RU2670207C1 - Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища - Google Patents
Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670207C1 RU2670207C1 RU2017145869A RU2017145869A RU2670207C1 RU 2670207 C1 RU2670207 C1 RU 2670207C1 RU 2017145869 A RU2017145869 A RU 2017145869A RU 2017145869 A RU2017145869 A RU 2017145869A RU 2670207 C1 RU2670207 C1 RU 2670207C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- gardnerella vaginalis
- synthetic oligonucleotides
- seq
- biological material
- Prior art date
Links
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 title claims abstract description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 title claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 26
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000006452 multicomponent reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241001633064 Atopobium vaginae Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагиноза Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств выявления ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале. 3 пр.
Description
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии, и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие бактериального вагиноза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Gardnerella vaginalis. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК маркера бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанной бактерии в биологическом материале с высокой точностью.
В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов и биологических материалах, в частности ДНК Gardnerella vaginalis.
Известен способ молекулярной диагностики, включающий специфический захват однонитевой целевой нуклеотидной последовательности, который может быть изготовлен из встречающихся в природе нуклеотидов или которые могут быть изготовлены из нуклеотидов, которые не встречаются в природе или любую их смесь, например, ДНК и/или РНК, с помощью дополнительного зонда, содержащего один или более молекулы интеркалятора (US 2013/0230856, (Quantibact A/S, DK), 05.09.2013). Заявленный способ подходит для выявления таких микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Atopobium vaginae и Candida albicans.
Известны дифференцирующие и специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа (Патент России №2348695, опубл. 10.03.2009 г., Бюл. №7, (ЗАО Молекулярно-медицинские технологии, RU). Для идентификации возбудителя используют следующие последовательности: спейсер между генами 16S-23S рРНК (16S-23S ITS) и ген белка 60 теплового шока (hsp60). В способе видовой идентификации инфекционных агентов проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию в присутствии специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров с последующей гибридизацией ПЦР-продуктов с дифференцирующими олигонуклеотидами на микрочипе и определяют урогенитальную инфекцию по наличию гибридизационных комплексов. Указанные специфические олигонуклеотиды входят в набор для видовой идентификации урогенитальной инфекции.
Также известен способ мультиплексного определения вульвовагинального кандидоза (VVC), трихомониаза и бактериального вагиноза (BV) (WO 2016/172204 А1, Becton, Dickinson And Company, US, опубл. 27.10.2016 г.). Способ включает постановку полимеразной цепной реакции с набором специфических праймеров из 16S рРНК «HINGVFW», «HINGVRV», «GV1FW», «GV3RV» и определение продуктов реакции. Перечень микроорганизмов включает, но не ограничивается Gardnerella vaginalis. Данный способ видовой идентификации микроорганизмов является ближайшим аналогом заявленного изобретения. Недостатком известного решения является недостаточная чувствительность применения метода детекции для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале.
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в области амплификации - 16s rRNA, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq. N1 и Seq. N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:
AGGGCGTATTGGTTGGATGC Seq. N1
CCTCGGATCAAAGCCCACTC Seq. N2
CGGGCTGCGATATGCCTCGG Seq. N3
Существенным отличием работы с данными праймерами является:
1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области 16s рибосомальной РНК позволяет выявить ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.
2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.
3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм ЮНИ» и «МагноПрайм ФАСТ» (ООО «НекстБио» Россия).
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильно высушенных реакционных смесей.
Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК Gardnerella vaginalis, в состав которых входят:
1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК Gardnerella vaginalis, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).
2. ПЦР-буфер.
3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):
3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.
3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости замены реагентов и необходимости переставить эксперимент.
Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Определение наличия ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Предварительно готовится реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).
В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.
В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.
Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие Gardnerella vaginalis с высокой точностью.
Пример 2. Определение наличия ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапаной под прослойку парафина.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.
На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.
Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.
Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Gardnerella vaginalis с высокой точностью.
Пример 3. Определение наличия ДНК Gardnerella vaginalis в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.
В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.
Поставить контрольные реакции:
а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.
б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.
Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Gardnerella vaginalis с высокой точностью.
Claims (4)
- Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагиноза Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:
- AGGGCGTATTGGTTGGATGC Seq.N1
- CCTCGGATCAAAGCCCACTC Seq.N2
- CGGGCTGCGATATGCCTCGG Seq.N3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145869A RU2670207C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145869A RU2670207C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670207C1 true RU2670207C1 (ru) | 2018-10-19 |
Family
ID=63862246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145869A RU2670207C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670207C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075306A1 (en) * | 2006-11-24 | 2010-03-25 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification |
| WO2016172204A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection of vulvovaginal candidiasis, trichomoniasis and bacterial vaginosis |
| RU2622028C1 (ru) * | 2016-04-22 | 2017-06-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лабораторной верификации вагинита у девочек с вульвитом в возрасте до 8 лет |
-
2017
- 2017-12-26 RU RU2017145869A patent/RU2670207C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075306A1 (en) * | 2006-11-24 | 2010-03-25 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification |
| WO2016172204A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection of vulvovaginal candidiasis, trichomoniasis and bacterial vaginosis |
| RU2622028C1 (ru) * | 2016-04-22 | 2017-06-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лабораторной верификации вагинита у девочек с вульвитом в возрасте до 8 лет |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3259602B9 (en) | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells | |
| US20180195111A1 (en) | 16s ribosomal rna universal primers and use thereof in microbiological analysis and diagnostics | |
| WO2009100449A1 (en) | Dynamic array assay methods | |
| UA92720C2 (ru) | Способ одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций днк микобактерий, которые приводят к стойкости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, на биологических микрочипах, набор праймеров, биочип и набор олигонуклеотидных зондив, которые применяются в способе | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| JP2023504258A (ja) | 臨床的状況及び非臨床的状況において微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を同定する方法 | |
| US10538805B2 (en) | Quantitative multiplexed identification of nucleic acid targets | |
| RU2348695C2 (ru) | Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа | |
| KR102200940B1 (ko) | 큐열균을 포함하는 고위험 병원체 또는 독소 11종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법 | |
| RU2670207C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2663453C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2663454C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2670206C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2608651C1 (ru) | Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов | |
| RU2670280C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища | |
| EP2524053A1 (en) | Method for detecting more than one target in a pcr-based approach applying an unspecific dye which is not interfering with the emission of fluorophore-labeled probes | |
| KR101080087B1 (ko) | 세포 증폭반응용 칩 및 이를 이용한 등온증폭반응기 | |
| RU2722185C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала | |
| US20170335382A1 (en) | Isothermal Amplification Assay for the Detection of Short Nucleic Acid Sequences | |
| RU2737619C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| RU2670278C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококков в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2386698C1 (ru) | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе | |
| RU2765497C1 (ru) | Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2 | |
| RU2732923C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191227 |