RU2670280C1 - Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища - Google Patents
Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670280C1 RU2670280C1 RU2017145862A RU2017145862A RU2670280C1 RU 2670280 C1 RU2670280 C1 RU 2670280C1 RU 2017145862 A RU2017145862 A RU 2017145862A RU 2017145862 A RU2017145862 A RU 2017145862A RU 2670280 C1 RU2670280 C1 RU 2670280C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- lactobacillus
- synthetic oligonucleotides
- seq
- biological material
- Prior art date
Links
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 title claims abstract description 18
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 title abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 26
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000006452 multicomponent reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001633064 Atopobium vaginae Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 description 1
- 241000604449 Megasphaera Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагинита Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств выявления ДНК Lactobacillus spp. в биологическом материале. 3 пр.
Description
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии, и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие бактериального вагиноза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Lactobacillus spp. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК маркера бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанной бактерии в биологическом материале с высокой точностью.
В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК инфекционных агентов и биологических материалах, в частности ДНК Lactobacillus spp.
Из уровня техники известны следующие патенты по данному направлению:
Известен способ мультилексного определения вульвовагинального кандидоза (VVC), трихомониаза и бактериального вагиноза (BV) [Заявка WO 2016/172204 А1 (Becton, Dickinson And Company, US), опубл. 27.10.2016 г.]. Способ включает постановку полимеразной цепной реакции с набором специфических праймеров и определение продуктов реакции. Перечень микроорганизмов включает, но неограничивается Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera Type 1, и BVAB2. В документе приведены последовательности праймеров для определения патогенных микроорганизмов и составы неселективных смесей праймеров (таблицы 6а, 6б, 7а и 7б).
Также известен способ проведения количественной ПЦР в режиме реального времени [Заявка WO 02/070751 А1 (University Of Pittsburg Of The Commonwealth System Of Higher Education, US), опубл. 12.09.2002 г.]. В способе используются наборы специфических праймеров для ПЦР. При описании способа заявитель приводит наиболее оптимальные параметры для ПЦР.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК Lactobacillus spp.в биологическом материале (отделяемое слизистой оболочки влагалища).
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp.в области амплификации - 16s rRNA, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:
TTAGCTGCAGCACTGAGAGG Seq.N1
AGGCTCGAAAGCATGGGTAG Seq.N2
ACGGCATGGACTACCAGGGT Seq.N3
Существенным отличием работы с данными праймерами является:
1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области 16s рибосомальной РНК позволяет выявить ДНК Lactobacillus spp.в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.
2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.
3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм Юни» и «МагноПрайм Фаст» (ООО «НекстБио» Россия).
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильновысушенных реакционных смесей.
Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК Lactobacillus spp., в состав которых входят:
1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК Lactobacillus spp., смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).
2. ПЦР - буфер.
3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):
3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.
3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Определение наличия ДНК Lactobacillus spp.в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Предварительно готовиться реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).
В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.
В пробирки с реакционной смесью, промаркиованные для образцов биологического материала, вноситься проба ДНК, полученная на этапе экстракции.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.
Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Lactobacillus spp.с высокой точностью.
Пример 2. Определение наличия ДНК Lactobacillus spp. в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Предварительно готовиться реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).
В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.
В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вноситься проба ДНК, полученная на этапе экстракции.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.
Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Lactobacillus spp.с высокой точностью.
Пример 3. Определение наличия ДНК Lactobacillus spp.в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.
В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.
Поставить контрольные реакции:
а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.
б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.
Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Lactobacillus spp.c высокой точностью.
Claims (4)
- Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагинита Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:
- TTAGCTGCAGCACTGAGAGG Seq.N1;
- AGGCTCGAAAGCATGGGTAG Seq.N2;
- ACGGCATGGACTACCAGGGT Seq.N3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145862A RU2670280C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145862A RU2670280C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670280C1 true RU2670280C1 (ru) | 2018-10-22 |
Family
ID=63923362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145862A RU2670280C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670280C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075306A1 (en) * | 2006-11-24 | 2010-03-25 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification |
| RU2622028C1 (ru) * | 2016-04-22 | 2017-06-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лабораторной верификации вагинита у девочек с вульвитом в возрасте до 8 лет |
-
2017
- 2017-12-26 RU RU2017145862A patent/RU2670280C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075306A1 (en) * | 2006-11-24 | 2010-03-25 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification |
| RU2622028C1 (ru) * | 2016-04-22 | 2017-06-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лабораторной верификации вагинита у девочек с вульвитом в возрасте до 8 лет |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NABI X.H. et al. Anti-atherosclerotic effect of traditional fermented cheese whey in atherosclerotic rabbits and identification of probiotics. BMC Complement Altern Med. 2016 Aug 24; 16: 309. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bian et al. | A microfluidic droplet digital PCR for simultaneous detection of pathogenic Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes | |
| CN108474042B (zh) | 一种评估幽门螺杆菌感染的试剂成分，试剂盒以及方法 | |
| Chang et al. | Rapid detection and typing of live bacteria from human joint fluid samples by utilizing an integrated microfluidic system | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| BRPI0710889A2 (pt) | método para a detecção e quantificação múltipla e simultánea de patogênicos mediante a reação em cadeia da polimerasa em tempo real | |
| WO2006080501A1 (ja) | ｒＲＮＡを標的とした微生物の定量的解析方法 | |
| RU2645263C1 (ru) | Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Kurakawa et al. | Establishment of a sensitive system for analysis of human vaginal microbiota on the basis of rRNA-targeted reverse transcription-quantitative PCR | |
| KR102200940B1 (ko) | 큐열균을 포함하는 고위험 병원체 또는 독소 11종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법 | |
| Gal et al. | Application of a polymerase chain reaction to detect Burkholderia pseudomallei in clinical specimens from patients with suspected melioidosis | |
| CN103276099A (zh) | 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒 | |
| RU2670280C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2608651C1 (ru) | Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов | |
| RU2663454C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2670206C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2670278C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококков в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2670207C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища | |
| Jin et al. | Rapid detection of antibiotic resistance genes in lactic acid bacteria using PMMA-based microreactor arrays | |
| RU2663453C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища | |
| JP5205609B2 (ja) | ウイルス検出用オリゴヌクレオチドセット、ｅｂｖ、ｃｍｖ及びｈｈｖ−６の分析方法及び検出キット | |
| RU2737619C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала | |
| RU2722185C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| RU2732923C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника | |
| Fujimoto et al. | Effect of the absence of spermatozoa on microrna-based semen identification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191227 |