CN111303242B

CN111303242B - 一种KdPT的修饰肽

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Publication number: CN111303242B
Application number: CN202010122681.4A
Authority: CN
Inventors: 张时群; 林华燕; 许元生; 边婧
Original assignee: Link Health Group
Current assignee: Link Health Group
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CN111303242A

Abstract

本发明提供了乙酰化KdPT在降低三肽KdPT引湿性和/或提高KdPT稳定性中的应用，通过对KdPT的第一个氨基酸(lys，K)的N端氨基和侧链氨基均进行乙酰化修饰，改善了KdPT的引湿性和稳定性，且不影响其活性，为工业化生产带来了极大的便利。

Description

一种KdPT的修饰肽

技术领域

本发明涉及具有生物活性及治疗活性的抗炎三肽KdPT，具体涉及所述三肽的修饰。

背景技术

在科学文献和专利文献二者中已报道多种生物活性肽。肽最早从天然来源分离，且最近已成为结构-功能关系研究的对象。此外，天然肽已充当设计合成肽类似物的起点。

KdPT为已报道的抗炎三肽，可以用于肠道炎症，如炎性肠病(IBD)的治疗。但是，KdPT具有极强的引湿性，暴露空气中短时间即可化成水样溶液，非常不利于保存。并且KdPT极不稳定，很容易发生降解，产生DKP。以上原因限制了KdPT的应用，目前非常需要一种能够降低KdPT引湿性和/或提高KdPT稳定性的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，本发明将KdPT的第一个氨基酸(lys，K)的N端氨基和侧链氨基均进行了乙酰化修饰，改善了KdPT的引湿性和降解性，且不影响其活性，为所述三肽的工业化生产带来了极大的便利。虽然仅仅是常规修饰，但带来了意想不到的效果，具有重大的应用价值和市场价值。

本发明提供乙酰化KdPT在降低三肽KdPT引湿性和/或提高KdPT肽稳定性中的应用，其中所述K是赖氨酸；dP是D-脯氨酸；T是苏氨酸。

优选地，所述乙酰化KdPT包括三肽KdPT中赖氨酸的乙酰化。

优选地，所述赖氨酸的乙酰化包括对赖氨酸的两个氨基进行乙酰化修饰。

优选地，所述赖氨酸的乙酰化包括赖氨酸的两个氨基乙酰化化，且对KdPT的C端进行酰胺化修饰。

优选地，所述赖氨酸的乙酰化包括对赖氨酸的侧链氨基进行乙酰化修饰，且三肽KdPT进行N和C末端的C-C环化。

本发明还提供一种乙酰化的三肽KdPT，其特征在于，对所述三肽KdPT的K进行乙酰化修饰，其中所述K是赖氨酸；dP是D-脯氨酸；T是苏氨酸。

优选地，所述三肽KdPT是：(乙酰基)₂-赖氨酸-D-脯氨酸-苏氨酸，其中(乙酰基)₂表示对赖氨酸的两个氨基进行乙酰化修饰。

优选地，所述三肽KdPT是：(乙酰基)₂-赖氨酸-D-脯氨酸-苏氨酸-NH₂，其中(乙酰基)₂表示对赖氨酸的两个氨基进行乙酰化修饰，NH₂表示对C端进行酰胺化修饰。

优选地，所述三肽KdPT是：乙酰基-(C赖氨酸-D-脯氨酸-苏氨酸C)，其中乙酰基表示对赖氨酸侧链上的氨基进行乙酰化修饰，C赖氨酸-D-脯氨酸-苏氨酸C表示三肽KdPT进行N和C末端的C-C环化。

本发明还提供一种降低三肽KdPT引湿性和/或提高KdPT稳定性的方法，包括对KdPT进行乙酰化修饰，其中所述K是赖氨酸；dP是D-脯氨酸；T是苏氨酸。

优选地，所述对KdPT进行乙酰化修饰包括三肽KdPT中赖氨酸的乙酰化。

优选地，还包括对KdPT的C端进行酰胺化修饰。

优选地，所述赖氨酸的乙酰化包括将赖氨酸的侧链氨基乙酰化，且三肽KdPT进行N和C末端的C-C环化。

本发明的有益效果：本发明将KdPT的第一个氨基酸(lys，K)的N端氨基和侧链氨基均进行了乙酰化修饰，极大改善了KdPT的引湿性和稳定性，且不影响其活性，为工业化生产到来了极大的便利。

附图说明

图1为实施例2各样品引湿性实验结果示意图。

图2为实施例3各样品稳定性实验结果示意图。

图3为实施例4各组大鼠的DAI评分结果示意图。

图4为实施例4各组大鼠的CMDI评分结果示意图。

图5为实施例4各组大鼠的病理评分结果示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1合成抗炎三肽KdPT及其修饰形式

委托浙江湃肽生物有限公司合成如下多肽，见表1：

表1合成的多肽序列

各合成500mg，纯度＞95％。其中607是未经修饰的KdPT。

实施例2.引湿性检测

取607、608、609、610、611样品各约100mg，置于室温，敞口放置，分别于放置2小时、6小时、24小时，称量样品吸潮后的重量，并计算各样品各时间点的增重率。增重率(％)＝(各时间点样品重量-样品0小时重量)/样品0小时重量×100％。

结果如图1所示：敞口放置24小时后，607(即KdPT)吸潮明显，样品变为水样溶液，增重率为34.8％。609吸潮较明显，样品表面潮湿，增重率为18.3％。608、610、611则吸潮不明显，增重率均在10％以下(分别为8.8％、9.3％、4.9％)。表明对KdPT的N端的赖氨酸(Lys，K)的氨基进行乙酰化修饰(样品608、610、611)，显著降低了KdPT的引湿性。而对C端苏氨酸(Thr，T)进行修饰(样品609)，引湿性的改善则并不显著。

实施例3.稳定性检测

采用HPLC方法：使用如下色谱系统和色谱条件进行样品的HPLC检测。

仪器：Thermo U3000 HPLC系统，配置LPG-3400SD泵，WPS-3000自动进样器，VWD-3100紫外检测器，TCC-3000柱温箱；

色谱柱：Synergi 4μm Hydro-RP

(4.6×150mm，4μm)；

流动相：A，含0.1％三氟乙酸的水溶液；

B，含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；

柱温：45℃；

检测波长：220nm；

流速：1mL/min；

进样量：20μL；

洗脱程序，见表2：

表2洗脱程序

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0	98	2
15	90	10
			20	85	15
35	60	40
			35.1	0	100

将样品607、608、609、610、611各100mg，各分装5支EP管，密闭避光保存，置于稳定箱中保存，保存条件为45℃、75％的相对湿度。各样品分别放置0、1、5、10、20、30天取样分析，以前述建立的HPLC方法进行分析，采用面积归一法确定主峰纯度。各样品均重复进样2次，取2次分析均值作为最终结果。

结果如图2所示：在高温高湿(温度为45℃、相对湿度为75％)的环境中放置30天后，607(即KdPT)全部降解，主峰纯度降为0；609降解较明显，主峰纯度降为53.38％；608、610、611则降解不明显，主峰纯度均超过95％(分别为97.23％、100％、99.16％)。表明对KdPT的N端的赖氨酸(Lys，K)的氨基进行乙酰化修饰(样品608、610、611)，显著改善了KdPT的降解，提高了其稳定性，而对C端苏氨酸(Thr，T)进行修饰(样品609)，KdPT降解的改善则并不显著。

实施例4.活性检测

1、实验方法：

动物：8周龄雌性SPF级SD大鼠按照体重随机分为6组，每组10只。SD大鼠连续5天喂食含有3％葡聚糖硫酸钠(DSS)，建立大鼠溃疡性结肠炎(UC)模型，每天通过测量体重来监测疾病。

治疗：造模第2天开始给药，连续给药2周。给药方式、给药剂量等见表3。

表3动物实验设计

组别	治疗药物	给药方式	剂量	给药体积	给药频率
						正常对照组	生理盐水	灌胃口服	/	10mL/kg	每日一次
模型对照组	生理盐水	灌胃口服	/	10mL/kg	每日一次
						607组	607	灌胃口服	100μg/只	10mL/kg	每日一次
608组	608	灌胃口服	100μg/只	10mL/kg	每日一次
						609组	609	灌胃口服	100μg/只	10mL/kg	每日一次
610组	610	灌胃口服	100μg/只	10mL/kg	每日一次
						611组	611	灌胃口服	100μg/只	10mL/kg	每日一次

测量指标：

大鼠一般状态观察：记录大鼠的一般情况，包括体质量、大便性状、毛发光泽度、精神状态、是否易激惹等，用大便隐血测定试剂盒(干化学法)测定大便出血情况。于造模第14天采用DAI评分评价疾病活动度。

具体评分标准：体质量未下降为0分，下降1％～5％为1分，下降6％～10％为2分，下降11％～15％为3分，下降＞15％为4分；大便性状正常为0分，松软为2分，腹泻为4分；大便出血阴性为0分，+为1分，++为2分，+++为3分，肉眼血便为4分。DAI＝(体质量下降分数+大便性状分数+大便隐血情况分数)/3。

结肠黏膜组织损伤评分：采用结肠黏膜损伤指数(CMDI)评价肠黏膜的损伤，评分标准为：0为无损伤；1为轻度充血，水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡；2为充血水肿，黏膜粗糙呈颗粒状，有糜烂或肠黏连；3为高度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径<1cm，肠壁增厚或表面有坏死及炎症；4为在3分基础上溃疡最大纵径>1cm，或全肠壁坏死。

结肠组织病理学检查：取出大鼠整段结肠冲洗干净，剪取病变组织约1cm，加入4％甲醛溶液固定，制作病理切片。进行HE染色，光学显微镜下观察炎症程度、病变深度、陷窝破坏程度、炎症范围，分别进行评分。炎症程度评分为：无炎症为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分。病变深度评分：无病变为0分，病变累及黏膜层为1分，累及黏膜下层为2分，累及肌层为3分，累及浆膜层为4分。隐窝破坏程度评分：无隐窝破坏为0分，基底1/3隐窝被破坏为1分，基底2/3隐窝被破坏为2分，仅有完整表面上皮为3分，全部隐窝和上皮被破坏为4分。炎症范围评分：无病变为0分，病变范围1％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，76％～100％为4分。以四项评分计算结肠组织病理学评分。

统计分析：实验数据由GraphPadPrism 7.0生物统计学软件进行统计学处理：计量资料以Mean±SD表示，采用方差分析结合Dunnett’s多重比较法；病理评分采用Kruskal-Wallis秩和检验结合Dunnett’s多重比较法。

2、结果：

2.1一般状态

如图3所示：DSS处理后，模型组动物出现明显的结肠炎症状，表现为体重明显下降，多数动物出现腹泻症状，且粪便中出血明显。与正常组相比，模型对照组动物的DAI评分明显升高(P＜0.01)。与模型对照组(3.89±0.87)相比，607组(1.56±0.25)、608组(1.22±0.21)、609组(1.43±0.27)、610组(1.19±0.28)、611组(0.97±0.18)的DAI评分明显降低，且差异有统计学意义(P＜0.01)，表明607、608、609、610、611均可改善结肠炎动物的一般症状。但607、608、609、610、611各组之间的差异则没有统计学意义(P＞0.05)，表明608、609、610、611的修饰并没有降低607(即KdPT)的活性。

2.2肠黏膜损伤

如图4所示：经DSS处理后，模型组动物的肠黏膜出现明显的损伤，表现为高度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，肠壁增厚或表面有坏死及炎症出现。与正常组相比，模型对照组动物的CMDI评分明显升高(P＜0.01)。与模型对照组(3.57±0.63)相比，607组(2.15±0.76)、608组(2.13±0.78)、609组(2.36±0.69)、610组(1.89±0.56)、611组(1.67±0.63)的CMDI评分明显降低，且差异有统计学意义(P＜0.01)，表明607、608、609、610、611均可改善结肠炎动物肠黏膜的损伤。但607、608、609、610、611各组之间的差异则没有统计学意义(P＞0.05)，表明608、609、610、611的修饰并没有降低607(即KdPT)的活性。

2.3病理评分

如图5所示：取各组受损的肠道组织，制作病理切片，进行HE染色。模型组动物炎症程度重，病变累及粘膜下层，隐窝破坏。与正常组相比，模型对照组动物的病理评分明显升高(P＜0.01)。与模型对照组(13.25±3.46)相比，607组(6.36±1.01)、608组(5.78±0.94)、609组(5.21±1.23)、610组(5.89±1.21)、611组(5.67±0.95)的病理评分明显降低，且差异有统计学意义(P＜0.01)，表明607、608、609、610、611均可改善结肠炎病理评分。但607、608、609、610、611各组之间的差异则没有统计学意义(P＞0.05)，表明608、609、610、611的修饰并没有明显降低607(即KdPT)的活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种乙酰化的三肽KdPT，其特征在于，对所述三肽KdPT的K进行乙酰化修饰，其中所述K 是赖氨酸；dP是D-脯氨酸；T是苏氨酸；所述三肽KdPT是：乙酰基-（C赖氨酸-D-脯氨酸-苏氨酸C），其中乙酰基表示对赖氨酸侧链上的氨基进行乙酰化修饰，C赖氨酸-D-脯氨酸-苏氨酸C表示三肽KdPT进行N和C末端的C-C环化。

2.如权利要求1所述乙酰化的三肽KdPT在降低三肽KdPT引湿性和/或提高KdPT稳定性中的应用，其中所述K是赖氨酸；dP是D-脯氨酸；T是苏氨酸。

3.一种降低三肽KdPT引湿性和/或提高KdPT稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括对三肽KdPT中赖氨酸的侧链氨基进行乙酰化修饰，且对三肽KdPT进行N和C末端的C-C环化。