RU2715557C1 - Способ обнаружения внеклеточной днк в цельной периферической крови - Google Patents
Способ обнаружения внеклеточной днк в цельной периферической крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2715557C1 RU2715557C1 RU2019119629A RU2019119629A RU2715557C1 RU 2715557 C1 RU2715557 C1 RU 2715557C1 RU 2019119629 A RU2019119629 A RU 2019119629A RU 2019119629 A RU2019119629 A RU 2019119629A RU 2715557 C1 RU2715557 C1 RU 2715557C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- extracellular
- dna
- extracellular dna
- peripheral blood
- whole peripheral
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/33—Immersion oils, or microscope systems or objectives for use with immersion fluids
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06M—COUNTING MECHANISMS; COUNTING OF OBJECTS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G06M11/00—Counting of objects distributed at random, e.g. on a surface
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии и клинической лабораторной диагностике, и предназначено для обнаружения внеклеточной ДНК в цельной периферической крови. Фиксированный мазок окрашивают раствором азур-эозина по Романовскому в разведении 1:9, выдерживают 10-20 мин, промывают фосфатным буфером, сушат на воздухе. Обнаруживают лейкоциты и внеклеточные сети ДНК. Проводят подсчет 100 структур разных групп нейтрофилов, внеклеточных сетей ДНК, сегментоядерных нейтрофилов, палочкоядерных нейтрофилов, юных (метамиелоциты) и рассчитывают процентное содержание каждой морфологической единицы. Изобретение позволяет четко визуализировать хроматин. 5 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и клинической лабораторной диагностике, и предназначено для обнаружения внеклеточных сетей ДНК экспресс-методом с количественной оценкой данного явления.
В настоящее время известно несколько способов обнаружения внеклеточной ДНК. Например, с использованием метода сканирующей электронной микроскопии [1]. Авторы использовали его для визуализации образовавшихся структур. Однако данный способ обнаружения нейтрофильных ловушек требует наличия специального оборудования (электронного микроскопа), набор реактивов для приготовления препарата и очень аккуратного выполнения исследования, так как образующиеся структуры очень хрупкие и быстро разрушаются при механическом воздействии [1].
Известен метод выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена [2]. Данная реакция требует фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10% забуференном формалине, для приготовления реактивов используются агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждаются в специальных условиях хранения. Кроме того, реакция проходит в 2 этапа, которые занимают около 2-2,5 часов. При соблюдении всех условий ядерное вещество окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводят с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении ×1000. Данный способ имеет ограниченное применение так как занимает длительное время и требует предварительного приготовления реактивов.
Существует способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек с помощью люминесцентной микроскопии [3]. Авторы определяют ловушки в мукозальных секретах используя сложный краситель. Данный способ уступает заявленному, так как требует специального оборудования (люминесцентный микроскоп) и приготовления двухкомпонентного красителя ex temporo.
Предлагаемый способ не требует специальной подготовки препарата, основан на базовом методе - приготовление мазка крови, не требует приобретения новых навыков сотрудников и специального оборудования, быстр в исполнении, позволяет четко визуализировать хроматин.
Целью заявляемого способа является разработка экспресс-метода обнаружения внеклеточной ДНК и их количественная оценка в периферической крови.
Сущность предлагаемого способа заключается в использовании раствора азур-эозина по Романовскому для окраски лейкоцитов и внеклеточных волокон ДНК.
Предлагаемый способ диагностики соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов обнаружения внеклеточных сетей ДНК ловушек обладает следующими существенными отличительными признаками:
- материалом для исследования является цельная периферическая кровь;
- не требует специального оборудования;
- для окрашивания используется один готовый реактив (Азур-эозин по Романовскому);
- позволяет дать количественную характеристику данному явлению.
Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:
1) Из цельной периферической крови готовят мазок на стекле (аналогично мазку для лейкоцитарной формулы в OAK).
2) Для фиксации мазка используют 96%-ый этиловый спирт, в который помещают препарат на 2-3 сек.
3) Фиксированный препарат окрашивают раствором азур-эозина по Романовскому в разведении 1:9, выдерживают 10-20 минут и промывают фосфатным буфером. Окрашенный препарат высушивают на воздухе.
4) Учет проводят с помощью светового микроскопа, используя иммерсионный объектив, масло иммерсионное для микроскопии, увеличение 40. Внеклеточная ДНК представлена тонкими фиолетово-красными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного лейкоцита.
При этом можно провести количественную оценку образования внеклеточных ловушек, так как при таком способе окраски хорошо различима морфология всех форменных элементов крови. Проводили подсчет нейтрофилов, которые являются основным видом лейкоцитов, циркулирующих в крови человека и основными продуцентами внеклеточных ловушек и внеклеточных сетей ДНК. Проводили подсчет следующих морфологических групп: 1 группа объединяет клетки с сегментированным ядром (фрагмент 1), 2 группа включает клетки с U- или S-образным ядром (фрагмент 2), 3 группа - это клетки с недифференцированным ядром (фрагмент 3), и к 4 группе относят свободнолежащие красно-фиолетовые волокна, представляющие собой нити ДНК (фрагмент 4). Проводят подсчет 100 структур разных групп и определяют процентное содержание каждой морфологической единицы.
Предлагаемым способом окрашено и изучено 200 фиксированных препаратов, приготовленных из цельной периферической крови.
Пример 1
Окраске подвергался мазок приготовленный из цельной периферической крови женщины, 57 лет, находящейся в реанимации с панкреонекрозом, септическим шоком. В мазках хорошо визуализировались все морфологические единицы нейтрофилов, в том числе красно-фиолетовые отдельно лежащие нити ДНК (фрагмент 5), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание внеклеточных ловушек составило - 34%, сегментоядерных нейтрофилов - 48%, палочкоядерных - 13% и юных (метамиелоцитов) - 5%).
Пример 2
Окраске подвергался мазок приготовленный из цельной периферической крови мужчины, 55 лет, находящейся в реанимации с острым деструктивным панкреатитом, тяжелым сепсисом. В мазках хорошо визуализировались все морфологические единицы нейтрофилов, в том числе красно-фиолетовые отдельно лежащие нити ДНК, что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание внеклеточных ловушек составило - 23%, сегментоядерных нейтрофилов - 52%, палочкоядерных - 10% и юных (метамиелоцитов) - 15%).
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет быстро обнаружить внеклеточные сети ДНК лейкоцитов и дать количественную характеристику данному явлению.
Литература:
1. Brinkmann V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. / V. Brinkmann, U. Rechard, C. Goosmann et al. // Science. - 2004. - Vol. 303. - P. 1532-1535.
2. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. / Г.А. Меркулов. - МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 1956. - 263 с.
3. Заявка №2009102579/10 RU. МПК C12N 15/10, C12Q 1/06. Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах. Опубликовано 10.10.2012.
Claims (1)
- Способ обнаружения внеклеточной ДНК в цельной периферической крови, отличающийся тем, что фиксированный мазок окрашивают раствором азур-эозина по Романовскому в разведении 1:9, выдерживают 10-20 мин, промывают фосфатным буфером, сушат на воздухе, учитывают с помощью световой микроскопии, используют масляную иммерсию, обнаруживают лейкоциты и внеклеточные сети ДНК, представленные тонкими фиолетово-красными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного лейкоцита, проводят подсчет 100 структур разных групп нейтрофилов, которые являются основным видом лейкоцитов, циркулирующих в крови человека, подсчитывают: внеклеточные сети ДНК, сегментоядерные нейтрофилы, палочкоядерные нейтрофилы, юные (метамиелоциты) и рассчитывают процентное содержание каждой морфологической единицы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019119629A RU2715557C1 (ru) | 2019-06-24 | 2019-06-24 | Способ обнаружения внеклеточной днк в цельной периферической крови |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019119629A RU2715557C1 (ru) | 2019-06-24 | 2019-06-24 | Способ обнаружения внеклеточной днк в цельной периферической крови |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2715557C1 true RU2715557C1 (ru) | 2020-03-02 |
Family
ID=69768230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019119629A RU2715557C1 (ru) | 2019-06-24 | 2019-06-24 | Способ обнаружения внеклеточной днк в цельной периферической крови |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2715557C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2815709C1 (ru) * | 2022-12-21 | 2024-03-20 | Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора) | Способ детекции внеклеточной днк в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017011329A1 (en) * | 2015-07-10 | 2017-01-19 | West Virginia University | Markers of stroke and stroke severity |
-
2019
- 2019-06-24 RU RU2019119629A patent/RU2715557C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017011329A1 (en) * | 2015-07-10 | 2017-01-19 | West Virginia University | Markers of stroke and stroke severity |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| АДАМОВА В.В. и др. Морфофункциональные особенности лейкоцитов Gallus domesticus в условиях гипотонии. 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука ХХI века". Сборник тезисов. Пущино, 2013 г. С.88-89. * |
| СЕМЕНОВА А.Б. и др. Формирование нейтрофильными гранулорцитами сетей внеклеточной ДНК как дополнительный диагностический критерий степени злокачественности карцином молочной железы. Уральский медицинский журнал. 2016; 3: 72-76. * |
| СЕМЕНОВА А.Б. и др. Формирование нейтрофильными гранулорцитами сетей внеклеточной ДНК как дополнительный диагностический критерий степени злокачественности карцином молочной железы. Уральский медицинский журнал. 2016; 3: 72-76. АДАМОВА В.В. и др. Морфофункциональные особенности лейкоцитов Gallus domesticus в условиях гипотонии. 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука ХХI века". Сборник тезисов. Пущино, 2013 г. С.88-89. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2815709C1 (ru) * | 2022-12-21 | 2024-03-20 | Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора) | Способ детекции внеклеточной днк в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Quintana et al. | Extracellular Onchocerca-derived small RNAs in host nodules and blood | |
| Rieger et al. | Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death | |
| Gutierrez et al. | Camel trypanosomosis in the Canary Islands: assessment of seroprevalence and infection rates using the card agglutination test (CATT/T. evansi) and parasite detection tests | |
| CN104094116A (zh) | 在哺乳动物个体中检测5t4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5t4阳性癌症的方法 | |
| CN105388288B (zh) | 人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒、方法和细胞固定液 | |
| Short et al. | Branching morphogenesis in the developing kidney is not impacted by nephron formation or integration | |
| Bayarmagnai et al. | Intravital imaging of tumor cell motility in the tumor microenvironment context | |
| Bayerl et al. | Guidelines for visualization and analysis of DC in tissues using multiparameter fluorescence microscopy imaging methods | |
| Da’dara et al. | New insights into the reaction of Schistosoma mansoni cercaria to the human complement system | |
| RU2715557C1 (ru) | Способ обнаружения внеклеточной днк в цельной периферической крови | |
| Jax et al. | Evaluating Effects of AIV Infection Status on Ducks Using a Flow Cytometry-Based Differential Blood Count | |
| CN107058465A (zh) | 一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法 | |
| CN102313813B (zh) | 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法 | |
| Dey et al. | A multi-colour confocal microscopy method for identifying and enumerating macrophage subtypes and adherent cells in the stromal vascular fraction of human adipose | |
| Baker et al. | SYLARAS: a platform for the statistical analysis and visual display of systemic immunoprofiling data and its application to glioblastoma | |
| EP2455756A1 (en) | Cell-based screening assay for inhibitors of NET formation | |
| RU2384844C2 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек | |
| Zhang et al. | Source of early regenerating axons in lamprey spinal cord revealed by wholemount optical clearing with BABB | |
| Sena-Lopes et al. | Cell viability analysis of Toxocara cati larvae with LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity kit | |
| Del Rio et al. | Impaired repair properties of endothelial colony‐forming cells in patients with granulomatosis with polyangiitis | |
| Ribeiro et al. | An ex vivo multiparametric flow cytometry assay using human whole blood to simultaneously measure cytotoxicity and leishmanicidal activities | |
| JP4839073B2 (ja) | 微弱光解析方法 | |
| CN111537531A (zh) | 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 | |
| Söderström et al. | Dynamic localisation of DamX regulates bacterial filamentation and division during UPEC dispersal from host cells | |
| Klasinc et al. | A Novel Flow Cytometric Approach for the Quantification and Quality Control of Chlamydia trachomatis Preparations |