RU2645263C1 - Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction - Google Patents
Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2645263C1 RU2645263C1 RU2017111554A RU2017111554A RU2645263C1 RU 2645263 C1 RU2645263 C1 RU 2645263C1 RU 2017111554 A RU2017111554 A RU 2017111554A RU 2017111554 A RU2017111554 A RU 2017111554A RU 2645263 C1 RU2645263 C1 RU 2645263C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- swine fever
- african swine
- fever virus
- test system
- dna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к тест-системе для обнаружения ДНК особо опасного возбудителя африканской чумы свиней (АЧС) в культуре инфицированных клеток и пробах патологических материалов от свиней, и может быть использовано при диагностике АЧС в научно-исследовательских учреждениях, региональных, областных ветеринарных лабораториях и на предприятиях биологической промышленности.The invention relates to the field of veterinary virology, in particular to a test system for detecting DNA of a particularly dangerous pathogen of African swine fever (ASF) in the culture of infected cells and samples of pathological materials from pigs, and can be used in the diagnosis of ASF in research institutions, regional , regional veterinary laboratories and enterprises of the biological industry.
Известна тест-система (см. патент РФ №2360971, кл. C12Q 1/68, 2009 г.), включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами, комплиментарными высококонсервативной области генома вируса АЧС района гена Р30, положительный и отрицательный контроли.A known test system (see RF patent No. 2360971, class C12Q 1/68, 2009), including plastic bottles and tubes, thermostable Tag polymerase enzyme, PCR mixture for the reaction with specific oligonucleotide primers, complementary highly conserved region genome of the ASF virus of the P30 gene region, positive and negative controls.
Также известна тест-система (см. патент РФ №2125089, кл. C12Q 1/68, 1999 г. - прототип), включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена vp72 вируса африканской чумы свиней, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд.A test system is also known (see RF patent No. 2125089,
Недостатком прототипа является недостаточная степень специфичности и чувствительности тест-системы, а также длительность проведения диагностики, что не исключает вероятность технологических ошибок при лабораторных манипуляциях.The disadvantage of the prototype is the lack of specificity and sensitivity of the test system, as well as the duration of the diagnosis, which does not exclude the likelihood of technological errors during laboratory manipulations.
Техническим результатом является повышение степени специфичности и чувствительности тест-системы, а также сокращение времени проведения диагностики при снижении вероятности технологических ошибок во время лабораторных манипуляциях.The technical result is to increase the degree of specificity and sensitivity of the test system, as well as reducing the time of diagnosis while reducing the likelihood of technological errors during laboratory manipulations.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающей пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена vp72 вируса африканской чумы свиней, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, согласно изобретению используют синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцирующий зонд, комплементарные консервативной области генома вируса африканской чумы свиней района гена vp72, имеющие следующий нуклеитидный состав:The technical result is achieved by the fact that in a test system for detecting DNA from African swine fever virus using a real-time polymerase chain reaction, including plastic bottles and tubes, thermostable Tag polymerase enzyme, reaction formulation buffer, a mixture of four deoxynucleotide triphosphates, a positive control - a recombinant plasmid containing a fragment of the vp72 gene of the virus of African swine fever, synthetic oligonucleotide primers and probe according to the invention use synthetic o igonukleotidnye fluorescent primers and probes complementary to the conserved region of the genome of the virus of African swine fever district gene vp72, having the following composition nukleitidny:
- прямой праймер, - direct primer
- обратный праймер, - reverse primer
- флуоресцирующий зонд и взятые при соотношении 1:1:0,5, при этом BHQ1 - темновой гаситель флуоресценции присоединен к 3'-концевому нуклеотиду, а FAM - флуоресцентный краситель присоединен к нуклеотиду С, причем для постановка реакции используют 5-кратный буфер и в качестве отрицательного контроля используют дистиллированную воду. - a fluorescent probe and taken at a ratio of 1: 1: 0.5, while BHQ1, a dark fluorescence quencher, is attached to the 3'-terminal nucleotide, and FAM is a fluorescent dye attached to nucleotide C, and a 5-fold buffer is used to set up the reaction and distilled water is used as a negative control.
Существенными признаками, отличающими заявляемое техническое решение от прототипа, являются:The essential features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are:
- нуклеотидные последовательности праймеров и зонда;- nucleotide sequences of primers and probe;
- формат амплификационной смеси;- format of the amplification mixture;
- состав амплификационой смеси, в которой используют два внутренних контроля проведения полимеразной цепной реакции.- the composition of the amplification mixture, in which two internal controls for the polymerase chain reaction are used.
Новизна заявляемой тест-системы заключается в том, что она позволяет в биологических образцах, в качестве которых используют по выбору: плазму, сыворотку крови, мазки со слизистых от латентно инфицированных и больных животных; патологический материал от павших животных, в инфицированных культурах клеток, а также в продуктах свиноводства и изделиях свиного происхождения, выявлять специфическую последовательность консервативного участка генома вируса африканской чумы свиней без использования дополнительных методов детекции ампликонов, тем самым сокращая процент технологических ошибок. Формат и состав амплификационной смеси сокращает трудоемкость и продолжительность анализа, а также позволяют осуществлять эффективную наработку фрагментов нуклеиновой кислоты вируса африканской чумы свиней, содержащих выбранные функционально значимые консервативные локусы гена-мишени вируса.The novelty of the claimed test system is that it allows in biological samples, which are optionally used: plasma, blood serum, smears from mucous membranes from latently infected and sick animals; pathological material from dead animals, in infected cell cultures, as well as in pig products and products of pig origin, to identify the specific sequence of the conserved region of the African swine fever virus genome without the use of additional amplicon detection methods, thereby reducing the percentage of technological errors. The format and composition of the amplification mixture reduces the complexity and duration of the analysis, and also allows for efficient production of nucleic acid fragments of the African swine fever virus containing selected functionally significant conserved loci of the target gene of the virus.
Также тест-система отличается тем, что в ее составе используют синтетические олигонуклеотидные конструкции:The test system is also characterized in that it uses synthetic oligonucleotide constructs:
(прямой праймер), (direct primer)
(обратный праймер), (reverse primer)
(флуоресцирующий зонд), где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду С. (fluorescent probe), where BHQ1 is a dark fluorescence quencher attached to the 3'-terminal nucleotide, and FAM is a FAM fluorescent dye attached to nucleotide C.
На основе синтетических олигонуклеотидных конструкций SEQ NO 1-3 готовят амплификационную смесь для проведения ПЦР в режиме реального времени; наличие в изучаемой пробе нуклеиновой кислоты искомого вируса определяют ростом сигнала флуоресценции красителя. Причем структура синтетических олигонуклеотидных конструкций обеспечивает связывание только с полностью комплементарными ДНК-мишенями, что обуславливает яркий флуоресцентный сигнал. Кроме того, физико-химические свойства олигонуклеотидных конструкций SEQ NO 1-3 препятствуют образованию между собой шпилек и дуплексов (высокоэнергетических внутренних структур), способствуют образованию необходимого количества продукта амплификации, а также подобраны с учетом одинаковой температуры отжига на ДНК-мишени (60-62°С). Для стабильной работы олигонуклеотидных конструкций в растворе тест-системы оптимизированы концентрация MgCl2 и самих конструкций, а также соотношение прямых, обратных праймеров и флуоресцентных зондов, количество циклов амплификации и их время на каждом этапе.Based on the synthetic oligonucleotide constructs of SEQ NO 1-3, an amplification mixture is prepared for real-time PCR; the presence of the desired virus in the studied nucleic acid sample is determined by the growth of the dye fluorescence signal. Moreover, the structure of synthetic oligonucleotide constructs provides binding only to fully complementary DNA targets, which causes a bright fluorescent signal. In addition, the physicochemical properties of the oligonucleotide constructs of SEQ NO 1-3 prevent the formation of studs and duplexes (high-energy internal structures), contribute to the formation of the required amount of amplification product, and are also selected taking into account the same annealing temperature on the target DNA (60-62 ° C). For the stable operation of oligonucleotide structures in the solution of the test system, the concentration of MgCl 2 and the structures themselves, as well as the ratio of forward, reverse primers and fluorescent probes, the number of amplification cycles and their time at each stage are optimized.
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены графики из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при использовании Real-time PCR:The invention is illustrated in the drawing, which presents graphs from the report of the device Rotor-Gene 6000 when using Real-time PCR:
на фиг. 1 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для отрицательного образца;in FIG. 1 is a graph of the FAM channel — the desired ASF DNA for a negative sample;
на фиг. 2 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - отрицательный образец;in FIG. 2 shows a graph of the channel Su5 - an internal control sample of specificity - pig DNA - negative sample;
на фиг. 3 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - отрицательный образец;in FIG. 3 shows a graph of the HEX channel — internal control sample of isolation — ASF synthetic DNA — negative sample;
на фиг. 4 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для положительного образца;in FIG. 4 is a graph of the FAM channel — the desired ASF DNA for a positive sample;
на фиг. 5 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - положительный образец;in FIG. 5 shows a graph of the Su5 channel — an internal control specimen of specificity — pig DNA — positive sample;
на фиг. 6 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - положительный образец;in FIG. 6 is a graph of the HEX channel — internal control sample of isolation — ASF synthetic DNA — positive sample;
на фиг. 7 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для сомнительного образца;in FIG. 7 is a graph of the FAM channel — the desired ASF DNA for a questionable sample;
на фиг. 8 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - сомнительный образец;in FIG. Figure 8 shows a graph of the Su5 channel — an internal control specimen of specificity — pig DNA — a dubious sample;
на фиг. 9 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - сомнительный образец;in FIG. 9 is a graph of the HEX channel — internal control sample of isolation — ASF synthetic DNA — doubtful sample;
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены графики из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при использовании Real-time PCR:The invention is illustrated in the drawing, which presents graphs from the report of the device Rotor-Gene 6000 when using Real-time PCR:
на фиг. 1 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для отрицательного образца;in FIG. 1 is a graph of the FAM channel — the desired ASF DNA for a negative sample;
на фиг. 2 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - отрицательный образец;in FIG. 2 shows a graph of the channel Su5 - an internal control sample of specificity - pig DNA - negative sample;
на фиг. 3 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - отрицательный образец;in FIG. 3 shows a graph of the HEX channel — internal control sample of isolation — ASF synthetic DNA — negative sample;
на фиг. 4 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для положительного образца;in FIG. 4 is a graph of the FAM channel — the desired ASF DNA for a positive sample;
на фиг. 5 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - положительный образец;in FIG. 5 shows a graph of the Su5 channel — an internal control specimen of specificity — pig DNA — positive sample;
на фиг. 6 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - положительный образец;in FIG. 6 is a graph of the HEX channel — internal control sample of isolation — ASF synthetic DNA — positive sample;
на фиг. 7 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для сомнительного образца;in FIG. 7 is a graph of the FAM channel — the desired ASF DNA for a questionable sample;
на фиг. 8 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - сомнительный образец;in FIG. Figure 8 shows a graph of the Su5 channel — an internal control specimen of specificity — pig DNA — a dubious sample;
на фиг. 9 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - сомнительный образец;in FIG. 9 is a graph of the HEX channel — internal control sample of isolation — ASF synthetic DNA — doubtful sample;
Примеры конкретного использования тест-системыExamples of specific use of the test system
Тест-система снабжена пластиковыми флаконами и пробирками, термостабильным ферментом Tag-полимеразой, 5-кратным буфером для постановки реакции, смесью четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент гена vp72 вируса африканской чумы свиней в качестве положительнго контроля, синтетическими олигонуклеотидными праймерами и зондом комплементарные консервативной области генома вируса африканской чумы свиней района гена vp72, имеющие следующий нуклеитидный состав:The test system is equipped with plastic bottles and tubes, thermostable Tag polymerase enzyme, a 5-fold reaction buffer, a mixture of four deoxynucleotide triphosphates, a recombinant plasmid containing a fragment of the African swine fever virus vp72 gene as a positive control, synthetic oligonucleotide and oligonucleotide regions of the African swine fever virus genome region of the vp72 gene region, having the following nucleitide composition:
- прямой праймер, - direct primer
- обратный праймер, - reverse primer
- флуоресцирующий зонд и взятые при соотношении 1:1:0,5 и отрицательным контролем в качестве которого используют дистиллированную воду. - a fluorescent probe and taken at a ratio of 1: 1: 0.5 and a negative control, which use distilled water.
Пример 1. Проведение ПЦР анализа в формате «моноплексная ПЦР-РВ» для детекции вируса, выделенного из тканей свиней.Example 1. Conducting PCR analysis in the format of "uniplex PCR-RV" for the detection of virus isolated from pig tissues.
Для проведения ПЦР анализа проводили выделение вирусной ДНК из тканей селезенки свиньи. Выделение проводили по следующей методике с использованием коммерческого набора компании «ИДС» для экспресс-выделения «ДНК-экспресс».For PCR analysis, viral DNA was isolated from pig spleen tissues. Isolation was carried out according to the following method using the commercial kit of the company "IDS" for rapid isolation of DNA Express.
Отбирают гомогенизат ткани селезенки и помещают его в пробирку на 1,5 мл с 300 мкл раствора «ДНК-экспресс». Добавляют в каждую пробирку по 10 мкл «ЭВК» (экзогенный внутренний контроль выделения, входит в состав коммерческого набора). Перемешивают на вортексе 5-10 сек. Осаждают капли с крышки пробирки коротким центрифугированием. Прогревают при 98°C в течение 15 минут. Центрифугируют 2 мин при максимальных оборотах (10-14,5 тыс.об/мин). Переносят надосадочную жидкость в чистую 1,5 мл пробирку. Перенесенную надосадочную жидкость используют для постановки ПЦР.A spleen tissue homogenizer is removed and placed in a 1.5 ml tube with 300 μl of DNA Express solution. Add to each
Для проведения самой ПЦР с использованием тест-системы требуется:To conduct PCR itself using a test system, you need:
Подготовить необходимое количество пробирок с реакционной смесью, включая три пробирки для стандартных образцов ДНК и отрицательного контрольного образца. При конструировании праймеров и зонда основными требованиями являются: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.Prepare the required number of tubes with the reaction mixture, including three tubes for standard DNA samples and a negative control sample. When designing primers and a probe, the basic requirements are: the degree of homology (complementarity) with the selected gene region; the absence of self-complementary regions within the oligonucleotides and complementarity to each other in order to prevent the emergence of stable secondary structures (dimers); the proximity of the annealing temperature of the primers.
Разработанные олигонуклеотиды имеют оптимальные размер (24-25 пл.) и GC состав (45,8 и 48%), температуру отжига праймеров 55°C, температуру отжига зонда до 72°C.The developed oligonucleotides have the optimal size (24–25 pl.) And GC composition (45.8 and 48%), primer annealing temperature of 55 ° C, and probe annealing temperature of up to 72 ° C.
Состав реакционной смеси был подобран таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 была в пределах 2,0 - 2,5 мМ, что обеспечивает оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, концентрация дНТФ - не более 2,5 мМ, концентрация каждого праймера -1,5 пмоль/мкл, зонда - 0,75 пмоль/мкл и объем пробы - 10 мкл.The composition of the reaction mixture was selected so that the concentration of MgCl 2 ions was in the range of 2.0 - 2.5 mm, which ensures optimal speed and accuracy of the Taq polymerase enzyme, the concentration of dNTP is not more than 2.5 mm, the concentration of each primer -1.5 pmol / μl, probe - 0.75 pmol / μl and sample volume - 10 μl.
Пробирки с амплификационной смесью расставляют в соответствии с заранее подготовленным протоколом, где указаны номера анализируемых проб, а также пробирки положительного и отрицательного контролей. Если реакцию проводят на анализаторе Rotor Gene 6000/Q (Corbett Research), то пробирки могут быть промаркированы.The tubes with the amplification mixture are placed in accordance with a pre-prepared protocol, which indicates the numbers of the analyzed samples, as well as the tubes of the positive and negative controls. If the reaction is carried out on a Rotor Gene 6000 / Q analyzer (Corbett Research), the tubes can be labeled.
Добавлят во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 7 мкл:Add to all tubes with individual tips with aerosol filters of 7 μl:
а) в амплификационную пробирку для постановки отрицательного контроляa) in an amplification tube for negative control
- отрицательный контрольный образец (ОКО) из комплекта тест-системы;- negative control sample (OKO) from the test system kit;
б) в пробирки исследуемых образцов - исследуемые образцы ДНК;b) in test tubes of test samples — test DNA samples;
в) в амплификационную пробирку для постановки положительного контроляc) in an amplification tube for positive control
- положительный контрольный образец (ПКО) из комплекта тест-системы.- positive control sample (FFP) from the test system kit.
Для снижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке.To reduce the risk of contamination, samples should be added in this order.
Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрыть крышкой и центрифугировать в течение 15 секунд на плашечной центрифуге или микроцентрифуге-вортексе. Затем переносят пробирки в прибор и проводят амплификацию.If possible, the tube into which the sample was introduced should be closed with a lid and centrifuged for 15 seconds in a centrifuge or microcentrifuge-vortex. The tubes are then transferred to the instrument and amplification is carried out.
Проводят амплификацию по программе для амплификатора Rotor-Gene Q или Rotor-Gene 6000 (Corbett Research), указанной в Таблице 1.Amplification is carried out according to the program for the Rotor-Gene Q or Rotor-Gene 6000 amplifier (Corbett Research), shown in Table 1.
Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов.The amplification products are detected automatically by the device in each amplification cycle. Based on these data, the control program constructs the fluorescence signal accumulation curves for each of the channels specified for the samples.
Для работы с тест-системой используют каналы: FAM (специфический сигнал), HEX (сигнал внутреннего контроля), CY5 (сигнал экзогенного внутреннего контроля).To work with the test system, channels are used: FAM (specific signal), HEX (internal control signal), CY5 (exogenous internal control signal).
Оценка эффективности использования тест-системы осуществлялась по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов проводилась по графикам из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при использовании Real-time PCR:Evaluation of the effectiveness of using the test system was carried out according to the curves of fluorescence signal accumulation for each of the channels specified for the samples was carried out according to the graphs from the report of the Rotor-Gene 6000 device using Real-time PCR:
Для отрицательного образцаFor negative sample
Фиг. 1. Канал FAM - искомая ДНК АЧС (фиолетовый цвет). Из исследуемых образцов не вышел. Регистрируется только сигнал контрольного образца (красный цвет).FIG. 1. Channel FAM - the desired DNA ASF (purple color). From the studied samples did not come out. Only the control signal is recorded (red).
Фиг. 2. Канал Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК АЧС (фиолетовый цвет) - выходят позже графика положительного контрольного образца (красный цвет), что говорит о незначительном ингибировании реакции.FIG. 2. Su5 channel - an internal control sample of specificity - ASF DNA (violet color) - come out later than the graph of the positive control sample (red color), which indicates a slight inhibition of the reaction.
Фиг. 3. Канал HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС (фиолетовый цвет). График экзогенного внутреннего контроля выделения и графики исследуемых образцов совпадают, что говорит, что реакция прошла успешно.FIG. 3. HEX channel - internal control sample of isolation - synthetic DNA ASF (purple color). The graph of exogenous internal control of the release and the graphs of the test samples are the same, which indicates that the reaction was successful.
Для положительного образцаFor a positive sample
Фиг. 4. Канал FAM - искомая ДНК АЧС (синий цвет) - флуоресцентно сигнал начал накапливаться до 36 цикла, его можно считать положительным. Отрицательный контрольный образец не вышел - контаминации контроля нет.FIG. 4. FAM channel - the desired DNA of the ASF (blue color) - the fluorescent signal began to accumulate until the 36th cycle, it can be considered positive. A negative control sample did not come out - there is no control contamination.
Фиг. 5. Канал Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК АЧС (синий цвет) - накопление флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Черный график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график - положительный контрольный образец.FIG. 5. Su5 channel - an internal control sample of specificity - ASF DNA (blue color) - the accumulation of a fluorescent signal is sufficient to consider the reaction as positive. The black graph is a negative control sample. Fluoresces due to the presence of an exogenous control sample introduced into the tube at the isolation stage. The red graph is a positive control.
Фиг. 6. Канал HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - накопления флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Черный график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график – положительный.FIG. 6. HEX channel - internal control sample of isolation - synthetic DNA of ASF - accumulation of a fluorescent signal is sufficient to consider the reaction as positive. The black graph is a negative control sample. Fluoresces due to the presence of an exogenous control sample introduced into the tube at the isolation stage. The red chart is positive.
Для сомнительного образцаFor a dubious sample
Фиг. 7. Канал FAM - искомая ДНК АЧС (синий цвет) - по графику видно, что и отрицательный контрольный образец, и исследуемый образец вышли до 36 цикла, это говорит о возможной контаминации.FIG. 7. FAM channel - the desired DNA of ASF (blue color) - the graph shows that both the negative control sample and the test sample came out before the 36th cycle, this indicates a possible contamination.
Фиг. 8. Канал Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК АЧС (синий цвет) - накопления флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Фиолетовый график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график - положительный контрольный образец.FIG. 8. Su5 channel - an internal control sample of specificity - ASF DNA (blue color) - the accumulation of a fluorescent signal is sufficient to consider the reaction as positive. The purple plot is a negative control. Fluoresces due to the presence of an exogenous control sample introduced into the tube at the isolation stage. The red graph is a positive control.
Фиг. 9. Канал HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - накопления флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Фиолетовый график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график - положительный контрольный образец.FIG. 9. HEX channel - an internal control sample of isolation - synthetic DNA of ASF - accumulation of a fluorescent signal is enough to consider the reaction positive. The purple plot is a negative control. Fluoresces due to the presence of an exogenous control sample introduced into the tube at the isolation stage. The red graph is a positive control.
При учете результата threshold (порог) устанавливали вручную на уровне 10% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации. Уровень threshold составил не более 0,02. Значения показателя «Ct» были на уровне 24-25. В положительных образцах кривая флуоресценции пересекает линию threshold и, в зависимости от интенсивности сигнала, возвышается над линией более или менее. В отрицательных образцах и отрицательном контроле флуоресценции не наблюдается, что отражается прямой детекции на уровне или ниже линии threshold.When taking into account the result, the threshold (threshold) was set manually at 10% of the maximum fluorescence level in the last amplification cycle. The threshold level was not more than 0.02. The values of the indicator "Ct" were at the level of 24-25. In positive samples, the fluorescence curve crosses the threshold line and, depending on the signal intensity, rises above the line more or less. In negative samples and negative control, fluorescence is not observed, which is reflected in direct detection at or below the threshold line.
Пример 1. Для анализа методом ПЦР были взяты 2 пробы тканей селезенки от свиней, признанных больными африканской чумой свиней, на основании ПЦР-исследований набором производства ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров. В процессе ПЦР в пробах были получены кривые флуоресценции, пересекающие линию threshold, при отсутствии таковой в отрицательном контроле. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.Example 1. For analysis by PCR, 2 samples of spleen tissues from pigs recognized as patients with African swine fever were taken on the basis of PCR studies using a kit manufactured by GNU VNIIVViM, Pokrov. During PCR in the samples, fluorescence curves crossing the threshold line were obtained, in the absence of such in the negative control. This indicates the reproducibility of the results of the experiments.
Пример 2. Применение реакции амплификации для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда, входящих в тест-систему.Example 2. The use of the amplification reaction to detect DNA of the virus of African swine fever using developed specific oligonucleotide primers and probe included in the test system.
Для анализа методом ПЦР были взяты 6 проб тканей селезенки свиней. В процессе ПЦР во всех пробах были получены кривые флуоресценции, пересекающие линию threshold, при отсутствии таковой в отрицательном контроле. Значения показателя «Ct» составило от 32 до 36. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.For analysis by PCR, 6 samples of pig spleen tissue were taken. In the PCR process, fluorescence curves crossing the threshold line were obtained in all samples in the absence of such in the negative control. The values of the "Ct" indicator ranged from 32 to 36. This indicates the reproducibility of the results of the experiments.
Предложенная тест-система позволяет количественно выявлять на ранних стадиях высококонсервативную область гена VP72 вируса африканской чумы свиней. Применение олигонуклеотидного зонда позволяет повысить чувствительность и специфичность способа, исключить субъективность при оценке результатов. Использование предлагаемой модификации ПЦР позволяет значительно снизить возможность контаминации образцов, помещения, оборудования и реактивов, а также сократить сроки проведения анализа, что важно как для владельцев животных, так и для ветеринарных специалистов.The proposed test system allows you to quantify the early stages of the highly conserved region of the VP72 gene of the African swine fever virus. The use of an oligonucleotide probe can increase the sensitivity and specificity of the method, eliminate subjectivity in evaluating the results. Using the proposed modification of PCR can significantly reduce the possibility of contamination of samples, premises, equipment and reagents, as well as reduce the time of analysis, which is important for both pet owners and veterinarians.
Предложенная тест-система апробирована с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2016 году на 8 пробах тканей селезенки свиней, признанных больными африканской чумой свиней, на основании ПЦР-исследований набором производства ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров.The proposed test system was tested with positive results and regular reproducibility of these results in 2016 on 8 samples of pig spleen tissues recognized as patients with African swine fever, based on PCR studies using a kit produced by GNU VNIIVViM, Pokrov.
Работу проводили на базе ФГБОУ ВО «Краснодарский ГАУ».The work was carried out on the basis of the Krasnodar State Agrarian University.
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017111554A RU2645263C1 (en) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017111554A RU2645263C1 (en) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2645263C1 true RU2645263C1 (en) | 2018-02-19 |
Family
ID=61227036
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017111554A RU2645263C1 (en) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2645263C1 (en) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2675535C1 (en) * | 2018-05-15 | 2018-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Achs/vniizzh/cv-1 strain of african swine fever, with decreased virulence for pigs, for virologic, diagnostic, molecular-genetic and surveillance studies |
CN110724770A (en) * | 2019-12-03 | 2020-01-24 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | Anti-pollution fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) primer group, kit and detection method for detecting African swine fever virus |
CN112795706A (en) * | 2021-03-30 | 2021-05-14 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | Fluorescent probe primer group and kit for African swine fever virus P72 gene and application of fluorescent probe primer group and kit |
CN113025751A (en) * | 2021-03-22 | 2021-06-25 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | Primer combination and kit of African swine fever virus and application of primer combination and kit |
CN114381553A (en) * | 2022-01-27 | 2022-04-22 | 云南大学 | Biological material and kit for detecting African swine fever virus and detection method of African swine fever virus for non-diagnosis purpose |
RU2799410C1 (en) * | 2022-10-06 | 2023-07-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Synthetic oligonucleotide primers and a method of highly sensitive detection of african swine fever virus dna by loop isothermal amplification in the presence of internal control sample dna |
-
2017
- 2017-04-05 RU RU2017111554A patent/RU2645263C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Aguero M. et al. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples //Journal of clinical microbiology. - 2003. - Vol. 41. - n. 9. - P. 4431-4434. * |
Васильев Д. А. и др. Разработка методики выявления специфического участка ДНК Ornithobacterium rhinotracheale с помощью ПЦР в режиме "Реального времени" //Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2009. - n. 3 (10). * |
Васильев Д. А. и др. Разработка методики выявления специфического участка ДНК Ornithobacterium rhinotracheale с помощью ПЦР в режиме "Реального времени" //Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2009. - n. 3 (10). Aguero M. et al. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples //Journal of clinical microbiology. - 2003. - Vol. 41. - n. 9. - P. 4431-4434. * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2675535C1 (en) * | 2018-05-15 | 2018-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Achs/vniizzh/cv-1 strain of african swine fever, with decreased virulence for pigs, for virologic, diagnostic, molecular-genetic and surveillance studies |
CN110724770A (en) * | 2019-12-03 | 2020-01-24 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | Anti-pollution fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) primer group, kit and detection method for detecting African swine fever virus |
CN113025751A (en) * | 2021-03-22 | 2021-06-25 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | Primer combination and kit of African swine fever virus and application of primer combination and kit |
CN112795706A (en) * | 2021-03-30 | 2021-05-14 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | Fluorescent probe primer group and kit for African swine fever virus P72 gene and application of fluorescent probe primer group and kit |
CN114381553A (en) * | 2022-01-27 | 2022-04-22 | 云南大学 | Biological material and kit for detecting African swine fever virus and detection method of African swine fever virus for non-diagnosis purpose |
CN114381553B (en) * | 2022-01-27 | 2023-07-04 | 云南大学 | Biological material for African swine fever virus detection, kit and method for detecting African swine fever virus for non-diagnostic purpose |
RU2799410C1 (en) * | 2022-10-06 | 2023-07-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Synthetic oligonucleotide primers and a method of highly sensitive detection of african swine fever virus dna by loop isothermal amplification in the presence of internal control sample dna |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2645263C1 (en) | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction | |
RU2700480C1 (en) | Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
RU2694713C1 (en) | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products | |
CN111286559B (en) | Primer, probe and kit for detecting African swine fever virus | |
CN110551851A (en) | CAMP primer group for amplifying ASFV, kit and application | |
JP7272202B2 (en) | Method and apparatus for testing target nucleic acid | |
RU2645262C1 (en) | Method of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction | |
CN105779656B (en) | Porcine torque teno virus type 2 loop-mediated isothermal amplification kit and application thereof | |
RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
RU2700479C1 (en) | Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
RU2725539C1 (en) | Test system for identification of dna tissues of rats and mice in dry fodder and meat semi-products | |
JP5205609B2 (en) | Oligonucleotide set for virus detection, EBV, CMV and HHV-6 analysis method and detection kit | |
CN105400908A (en) | Primer and kit for detecting channel catfish viruses through pyrosequencing technology and detecting method | |
CN107557456B (en) | LAMP (loop-mediated isothermal amplification) detection primer group and kit for ureaplasma urealyticum | |
RU2658493C1 (en) | Oligonucleotide primers and fluorescence-labelled probe, method and test system of pcr in real time for detecting capripoxviruses genome | |
RU2822748C1 (en) | Test system for identification of dna tissue of pacific saury (cololabis saira) in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders using real-time polymerase chain reaction | |
CN112063734A (en) | Primer, probe and method for quantitatively detecting brucella in human blood by adopting real-time fluorescent quantitative PCR technology | |
RU2814552C1 (en) | Method of identifying dna tissue of japanese mackerel (scomber japonicus) in fish products, meat and bone fish meal and feed using real-time polymerase chain reaction | |
RU2726432C1 (en) | Test system for determining dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in biological material of animals by pcr with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel | |
RU2823069C1 (en) | Test system for identification of dna of japanese pilchard (sardinops melanostictus) tissue in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders by means of real-time polymerase chain reaction | |
RU2728660C1 (en) | Method for determining dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in biological material of animals by pcr with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel | |
RU2700254C1 (en) | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
RU2814548C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of mannheimiosis (mannheimia haemolytica) in biological material of animals and fodders using real-time polymerase chain reaction | |
RU2725210C1 (en) | Test system for identification of dna tissue of common quail (coturnix coturnix) in dry fodder and semi-finished meat products | |
RU2725216C1 (en) | Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200406 |