RU2627648C2

RU2627648C2 - Короткие антимикробные липопептиды

Info

Publication number: RU2627648C2
Application number: RU2014142038A
Authority: RU
Inventors: Лицзюань ЧЖАН; Робин КАРМАЙКЛ
Original assignee: Хеликс Байомедикс, Инк.
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2017-08-09
Also published as: CA2864179A1; CN104379177B; AR090439A1; HK1204453A1; RU2017127273A; JP2015512386A; US9278994B2; WO2013142088A1; CN107080831A; AU2013235692A1; US20150080291A1; AU2013235692B2; SG11201405244RA; RU2014142038A; CN104379177A; PL2827907T3; TW201339176A; EP2827907B1; DK2827907T3; SG10201607784VA

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа лечения микробной инфекции кожи или слизистой ткани у млекопитающего, включающего введение в инфицированную область указанного млекопитающего терапевтически эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один пептид формулы Pal-липид-лизин-пролин-NH₂ или Pal-липид-лизин-d-пролин-NH₂, и фармацевтически приемлемый носитель в течение эффективного количества времени. Изобретение обеспечивает лечение микробной инфекции кожи или слизистой ткани у млекопитающего. 5 з.п. ф-лы, 1 пр., 4 табл.

Description

[0001] По данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой США 61/613212, поданной 20 марта 2012 года, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в своем полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Изобретение относится к пептидам, обладающим биологической и терапевтической активностью. В частности, настоящее изобретение относится к модифицированным липидами ди- или трипептидным аналогам KPV или KdPT, которые обладают противомикробной активностью. В частности, пептиды, соответствующие данному изобретению, обеспечивают повышенную противомикробную активность по сравнению с основными трипептидами, лизин-пролин-валином и лизин-d-пролин-тирозином. Кроме того, изобретение относится к способам применения этих пептидов для лечения различных поражений, воспалений или бактериальных инфекций, негативно воздействующих на кожу и другие связанные поверхности тела, такие как ротовая полость.

ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Исследователями на протяжении десятилетий разрабатывались противомикробные средства и методы лечения. В последнее время наблюдается потребность в новых противомикробных средствах для лечения все большего количества лекарственно-резистентных бактериальных, вирусных и грибковых инфекций.

[0004] О различных биоактивных пептидах сообщалось как в научной литературе, так и в выданных патентах. Пептиды исторически были выделены из природных источников, а в последнее время были предметом исследований взаимосвязи структура-действие. Кроме того, природные пептиды служили отправными точками для проектирования синтетических пептидных аналогов.

[0005] Имеются различные патенты, описывающие косметические композиции, содержащие короткие пептиды. Например, в патенте США № 6492326 предложено получение и применение композиций для ухода за кожей, содержащих пентапептиды и активные ингредиенты для ухода за кожей.

[0006] В своей работе Strom et al. 2003 (Journal of Medicinal Chemistry 46: 1567-1570) описывают короткие противобактериальные пептиды, сосредотачиваясь в основном на очень коротких пептидах (димеры и тримеры), имеющих химические модификации. Также были описаны некоторые гексапептиды. Однако исследование или обсуждение противомикробной активности указанных гексапептидов в этих документах отсутствует.

[0007] Альфа-меланоцитстимулирующий гормон (α-MSH) представляет собой 13-аминокислотный нейропептид с сильной противовоспалительной активностью. Он образуется путем посттрансляционной модификации большей молекулы предшественника проопиомеланокортина. Было показано, что карбоксиконцевой трипептид α-MSH, состоящий из остатков от 11 до 13, KPV, оказывает противовоспалительное действие in vivo и in vitro (Brzoska, T., Luger, T.A. et al., α-melanocyte-stimulating hormone and related tripeptides: biochemistry, anti-inflammatory and protective effects in vitro and in vivo, and future perspectives for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. Endocrine Reviews 2009. 29 (5): 581-602). Было описано близкое по структуре производное KdPT (KPT), коллинеарное по остаткам 193-195 IL-1β и, по-видимому, способное взаимодействовать с рецептором IL-1 типа I (Luger T.A., and Brzoska T. α-MSH related peptides: a new class of anti-inflammatory and immunomodulating drugs. Ann Rheum Dis 2007; 66 (suppl III): iii52-iii55). Имелось одно сообщение о том, что KPV обладает противомикробным действием в отношении S. стафилококка (S. aureus) и C. альбиканс (C. albicans), однако МИК не определялась (Cutuli M et al., 2000, antimicrobial effects of α-MSH peptides, J. Leukocyte Biology, 67:233-239). В отличие от KPV, никогда не сообщалось о том, что трипептид KdPT обладает противомикробным действием.

[0008] Таким образом, существует потребность в разработке пептидов, обладающих широким спектром мощной противомикробной активности в отношении ряда микроорганизмов, в том числе грамотрицательных и грамположительных бактерий. Затраты на получение противомикробных пептидов также являются важным фактором для фармацевтического и косметического использования. В данном изобретении предложены экономически эффективные короткие противомикробные пептиды, которые могут быть использованы в фармацевтических или косметических композициях для местного лечения или сдерживания развития кожных заболеваний, связанных с бактериальными и грибковыми инфекциями.

СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение относится к модифицированным липидами ди- или трипептидным аналогам KPV или KdPT, которые проявляют противомикробную активность. В частности, пептиды по настоящему изобретению обеспечивают повышенную противомикробную активность по сравнению с основными трипептидами, лизин-пролин-валином и лизин-d-пролин-тирозином. Противобактериальная активность, являющаяся задачей выделенных пептидов, направлена против таких бактерий, которые негативно воздействуют на кожу и связанные поверхности слизистых оболочек. Не предполагая ограничиваться каким-либо конкретным механизмом действия, возможно, пептиды по настоящему изобретению способны стимулировать здоровое состояние кожи, ингибируя бактериальный рост и ингибируя связанное с этим воспаление, вызванное бактериальной инфекцией.

[0010] Один вариант осуществления настоящего изобретения касается модифицированных липидами ди- или трипептидов общей формулы:

C_12-18 липид-KXZ-NH₂,

где K представляет собой лизин; X представляет собой пролин, D-пролин (D-изомер пролина), гистидин или аргинин; Z является необязательным и, если присутствует, Z представляет собой валин, треонин, аланин или лейцин; и концевая COOH амидирована NH₂. Пептид модифицирован C_12-18 липидом и, предпочтительно, липидным фрагментом лауриновой кислоты (C12), миристиновой кислоты (C14), пентадекановой кислоты (C15), пальмитиновой кислоты (C16) или стеариновой кислоты (C18). Пентадеканоил и пальмитоил являются наиболее предпочтительными липидными группами.

[0011] Предпочтительные модифицированные липиды ди- и три-аминокислот включают

C_12-18 липид-лизин-пролин-валин-NH₂;

C_12-18 липид-лизин-d-пролин-треонин-NH₂;

C_12-18 липид-лизин-пролин-аланин-NH₂;

C_12-18 липид-лизин-пролин-лейцин-NH₂;

C_12-18 липид-лизин-пролин-NH₂;

C_12-18 липид-лизин-d-пролин-NH₂;

C_12-18 липид-лизин-гистидин-NH₂ и

C_12-18 липид-лизин-аргинин-NH₂.

[0012] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям, которые содержат фармацевтически или косметически приемлемый носитель и один или несколько из вышеупомянутых пептидов. Пептид в таких композициях, предпочтительно, находится в диапазоне концентраций от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 20 мкг/мл, или от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 10% (масс./об.). Предпочтительными формами композиции являются аэрозоли, эмульсии, жидкости, водные растворы, лосьоны, кремы, пасты, мази, порошки и пены, подходящие для местного применения.

[0013] Настоящее изобретение касается также способов применения указанных выше композиций для лечения или профилактики микробных инфекций кожи млекопитающих. Как правило, способ лечения влечет за собой введение эффективного количества содержащих пептид композиций на пораженные участки кожи (эпидермис) и связанных тканей слизистой оболочки в течение эффективного количества времени. Способы также могут быть использованы, когда бактериальная инфекция вызвана бактерией, выбранной из P. acnes, S. aureus, E. coli и C. albicans.

[0014] Кроме того, пептиды по настоящему изобретению и композиции, содержащие их, могут обеспечить полезные характеристики для включения их в общеизвестные средства по уходу за кожей и в косметические препараты, такие как различная косметика для кожи, кремы для кожи, лосьоны, солнцезащитные кремы и терапевтические лосьоны или кремы, такие как противоугревые препараты.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0015] Для того чтобы описанное в данном документе настоящее изобретение было более понятным, далее дано его подробное описание. Настоящее изобретение в целом относится к композиции и способам, включающим противомикробные модифицированные липидами ди- или трипептидные аналоги KPV или KdPT общей формулы:

C_12-18 липид-KXZ-NH₂,

где K представляет собой лизин; X представляет собой пролин, d-пролин, гистидин или аргинин; Z является необязательным и, если присутствует, Z представляет собой валин, треонин, аланин или лейцин; и концевая COOH амидирована NH₂.

Примеры насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, которые могут быть использованы для обеспечения C_12-18 липид-компонента соединений по настоящему изобретению включают:

Системное название	Общее название	Сокращенное обозначение
додекановая кислота	лауриновая кислота	12:0
тетрадекановая кислота	миристиновая кислота	14:0
гексадекановая кислота	пальмитиновая кислота	16:0
гептадекановая кислота	маргариновая (датуровая) кислота	17:0
октадекановая кислота	стеариновая кислота	18:0
9-цис-тетрадеценовая кислота	миристинолеиновая кислота	14:1 (n-5)
9-цис-гексадеценовая кислота	пальмитолеиновая кислота	16:1 (n-7)
6-цис-гексадеценовая кислота	сапиеновая кислота	16:1 (n-10)
все-цис-7,10,13-гексадекатриеновая кислота		16:3 (n-3)
9-цис-октадеценовая кислота	олеиновая кислота	18:1 (n-9)
все-цис-9,12-октадекадиеновая кислота	линолевая кислота	18:2 (n-6)

[0016] Альфа-меланоцитстимулирующий гормон (α-MSH) представляет собой 13-аминокислотный нейропептид с сильной противовоспалительной активностью. Он образуется путем посттрансляционной модификации большей молекулы предшественника проопиомеланокортина. Как было показано, карбоксиконцевой трипептид α-MSH, состоящий из остатков от 11 до 13, KPV, оказывает противовоспалительное действие in vivo и in vitro (Brzoska, T., Luger, T.A. et al., α-melanocyte-stimulating hormone and related tripeptides: biochemistry, anti-inflammatory and protective effects in vitro and in vivo, and future perspectives for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. Endocrine Reviews 2009. 29 (5): 581-602). Было описано, что близкое по структуре производное KdPT (KPT) является коллинеарным по остаткам 193-195 IL-1β и, по-видимому, способно взаимодействовать с рецептором IL-1 типа I (Luger T.A., and Brzoska T. α-MSH related peptides: a new class of anti-inflammatory and immunomodulating drugs. Ann Rheum Dis 2007; 66 (suppl III): iii52-iii55). Имелось одно сообщение о том, что KPV обладает противомикробным действием в отношении S. aureus и C. albicans, однако МИК не была определена (Cutuli M et al., 2000, antimicrobial effects of α-MSH peptides, J. Leukocyte Biology, 67:233-239). В отличие от KPV, никогда не сообщалось о том, что трипептид KdPT обладает противомикробным действием.

[0017] Авторы настоящего изобретения осуществили определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в соответствии с рекомендациями CLSI (Институт клинических лабораторных стандартов) с помощью стандартного подхода по выбору противомикробных средств (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Ninth Edition). К удивлению авторов настоящего изобретения, ни KPV, ни KdPT не показали определяемые МИК при концентрациях вплоть до 2000 мкг/мл в отношении E. coli, S. aureus или дрожжей. Такой плохой противомикробный профиль делает оба трипептида гораздо менее желательным для терапевтического или косметического использования, когда требуется проявление противомикробной активности.

[0018] Авторы настоящего изобретения модифицировали оба пептида посредством N-концевого ацилирования липидами различной длины по альфа-аминогруппе KPV и KdPT. Такая модификация генерирует молекулы с новой превосходной и неожиданной противомикробной активностью в отношении широкого спектра микроорганизмов. Полученные липотрипептиды показали неожиданную противомикробную активность, превосходящую активность исходных пептидов в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий и дрожжей. Длина липида также влияет на такую активность, и авторы настоящего изобретения обнаружили, что липиды с числом атомов углерода в диапазоне от 12 до 18 были наиболее эффективными. После такой липидной модификации МИК была значительно улучшена в бульоне Мюллера-Хинтона в интервале от 1 до 64 мкг/мл в отношении P. acnes, S. aureus, E. coli и C. albicans. Замена третьего остатка в Pal-KPV-NH₂ на A или L сохраняла противомикробную активность, и обнаружение этого факта помогло авторам настоящего изобретения удалить третий аминокислотный остаток у KPV или KdPT. Полученные липопептиды, Pal-KP-NH₂, Pal-K-dP-NH₂, все продемонстрировали новую противомикробную активность. Кроме того, оба, и KP-NH₂, и KdP-NH₂, продемонстрировали умеренную противовоспалительную активность в отношении индуцированной гистамином экспрессии IL-6 в кератиноцитах кожи человека (данные не представлены). Авторы настоящего изобретения затем заменили второй остаток P или dP на V, A, F, G, S, H, K, I, L, D, R, S, W или Y. Эта работа обеспечила группе липодипептидов новую противомикробную активность, о чем никогда не сообщалось ранее. Противомикробная активность может быть транслирована на терапевтическое применение в фармацевтическом или косметическом препарате.

[0019] Таким образом, настоящее изобретение основано на разработке конкретных липодипептидов и липотрипептидов, полученных из KPV, состоящих из липида-KXZ, где липид может быть желательно выбран из группы пальмитоил-, лаурил-, миристил-, пентадеканоил- и стеарил-; и х может быть выбран из P, G, I, H и R, в L- или D-энантиомерной форме, Z является необязательным и, если присутствует, Z представляет V, T, А или L, амидированных по карбокси-концу. Такие короткие липопептиды являются новыми противомикробными средствами в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая Escherichia coli (E. coli), Staphylococcus aureus (S. aureus), Propionibacterium acnes (P. acnes), дерматофитов, таких как Trichophyton spp., и дрожжей Candida spp., включая C. albicans, C. glabrata и C. Tropicalis.

[0020] Ключ к аббревиатурам: Липиды, перечисленные выше, которые присоединены посредством амидной связи к ди- или трипептиду, используя стандартные способы синтеза химии пептидов: myr = миристиновая кислота, pen = пентадекановая кислота, pal = пальмитиновая кислота, ste = стеариновая кислота, lau = лауриновая кислота. Декстроформа аминокислоты обозначена сокращенно "d", например, декстроформа пролина обозначена d-пролин. Кроме того, аббревиатуры аминокислот соответствуют общепринятым:

Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагины	ASN	N
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутаминовая кислота	Glu	E

Глутамин	Gln	Q
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	K
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	V

[0021] Подробную информацию о способах разработки и введения фармацевтических препаратов можно найти в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Хотя желательна местная наружная доставка, есть и другие средства доставки, например: пероральное, парентеральное, с помощью аэрозоля, внутримышечное, подкожное, чрескожное, интрамедуллярное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное средство. Препараты по настоящему изобретению могут быть в составе с рядом доставляющих носителей, например, в составе спрея; аэрозоля; эмульсии типа вода-масло; эмульсии типа масло-вода; крема для лица или крема для тела; лосьона для загара или лосьона после загара; или с другими доставляющими носителями для местного введения. Кроме того, пептиды по настоящему изобретению и композиции, содержащие их, могут обеспечивать полезные характеристики для включения в общеизвестные средства по уходу за кожей и косметические препараты, такие как различная косметика для кожи, кремы для кожи, лосьоны, солнцезащитные кремы и терапевтические лосьоны или кремы, такие противоугревые препараты.

[0022] Как используется в настоящем документе, термин "терапевтический" обозначает агент, используемый для лечения, подавления, облегчения, предотвращения или улучшения нежелательного состояния или заболевания пациента. Состояние, которое лечат, в настоящем изобретении включает различные бактериальные инфекции, которые обычно действуют на кожу или слизистые участки млекопитающих, таких как люди. Способы могут быть также использованы при бактериальной инфекции, вызванной бактерией или грибком, выбранными из P. acnes, S. aureus, E. coli и C. albicans.

[0023] В зависимости от предусмотренного конкретного применения фармацевтическая композиция в соответствии с объектом изобретения может быть изготовлена в виде раствора, суспензии, препарата для парентерального введения, мази, крема, лосьона, спрея, порошка, таблеток или капсул. Препараты для парентерального введения могут включать наполнитель для лекарственной формы, такой как специально дистиллированная апирогенная вода, фосфатный буфер или физиологический раствор. Мази, кремы, лосьоны и спреи могут включают носитель, такой как растительное или минеральное масло, белый вазелин или высокомолекулярный спирт, т.е. больше, чем C12. Таблетки или капсулы могут включать разбавители (например, лактозу), связующие вещества, смазывающие вещества (например, стеариновую кислоту) и разрыхлитель (например, кукурузный крахмал).

[0024] Спрей для рта, содержащий эффективное количество активного агента, может быть также приготовлен с одним или несколькими модифицированными липидами пептидами по настоящему изобретению. Этот материал может быть распылен в качестве противомикробного агента аликвотами от 0,25 до 0,5 мл на поверхности зубов и десен в каждом квадранте от 1 до 3 раз в день. В случае зубных протезов спрей может быть использован непосредственно на поверхности зубного протеза перед ежедневным надеванием протеза. При желании может быть предусмотрен препарат для полоскания рта, содержащий эффективное количество противомикробного агента.

[0025] Композиции по настоящему изобретению также могут включать фармацевтически или дерматологически приемлемый носитель. Примеры носителей включают эмульсии и гели. Эмульсии часто являются смесью масляной фазы и водной фазы. Композиции могут также содержать отшелушивающие абразивные материалы. Композиции могут также содержать стабилизатор. Композиции могут также включать соединение, подавляющее пену.

[0026] Композиции также могут включать один или несколько дополнительных активных компонентов по уходу за кожей. Примеры активных компонентов по уходу за кожей включают десквамативные активные вещества, противоугревые активные вещества, соединения витамина B3, ретиноиды (включая ретинол, ретиналь, эфиры ретинола, ретинилпропионат, ретиноевую кислоту и ретинилпальмитат), гидроксильные кислоты, поглотители свободных радикалов, хелаторы, противовоспалительные агенты, местные анестетики, дубильные активные вещества, осветляющие кожу средства, антицеллюлитные средства, флавоноиды, противомикробные активные вещества, оздоровляющие кожу агенты, противогрибковые активные вещества, фарнезол, фитантриол, аллантоин, салициловую кислоту, ниацинамид, декспантенол, токоферол ацетат и глюкозамин.

[0027] Композиции также могут включать солнцезащитные соединения. Примеры солнцезащитных соединений включают неорганические солнцезащитные соединения и органические солнцезащитные соединения. Неорганические солнцезащитные вещества могут включать оксиды металлов, такие как оксид цинка, оксид титана и оксид железа. Органические солнцезащитные соединения могут включать октилметоксициннамат, октилсалицилат, терефталиден-дикамфор-сульфоновую кислоту, авобензон и октокрилен.

Материалы и способы

[0028] 1. Пептидный синтез. Все описанные пептиды были синтезированы с использованием стандартного Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил) твердофазного химического синтеза. Пептиды были получены в виде амидированных или свободнокислотных последовательностей с использованием стандартных аминокислот.

[0029] 2. Бактериальные штаммы и условия культивирования. Штаммы бактерий, включенные в это исследование, приведены в таблице 1. E. coli UB1005, S. aureus SAP0017 (MRSA) и C. albicans 105 выращивали на пластинах с агаром Мюллера-Хинтона (MH) (Difco, BD Biosciences, MD) и в бульоне (2 г мясного экстракта, 17,5 г кислотного гидролиза казеина и 1,5 г крахмала на литр) при 37°C, если не указано иное. Перед исследованием чувствительности к антимикробным препаратам бактерии из замороженного бульона пересевали на плашки со свежеприготовленным агаром MH. Для P. acnes бактерии выращивали в бульоне BBLTM Brain-Heart Infusion (Becton, Dickinson & Company, Sparks MD) или на агаровых пластинах при температуре 37°С в анаэробных условиях, генерируемых с использованием анаэростата и AnaeroGenTM (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England).

[0030] 3. Определение противомикробной активности. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) каждого пептида определяли с использованием модифицированного анализа CLSI микротитрованием разведений бульона (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Ninth Edition). Был использован инокулят 105-106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл или 104 КОЕ/мл для дрожжей. Значение МИК было принято в качестве наименьшей концентрации пептида, при которой подавлялось более 90% роста микроорганизмов после 15-20 часов инкубирования при температуре 37°С. Для P. acnes инкубирование в анаэробных условиях при температуре 37°С продолжали в течение 2 недель, после чего определяли МИК. Определение кинетики гибели проводили с использованием заданной концентрации (около 2-5-кратной МИК) пептида, смешанного с индикаторным микроорганизмом. После соответствующего разведения клетки высевали на чашки с агаром через определенные промежутки времени и инкубировали при температуре 37°С в течение ночи. В случае P. acnes требовался длительный период инкубации. Подсчитывали КОЕ и наносили на график зависимости выживания бактерий после обработки пептидом от времени, который показывает эффективность пептида в уничтожении микроорганизма.

[0031] 4. Определение токсичности в отношении кожной ткани. Совместимость и токсичность по отношению к коже определяли с помощью кожной ткани EpiDerm (EPI-200) и набора MTT Kit (MTT-100) (MatTek, Ashland, MA) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. В качестве положительного (токсичного) и отрицательного (нетоксичного) контроля были использованы 1% Triton X-100 и PBS, соответственно.

[0032] 5. Анализ профилирования генов. Были проанализированы 84 гена, кодирующие молекулы адгезии к внеклеточному матриксу в фибробластах кожи человека, используя массивы PCR (PCR arrays), производимых Sunny Biodiscovery, Inc (Santa Paula, CA). Фибробласты кожи человека были получены от фирмы Zen-Bio, Research Triangle Park, NC (cat.# DF-F, lot# DFMF112410). Клетки (низкий перенос) выращивали в среде DMEM/10% FCS w/o фенолового красного, пока они не достигали конфлюэнтной стадии, после чего их инкубировали дважды с исследуемыми веществами при концентрации 3, 5 или 10 мкг/мл, или с водой в течение 24 часов. В конце инкубирования клетки наблюдали под инвертированным микроскопом Nikon TS. Ни в одном из экспериментальных условий не было выявлено цитотоксичности. Качественная оценка показала больше клеток, подвергающихся митозу под действием исследуемых веществ при 5 мкг/мл, чем при 10 мкг/мл, и поэтому условие 5 мкг/мл было выбрано для экстракции РНК.

[0033] В конце инкубационного периода клетки хранили в растворе RNAlater (Ambion, Austin, TX) в течение 6 час. РНК экстрагировали и очищали с помощью набора NucleoSpin RNA II от фирмы Machery-Nagel, Bethleem, PA). Общую очищенную РНК оценивали при 230 нм, 260 нм и 280 нм с помощью спектрофотометра Agilent HP-8452A с диодной матрицей. Концентрацию РНК усредняли по образцам, и экспрессию генов, представляющих интерес, измеряли с помощью системы BioRad iCycler iQ Detection System с проведением PCR в режиме реального времени, используя массивы PCR PAHS-013A (www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/HTML/PAHS-013A.html), с набором синтеза 1-й нити, SYBR Green master mix и условий проведения PCR от фирмы Qiagen (ранее SA Biosciences). После нормализации экспрессии генов до 5 генов «домашнего хозяйства», проведенной с помощью коммерческого набора RT2 Profiler PCR Array для анализа, программное обеспечение версии 3.5, для количественного определения результатов был использован эффективный метод ΔΔCt.

Результаты и обсуждение

[0034] Противовоспалительная активность in vitro и in vivo как KPV, так и KdPT трипептидов была известна. Сообщалось также, что трипептид KPV проявлял противомикробную активность в фосфатном буфере в отношении S. aureus и C. albicans (Cutulis M. et al., Antimicrobial effects of α-MSH peptides. J. Leukocyte Bio. 2000 67:233-239). Однако значение МИК для KPV никогда не было определено или об этом не сообщали. Неизвестно также было, обладает ли KdPT противомикробным действием или нет.

[0035] Авторы настоящего изобретения исследовали антимикробную активность KPV и K-dPT в культуральной среде с использованием рекомендованного CLSI анализа серийного разведения в бульоне, стандартного анализа по определению МИК in vitro на противомикробную и противогрибковую активность (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Ninth Edition). К удивлению авторов, ни KPV (HB2067, HB2068), ни KdPT (HB2089, HB2090) с С-концевым амидированием или без него не показали определяемые МИК при концентрациях вплоть до 2000 мкг/мл в бульоне MH (таблица 1). Это согласовывалось с выводами, описанными Rauch и сотрудниками, о том, что KPV не подавляет рост дрожжей вплоть до 100 мкМ в анализе роста в отношении C. albicans штамма SC5314, стандартного лабораторного штамма в экспериментах по противогрибковой чувствительности (Rauch I., Holzmeister S., and Kofler B. Anti-Candida activity of alpha-melanocyte-stimulating hormone (alpha-MSK) peptides. J. Leukoc. Biol. 2009. 85 (3):371-372).

[0036] Авторы настоящего изобретения модифицировали KPV и KdPT липидами различной длины с целью поиска аналогов с лучшим или улучшенным противомикробным профилем, чем исходные трипептиды. Ацетилирование трипептидного ядра показало удивительные результаты. Длина липида, по-видимому, является важной, и в таблице 2 показаны результаты с использованием KPV в качестве примера.

[0037] Липид с количеством атомов углерода от 11 до 18, по-видимому, проявляет положительное влияние на противомикробную активность обоих, и KPV, и KdPT (таблица 1, 2). Оптимальная длина липида была установлена равной 15 и 16 для KPV и KdPT (таблица 1, 2). Такие липиды значительно повышают противомикробную активность обоих пептидов к широкому спектру микроорганизмов, включая грамположительные, грамотрицательные бактерии и дрожжи, как видно по SEQ ID NO 5 (HB2178), 7 или 24 (HB2180 или HB2200), 17 (HB2192), 23 (HB2199) (таблица 1, 2). Действительно, липопептиды показали почти 2000-кратное улучшение в МПК, начиная от 1-64 мкг/мл в отношении P. acnes, S. aureus, E. coli и C. albicans, по сравнению с исходным трипептидом KPV-NH₂ или KdPT-NH₂ самим по себе, который был неактивным вплоть до 2000 мкг/мл (таблица 1). Увеличение длины липида до 18-углеродов отменяет грамотрицательную селективную активность, но сохраняет как грамположительную, так и дрожжевую селективную активность (таблица 1, 2). Авторы настоящего изобретения далее провели замещение третьей аминокислоты в Pal-KPV-NH₂ с участием либо A, либо L и получением ID NO 30 (HB2208) и 31 (HB2209). Интересно, что обе SEQ ID NO 30 и 31 сохраняли достаточно широкий спектр противомикробной активности, что предполагало, что третий остаток V в Pal-KPV-NH₂ либо может, либо не может потребоваться для наблюдаемой новой противомикробной активности. В дополнение к широкому спектру активности, как показывает МИК, аналоги, включая SEQ ID NO 5 (HB2178), 7 (2180), 30 (HB2208) и 31 (HB2209) были все фунгицидными и уничтожали 5-6 log S. Aureus в течение 20 минут в анализе по подавлению микроорганизмов (таблица 3). Резюмируя, можно сказать, что присоединение липидов к KPV-NH₂ или KdPT-NH₂ с числом атомов углерода от 12 до 18 позволяет генерировать липотрипептиды с новым широким спектром противомикробной активности, о чем никогда не сообщалось ранее. Третий остаток в Pal-KPV-NH₂ или Pal-KdPT-NH₂ может быть или может не быть определяющим для наблюдаемой новой противомикробной активности. Амидирование по C-концу является весьма важным для описанной противомикробной активности, так как неамидированные дубликаты, такие как HB2184 и HB2182, были менее активны или неактивны.

[0038] То, что замещение третьего остатка Pal-KPV-NH₂ с участием A и L не отменяло активность, побудило авторов настоящего изобретения к дальнейшим модификациям. Так, авторы настоящего изобретения удалили третий аминокислотный остаток у обоих, Pal-KPV-NH₂ и Pal-KdPT-NH₂, с получением липодипептидов SEQ ID NO 26 (HB2202) и SEQ ID NO 27 (HB2203). Оба производные показали новую противомикробную активность, подобную исходным липотрипептидам Pal-KPV-NH₂ и Pal-KdPT-NH₂ (таблица 1). Такая активность была неожиданной и никогда не была описана. Кинетика подавления предполагает, что оба липодипептидных производных были одинаково фунгицидными и уничтожали 5-6 log микроорганизмов, включая P. acnes, S. aureus, E. coli и дрожжи C. albicans в течение 20 минут при прямом контакте в PBS (таблица 3). Противомикробная активность липодипептидов, описанных в настоящем изобретении, была также очевидной, как и сохраняемая значительная подавляющая активность в отношении S. aureus в присутствии 10%-ной фетальной бычьей сыворотки (таблица 3). Это имеет особую важность. Пептидные антибиотики часто являются проблемой из-за взаимодействия и связывания с белками хозяина, что приводит к снижению противомикробной активности. Учитывая, что порезы или повреждения кожи, включая акне, часто сопровождаются инфильтрацией серозной жидкости в область поражения, противомикробная активность в сыворотке является очень важной для возможных терапевтических средств.

[0039] Чтобы убедиться в том, что Pal-KP-NH₂ имеет конструкцию для проявления оптимальной активности, авторы настоящего изобретения поменяли положение для P и K с образованием HB2251 (Pal-PK-NH₂) и HB2255 (Pal-PK-OH). По сравнению с Pal-KP-NH₂, Pal-PK-NH₂ показал более чем 8-кратное снижение активности. Неамидированные производные Pal-PK-OH и Pal-KP-OH были неактивны, снова позволяя предполагать, что С-концевое амидирование является определяющим для противомикробной активности.

[0040] Возможность лечения кожного раздражения липодипептидами была протестирована с помощью модели EpiDermTM Skin Model (MatTek, Ashland, MA) в сочетании с модифицированным анализом МТТ. Модель EpiDermTM Skin Model демонстрирует in vivo-подобные морфологические и ростовые характеристики, которые являются однородными и легко воспроизводимым. EpiDermTM состоит из органических базальных, остистых, гранулированных и ороговевших слоев, аналогичных тем, которые имеются in vivo. Ткани обрабатывали каждым соединением при желаемой концентрации в течение 20 часов. Как видно из таблицы 1, ни один из выбранных липопептидов, представленных HB2202, HB2203, HB2180 HB2208 и HB2209, не проявлял негативного действия на жизнеспособность тканей вплоть до 2000 мкг/мл.

[0041] Воодушевленные новыми липодипептидами HB2202 и HB2203, авторы настоящего изобретения продолжили модификации путем замещения второго остатка Pal-KP-NH₂ и Pal-K-dP-NH₂ с участием V, A, F, G, L, S, H, K, I, S, R, T, Y или W. Как показано в таблице 1, такая модификация приводит к открытию обширной группы новых липодипептидов, которые оказывают либо широкий спектр противомикробной активности (Pal-KH-NH₂, Pal-KR-NH₂, Pal-KR-OH), либо большую грамположительную селективную активность (Pal-KG-NH₂, Pal-KL-NH₂ и Pal-KI-NH₂) (таблица 1).

[0042] Три показательных соединения, SEQ ID NO 26 (HB2202), SEQ ID NO 41 (HB2242) и SEQ ID NO 55 (HB2259), были выбраны для изучения генной пролиферации на дермальных фибропластах человека. Как показано в таблице 4, три соединения показали одинаковый характер тренда с точки зрения влияния на фибробласты кожи человека. Генами, которые подвергались воздействию, являлись те, которые участвуют в заживления ран и противофиброзных каскадах. Три соединения влияют на интегрины, как показывает то, что HB2202 и HB2242 активируют экспрессию ITGA2 (интегрин альфа 2), тогда как HB2259 индуцирует ITGA6 (интегрин альфа 6) (таблица 4). Интегрины присоединяются к коллагенам и играют важную роль в клетке при матричных взаимодействиях. Эти белки обильно экспрессируются базальными кератиноцитами в неповрежденной коже и являются необходимыми для реэпителизации кожных ран человека. Соединения также модулируют экспрессию ADAMTS (адам металлопептидаза с тромбоспондином типа 1) и THBS3 (тромбоспондин) (таблица 4), оба из которых участвуют в заживлении ран. В исследованиях на животных моделях даун-регуляции тромбоспондина было показано, что THBS-нулевые мыши имеют улучшенные артериогенез, ангиогенез и восстановление кровотока после ишемии по сравнению с контрольными мышами (Kyriakides TR and MacLauchlan S. The role of thrombospondins in wound healing, ischemia, and the foreign body reaction. J Cell Commun Signal 2009. 3:215-225). Кроме того, в таблице 4 показано, что все три соединения значительно снижают экспрессию CTGF (фактор роста соединительной ткани), а также CTNND1 (катенин). Оба, и CTGF, и CTNND1, связаны с фибропролиферативной активностью, и повышенные уровни экспрессии были обнаружены при таких заболеваниях, как келоиды и гипертрофированные рубцы (HTS) (Poon R et al., Catenin driven neoplastic and reactive fibroproliferative disorders. PLoS One. 2012; 7:e37940). HTS представляет собой отклонения от нормы фундаментальных процессов заживления ран, вызывая чрезмерное производство коллагена фибробластами. Ожоги, травматические повреждения и хирургические процедуры часто продуцируют HTS. Раневые инфекции также оставляют кожу с HTS после удаления инфекционных агентов, таких как бактерии и грибки, с помощью противомикробных агентов. Липодипептиды также влияют на KAL1 (таблица 4). Это особенно интересно, поскольку было обнаружено, что белок, кодируемый геном KAL1, участвует в модулировании плотности эпидермального нерва при атопическом дерматите. Сверхэкспрессия KAL1 подавляет рост аксонов, возможно ингибируя гипериннервацию и аномальное восприятие зуда при атопическом дерматите (Tengara S et al., Keratinocyte-derived anosmin-1, an extracellular glycoprotein encoded by the X-linked Kallmann syndrome gene, is involved in modulation of epidermal nerve density in atopic dermatitis. J Dermatol Sci 2010. 58:64-71). В заключение, помимо обсуждаемого широкого спектра противомикробной активности, короткие липопептиды могут активировать кожные клетки человека, что способствует заживлению ран и антифиброзной активности. Таким образом, липопептиды являются полезными для восстановления раны после противомикробной терапии.

Таблица 4 Исследование генной пролиферации на фибробластах кожи человека
Символ	Название гена	Кратное изменение (пептид в сравнении с контролем PBS) Регулирование вверх (+) или вниз(-)
Символ	Название гена	HB2202	HB2242	HB2259
ADAMTS	ADAM металлопептидаза с тромбоспондином типа 1	3,8106	4,7899	2,4284
CDH1	Кадхерин типа I, Е-кадхерин	1,3566	1,9725	1,0718
COL1A1	Коллаген типа I альфа 1	-1,0867	1,1975	-1,8661
COL8A1	Коллаген типа VIII альфа-1	1,4948	-1,4044	-2,5847
CTGF	Фактор роста соединительной ткани	-2,9485	-1,8921	-3,0314
CTNND1	Катенин (кадхерин-связанный белок), дельта 1	-2,395	-2,0279	-1,1487
HAS1	Гиалуронан-синтаза 1	-2,395	-2,3295	-3,0314
ITGA2	Интегрин альфа 2	2,2038	2,114	1,3195
ITGA6	Интегрин альфа 6	1,2658	-1,014	2,1435
ITGA7	Интегрин альфа 7	-1,815	-2,0279	-1,8661
ITGB2	Интегрин бета 2	2,2038	1,3947	2,1435
KAL1	Последовательность синдрома Каллмана 1	3,5801	1,8404	1,2311
MMP1	Матриксная металлопептидаза 1	2,362	1,7171	1,1487
MMP8	Матриксная металлопептидаза 8	2,362	-1,6472	2,1435
MMP9	Матриксная металлопептидаза 9	-1,2834	-1,6472	-2,1435
MMP10	Матриксная металлопептидаза 10	2,9079	1,2142	1,6245

MMP13	Матриксная металлопептидаза 13	1,0281	-2,4967	-3,249
MMP14	Матриксная металлопептидаза 14	-1,0425	1,2142	-2,4623
SELE	E-селектин	2,0562	1,3947	1,0718
THBS3	Тромбоспондин	-1,9453	-3,0738	-1,6245

[0043] Следующие примеры представлены для демонстрации некоторых предпочтительных вариантов настоящего изобретения.

[0044] Инфекция ран является серьезной проблемой, которая усугубляется возрастающей частотой резистентности ко многим лекарствам патогенных микроорганизмов, таких как MRSA. Настоящее изобретение может быть применено, терапевтически или косметически, для лечения, улучшения и профилактики кожных заболеваний, связанных с бактериями, включая акне, атопический дерматит, розацеа или грибки, включая перхоть и эпидермофитию стоп.

[0045] S. aureus является одной из основных причин внутрибольничных инфекций, наиболее часто связанных с кровотоком, кожей и мягкими тканями, искусственной вентиляцией легких при пневмонии и катетерами. Возрастающая частота инфекций, вызванных метициллин-устойчивым S. aureus (MRSA) представляет особый интерес, особенно в Соединенных Штатах, где распространенность составляет более 55% в реанимации, и заболеваемость вызывает более продолжительную госпитализацию, более высокие затраты и повышенный риск смерти. Внебольничный MRSA (CA-MRSA), генотипически отличный от HA-MRSA, также теперь стал установленной угрозой для пациентов без обычных факторов риска. Помимо S. aureus, грамположительные бактерии Streptococcus pyogenes являются одной из основных причин сложных инфекции кожи и кожных структур (SSTI). Настоящее изобретение обеспечивает потенциальную профилактику и лечение в отношении инфекций, связанных с MRSA.

[0046] Обыкновенные угри являются общим заболеванием кожи человека, характеризующиеся участками кожи с себореей, комедонами, папулами, пустулами, узелками и, возможно, рубцами. Области, страдающие от акне, охватывают лицо, верхнюю часть груди и спину. Серьезные виды угрей являются воспалительными, но акне может проявляться и в виде невоспалительных элементов. Бактерия, Propionibacterium acnes, может вызвать воспаление, которое приводит к воспалительным поражениям в дерме вокруг микрокомедон или комедон, что приводит к покраснению и может привести к образованию рубцов или гиперпигментации. Противомикробные короткие липопептиды могут быть использованы для устранения покраснения и воспаления кожи в виде, но этим не ограничиваясь, карандаша, пены, салфетки, кремов, лосьонов, спреев, тонеров и/или моющих средств. Другим возможным применением могло бы быть использование современных разработок в сочетании с, но не ограничиваясь этим, салициловой кислотой или ретиноидами.

[0047] Фолликулит - это слово используется для описания воспаления одного или нескольких фолликулов волос в любом месте кожи, включая Pseudofolliculitis barbae, такой как фолликулит бритвенных порезов (razor bump) и кожи головы, особенно известный у афроамериканских мужчин. Фолликулит представляет собой инфекцию волосяных фолликулов. Умеренные случаи, как правило, вызывают зуд, а тяжелые случаи могут привести к глубоким рубцам. Это вызвано бактериями, которые попадают в кожу через небольшое отверстие волосяного фолликула. В большинстве случаев фолликулита поврежденные фолликулы затем инфицируются бактериями стафилококка. Зуд Барбера представляет собой инфекцию стафилококка волосяных фолликулов на лице в области бороды, как правило, на верхней губе. Дерматомикоз бороды и усов похож на зуд Барбера, но инфекция вызывается грибком. Известны советы, которые могут помочь предотвратить это состояние кожи, такие как использование антибактериального мыла и шампуня для кожи головы для лечения фолликулита. Также были использованы гидрокортизон, антибиотик или третиноин крем для лечения бритвенного пореза, вызванного раздражением и прыщами. Широкий спектр противомикробных липопептидов, описанных в настоящем изобретении, должен быть превосходным для лечения расстройства, связанного с повреждением фолликулов, закупоркой фоликула, бритьем или трением, вызываемым одеждой, ремнями шлема и т.п., в области шеи, паха или области гениталий.

[0048] Перхоть представляет собой общее хроническое состояние кожи головы, отмеченное зудом и шелушением кожи в волосистой части головы. Виды Malassezia представляют собой хорошо известные дрожжи, которые являются причиной распространенных заболеваний кожи, в том числе перхоти, отрубевидного лишая, себорейного дерматита, псориаза и атопического дерматита у людей. Стригущий лишай, также известный как стригущий лишай волос или стригущий лишай волосистой части головы, является поверхностной грибковой инфекцией кожи головы. Заболевание обычно вызывается дерматофитами рода Trichophyton и Microsporum, которые внедряются в стержень волоса. Случаи инфицирования Trichophyton преобладают на территории от Центральной Америки до Соединенных Штатов Америки и в некоторых частях Западной Европы. Заболевание является инфекционным и может передаваться людям, животным или объектам, на которых может существовать грибок. Носительство возбудителей инфекции также имеется, когда грибок присутствует на коже головы, но нет никаких клинических признаков или симптомов. Эпидермофития стоп, известная также как стригущий лишай ноги или дермофития стопы, также является грибковой инфекцией кожи ног, которая приводит к шелушению, отслаиванию и зуду пораженных областей. Она вызывается Trichophyton spp. В некоторых случаях вторичная бактериальная инфекция может сопровождаться грибковой инфекцией. В терапии начали получать признание такие противогрибковые средства, как тербинафин, итраконазол и флуконазол. Липодипептиды с широким спектром активности в отношении бактерий и грибов, описанные в данном документе, могут быть эффективными в качестве местного лечебного препарата для профилактики и устранения описанных состояний.

[0049] Атопический дерматит (AD) представляет собой воспалительное, хронически рецидивирующее, незаразное и сопровождающееся кожным зудом расстройство, от которого страдают 15-30% детей и 2-10% взрослых. Иногда называемый экземой или диффузным нейродермитом, атопический дерматит является наиболее распространенным у младенцев и детей, он характеризуется зудом, экзематозными поражениями, ксерозом (сухая кожа) и лихенизацией (утолщение кожи и усиление кожного рисунка). Наиболее распространенными бактериями, обнаруживаемыми на коже при AD, являются S. aureus. На самом деле, у больных AD более чем на 90% поврежденная и неповрежденная кожа заселена S. aureus по сравнению с 5% для здоровой кожи. Кожа при AD проявляет нарушенное действие эпидермального барьера, а также недостаток в системе врожденного иммунитета эпидермиса, как было предположено по снижению экспрессии противомикробных пептидов. Описанные в настоящем документе липопептиды с противомикробной активностью плюс противовоспалительной активностью должны стать альтернативой при лечении AD.

[0050] Галитоз, известный также как дурной запах изо рта - это термин, используемый для описания заметно неприятных запахов, выделяемых при дыхании. Галитоз, по оценкам, является третьей по частоте причиной обращения за стоматологической помощью после кариеса и пародонтальных заболеваний. Неприятный запах изо рта и пародонтит вызываются грамотрицательными бактериями, такими как Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides spp. Бактерии также вызывают серьезное воспаление эпителиальной поверхности ротовой полости. Анти-грамотрицательные селективные пептиды с противовоспалительной активностью будут идеальными для поддержания здоровья ротовой полости.

[0051] Триклозан представляет собой хлорированное ароматическое соединение с противобактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами. Он используется в различных обычных бытовых изделиях, в том числе мыла, жидкости для полоскания рта, посудомоечных моющих средствах, зубных пастах, дезодорантах и средствах для дезинфекции рук. Отчеты показали, что триклозан может соединяться с хлором в водопроводной воде с образованием хлороформа, который Агентство по охране окружающей среды США (United States Environmental Protection Agency) классифицирует как возможный канцероген для человека, то есть, он, скорее всего, вызывает рак. Противомикробные липодипептиды, описанные в настоящем документе, представляют большие возможности по замене триклозана за право проявлять противобактериальные и противогрибковые свойства без канцерогенного риска.

[0052] Подобным же образом, запах тела также зависит от воздействия членов семейства Corynebacterium. Противомикробное свойство описанного продукта может быть использовано в косметических порошках, гелях, полутвердых продуктах, кремах или других формах, таких как дезодоранты для подмышек или ног.

[0053] Бактериальный вагиноз (BV) является наиболее общей причиной вагинальной инфекции, известной как вагинит. Обычно он не считается «передаваемым половым путем». От бактериального вагиноза страдают от 20% до 70% женщин. Сильный запах и необычные выделения из влагалища являются наиболее распространенными симптомами заболевания, помимо зуда и жжения. Вагинальный кандидоз представляет собой инфекцию влагалища с участием чрезмерного роста дрожжей или грибка, известного как Candida. Эти дрожжи обычно присутствуют в полости рта, кишечника и влагалища, как и ряд других организмов. Если баланс микроорганизмов нарушается, как это может произойти при принятии антибиотиков широкого спектра действия, гормональных колебаниях и при других условиях, может произойти чрезмерно быстрый рост дрожжей. Вагинальный кандидоз, часто упоминается как "дрожжевая инфекция", является общей проблемой, затрагивающей около 75% взрослых женщин в течение их жизни. Также связанными с вагинальным воспалением являются не-albican Candida spp, такие как С. glabrata и C. tropicalis; герпес и Streptococcus группы B. Состояния изменяются и могут ухудшаться в связи с потерей Lactobacillus spp, природного симбионта, который действует как защитный барьер в отношении условно-патогенных микроорганизмов. Поэтому использование противомикробных пептидов, описанных в настоящем документе, для подавления индикативных микробов, например, но этим не ограничиваясь, в лубрикантах, может оказывать эффективную помощь в качестве средств женской гигиены.

[0054] Производители косметики добавляют химические консерванты в средства для макияжа и лосьоны, чтобы убить бактерии и продлить срок годности этих продуктов. Однако некоторые консерванты вызывают сыпь и другие аллергические реакции, и исследования показали связь некоторых из этих агентов со злокачественным новообразованием и другими проблемами со здоровьем. Синтетические консерванты на основе парабенов, такие как метилпарабен, бутилпарабен и этилпарабен, имеются в более чем 70 процентах косметических средств, лосьонах для кожи и дезодорантах. Консерванты на основе парабенов повторяют действие эстрогена. Даже небольшие количества этих сильнодействующих химических веществ могут вывести природную гормональную систему организма из состояния равновесия. Искусственно запускаемый дисбаланс эстрогена был связан с раком молочной железы у женщин и недостатком тестостерона у мальчиков. Косметическая промышленность в качестве консерванта использует также формальдегид. Даже при том, что его количество, добавленное в средство для макияжа, мало, оно может вызвать аллергическую реакцию у тех, кто чувствителен к химическим веществам. Таким образом, одним из возможных применений широкого спектра описанных противомикробных липодипептидов, являющихся экономически эффективными для косметической промышленности, может быть замена вредных химических веществ в качестве консервантов.

[0055] Композиции, используемые для доставки пептидов в указанном выше терапевтическом способе, могут представлять собой аэрозоль, эмульсию, жидкость, лосьон, крем, пасту, мазь, порошок или пену или другую фармацевтически приемлемую композицию. Кроме того, пептиды могут быть доставлены с помощью менее сложных по составу препаратов, таких как деионизированная/дистиллированная вода, PBS или стандартные медицинские солевые растворы. Обычно фармацевтически приемлемый препарат мог бы включать любой носитель, подходящий для использования на коже человека. Такие фармацевтически приемлемые носители включают этанол, диметилсульфоксид, глицерин, диоксид кремния, оксид алюминия, крахмал и эквивалентные носители и разбавители. Препарат, необязательно, может иметь косметическое применение и/или может содержать другие вещества, такие как ретиноиды или иные пептиды, которые могут выступать в качестве вспомогательных веществ при терапевтическом действии пептидов по настоящему изобретению. В композиции также могут быть добавлены антибиотики для того, чтобы отражать инфекцию, тем самым обеспечивая протекание процессов максимального заживления. Концентрация пептида в композиции может составлять от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл или от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 10 (масс./об.); однако конечная концентрация может изменяться и за пределами этих диапазонов, в зависимости от природы состояния раны/ткани, биоактивности пептида по изобретению и использования какого-либо вспомогательного вещества или метода, чтобы обеспечить повышенную абсорбцию композиции.

[0056] Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько дополнительных агентов, которые проявляют действие по уходу за кожей.

[0057] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, когда композиция должна быть в контакте с ороговевшей тканью человека, помимо пептидов по настоящему изобретению могут быть любые дополнительные компоненты, подходящие для применения в ороговевшей ткани; то есть, когда они включены в композицию, такие другие компоненты не должны проявлять чрезмерную токсичность, несовместимость, нестабильность, вызывать аллергическую реакцию и т.п., в объеме медицинской точки зрения. В справочнике CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, второе издание (1992), описано широкое разнообразие неограничивающих косметических и фармацевтических ингредиентов, обычно используемых в промышленности по уходу за кожей, которые подходят для использования в композиции по настоящему изобретению. Примеры этих классов ингредиентов включают абразивы, абсорбенты, эстетические компоненты, такие как ароматизаторы, пигменты, красящие вещества/красители, эфирные масла, дермальные сенсаты, астрингенты и т.п. (например, гвоздичное масло, ментол, камфора, эвкалиптовое масло, эвгенол, ментиллактат, дистиллят гамамелиса), противоугревые агенты, предотвращающие слипание агенты, пеногасители, противомикробные агенты (например, йодпропил бутилкарбамат), антиоксиданты, связующие вещества, биологические добавки, буферные агенты, наполнители, хелатирующие агенты, химические добавки, косметические биоциды, денатуранты, лекарственные астрингенты, экстернальные анальгетики, пленкообразователи или пленочные материалы, контрастные вещества, регуляторы рН, пропелленты, восстанавливающие агенты, секвестранты, кожные отбеливающие и осветляющие средства (например, гидрохинон, койевая кислота, аскорбиновая кислота, аскорбилфосфат магния, аскорбилглюкозамин), кондиционеры для кожи (например, увлажнители), кожные успокаивающие и/или целебные вещества (например, пантенол и его производные, алоэ вера, пантотеновая кислота и ее производные, аллантоин, бисаболол и дикалия глицирризинат), лечебные средства для кожи, загустители и витамины и их производные.

[0058] Введение пептидов по изобретению и связанных с ними композиций может быть осуществлено людям и животным, в том числе всем млекопитающим. Применение может быть также осуществлено в сочетании с обычными и/или экспериментальными материалами, такими как тканевые трансплантаты, продукты тканевых культур, кислород и повязки.

Перечень обычно используемых материалов для обработки ран

Виды материалов для обработки ран	Продукты
Пленки	Биоклюзив Bioclusive^TM(Johson & Johson Medical, Inc)
	Омидерм Omiderm^TM(omicron Scientific Ltd.)
	Опсит Opsite* (Smith & Nephew United, Inc)
	Прозрачный перевязочный материал Полискин II Polyskin® II (Kendall Healthcare)
	Тегадерм Tegaderm^TM (3M Health Care)
Гидрогели	Intrasite^TM (Smith & Nephew United, Inc)
	Нугель Nu-Gel^TM (Johnson & Johnson Medical, Inc.)
	Вигилон Vigilon® (Bard Medical Division)
Гидроколлоиды	Комфил Comfeel® (Coloplast Sween Corp.)
	Дуодерм DuoDerm® (ConvaTec®)
	Restore^TM (Hollister Incorporated)
Полисахариды	Абсорбирующая повязка Bard* (Bard Medical Division)
	Дебризан Debrisan (Johnson & Johnson Medical, Inc.)
	Гранулы дуодерм DuoDerm® Granules (ConvaTec®)
Альгинаты	Калтостат Kaltostat® (ConvaTec®)
	Сорбсан Sorbsan^TM(Dow Hicham Pharmaceuticals Inc)

Пенные повязки	Аллевин Allevyn* (Smith & Nephew United, Inc)
	Лиофоам Lyofoam® (Acme United Corporation)
Повязки из слоистого материала	Biobrane® (Dow Hickam Pharmaceuticals Inc)
(*) Звездочки относятся к торговым маркам отдельных компаний

[0059] Обычно композиция может быть введена местно, перорально, трансдермально, системно или любым другим способом, известным специалистам в данной области техники, который может быть использован для доставки пептидов по настоящему изобретению к месту поражения. Композиции могут быть также нанесены методом in vitro или ex vivo, либо в клетки, либо в трансплантаты пациентов, растущие в культуре, например.

[0060] Благодаря своим малым размерам пептиды, как ожидается, сами по себе могут достичь некоторого уровня проницаемости через кожу; однако, некоторые методы могут быть использованы для усиления этого движения. Например, в пептиды могут быть добавлены липофильные (неполярные) группы, или пептиды могут быть доставлены в кожу в липофильном эксципиенте, с тем, чтобы повысить поступление пептида в роговой слой с целью осуществления его перемещения в нижние слои эпидермиса. Таким образом, такие липофильные модификации могут быть рассмотрены как пролекарство. В наполнителе могут быть использованы усилители проницаемости, такие как известные растворители и поверхностно-активные вещества для лучшей абсорбции пептидов. Специальные методы, которые, как ожидается, могут быть использованы для улучшения поступления пептидов к мишеневой ткани/травме, включают ионофорез, электрофорез и ультразвук. Ионтофоретическое устройство состоит из двух электродов, погруженных в раствор электролита и помещенных на коже. Когда электрический ток проходит между электродами, через роговой слой создается электрическое поле, что обуславливает доставку пептидов. Электропорация включает в себя применение высоковольтных электрических импульсов, чтобы увеличить проникновение через липидные бислои. Она отличается от ионофореза по продолжительности и интенсивности прилагаемого электрического тока (ионофорез использует относительно постоянное низковольтное электрическое поле). Электрический импульс высокого напряжения при электропорации, как полагают, вызывает обратимое образование гидрофильных пор в липидных ламеллах мембран, которые могут обеспечить высокую степень усиления проникновения. При ультразвуке используются звуковые волны, имеющие частоту больше, чем 16 кГц, на кожу, что вызывает сжатие и расширение ткани, через которую пропускаются звуковые волны. Полученные изменения давления вызывают ряд процессов (например, кавитация, смешивание, повышение температуры), которые могут усилить проникновение пептидов.

[0061] Все перечисленные выше пептидные препараты и их применения хорошо известны в данной области техники. Дополнительные способы получения и применения пептидов по изобретению описаны, например, в патентах США № 6492326 и 6974799, которые оба включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте.

[0058] Все композиции или способы, описанные и заявленные в данном документе, могут быть получены и осуществлены в свете настоящего описания без излишних экспериментов. В то время как композиции и способы по настоящему изобретению были описаны в терминах предпочтительных вариантов осуществления изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что к композициям и/или способам, а также к стадиям или последовательностям стадий способов, описанным в данном документе, могут быть применены изменения, не отступая от концепции, духа и рамок настоящего изобретения. Более конкретно, должно быть очевидно, что некоторые средства, которые химически и физиологически связаны, могут быть заменены на средства, описанные в настоящем документе, при этом будут достигнуты одни и те же или аналогичные результаты. Все такие сходные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются подпадающими под объем настоящего изобретения.

Claims

1. Способ лечения микробной инфекции кожи или слизистой ткани у млекопитающего, включающий введение в инфицированную область указанного млекопитающего терапевтически эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере один пептид формулы

Pal-липид-лизин-пролин-NH₂ или

Pal-липид-лизин-d-пролин-NH₂,

и фармацевтически приемлемый носитель в течение эффективного количества времени.

2. Способ по п. 1, где терапевтически эффективное количество композиции включает пептид в концентрации в диапазоне от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 100000 мкг/мл.

3. Способ по п. 1, где микробная инфекция вызвана бактерией, выбранной из группы, состоящей из P. acnes, S. aureus, Е. coli и С. albicans.

4. Способ по п. 1, где пептид в композиции представляет собой

пальмитоил-лизин-пролин-NH₂;

пальмитоил-лизин-d-пролин-NH₂;

миристоил-лизин-d-пролин-NH₂ или

пентадеканоил-лизин-d-пролин-NH₂.

5. Способ по п. 1, где микробная инфекция кожи представляет собой акне, атопический дерматит, розацеа, бактериальный вагиноз, перхоть или эпидермофитию стоп.

6. Способ по п. 1, где микробная инфекция является причиной запаха тела, галитоза или заболевания десен.