RU2725216C1 - Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products - Google Patents

Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products Download PDF

Info

Publication number
RU2725216C1
RU2725216C1 RU2019133083A RU2019133083A RU2725216C1 RU 2725216 C1 RU2725216 C1 RU 2725216C1 RU 2019133083 A RU2019133083 A RU 2019133083A RU 2019133083 A RU2019133083 A RU 2019133083A RU 2725216 C1 RU2725216 C1 RU 2725216C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
control sample
bacteriophage
woodpecker
dna
mixture
Prior art date
Application number
RU2019133083A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Олег Юрьевич Черных
Василий Александрович Баннов
Денис Владиславович Малышев
Александр Анатолиевич Лысенко
Владимир Олегович Черных
Андрей Георгиевич Кощаев
Александра Андреевна Котельникова
Юрий Дмитриевич Дробин
Ольга Петровна Неверова
Марина Петровна Семененко
Антон Алексеевич Нестеренко
Юсупжан Артыкович Юлдашбаев
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Priority to RU2019133083A priority Critical patent/RU2725216C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2725216C1 publication Critical patent/RU2725216C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Invention is a test system for identifying DNA of woodpecker tissue (Picidae) in dry fodder and meat semi-products, comprising a buffer for carrying out a polymerase chain reaction, a mixture for carrying out thereof, consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific for the animal genome region and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies inhibiting enzyme activity, TAQ POLYMERASE, an internal control sample in the form of suspension of bacteriophage T4 with concentration of 5×10phage particles per 1 mcl, a negative control sample, which is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of an animal's genome and a fragment of the bacteriophage T4 genome with a nucleotide sequence, taken in volume ratio of 1:1, according to the invention, phagolysate of bacteriophage T4 is used for internal control sample, and for positive control sample fragments of genomes of native bacteriophage T4 and woodpecker (Picidae) with the following nucleotide sequence are used.EFFECT: invention widens functional capabilities and accuracy of identification of species identity, simplifies the preparation process.1 cl, 5 tbl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.The invention relates to veterinary microbiology, in particular to methods for determining the species of meat using polymerase chain reaction.

Известно использование тест-системы при проведении ПЦР в реальном времени для определения ДНК тканей животных в мясном продукте (CN 108624659 A, кл C12G 1/6851, 2018 г.).It is known to use a test system for real-time PCR to determine the DNA of animal tissues in a meat product (CN 108624659 A, cl C12G 1/6851, 2018).

Также известно техническое решение содержащее набор для идентификации ДНК животных в кормах и мясных продуктах (патент РФ №2560579, C12Q 1/68, 2015 г.), включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец и другие контрольные образцы.Also known is a technical solution containing a kit for the identification of animal DNA in feed and meat products (RF patent No. 2560579, C12Q 1/68, 2015), including a buffer for polymerase chain reaction, a mixture for its implementation consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific for the genome of the animal and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies that inhibit enzyme activity, TAQ POLYMERASE, an internal control sample and other control samples.

Однако известный набор используется для полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией, в которой нуклеотидная последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности ткани животного в кормах и мясных продуктах.However, the known kit is used for polymerase chain reaction with electrophoretic detection, in which the nucleotide sequence is directly read by electrophoregram. The length of the fragment that can be decoded by this method is limited by the resolution of the gel electrophoresis method, which affects the accuracy of diagnosing the species affiliation of animal tissue in feed and meat products.

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (патент РФ №2680094, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019 г.) включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:The closest in technical essence is the technical solution (RF patent No. 2680094, class C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019) including a buffer for the polymerase chain reaction, a mixture for its implementation consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific for the genome of the animal and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies that inhibit enzyme activity, TAQ POLYMERASE, an internal control sample in the form of a suspension of T4 bacteriophage with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl, a negative control sample, which is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the animal’s genome and a fragment of the genome of the bacteriophage T4 with the nucleotide sequence:

Figure 00000001
Figure 00000001

взятых в объемном соотношении 1:1.taken in a volume ratio of 1: 1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК ткани дятла в кормах и пищевых продуктах, недостаточная точность из-за использования суспензии бактериофага, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты, а также использование генома бактериофага Т4 с возможными повреждениями, после исследования, что также влияет на точность выявления объекта.A disadvantage of the known technical solution is the inability to detect woodpecker tissue DNA in feed and food products, insufficient accuracy due to the use of a bacteriophage suspension, which requires pre-treatment, including centrifugation, concentration and transfer to a specific buffer solution, which entails considerable laboriousness and financial costs, as well as the use of the genome of the bacteriophage T4 with possible damage, after the study, which also affects the accuracy of identification of the object.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности ткани дятла, упрощение процесса подготовки внутреннего контроля и уменьшение стоимости этого процесса.The technical result is to expand the functionality and increase the accuracy of identification of species of woodpecker tissue, simplifying the process of preparing internal control and reducing the cost of this process.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:The technical result is achieved by the fact that in the test system for determining the DNA of woodpecker tissue (Picidae) in dry feed and meat products, including a buffer for polymerase chain reaction, a mixture for its implementation, consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific to the site animal genome and for internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies that inhibit the activity of the enzyme, TAQ POLYMERASE, an internal control sample in the form of a suspension of T4 bacteriophage with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl, a negative control sample is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the animal’s genome and a fragment of the genome of the bacteriophage T4 with the nucleotide sequence:

Figure 00000002
Figure 00000002

взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани дятла (Picidae) со следующей нуклеотидной последовательностью:taken in a volume ratio of 1: 1, according to the invention, the bacteriophage T4 phagolysate is used for the internal control sample, and fragments of the native T4 bacteriophage and woodpecker tissue genomes (Picidae) with the following nucleotide sequence are used for the positive control sample:

Figure 00000003
Figure 00000003

Новизна заявляемой тест-системы состоит в идентификации видовой принадлежности ткани птиц семейства дятловых с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.The novelty of the claimed test system consists in identifying the species of tissue of birds of the woodpecker family using polymerase chain reaction (PCR) with fluorescence detection in real time, which in turn allows you to accurately determine the presence of their ingredients in food raw materials, feed and food products .

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».The features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".

Заявляемая тест-система рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive test system is recommended for use in specialized veterinary, sanitary-epidemiological, livestock, agricultural enterprises, which meets the criterion of "industrial applicability".

Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах реализуется следующим образом.A test system for determining the DNA of woodpecker tissue (Picidae) in dry feed and meat products is implemented as follows.

Для исследования сухих кормов и мясных полуфабрикатов на содержание ДНК ткани дятла проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани дятла (Picidae) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.To study dry feed and meat products for woodpecker DNA, a polymerase chain reaction is carried out with fluorescence detection using a Rotor-Gene Q thermocycler with appropriate temperature-time amplification modes and the accumulation of fluorescent signals is measured through the channels of the corresponding fluorescent dyes: JOE / Yellow for a specific signal for woodpecker DNA (Picidae) and Cy5 / Red for the internal control sample. Interpretation of the results is carried out on the basis of the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line, if the fluorescence signal accumulation curves go out before the 35th cycle, then the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, the reaction result is negative .

Для повышения точности идентификации ткани дятла для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов ДНК ткани птиц семейства дятловых (Picidae) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

Figure 00000004
To increase the accuracy of woodpecker tissue identification for an internal control sample, a T4 bacteriophage phagolysate with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl is used, if the concentration of phage particles deviates up or down, then duplicate samples are observed. For a positive control sample, a mixture containing fragments of DNA genomes of tissue from birds of the woodpecker family (Picidae) and bacteriophage T4 taken in a 1: 1 ratio with the following nucleotide sequences is used:
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома нативного бактериофага Т4 со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани птиц семейства дятловых в продуктах. Использование нативного бактериофага, т.е. неповрежденного при исследовании, улучшает синтез ДНК, что также улучшает качество процесса идентификации.The use of different forms of T4 bacteriophage material for different types of control: the phagolysate and the genome fragment of the native T4 bacteriophage with specific primers and a probe, is due to the fact that this allows you to control the correct passage of the reaction in each tube, and also controls the stage of DNA extraction from samples. In addition, the use of the T4 bacteriophage phagolysate, which is a suspension of the bacteriophage obtained after lysis of tissue cells infected with the phage, increases the sensitivity and simplifies the process of identifying tissue of birds of the woodpecker family in products. Use of a native bacteriophage, i.e. intact during the study, improves DNA synthesis, which also improves the quality of the identification process.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.When designing the primers and probe, the main requirements were: the degree of homology (complementarity) with the selected gene region; the absence of self-complementary regions within the oligonucleotides and complementarity to each other in order to prevent the emergence of stable secondary structures (dimers); the proximity of the annealing temperature of the primers.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.Specific primers and probes were constructed using computer programs based on analysis of the nucleotide sequences of reference strains and isolates published on the GenBank resource and selection of conditions for real-time PCR using the developed primers and probe carrying a fluorophore and quencher, and a complementary part of the amplified specific fragment primers.

Праймеры, специфичные для ДНК птиц семейства дятловых (Picidae) были отобраны на основе нуклеотидной последовательности фибриногена

Figure 00000006
пестрого
Figure 00000007
(Picoides major isolate PMAJ51755 beta fibrinogen (Bfib) gene, intron 7, Length: 868) на уастке между 50 и 250 нуклеотидами.DNA-specific birds of the woodpecker family (Picidae) were selected based on the nucleotide sequence of fibrinogen
Figure 00000006
motley
Figure 00000007
(Picoides major isolate PMAJ51755 beta fibrinogen (Bfib) gene, intron 7, Length: 868) on a gap between 50 and 250 nucleotides.

Код доступа нуклеотидной последовательности в GeneBank NCBI: AF394320.1.Nucleotide sequence access code in GeneBank NCBI: AF394320.1.

Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Pic Р (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, фланкированной позициями для праймеров Pic F и Pic R). На 5'-конец зонда Pic Р добавлен флуоресцентный краситель карбоксифлуор«сцеин (FAM).Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested for specificity using the BLAST program on the NCBI server. To detect amplification products, an Pic P oligonucleotide fluorescence-labeled probe (complementary to the nucleotide sequence flanked by the positions for the primers Pic F and Pic R) was selected. A fluorescent dye carboxyfluor "stsein (FAM)" was added to the 5'-end of the Pic P probe.

Предлагаемые нуклеотидные последовательности:Suggested nucleotide sequences:

Figure 00000008
Figure 00000008

Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах каких либо животных и птиц (исключая представителей семейства Picidae) и любых видов растений, которые потенциально могут быть использованы при производстве кормов и пищевых продуктов.Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in the NDP. None of the selected sequences were found in the genomes of any animals and birds (excluding representatives of the Picidae family) and any plant species that could potentially be used in the production of feed and food products.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI.Bacteriophage T4 having genomic DNA of the order of 170 thousand pairs of nucleotides (Enterobacteria phage T4T, complete genome GenBank: HM137666.1) was used as an internal control. As a result of the analysis, a region between 400 and 600 nucleotides containing unique nucleotide sequences was selected; primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected genome region were calculated. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested for specificity using the BLAST program on the NCBI server.

Figure 00000009
Figure 00000009

Figure 00000010
Figure 00000010

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем HEX. Используя программу "Oligo 6.0", описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР.To detect amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled T4P probe was selected that is complementary to the portion of the nucleotide sequence limited to the annealing positions of the T4F and T4R primers. The probe was labeled with HEX dye. Using the program "Oligo 6.0", the basic properties of the calculated oligonucleotides are described, which determined the possibility of their use in the NDP.

Пример конкретного использования тест-системы для определения ДНК ткани дятлаAn example of a specific use of a test system for determining woodpecker DNA

Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.To confirm the effectiveness of the test system, dry feeds in the form of fish and meat flour were used; raw and thermally processed meat products, i.e. semi-finished meat products.

От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.From a sample of dense consistency, a total sample weighing 10-50 g is taken for examination. Granulated or canned products before testing (10-20 g) are ground in a mortar to a homogeneous state.

Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.Laboratory samples (20-40 mg) are taken for study in single use microtubes with a capacity of 1.5 ml in duplicate. Selected laboratory samples are sent for DNA isolation.

Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-ДЯТЕЛ-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)The study is carried out using a set of reagents "PCR-DYATEL-FACTOR". The kit consists of a kit of reagents for conducting multiplex PCR (kit No. 1) and a set of control samples (kit No. 2). The kit is available in two versions: 1) For analysis of 55 samples (including control samples)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ДЯТЕЛ-ФАКТОР» для определения ДНК ткани птиц дятлах (Picidae) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-163-51062356-2018, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.2) For analysis of 110 samples (including control samples). The kits are used in accordance with the instructions for use of the PCR-DYATEL-FACTOR reagent kit for determination of woodpecker tissue DNA (Picidae) by polymerase chain reaction (PCR) with fluorescence detection in RV TU 21.10.60-163-51062356-2018, for in vitro diagnostics, http://www.vetfaktor.ru/.

Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.The composition of the kit is shown in Tables 1 and 2.

Figure 00000011
Figure 00000011

Figure 00000012
Figure 00000012

Исследования состоит из трех этапов:Research consists of three stages:

Figure 00000013
экстракция нуклеиновая кислота (НК);
Figure 00000013
nucleic acid (NK) extraction;

Figure 00000014
проведение реакции ПЦР РВ;
Figure 00000014
carrying out the reaction of PCR RV;

Figure 00000015
учет результатов анализа.
Figure 00000015
recording analysis results.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани птиц семейства дятловых, в качестве которого, используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл. Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.For extraction (isolation) of NK from the test samples, the required number of 1.5 ml disposable tubes is selected, including a negative selection control. In all test tubes with the test samples, including a test tube for the negative control sample (CLE), 10 μl of the internal control sample (CEC) for tissue of the woodpecker family is added, which uses the T4 bacteriophage phagolysate with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl The next step is the preparation of samples for PCR. The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the DNA sample is 10 μl.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) ДЯТЕЛ, ВКО ДЯТЕЛ и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани птиц семейства дятловых и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1. со следующими нуклеотидными последовательностями:Successful completion of the reaction is monitored using a positive woodpecker (PCD) DKT, VKK DKT and DNA buffer. As FFP, a mixture containing fragments of genomes of tissue from birds of the woodpecker family and native T4 bacteriophage taken in a 1: 1 ratio is used. with the following nucleotide sequences:

Figure 00000016
Figure 00000016

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:In a separate tube mix the components of the kit based on each reaction:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ ДЯТЕЛ;5 μl PCR MIXTURE PENCIL;

10 мкл ПЦР БУФЕР ДЯТЕЛ;10 μl PCR Buffer Woodpecker;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE0.5 μl TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.Vortex the mixture and mix the droplets by brief centrifugation.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.Select the required number of tubes for amplification of the DNA of the investigated and control samples. Add 15 μl of the prepared reaction mixture.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.Prepare the tubes prepared for PCR in the amplifier cells and use the instrument software. Next, carry out PCR RV with fluorescence detection.

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.The parameters of the temperature-time mode of amplification on the device "Rotor-Gene Q" are presented in table 3.

Figure 00000017
Figure 00000017

Интерпретация результатов анализа. Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.Interpretation of analysis results. The data obtained - the fluorescence signal accumulation curves are analyzed using the software of the device used for PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the device.

Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).The results of RT PCR are taken into account by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle value “Ct” for the test sample).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.The result is considered reliable if the positive and negative DNA amplification and extraction controls are correctly passed in accordance with table 4.

Figure 00000018
Figure 00000018

Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПНР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value in table 4 of the results for the negative control of the BK- extraction stage on the JOE / Yellow channel and for the negative control of the N-stage K- on any channel indicates the presence of contamination of reagents or samples. In this case, the analysis results for all samples are considered invalid. It is required to repeat the analysis of all samples, as well as take measures to identify and eliminate the source of contamination.

Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.Samples for which the Ct value for the Cy5 / Red channel is absent or exceeds the 35th cycle (and a positive result on the JOE / Yellow channel is not obtained) require repeated testing from the DNA extraction stage. A delay in the threshold cycle values for the test samples indicates the presence of inhibitors in the sample (s) or errors in DNA extraction or in the formulation of the PCR reaction.

В образце обнаружена ДНК ткани птиц семейства дятловых (Picidae), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4,).DNA of tissue of the woodpecker family (Picidae) was detected in the sample if an exponential signal growth was observed on the JOE / Yellow channel, while the Ct values of the control samples were within normal limits (Table 4,).

Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.If the Ct value is determined after the 37th cycle for the test sample through JOE / Yellow channels with the correct passage of the positive and negative controls, the sample is re-examined from the DNA extraction step. If when re-setting Ct more than 37, the result is considered negative.

Образец считается отрицательным ДНК (Picidae) не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.A sample is considered negative DNA (Picidae) is not detected) if the Ct value is not determined (no specific signal growth is observed) on the JOE / Yellow channel, while the Ct values of the control samples are within normal limits (Table 4), and the Ct value along the Cy5 channel / Red less than 35.

Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани птиц семейства дятловых представлен в таблице 5.For the studied samples (dry food and meat semi-finished products), the accuracy limit of the tissue content of woodpeckers is presented in table 5.

Figure 00000019
Figure 00000019

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном нативного бактериофага. Оказалось чувствительность ПЦР при обнаружении примеси ткани птиц семейства дятловых в кормах и в мясных фаршах примерно в 1,5 раза выше. Трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК ткани птиц семейства дятловых в кормах и фаршах снизилась на 3-5%.To prove the effectiveness of the use of PCR with fluorescence detection in real time, a comparative analysis of the sensitivity of the claimed with the prototype was carried out, in which the PCR method was used using internal control in the form of a suspension of a bacteriophage, and in the claimed method, the bacteriophage phagolysate and the native bacteriophage genome were used. It turned out that PCR sensitivity when detecting impurities in the tissue of birds of the woodpecker family in feed and minced meat is about 1.5 times higher. The complexity and cost of the DNA determination of tissue of birds of the woodpecker family in feed and minced meat decreased by 3-5%.

Claims (4)

Тест система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:Test system for determining DNA of woodpecker tissue (Picidae) in dry food and meat semi-finished products, including a buffer for polymerase chain reaction, a mixture for its conduct, consisting of deoxynucleoside triphosphates, oligonucleotide primers and fluorescent probes specific for the genome of the animal and for the internal control sample; a mixture of enzymes from DNA polymerase with antibodies that inhibit enzyme activity, TAQ POLYMERASE, an internal control sample in the form of a suspension of T4 bacteriophage with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl, a negative control sample, which is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the animal’s genome and a fragment of the genome of the bacteriophage T4 with the nucleotide sequence:
Figure 00000020
Figure 00000020
 взятых в объемном соотношении 1:1, отличающийся тем, что для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и дятла (Picidae) со следующей нуклеотидной последовательностью:taken in a volume ratio of 1: 1, characterized in that the bacteriophage T4 phagolysate is used for the internal control sample, and fragments of the native bacteriophage T4 and woodpecker genomes (Picidae) with the following nucleotide sequence are used for the positive control sample:
Figure 00000021
Figure 00000021
RU2019133083A 2019-10-16 2019-10-16 Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products RU2725216C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019133083A RU2725216C1 (en) 2019-10-16 2019-10-16 Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019133083A RU2725216C1 (en) 2019-10-16 2019-10-16 Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2725216C1 true RU2725216C1 (en) 2020-06-30

Family

ID=71509893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019133083A RU2725216C1 (en) 2019-10-16 2019-10-16 Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2725216C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624659A (en) * 2018-06-22 2018-10-09 武汉轻工大学 A kind of real time quantitative PCR method of detection meat product ingredient
RU2680094C1 (en) * 2018-10-01 2019-02-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals
RU2700480C1 (en) * 2018-10-01 2019-09-17 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624659A (en) * 2018-06-22 2018-10-09 武汉轻工大学 A kind of real time quantitative PCR method of detection meat product ingredient
RU2680094C1 (en) * 2018-10-01 2019-02-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals
RU2700480C1 (en) * 2018-10-01 2019-09-17 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ДРАГУНОВА Е.Е., и др., ПЦР-тест-система для идентификации патогенного прионного белка: необходимость разработки, методика изготовления и основные характеристики, Фундаментальные исследования, N10, 2013, с.1739-1744. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2700480C1 (en) Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products
RU2694713C1 (en) Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products
RU2645263C1 (en) Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction
RU2726555C1 (en) Test system for detecting dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products
CN113186312A (en) Molecular marker for distinguishing Brucella A19 vaccine strain and wild strain
RU2725539C1 (en) Test system for identification of dna tissues of rats and mice in dry fodder and meat semi-products
RU2700479C1 (en) Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products
CN116814857A (en) Cat parvovirus and kit thereof and fluorescent recombinase polymerase amplification method
RU2725216C1 (en) Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products
RU2725215C1 (en) Test system for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) tissue dna in dry fodder and semi-finished meat products
RU2725210C1 (en) Test system for identification of dna tissue of common quail (coturnix coturnix) in dry fodder and semi-finished meat products
RU2714287C1 (en) Method for woodpecker (picidae) tissue dna determination in dry feed and semi-finished meat products
RU2726242C1 (en) Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time
RU2726429C1 (en) Test system for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products
RU2726248C1 (en) Method for detection of dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products
RU2728382C1 (en) Test system for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and semi-finished meat products
RU2734035C1 (en) Method for identification of dna tissue of common quail (coturnix coturnix) in dry fodder and semi-finished meat products
RU2728612C1 (en) Method for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and meat semi-products
RU2814552C1 (en) Method of identifying dna tissue of japanese mackerel (scomber japonicus) in fish products, meat and bone fish meal and feed using real-time polymerase chain reaction
RU2822748C1 (en) Test system for identification of dna tissue of pacific saury (cololabis saira) in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders using real-time polymerase chain reaction
RU2726427C1 (en) Method for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products
RU2702858C1 (en) Test system for identification of mutton and beef species identity in food raw material, fodder and food products
RU2726433C1 (en) Method for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) dna tissue in dry fodder and semi-finished meat
RU2728639C1 (en) Test system for identification of dna of domestic cat tissue (felis silvestris catus) in dry fodder and semi-finished meat products
RU2823069C1 (en) Test system for identification of dna of japanese pilchard (sardinops melanostictus) tissue in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders by means of real-time polymerase chain reaction