RU2822748C1 - Test system for identification of dna tissue of pacific saury (cololabis saira) in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders using real-time polymerase chain reaction - Google Patents
Test system for identification of dna tissue of pacific saury (cololabis saira) in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders using real-time polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2822748C1 RU2822748C1 RU2023116699A RU2023116699A RU2822748C1 RU 2822748 C1 RU2822748 C1 RU 2822748C1 RU 2023116699 A RU2023116699 A RU 2023116699A RU 2023116699 A RU2023116699 A RU 2023116699A RU 2822748 C1 RU2822748 C1 RU 2822748C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fish
- test system
- tissue
- meat
- dna
- Prior art date
Links
- 241000624562 Cololabis saira Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 title claims abstract description 14
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 title claims abstract description 10
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 29
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 23
- 241000534669 Albula vulpes Species 0.000 claims description 8
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 abstract description 9
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 7
- 241000276495 Melanogrammus aeglefinus Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 3
- 241001609028 Micromesistius poutassou Species 0.000 description 2
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101001017362 Enterobacteria phage T4 Holin Proteins 0.000 description 1
- 241001329308 Enterobacteria phage T4T Species 0.000 description 1
- 241001125046 Sardina pilchardus Species 0.000 description 1
- 241000132921 Sardinops melanostictus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к идентификации видовой принадлежности тканей рыб с помощью полимеразной цепной реакции.The invention relates to veterinary microbiology, in particular to the identification of the species of fish tissue using polymerase chain reaction.
Известна тест-система видовой идентификации рыб семейства тресковых методом ПЦР в режиме реального времени, в котором выделяют ДНК из проб тканей рыб или из образца пищевого продукта (продовольственного сырья). Проводят анализ методом полимерной цепной реакции в режиме реального времени для выявления специфических последовательностей ДНК рыб с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов, установленных для каждого вида рыб. Готовят смесь для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР. Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышает 30. Для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30 в пробирках/реакторах с тест-системами. Предлагаемый тест-система позволяет провести идентификацию всех видов тресковых рыб в рамках одного анализа и получить результат анализа быстрее по сравнению с существующими методами (патент РФ №2748058, кл. C12Q 1/68, 2021 г.).There is a known test system for species identification of fish of the cod family using real-time PCR, in which DNA is isolated from fish tissue samples or from a sample of a food product (food raw material). Real-time polymer chain reaction analysis is performed to identify specific fish DNA sequences using synthetic oligonucleotide primers and probes specific to each fish species. Prepare a mixture for PCR with hybridization-fluorescence detection of PCR products. The results are interpreted based on the presence/absence of intersection of the fluorescence curve with the established Threshold threshold line and the threshold cycle value calculated by the cycler software. DNA of cod fish (except haddock, Melanogrammus aeglefinus) is considered detected if the threshold cycle value for the corresponding test tube/reactor does not exceed 30. DNA of haddock (Melanogrammus aeglefinus) is considered detected if simultaneously for the test tube/reactor with the test system for determination of haddock (Melanogrammus aeglefinus) the threshold cycle value does not exceed 30. For the determination of blue whiting (Micromesisteus poutassou) and pollock (Pollachius virens), the fluorescent signal is not recorded or the threshold cycle value exceeds 30 in test tubes/reactors with test systems. The proposed test system makes it possible to identify all types of cod fish in one analysis and obtain the analysis result faster compared to existing methods (RF patent No. 2748058, class C12Q 1/68, 2021).
Наиболее близкой по технической сущности является тест-система идентификации видовой принадлежности тканей животного в продовольственном сырье, кормах, включающий выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного оли-гонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:The closest in technical essence is a test system for identifying the species of animal tissue in food raw materials, feed, including DNA extraction from animal tissue by the sorption method, polymerase chain reaction with fluorescent detection with 45 cycles of amplification in real time using specific genome sections Animal DNA oligonucleotide primers, probes, fluorescent dyes: for a specific signal for the animal - JOE/Yellow and Cy5/Red - for an internal control sample in the form of bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl, a positive control sample in in the form of a mixture containing fragments of the animal and bacteriophage T4 genomes with the nucleotide sequence:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймерT4F TACATATAAATCACGCAAAGC - direct primer
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймерT4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - reverse primer
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - probe,
взятых в соотношении 1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный (патент РФ №2726433, кл. C12Q 1/68, 2020 г.).taken in a 1:1 ratio and measuring the accumulation of fluorescent signals through the channels of the corresponding fluorescent dyes, interpreting the results based on the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line, if the accumulation curves of the fluorescent signal appear before the 35th cycle, then the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, then the result of the reaction is negative (RF patent No. 2726433, class C12Q 1/68, 2020).
Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности идентифицировать ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах.The disadvantage of the known technical solution is the inability to identify the tissues of Pacific saury (Cololabis saira) in fish products, meat and bone fish meal and feed.
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности тканей рыб.The technical result is to expand the functionality and increase the accuracy of identifying the species of fish tissue.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе идентификации ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах, включающей олигонуклеотидные праймеры, зонды, со следующими нуклеотидными последовательностями:The technical result is achieved by the fact that in the test system for identifying DNA tissue of Pacific saury (Cololabis saira) in fish products, in meat and bone fish meal in feed, including oligonucleotide primers, probes, with the following nucleotide sequences:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGCT4F TACATATAAATCACGCAAAGC
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGGT4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTCТ4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC
Cs-F AGGGACAAAAATCGTGGGGGCs-F AGGGACAAAAATCGTGGGGG
Cs-R CGTGTGCACTCTGAAATGCCCs-R CGTGTGCACTCTGAAATGCC
Cs-Z R6G C ATGGTGGGTGACAGGGTAA BHQ1.Cs-Z R6G C ATGGTGGGTGACAGGGTAA BHQ1.
Новизна заявляемой тест-системы состоит в идентификации видовой принадлежности ткани рыб, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в сырых рыбных продуктах (частях туши, икре, полуфабрикатах и т.д.), в рыбных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке, а также в мясокостной рыбной муке и кормах.The novelty of the proposed test system lies in the identification of the species of fish tissue using polymerase chain reaction (PCR) with fluorescent detection in real time, which in turn makes it possible to accurately determine the presence of their ingredients in raw fish products (carcass parts, caviar , semi-finished products, etc.), in cooked fish products, as well as in meat and bone fish meal and feed.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».The features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of “inventive step”.
Заявляемая тест-система рекомендована к использованию в специалиазированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических и сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».The claimed test system is recommended for use in specialized veterinary, sanitary-epidemiological and agricultural enterprises, which meets the “industrial applicability” criterion.
Тест-систему идентификации ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах осуществляют следующим образом.A test system for identifying DNA tissue of Pacific saury (Cololabis saira) in fish products and in meat and bone fish meal in feed is carried out as follows.
Для исследования наличия ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в сырых рыбных продуктах (частях туши, икре, полуфабрикатах и т.д.), в рыбных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке, а также в мясо-костной рыбной муке и кормах проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.To study the presence of Pacific saury (Cololabis saira) tissue in raw fish products (carcass parts, caviar, semi-finished products, etc.), in fish products that have undergone culinary processing, as well as in meat and bone fish meal and feed, a polymerase chain reaction is carried out with fluorescent detection using a thermal cycler of the Rotor-Gene Q type under appropriate temperature-time amplification conditions and measure the accumulation of fluorescent signals through the channels of the corresponding fluorescent dyes: JOE/Yellow for a specific signal for DNA tissue of Pacific saury (Cololabis saira) and Cy5/Red for internal control sample. The interpretation of the results is carried out on the basis of the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line; if the accumulation curves of the fluorescent signal appear before the 35th cycle, then the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, then the reaction result is negative .
Для повышения точности идентификации ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) для внутреннего контрольного образца используют бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:To increase the accuracy of identification of Pacific saury (Cololabis saira) tissue, bacteriophage T4 with a concentration of 5×10 3 phage particles per 1 μl is used for the internal control sample; if the concentration of phage particles deviates upward or downward, then duplicates of questionable samples are observed. For a positive control sample, use a mixture containing fragments of the DNA genomes of Pacific saury tissue (Cololabis saira) and bacteriophage T4, taken in a 1:1 ratio with the following nucleotide sequences:
Cs-F AGGGACAAAAATCGTGGGGG - праймерCs-F AGGGACAAAAATCGTGGGGG - primer
Cs-R CGTGTGCACTCTGAAATGCC - праймерCs-R CGTGTGCACTCTGAAATGCC - primer
Cs-Z R6G CATGGTGGGTGACAGGGTAA BHQ1 - зондCs-Z R6G CATGGTGGGTGACAGGGTAA BHQ1 - probe
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймерT4F TACATATAAATCACGCAAAGC - direct primer
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймерT4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - reverse primer
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд.Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - probe.
Использование бактериофага Т4 со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование бактериофага Т4 повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани рыб в продуктах, а также улучшает качество процесса идентификации.The use of bacteriophage T4 with primers and probe specific to it is due to the fact that this makes it possible to control the correct progress of the reaction in each test tube, and also controls the stage of DNA extraction from the samples. In addition, the use of bacteriophage T4 increases the sensitivity and simplifies the process of identifying fish tissue in products, and also improves the quality of the identification process.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.When designing primers and probes, the main requirements were: degree of homology (complementarity) with the selected gene region; the absence of self-complementary regions within oligonucleotides and complementarity to each other, in order to prevent the formation of stable secondary structures (dimers); proximity of primer annealing temperatures.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.The design of specific primers and a probe was carried out using computer programs based on the analysis of nucleotide sequences of reference strains and isolates published on the GenBank resource and the selection of conditions for real-time PCR using the developed primers and probe carrying a fluorophore and quencher, and complementary to part of the amplified substance. specific fragment primers.
Праймеры, специфичные сайры тихоокеанской (Cololabis saira) были отобраны на основе митохондриальной последовательности ДНК генома сайры тихоокеанской (Cololabis saira) (Cololabis saira mitochondrial DNA, complete genome GenBank: AP002932.1 участок между 8941 и 9241). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации были подобраны оли-гонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Cs-F-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Cs-F и Cs-F). Зонд был помечен красителем HEX. Используя программу "Oligo 6.0", описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.Pacific saury (Cololabis saira)-specific primers were selected based on the mitochondrial DNA sequence of the Pacific saury (Cololabis saira) genome (Cololabis saira mitochondrial DNA, complete genome GenBank: AP002932.1 region between 8941 and 9241). Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and examined using BLAST to confirm their specificity. To detect amplification products, oligonucleotide fluorescently labeled probes Cs-F-Z (complementary to the region of the nucleotide sequence limited by the annealing positions of the primers Cs-F and Cs-F) were selected. The probe was labeled with HEX dye. Using the "Oligo 6.0" program, the main properties of the calculated oligonucleotides, which determine the possibility of their use in PCR, are described. None of the selected sequences are found in the genome of any plant or animal species that potentially occur close to those identified in feed and food products.
Ни одна из выбранных последовательностей:None of the selected sequences:
Cs-F AGGGACAAAAATCGTGGGGG - праймерCs-F AGGGACAAAAATCGTGGGGG - primer
Cs-R CGTGTGCACTCTGAAATGCC - праймерCs-R CGTGTGCACTCTGAAATGCC - primer
Cs-Z R6G CATGGTGGGTGACAGGGTAA BHQ1 - зонд,Cs-Z R6G CATGGTGGGTGACAGGGTAA BHQ1 - probe,
не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.not found in the genome of any plant and animal species potentially found in the vicinity of those identified in feed and food products.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нук-леотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. T4F tacatataaatcacgcaaagc T4R tagtatggctaatcttattgg Т4Р Су5 acattggcactgaccgagttc.Bacteriophage T4, which has a genomic DNA of about 169-170 thousand base pairs (Enterobacteria phage T4T, complete genome GenBank: HM137666.1), was used as an internal control. As a result of the analysis, a region between 400 and 500 nucleotides containing unique nucleotide sequences was selected, and the primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected genome region were calculated. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and examined using BLAST to confirm their specificity. T4F tacatataaatcacgcaaagc T4R tagtatggctaatcttattgg T4R Su5 acattggcactgaccgagttc.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.To detect amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled probe T4P was selected, complementary to the region of the nucleotide sequence limited by the annealing positions of primers T4F and T4R. The probe was labeled with Cy5 dye. Using the "Oligo 6.0" program, the main properties of the calculated oligonucleotides are described, which determine the possibility of their use in PCR.
Пример конкретного осуществления тест-системы идентификации ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормахAn example of a specific implementation of a test system for identifying DNA tissue of Pacific saury (Cololabis saira) in fish products, meat and bone fish meal and feed
Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сырые рыбные продукты (части туши, икра, полуфабрикаты и т.д.), рыбные продукты, подвергшиеся кулинарной обработке, а также мясокостная рыбная мука и корма.To confirm the effectiveness of the test system, raw fish products (carcass parts, caviar, semi-finished products, etc.), cooked fish products, as well as meat and bone fish meal and feed were used.
От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.From a sample of dense consistency, a total sample weighing 10-50 g is taken for research. Before testing, granulated or canned products (10-20 g) are ground in a mortar until homogeneous.
Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.Laboratory samples (20-40 mg) are taken for research in disposable microtubes with a capacity of 1.5 ml in duplicate. Selected laboratory samples are sent for DNA extraction.
Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-САЙРА-ФАКТОР». Под словом «САЙРА» авторы подразумевают набор реагентов используемых для выявления ДНК ткани сайры тихоокеанской (Sardinops melanostictus). Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах:The study is carried out using the PCR-SAYRA-FACTOR reagent kit. By the word “SAURA” the authors mean a set of reagents used to detect the DNA of the tissue of the Pacific saury (Sardinops melanostictus). The kit consists of a set of reagents for multiplex PCR (set No. 1) and a set of control samples (set No. 2). The set is available in two versions:
1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы),1) For analysis of 55 samples (including control samples),
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).2) For analysis of 110 samples (including control samples).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-САЙРА-ФАКТОР» для определения ДНК ткани сайры тихоокеанской (Cololabis saira) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-256-51062356-2021, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/. Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.The kits are used in accordance with the instructions for use of the PCR-SAIRA-FACTOR reagent kit for determining the DNA of Pacific saury (Cololabis saira) tissue using the polymerase chain reaction (PCR) method with fluorescent detection in RV TU 21.10.60-256-51062356-2021, for in vitro diagnostics, http://www.vetfaktor.ru/. The composition of the kit is shown in Tables 1 and 2.
1 Вместо ОКО допускается использование физиологического раствора, ТЕ-буфера, дистиллированной воды. Реагенты должны быть чистыми и стерильными. Запрещается использовать забуференный физиологический раствор! 1 Instead of OKO, it is allowed to use saline solution, TE buffer, distilled water. Reagents must be clean and sterile. Do not use buffered saline solution!
Исследования состоит из трех этапов:The research consists of three stages:
• экстракция нуклеиновая кислота (НК);• nucleic acid (NA) extraction;
• проведение реакции ПЦР РВ;• carrying out RT-PCR reaction;
• учет результатов анализа.• taking into account the results of the analysis.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани сайры тихоокеанской, в качестве которого, используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл.For extraction (isolation) of NK from the test samples, the required number of disposable tubes with a volume of 1.5 ml are selected, including a negative isolation control. All tubes with test samples, including a tube for a negative control sample (NCS), add 10 μl of an internal control sample (ICS) for Pacific saury tissue, which is bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 phage particles per 1 μl .
Следующий этап - это подготовка образцов к проведению ПЦР.The next stage is preparing samples for PCR.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of DNA sample is 10 μl.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) САЙРА, ВКО САЙРА и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани сайры тихоокеанской и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1.The successful completion of the reaction is monitored using a positive control sample (PCS) SAYRA, VKO SAYRA and DNA buffer. As a PCO, a mixture containing fragments of the genomes of Pacific saury tissue and bacteriophage T4 taken in a 1:1 ratio is used.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:In a separate test tube, mix the components of the kit based on each reaction:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ САЙРА;5 µl PCR MIXTURE OF SAIRA;
10 мкл ПЦР БУФЕР САЙРА;10 µl PCR BUFFER SAYRA;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE.0.5 µl TAQ POLYMERASE.
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.Mix the mixture by vortex and remove the drops by short-term centrifugation.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.Select the required number of tubes for DNA amplification of test and control samples. Add 15 µl of the prepared reaction mixture.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.Place the tubes prepared for PCR into the cells of the amplifier and use the device software. Next, RT-PCR with fluorescent detection is performed.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.The parameters of the temperature-time regime of amplification on the Rotor-Gene Q device are presented in Table 3.
Интерпретация результатов анализаInterpretation of analysis results
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.The obtained data - fluorescent signal accumulation curves - are analyzed using the software of the device used for PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the device.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).The results of RT-PCR are taken into account by the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle “Ct” value for the test sample).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.The result is considered reliable if the positive and negative controls for amplification and DNA extraction are correctly passed in accordance with Table 4.
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value in Table 4 of the results for the negative control of the extraction step BK- on the JOE/Yellow channel and for the negative control of the PCR step K- on any of the channels indicates the presence of contamination of the reagents or samples. In this case, the analysis results for all samples are considered invalid. It is necessary to repeat the analysis of all samples, as well as take measures to identify and eliminate the source of contamination.
Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow), требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.Samples for which the Ct value in the Cy5/Red channel is absent or exceeds cycle 35 (and a positive result is not obtained in the JOE/Yellow channel) require repeat testing from the DNA extraction stage. A delay in threshold cycle values for test samples indicates the presence of inhibitors in the sample(s) or errors in DNA extraction or RT-PCR reaction.
В образце обнаружена ДНК ткани дальневосточной сардины или иваси, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).The DNA of the tissue of the Far Eastern sardine or ivashi is detected in the sample if an exponential increase in the signal on the JOE/Yellow channel is observed, while the Ct values of the control samples are within the normal range (Table 4).
Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37, результат считается отрицательным.If for the test sample the Ct value is determined via the JOE/Yellow channels later than cycle 37 with correct passage of positive and negative controls, the sample is retested from the DNA extraction stage. If, upon repeated testing, Ct is more than 37, the result is considered negative.
Образец считается отрицательным (ДНК ткани сайры тихоокеанской не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red - менее 35.A sample is considered negative (no Pacific saury tissue DNA was detected) if the Ct value is not determined (no increase in the specific signal is observed) on the JOE/Yellow channel, while the Ct values of the control samples are within normal limits (Table 4), and the Ct value according to channel Cy5/Red - less than 35.
Для исследуемых образцов (сухой корм и рыбные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани сайры тихоокеанской представлен в таблице 5.For the studied samples (dry food and semi-finished fish products), the accuracy limit for Pacific saury tissue content is presented in Table 5.
Claims (7)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2822748C1 true RU2822748C1 (en) | 2024-07-12 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2294633C2 (en) * | 2005-03-25 | 2007-03-10 | ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА Российской Академии Наук (ИБГ РАН, статус Государственного учреждения) | Biological marker for identifying race of fish, set and method for identification of fish race belonging |
| RU2748058C1 (en) * | 2020-10-13 | 2021-05-19 | Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит" | Method for species identification of fish of the codd family by pcr in real time |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2294633C2 (en) * | 2005-03-25 | 2007-03-10 | ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА Российской Академии Наук (ИБГ РАН, статус Государственного учреждения) | Biological marker for identifying race of fish, set and method for identification of fish race belonging |
| RU2748058C1 (en) * | 2020-10-13 | 2021-05-19 | Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит" | Method for species identification of fish of the codd family by pcr in real time |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Фомина Т.А., Кулешова М.Г. и др. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВ РЫБЫ С ПОМОЩЬЮ ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS), Пищевые системы, 2022, том 5, N 2, стр. 80-93. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2694713C1 (en) | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2700480C1 (en) | Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
| WO2004101815A1 (en) | Identification of clonal cells by repeats in (eg.) t-cell receptor v/d/j genes | |
| RU2645263C1 (en) | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction | |
| CN107828914A (en) | Infectious subcutaneous and haematopoietic necrosis virus（IHHNV）RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent | |
| RU2726555C1 (en) | Test system for detecting dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2822748C1 (en) | Test system for identification of dna tissue of pacific saury (cololabis saira) in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders using real-time polymerase chain reaction | |
| RU2823069C1 (en) | Test system for identification of dna of japanese pilchard (sardinops melanostictus) tissue in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders by means of real-time polymerase chain reaction | |
| RU2814552C1 (en) | Method of identifying dna tissue of japanese mackerel (scomber japonicus) in fish products, meat and bone fish meal and feed using real-time polymerase chain reaction | |
| RU2725539C1 (en) | Test system for identification of dna tissues of rats and mice in dry fodder and meat semi-products | |
| RU2700479C1 (en) | Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
| RU2816210C1 (en) | Test system for identification of dna of tissue of pacific mackerel (scomber japonicus) in fish products, in meat-and-bone fish meal and fodders using polymerase chain reaction in real time | |
| RU2726248C1 (en) | Method for detection of dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2734035C1 (en) | Method for identification of dna tissue of common quail (coturnix coturnix) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2725210C1 (en) | Test system for identification of dna tissue of common quail (coturnix coturnix) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2725216C1 (en) | Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2714287C1 (en) | Method for woodpecker (picidae) tissue dna determination in dry feed and semi-finished meat products | |
| RU2726429C1 (en) | Test system for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2726433C1 (en) | Method for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) dna tissue in dry fodder and semi-finished meat | |
| RU2728662C1 (en) | Method for identification of domestic cat tissue dna (felis silvestris catus) in dry fodders and semi-finished meat products | |
| RU2726427C1 (en) | Method for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2728612C1 (en) | Method for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and meat semi-products | |
| RU2728382C1 (en) | Test system for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2694501C1 (en) | Test system for genome detection of rotavirus agent of type a in agricultural animals by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time |