гелей такой стандарт известен из литературы. Это так называемое «универсальное плацебо», которое представляет из себя 1,5% гидроксиэти л целлюлозный гель. Его реологические свойства детально описаны, а способность длительное время удерживаться во влагалище доказана на практике (ССС). Поэтому для изучения пригодности разработанного нами геля с пентадефенином для интравагинального применения достаточно было доказать идентичность вязкости геля и плацебо.

Определение вязкости проводили с помощью ротационного вискозиметра RVDV-II (Brookfield, США) со шпинделем №6, при скорости вращения 40 об./мин, при комнатной температуре. Для проведения анализа гель помещали в цилиндр для измерения, медленно погружали в него шпиндель, ждали 5 минут, пока гель ровно покроет шпиндель, затем включали мотор и проводили измерение. Пентадефенин не оказывал влияния на вязкость и рН геля (Таблица 5).

Таким образом, разработанная готовая лекарственная форма представляла собой 0,1% гель на основе гидроксиэтилцеллюлозы и отвечала трем заложенным при разработке требованиям:

- однородность и пластичность гелевой основы;

- выход АФИ - пентадефенина - из геля не менее 75%;

- гель должен поддерживать рН 3,5-4,5.

Пример 2. Оценка антимикробной активности гелей методом радиальной диффузии в агарозном геле.

Реагенты: хлорид натрия, триптический гидролизат сои, агароза Type I low ЕЕО (Sigma, США), о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (Sigma, США); нитроцефин (484400, Calbiochem, США); уксусная кислоту (Вектон, Россия).

Бактерии: Escherichia coli ML-35p, Listeria monocytogenes EGD, Staphylococcus aureus SG 511.

Антибиотическое действие пептидов определяли по методу, предложенному Лерером и др. [Lehrer R.I. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides / R.I. Lehrer, M. Rosenman, S.S. Harwig, R. Jackson, P. Eisenhauer // J. Immunol. Methods - 1991. - T. 137 - №2 - 167-173].

Микроорганизмы культивировали в течение 16-18 часов в среде, содержащей 3% раствор триптического гидролизата сои (ТГС) (Sigma, США) при температуре 37°С. Из полученной культуры отбирали аликвоты и переносили в 50 мл свежеприготовленного триптического гидролизата сои, после чего инкубировали при температуре 37°С в течение 2,5 ч для получения микроорганизмов, находящихся в логарифмической фазе роста.

Суспензии микроорганизмов далее центрифугировали при 400 g в течение 10 мин, осадок дважды промывали в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.4, и ресуспендировали в 3 мл того же буфера. Далее измеряли оптическую плотность полученной суспензии и рассчитывали количество КОЕ на 1 мл, как описано выше. Для приготовления агарозных гелей, содержащих микроорганизмы, рассчитывали объем суспензии, в котором имеется 4×10⁶ клеток. Добавляли этот объем к 8 мл стерильного 1% раствора агарозы в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.4, при температуре +43°С.Полученную смесь выливали в стерильную пластиковую чашку Петри диаметром 90 мм, где смесь застывала с образованием агарозного геля.

Приготавливали разведения исследуемых препаратов: 1 весовая часть КП геля +3 весовых части дистиллированной воды; 1 часть геля с ПЭГ+4 части воды, пептиды разводили в 4 и 5 раз в 0,01% водном растворе уксусной кислоты.

В агарозных гелях, содержащих микроорганизмы, проделывали отверстия диаметром 2 мм. В лунки вносили анализируемые образцы (3 мкл), и инкубировали в течение 3 часов при температуре 37°С. За время инкубации препараты диффундировали из лунок в агарозные гели. По окончании инкубации на поверхность агарозного геля наносили 1% раствор агарозы, содержащий 6% триптический гидролизат сои. Затем чашки инкубировали еще в течение 20 часов при 37°С.

Для количественной оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зоны ингибирования роста микробов вокруг лунок, принимая за 1 условную единицу 0,1 мм, и вычитали из измеренного значения 20 единиц, соответствующих диаметру лунки. Результаты оценки антибиотического действия представлены в Таблицах 2 и 4.

Пример 3. Эффективность средства местного применения по настоящему изобретению в модели бактериального вагинита на мышах.

В экспериментах использовались беспородные белые мыши-самки, возрастом 3 месяца, весом 21-23 г. Мышей заражали per vaginum смесью равных объемов Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В (СГВ), серотип III штамм 6224) и Staphylococcus aureus GA 1 (клинический изолят из коллекции Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова) в объеме 50 мкл (2,5×10⁸ КОЕ/мышь), соответственно. Процедуру заражения проводили ежедневно в течение 5 дней. Затем в течение 5 дней ежедневно вводили средство по настоящему изобретению. Взятие вагинальных смывов проводили промыванием вагинальной полости фосфатно-буферным раствором в объеме 50 мкл. Смывы исследовали бактериологическим методом и при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для определения динамики обсемененности стрептококками и стафилококками высевы делали через день на протяжении всего периода после инфицирования 1, 3, 6 и 9 дни после введения.

На 14 день эксперимента животных декапитировали, отбирали пробы крови и делали смывы со слизистой влагалища. Выборочно отбирались биоптаты матки мышей из различных групп для гистологического исследования.

В модели бактериального вагинита на мышах, вызванного интавагинальным введением культур Staphillococcus aureus и Streptococcus agalactiae, средство по настоящему изобретению активно подавляет рост бактерий уже в первые дни после введения. Также он сильнее других препаратов снижает совокупное содержание бактерий Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia и Porphyromonas spp.во влагалище мышей.

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Средство местного применения для лечения инфекционных вагинитов» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.

Claims (1)

1. Средство местного применения для лечения инфекционных вагинитов, содержащее 0,1% (масс.) биоцидного пептида формулы H₂N-(CH₂)₁₀-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH₂ и 1,5% (масс.) гидроксиэтилцеллюлозы в 0,15 М лактатном буферном растворе.