RU2726242C1 - Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time - Google Patents
Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time Download PDFInfo
- Publication number
- RU2726242C1 RU2726242C1 RU2019133068A RU2019133068A RU2726242C1 RU 2726242 C1 RU2726242 C1 RU 2726242C1 RU 2019133068 A RU2019133068 A RU 2019133068A RU 2019133068 A RU2019133068 A RU 2019133068A RU 2726242 C1 RU2726242 C1 RU 2726242C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lsdv
- control sample
- bacteriophage
- genome
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.The invention relates to veterinary microbiology, in particular to laboratory diagnosis of infectious pathogens, and in particular to means for diagnosing infection in animals using polymerase chain reaction.
Известна тест-система для выявления генома полевых изолятов вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС, включающая готовую ПЦР смесь, фермент Taq-ДНК-полимеразу, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, содержащие олигонуклеотидные праймеры и зонд (патент RU 2668398, кл. C12Q 1/68, 2018 г.).A known test system for detecting the genome of field isolates of the virus of infectious nodular dermatitis (nodular dermatitis) cattle, including ready-made PCR mixture, Taq DNA polymerase enzyme, positive control sample, negative control sample containing oligonucleotide primers and probe (patent RU 2668398, cl .C12Q 1/68, 2018).
Однако тест-система предназначена для выявления генетического материала полевого вируса ЗУД КРС в биологических и культуральных образцах для постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач по мониторингу распространения вируса ЗУД КРС среди восприимчивых животных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (РВ) с использованием олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для амплификации и детекции фрагмента гена наружного капсидного белка EEV вируса заразного узелкового дерматита (ЗУД) КРС.However, the test system is designed to detect the genetic material of the field virus of the itch of cattle in biological and cultural samples for diagnosis and to clarify the diagnosis, to solve research problems on monitoring the spread of the virus of itch of cattle among susceptible animals by the polymerase chain reaction (PCR) with hybridization-fluorescence real-time detection (RV) using oligonucleotide primers and a fluorescently-labeled probe for amplification and detection of a fragment of the external capsid protein EEV gene of infectious nodular dermatitis virus (RED) cattle.
Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (патент РФ №2680094, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019 г.), включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:The closest in technical essence is the technical solution (RF patent No. 2680094, class C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019), including a buffer for polymerase chain reaction, a mixture for its implementation, consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific for the genome of the animal and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies that inhibit enzyme activity, TAQ POLYMERASE, an internal control sample in the form of a suspension of T4 bacteriophage with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl, a negative control sample, which is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the animal’s genome and a fragment of the genome of the bacteriophage T4 with the nucleotide sequence:
Недостатками известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных, недостаточная чувствительность из-за использования суспензии бактериофага для внутреннего контрольного образца, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты.The disadvantages of the known technical solution are the inability to detect DNA virus nodular dermatitis (LSDV) in the biological material of animals, insufficient sensitivity due to the use of a suspension of bacteriophage for the internal control sample, which requires pre-treatment, including centrifugation, concentration and transfer to a specific buffer solution, which entails considerable labor input and financial costs.
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей, повышение чувствительности и упрощение процесса подготовки внутреннего контрольного образца, а также уменьшение стоимости этого процесса.The technical result is the expansion of functionality, increasing sensitivity and simplifying the process of preparing an internal control sample, as well as reducing the cost of this process.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома возбудителя инфекционного заболевания животного и для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, отрицательный контрольный образец и положительный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащей фрагмент генома возбудителя инфекционного заболевания животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:The technical result is achieved in that in a test system for detecting DNA of nodular dermatitis virus (LSDV) in biological material of animals using real-time polymerase chain reaction, including a buffer for conducting polymerase chain reaction, a mixture for its conduct, consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific for the genome portion of the pathogen of the animal infectious disease and for the internal control sample in the form of a suspension of T4 bacteriophage with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies that inhibit enzyme activity, TAQ POLYMERASE, a negative control sample and a positive control sample, which is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the genome of the causative agent of an infectious disease of the animal and a fragment of the T4 bacteriophage genome with the nucleotide sequence:
Новизна заявляемой тест-системы состоит в идентификации ДНК вируса нодулярного дерматита с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: фаголизат и фрагмент нативного генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.The novelty of the claimed test system consists in identifying DNA virus of nodular dermatitis using polymerase chain reaction (PCR) with fluorescence detection in real time using specific for the genome region of the oligonucleotide primers of the fluorescently labeled probe and different types of control for which various forms of bacteriophage material are used T4: phagolysate and fragment of the native genome with specific primers and probe. Such a real-time PCR setup reduces and simplifies the analysis procedure, reduces the risk of contamination. In addition, fluorescence detection of amplification products is carried out using the principle of cleavage of the fluorescent label at the 5 'end of the oligonucleotide probe.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».The features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".
Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive test system is recommended for use in specialized veterinary, sanitary-epidemiological, livestock, agricultural enterprises, which meets the criterion of "industrial applicability".
Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени реализуется следующим образом.The test system for detecting DNA virus of nodular dermatitis (LSDV) in the biological material of animals using polymerase chain reaction in real time is as follows.
Предварительно выделяют ДНК из биологического материала животного сорбционным методом. В качестве биологического материала может быть использованы: цельная кровь, фрагменты пораженных кожных покровов (высыпания, корки, узелковые поражения-нодулы), легких, бронхов, селезенки, лимфоузлы, мазки со слизистых конъюнктивы и ротоглотки, молоко и сперма, которые подвергают определенной обработке.DNA is preliminarily isolated from the biological material of the animal by the sorption method. As biological material can be used: whole blood, fragments of affected skin (rashes, crusts, nodular lesions-nodules), lungs, bronchi, spleen, lymph nodes, smears from the mucous membranes of the conjunctiva and oropharynx, milk and sperm, which are subjected to a certain treatment.
Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК вируса LSDV олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange и для внутреннего контрольного образца в виде фаголизата бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл - FAM/Green. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов вируса нодулярного дерматита (LSDV) и нативного бактериофага Т4 со следующими нуклеотидными последовательностями:A polymerase chain reaction with fluorescence detection is carried out with 45 amplification cycles in real time using oligonucleotide primers, probes, and fluorescent dyes specific for the LSDV DNA genome segment: for the specific signal for DNA virus nodular dermatitis (LSDV), use a fluorescent dye Orange / ROSD Orange and for the internal control sample in the form of a phagolysate of the bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl - FAM / Green. For a positive control sample, a mixture containing the same volume ratio fragments of genomes of the virus of nodular dermatitis (LSDV) and native bacteriophage T4 with the following nucleotide sequences is used:
Затем измеряют накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводят интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.Then, the accumulation of fluorescent signals is measured through the channels of the corresponding fluorescent dyes, the results are interpreted based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line, if the fluorescence signal accumulation curves go out before the 35th cycle, then the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, then the reaction result is negative.
Для повышения точности идентификации вируса нодулярного дерматита (LSDV) для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:To increase the accuracy of identification of the virus of nodular dermatitis (LSDV) for the internal control sample, use a T4 bacteriophage phagolysate with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl, if the concentration of phage particles deviates to a greater or lesser extent, then duplicate samples are observed. For a positive control sample, a mixture is used containing fragments of genomes of the native bacteriophage T4 and DNA of nodular dermatitis virus (LSDV) taken in a 1: 1 ratio, with the following nucleotide sequences:
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома нативного бактериофага Т4 со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирке, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации вируса нодулярного дерматита. Использование нативного бактериофага, т.е. неповрежденного при исследовании, улучшает синтез ДНК, что также улучшает качество процесса идентификации.The use of different forms of T4 bacteriophage material for different types of control: the phagolysate and the genome fragment of the native T4 bacteriophage with specific primers and a probe, is due to the fact that this allows you to control the correct course of the reaction in each tube, and also controls the stage of DNA extraction from samples. In addition, the use of the T4 bacteriophage phagolysate, which is a suspension of the bacteriophage obtained after lysis of tissue cells infected with the phage, increases sensitivity and simplifies the process of identifying nodular dermatitis virus. Use of a native bacteriophage, i.e. intact during the study, improves DNA synthesis, which also improves the quality of the identification process.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.When designing the primers and probe, the main requirements were: the degree of homology (complementarity) with the selected gene region; the absence of self-complementary regions within the oligonucleotides and complementarity to each other in order to prevent the emergence of stable secondary structures (dimers); the proximity of the annealing temperature of the primers.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.Specific primers and probes were constructed using computer programs based on analysis of the nucleotide sequences of reference strains and isolates published on the GenBank resource and selection of conditions for real-time PCR using the developed primers and probe carrying a fluorophore and quencher, and a complementary part of the amplified specific fragment primers.
Праймеры, специфичные для генома вируса нодулярного дерматита выбраны на участке между 18200 и 19000 нуклеотидами последовательности ДНК генома, кодирующей гипотетический белок гликопротеина(Lumpy skin disease virus strain LSDV/Russia/Saratov/2017, complete genome 150606 bp DNA linear VRL 18-NOV-2018, код доступа MH646674).Primers specific for the genome of the virus of nodular dermatitis were selected between 18,200 and 19,000 nucleotides of the DNA sequence of the genome encoding the hypothetical glycoprotein protein (Lumpy skin disease virus strain LSDV / Russia / Saratov / 2017, complete genome 150606 bp DNA linear VRL 18-NOV-2018 , access code MH646674).
Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации были подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды LSDV-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров LSDV-F и LSDV-R) Зонд был помечен красителем ROX (карбокси-Х-родамин- длина волны возбуждения - 580 нм, флуоресценции - 602 нм.). Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested using BLAST to confirm their specificity. For the detection of amplification products, LSDV-P oligonucleotide fluorescently-labeled probes (complementary to the region of the nucleotide sequence limited by the annealing positions of LSDV-F and LSDV-R primers) were selected. The probe was labeled with ROX dye (carboxy-X-rhodamine-excitation wavelength - 580 nm , fluorescence - 602 nm.). Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
В качестве внутреннего контроля использовался фаголизат бактериофага Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.The bacteriophage T4 phagolysate with genomic DNA of about 170 thousand pairs of nucleotides (Enterobacteria phage T4T, complete genome GenBank: HM137666.1) was used as internal control. As a result of the analysis, a region between 400 and 600 nucleotides containing unique nucleotide sequences was selected; primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected genome region were calculated. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested using BLAST to confirm their specificity.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем FAM (Карбоксифлуоресцеин- длина волны возбуждения - 490 нм, флуоресценции - 520 нм). Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.To detect amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled T4P probe was selected that is complementary to the portion of the nucleotide sequence limited to the annealing positions of the T4F and T4R primers. The probe was labeled with a FAM dye (Carboxyfluorescein - excitation wavelength - 490 nm, fluorescence - 520 nm). Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
Пример конкретного применения тест-системы для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времениAn example of a specific application of the test system for the detection of DNA virus nodular dermatitis (LSDV) in the biological material of animals using polymerase chain reaction in real time
Для исследования используют следующий материал:For research using the following material:
1. Цельная кровь (в ранний период заболевания, во время виремии). Кровь забирается в пробирку с 3-6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.1. Whole blood (in the early period of the disease, during viremia). Blood is drawn into a test tube with 3-6% EDTA at the rate of 50 μl of EDTA solution per 1 ml of blood, a closed tube with blood is turned over several times.
2. Фрагменты пораженых кожных покровов (высыпания, корки, узелковые поражения-нодулы), легких, бронхов, селезенки отбирают в стерильный контейнер.2. Fragments of the affected skin (rashes, crusts, nodular lesions-nodules), lungs, bronchi, spleen are taken into a sterile container.
3. Лимфоузлы берут на исследование целиком.3. Lymph nodes are taken for examination as a whole.
4. Мазки со слизистых конъюнктивы и ротоглотки снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора/фосфатного буфера/транспортной среды.4. The smears from the conjunctival mucosa and oropharynx are removed using a sterile probe, the probe is placed in a 1.5 ml plastic microtube with 0.5 ml of sterile physiological saline / phosphate buffer / transport medium.
5. Молоко отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду;5. Milk is taken in a volume of 10-30 ml in sterile dishes;
6. Сперму (0,5 - 1 мл) отбирают в стерильный контейнер. Полученные образцы можно транспортировать и хранить в следующих режимах:6. Sperm (0.5 - 1 ml) is taken into a sterile container. The resulting samples can be transported and stored in the following modes:
- при комнатной температуре - в течение 48 часов;- at room temperature - for 48 hours;
- при температуре от 2 до 8°С - в течение двух недель;- at a temperature of 2 to 8 ° C - for two weeks;
- при температуре не выше минус 20°С - в течение месяца;- at a temperature not exceeding minus 20 ° С - within a month;
- при температуре не выше минус 68°С - длительно,- at a temperature not higher than minus 68 ° С - for a long time,
- оттаивание биологического материала.- thawing of biological material.
Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо после вакцинации выдержать 3-4 недели перед сдачей анализа.To avoid false positive results, it is necessary to withstand 3-4 weeks after vaccination before passing the test.
Далее исследуемые образцы обрабатывают следующим образом:Next, the test samples are processed as follows:
Мазки со слизистых конъюнктивы, ротоглотки, пробы цельной крови, молоко исследуют без предварительной подготовки.Smears from conjunctival mucosa, oropharynx, whole blood samples, milk are examined without preliminary preparation.
Сперму разводят физиологическим раствором 1:3, тщательно перемешивают на вортексе. Для экстракции ДНК используют аликвоту 0,1 мл суспензии.Sperm is diluted with saline 1: 3, thoroughly mixed on a vortex. An aliquot of 0.1 ml of suspension is used for DNA extraction.
Из тканей и органов вырезают небольшие кусочки до 1 г весом. Растирают пробы в фарфоровых ступках или гомогенизируют на автоматических гомогенизаторах. Затем готовят 20% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600 -1000 g (2000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.Small pieces of up to 1 g in weight are cut from tissues and organs. Grind the samples in porcelain mortars or homogenize on automatic homogenizers. Then prepare a 20% suspension in sterile saline or phosphate buffer. The suspension is transferred into a 1.5 ml tube and centrifuged at 600 -1000 g (2000 rpm on a MiniSpin centrifuge, Eppendorf, Germany) for 2 minutes. An aliquot of the supernatant (0.1 ml) is used for DNA extraction.
Для подтверждения эффективности заявляемой тест-системы, для исследования были использованы мазки со слизистых конъюнктивы, ротоглотки, пробы цельной крови, молоко которые не требуют предварительной подготовки.To confirm the effectiveness of the claimed test system, smear from conjunctival mucosa, oropharynx, and whole blood samples, milk that did not require preliminary preparation, were used for the study.
Лабораторные пробы (20 - 40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.Laboratory samples (20 - 40 mg) are taken for study in disposable 1.5 ml microtubes in duplicate. Selected laboratory samples are sent for DNA isolation.
Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-НОДУЛЯРНЫЙ-ДЕРМАТИТ-КРС-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)The study is carried out using a set of reagents "PCR-NODULAR-DERMATITIS-KRS-FACTOR". The kit consists of a kit of reagents for conducting multiplex PCR (kit No. 1) and a set of control samples (kit No. 2). The kit is available in two versions: 1) For analysis of 55 samples (including control samples)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).2) For analysis of 110 samples (including control samples).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-НОДУЛЯРНЫЙ-ДЕРМАТИТ-КРС-ФАКТОР» для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (Lumpy skin disease virus, LSDV) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, ТУ 21.10.60-124-51062356-2016, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.The kits are used in accordance with the instructions for use of the PCR-NODULAR-DERMATIT-KRS-FACTOR reagent kit to detect DNA of the nodular dermatitis virus (Lumpy skin disease virus, LSDV) in the biological material by polymerase chain reaction (PCR) with fluorescence detection in the mode real time, TU 21.10.60-124-51062356-2016, for in vitro diagnostics, http://www.vetfaktor.ru/.
Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.The composition of the kit is shown in Tables 1 and 2.
Исследования состоит из трех этапов:Research consists of three stages:
- экстракция нуклеиновая кислота (НК);- extraction of nucleic acid (NK);
- проведение реакции ПЦР РВ;- carrying out the reaction of PCR RV;
- учет результатов анализа.- accounting of the results of the analysis.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО), в качестве которого, используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл.For extraction (isolation) of NK from the test samples, the required number of 1.5 ml disposable tubes is selected, including a negative selection control. In all test tubes with the test samples, including the test tube for the negative control sample (CLE), 10 μl of the internal control sample (CEC) was added, which was used as a phage of T4 bacteriophage with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl.
Следующий этап - это подготовка образцов к проведению ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.The next stage is the preparation of samples for PCR. The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the DNA sample is 10 μl.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) LSDV, ВКО LSDV и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов вируса нодулярного дерматита LSDV и нативного бактериофага Т4 взятых в объемном соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:Successful completion of the reaction is monitored using a positive control sample (PSC) LSDV, CTP LSDV and DNA buffer. As FFP, a mixture containing fragments of the genomes of the virus of nodular dermatitis LSDV and native bacteriophage T4 taken in a volume ratio of 1: 1 with the following nucleotide sequences is used:
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:In a separate tube mix the components of the kit based on each reaction:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ LSDV;5 μl PCR MIXTURE LSDV;
10 мкл ПЦР БУФЕР LSDV;10 μl PCR Buffer LSDV;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE0.5 μl TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.Vortex the mixture and mix the droplets by brief centrifugation.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.Select the required number of tubes for amplification of the DNA of the investigated and control samples. Add 15 μl of the prepared reaction mixture.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.Prepare the tubes prepared for PCR in the amplifier cells and use the instrument software. Next, carry out PCR RV with fluorescence detection.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.The parameters of the temperature-time mode of amplification on the device "Rotor-Gene Q" are presented in table 3.
Интерпретация результатов анализа.Interpretation of analysis results.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.The data obtained - the fluorescence signal accumulation curves are analyzed using the software of the device used for PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the device.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).The results of RT PCR are taken into account by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle value “Ct” for the test sample).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.The result is considered reliable if the positive and negative DNA amplification and extraction controls are correctly passed in accordance with table 4.
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале ROX/Orange и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value in table 4 of the results for the negative control of the VK- extraction stage on the ROX / Orange channel and for the negative control of the K- PCR stage on any of the channels indicates the presence of reagent or sample contamination. In this case, the analysis results for all samples are considered invalid. It is required to repeat the analysis of all samples, as well as take measures to identify and eliminate the source of contamination.
Образцы, для которых значение Ct по каналу FAM/Green отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале ROX/Orange) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.Samples for which the Ct value for the FAM / Green channel is absent or exceeds the 35th cycle (and no positive result was obtained on the ROX / Orange channel) require repeated testing from the DNA extraction stage. A delay in the threshold cycle values for the test samples indicates the presence of inhibitors in the sample (s) or errors in DNA extraction or in the formulation of the PCR reaction.
В образце обнаружена ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).Nodular dermatitis virus DNA (LSDV) was detected in the sample if an exponential signal growth was observed on the ROX / Orange channel, while the Ct values were within normal limits (Table 4).
Если для исследуемого образца по каналам ROX/Orange значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.If the Ct value is determined after the 37th cycle for the studied sample via ROX / Orange channels with the correct passage of the positive and negative controls, the sample is re-examined from the DNA extraction stage. If when re-setting Ct more than 37, the result is considered negative.
Образец считается отрицательным ДНК (LSDV не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу FAM/Green менее 35.A sample is considered negative DNA (LSDV not detected) if the Ct value is not determined (no specific signal growth is observed) on the ROX / Orange channel, while the Ct values of the control samples are within normal limits (Table 4) and the Ct value is FAM / Green less than 35.
Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемой тест-системы с известными техническими решениями (патенты №№2648773, 2668398, а также с прототипом (патент №2680094) в котором использовался метод ПЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном нативного бактериофага. Оказалось чувствительность ПЦР в заявляемой тест-системе при обнаружении ДНК LSDV примерно выше в 1,42 раза, а трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК LSDV снизилась на 3,2-4,2%.To prove the effectiveness of using real-time PCR with fluorescence detection to detect the DNA of nodular dermatitis virus, a comparative analysis of the sensitivity of the inventive test system with known technical solutions (patents No. 2648773, 2668398, as well as with the prototype (patent No. 2680094) was used PCR method using internal control in the form of a suspension of a bacteriophage, and the claimed one used the phagolysate of the bacteriophage and the genome of the native bacteriophage.The sensitivity of the PCR in the inventive test system when detecting LSDV DNA was approximately 1.42 times higher, and the complexity and cost of the DNA determination process LSDV decreased by 3.2-4.2%.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019133068A RU2726242C1 (en) | 2019-10-16 | 2019-10-16 | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019133068A RU2726242C1 (en) | 2019-10-16 | 2019-10-16 | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2726242C1 true RU2726242C1 (en) | 2020-07-10 |
Family
ID=71510589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019133068A RU2726242C1 (en) | 2019-10-16 | 2019-10-16 | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2726242C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373263A (en) * | 2021-05-27 | 2021-09-10 | 华南农业大学 | Primer and kit for detecting LSDV (localized surface plasmon resonance) |
| RU2785381C1 (en) * | 2021-12-24 | 2022-12-07 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system for identifying the dna of a cryptosporidiosis pathogen in biological material of animals and in feeds using real-time polymerase chain reaction |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106435008A (en) * | 2016-12-26 | 2017-02-22 | 河南科技大学 | Primers, kit and detection method for detecting genders of cotuenix coturnix |
| CN108624659A (en) * | 2018-06-22 | 2018-10-09 | 武汉轻工大学 | A kind of real time quantitative PCR method of detection meat product ingredient |
| RU2680094C1 (en) * | 2018-10-01 | 2019-02-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals |
-
2019
- 2019-10-16 RU RU2019133068A patent/RU2726242C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106435008A (en) * | 2016-12-26 | 2017-02-22 | 河南科技大学 | Primers, kit and detection method for detecting genders of cotuenix coturnix |
| CN108624659A (en) * | 2018-06-22 | 2018-10-09 | 武汉轻工大学 | A kind of real time quantitative PCR method of detection meat product ingredient |
| RU2680094C1 (en) * | 2018-10-01 | 2019-02-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373263A (en) * | 2021-05-27 | 2021-09-10 | 华南农业大学 | Primer and kit for detecting LSDV (localized surface plasmon resonance) |
| RU2785381C1 (en) * | 2021-12-24 | 2022-12-07 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system for identifying the dna of a cryptosporidiosis pathogen in biological material of animals and in feeds using real-time polymerase chain reaction |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (en) | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals | |
| RU2645263C1 (en) | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction | |
| RU2694558C1 (en) | Method for genome detection of coronavirus infection causative agent in cattle | |
| RU2681473C1 (en) | Test system for detection of the virus genome of parainfluenza 3 types at cattle with a multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time mode | |
| RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
| CN110607398B (en) | RT-LAMP kit for fluorescent visual rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus | |
| RU2726555C1 (en) | Test system for detecting dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2703401C1 (en) | Test system for detecting and genotyping rna of swine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| CN116814857A (en) | Cat parvovirus and kit thereof and fluorescent recombinase polymerase amplification method | |
| RU2698662C1 (en) | Test system for detecting rna of agent of arteritis virus in horses | |
| RU2719719C1 (en) | Method for detection of dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in animal biological material by means of polymerase chain reaction in real time | |
| RU2700481C1 (en) | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses | |
| RU2725539C1 (en) | Test system for identification of dna tissues of rats and mice in dry fodder and meat semi-products | |
| RU2689718C1 (en) | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals | |
| RU2703400C1 (en) | Method for detecting a genome of a brucella infection agent (brucella speciales) in farm animals | |
| RU2694501C1 (en) | Test system for genome detection of rotavirus agent of type a in agricultural animals by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
| RU2694499C1 (en) | Test system for detecting coronavirus infection pathogen genome in cattle by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
| RU2785381C1 (en) | Test system for identifying the dna of a cryptosporidiosis pathogen in biological material of animals and in feeds using real-time polymerase chain reaction | |
| RU2726432C1 (en) | Test system for determining dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in biological material of animals by pcr with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel | |
| RU2814556C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of moraxellosis kpc (moraxella bovis) in biological material of animals and feed using polymerase chain reaction in real time | |
| RU2728660C1 (en) | Method for determining dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in biological material of animals by pcr with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel | |
| RU2725210C1 (en) | Test system for identification of dna tissue of common quail (coturnix coturnix) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2694719C1 (en) | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals | |
| RU2814548C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of mannheimiosis (mannheimia haemolytica) in biological material of animals and fodders using real-time polymerase chain reaction | |
| RU2782427C1 (en) | Method for detecting the dna of the causative agent of cryptosporidiosis in animal biological material and feed using a polymerase chain reaction in real time |