RU2670206C1 - Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища - Google Patents
Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670206C1 RU2670206C1 RU2017145864A RU2017145864A RU2670206C1 RU 2670206 C1 RU2670206 C1 RU 2670206C1 RU 2017145864 A RU2017145864 A RU 2017145864A RU 2017145864 A RU2017145864 A RU 2017145864A RU 2670206 C1 RU2670206 C1 RU 2670206C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- atopobium vaginae
- synthetic oligonucleotides
- seq
- pcr
- Prior art date
Links
- 241001633064 Atopobium vaginae Species 0.000 title claims abstract description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 title claims abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 26
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 16
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 description 2
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000006452 multicomponent reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036764 Adenocarcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 description 1
- 241000604449 Megasphaera Species 0.000 description 1
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 206010030137 Oesophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000028653 esophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000005005 sentinel lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагиноза Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонды с флуоресцентной меткой. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств выявления ДНК Atopobium vaginae в биологическом материале. 3 пр.
Description
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК Atopobium vaginae. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие бактериального вагиноза вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания с целью выявления ДНК Atopobium vaginae. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК маркера бактериального вагиноза - анаэробной бактерии Atopobium vaginae методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанной бактерии в биологическом материале с высокой точностью.
Из уровня техники известны следующие патенты по данному направлению:
Известен способ мультилексного определения вульвовагинального кандидоза (VVC), трихомониаза и бактериального вагиноза (BV) [Заявка WO 2016/172204 А1, (Becton, Dickinson And Company, US) опубл. 27.10.2016 г.], включающий постановку полимеразной цепной реакции с набором специфических праймеров и определение продуктов реакции. Перечень микроорганизмов включает, но неограничивается Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera Type 1, и BVAB2. В документе приведены последовательности праймеров для определения патогенных микроорганизмов и составы неселективных смесей праймеров (таблицы 6а, 6б, 7а и 76).
Также известен способ проведения количественной ПЦР в режиме реального времени [Заявка WO 02/070751 А1, (University Of Pittsburg Of The Commonwealth System Of Higher Education, US), опубл. 12.09.2002 г.]. Метод включает балансировку двух или более мультиплексированных методов ПЦР. В известном способе последовательные временные стадии ПЦР используются для эффективного разделения двух или более реакций ПЦР в одной пробирке в качестве альтернативы праймеру, ограничивающему модуляцию относительной скорости образования первого ампликона с помощью первого набора праймеров и второго ампликона вторым набором праймеров во время первой и второй ступеней амплификации. Также предлагаются быстрые методы ОТ-ПЦР, которые полезны при интраоперационных диагнозах и прогнозах, например, при диагностике злокачественной аденокарценомы пищевода путем определения уровней экспрессии карциноэмбрионального антигена (СБА) в дозорных лимфатических узлах. Также описаны наборы специфических праймеров для ПЦР. При описании способа заявитель приводит наиболее оптимальные параметры для ПЦР.
Также известен способ молекулярной диагностики, включающий специфический захват однонитевой целевой нуклеотидной последовательности который может быть изготовлен из встречающихся в природе нуклеотидов или которые могут быть изготовлены из нуклеотидов, которые не встречаются в природе или любую их смесь, например, ДНК и/или РНК, с помощью дополнительного зонда, содержащего один или более молекулы интеркалятора [US 20130230856, правообладатель Quantibact A/S, DK, от 05.09.2013]. Способ подходит для выявления таких микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Atopobium vaginae и Candida albicans.
Также известны методы и олигонуклеотиды для выявления Neisseria gonorrhoeae, а также для выявления Atopobium vaginae [WO/2016/086305, (University of Saskatchewan, CA), от 09.06.2016] Предпочтительные олигонуклеотиды приведены в таблице 2 патентного документа.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК Atopobium vaginae в биологическом материале.
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в области амплификации - 16s rRNA, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:
AACCCCTATCCGCTCCTGAT Seq.N1
CAGTCATGGCCCAGAAGACC Seq.N2
AGAACACCGGTGGCGAAGGC Seq.N3
Существенным отличием работы с данными праймерами является:
1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области 16s рибосомальной РНК позволяет выявить ДНК Atopobium vaginae в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.
2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.
3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм Юни» и «МагноПрайм Фаст» (ООО «НекстБио» Россия).
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильновысушенных реакционных смесей.
Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК Atopobium vaginae, в состав которых входят:
1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК Atopobium vaginae, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).
2. ПЦР-буфер.
3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):
3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов X и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.
3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости замены реагентов и необходимости переставить эксперимент.
Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Определение наличия ДНК Atopobium vaginae в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Предварительно готовится реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).
В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.
В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.
Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие Atopobium vaginae с высокой точностью.
Пример 2. Определение наличия ДНК Atopobium vaginae в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапаной под прослойку парафина.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.
На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.
Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.
В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.
Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Atopobium vaginae с высокой точностью.
Пример 3. Определение наличия ДНК Atopobium vaginae в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси.
Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки влагалища) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.
Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.
В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.
Поставить контрольные реакции:
а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.
б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.
Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.
Предложенный набор набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК Atopobium vaginae с высокой точностью.
Claims (4)
- Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя бактериального вагиноза Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища методом полимеразной цепной реакции, включающий в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:
- AACCCCTATCCGCTCCTGAT Seq.N1
- CAGTCATGGCCCAGAAGACC Seq.N2
- AGAACACCGGTGGCGAAGGC Seq.N3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145864A RU2670206C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145864A RU2670206C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670206C1 true RU2670206C1 (ru) | 2018-10-19 |
Family
ID=63862447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145864A RU2670206C1 (ru) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670206C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075306A1 (en) * | 2006-11-24 | 2010-03-25 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification |
| RU2583924C1 (ru) * | 2015-04-06 | 2016-05-10 | Анжела Владимировна Цветкова | СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-ДЕТЕКЦИИ Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens И Eggerthella spp. В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ |
| WO2016172204A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection of vulvovaginal candidiasis, trichomoniasis and bacterial vaginosis |
-
2017
- 2017-12-26 RU RU2017145864A patent/RU2670206C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075306A1 (en) * | 2006-11-24 | 2010-03-25 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification |
| RU2583924C1 (ru) * | 2015-04-06 | 2016-05-10 | Анжела Владимировна Цветкова | СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-ДЕТЕКЦИИ Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens И Eggerthella spp. В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ |
| WO2016172204A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection of vulvovaginal candidiasis, trichomoniasis and bacterial vaginosis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blassl et al. | Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer–Establishment of a multi-marker gene panel | |
| Perkins et al. | Droplet-based digital PCR: application in cancer research | |
| EP3320110B1 (en) | 16s ribosomal rna universal primers and use thereof in microbiological analysis and diagnostics | |
| CA2895945C (en) | Target capture system | |
| US20160245813A1 (en) | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells | |
| CN102066573A (zh) | 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 | |
| JP2011062119A (ja) | 生体試料定量用チップ | |
| US10538805B2 (en) | Quantitative multiplexed identification of nucleic acid targets | |
| Aigelsreiter et al. | Chlamydia psittaci in MALT lymphomas of ocular adnexals: the Austrian experience | |
| RU2670206C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища | |
| Jin et al. | Rapid detection of antibiotic resistance genes in lactic acid bacteria using PMMA-based microreactor arrays | |
| RU2670207C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2670280C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Lactobacillus spp. в слизистой оболочке влагалища | |
| EP2524053A1 (en) | Method for detecting more than one target in a pcr-based approach applying an unspecific dye which is not interfering with the emission of fluorophore-labeled probes | |
| RU2663454C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК возбудителей вульвовагинального кандидоза в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2608651C1 (ru) | Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов | |
| TW200427840A (en) | Method of detecting acid-fast bacteria using ribosomal RNA as target | |
| RU2663453C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в слизистой оболочке влагалища | |
| JP5505646B2 (ja) | 生体試料定量方法 | |
| RU2722185C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала | |
| RU2670278C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для количественного определения ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококков в слизистой оболочке влагалища | |
| RU2636458C1 (ru) | Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий | |
| RU2737619C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| JP6871271B2 (ja) | Ｄｌｂｃｌを分類するための方法および組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191227 |