RU2588670C2

RU2588670C2 - Nutrient medium for cultivation of corynebacteria

Info

Publication number: RU2588670C2
Application number: RU2014120590/10A
Authority: RU
Inventors: Магомед Омарович Баратов; Магомед Муртузалиевич Ахмедов
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2016-07-10
Also published as: RU2014120590A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: nutrient medium for cultivation of corynebacteria contains pancreatic sprat hydrolysate, sodium chloride, D-glucose, water blue, sodium carbonate, microbiological agar, geothermal water and sterile defibrinated human or animal blood at a given ratio of components.

EFFECT: invention allows to reduce duration of cultivation of corynebacteria and increases purity of their selection.

1 cl, ? tbl

Description

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к изолированию микроорганизмов при бактериологической диагностике инфекционных заболеваний. Как правило, выбор сред или их ингредиентов обусловлен возможностями лаборатории, нередко учитывается доступность, нежели диагностическая ценность, что в конечном итоге сказывается на качестве лабораторных исследований.The invention relates to the field of veterinary medicine and medicine, in particular to the isolation of microorganisms in the bacteriological diagnosis of infectious diseases. As a rule, the choice of media or their ingredients is determined by the capabilities of the laboratory; accessibility rather than diagnostic value is often taken into account, which ultimately affects the quality of laboratory tests.

В настоящее время в лабораторной практике для культивирования коринебактерий широко применяются питательные среды: нитритный агар по Виноградскому, среда Сотона, кровяной агар, кровяно-теллуритовый агар, среда Клауберг II, среда Бучина и т.д.At present, in laboratory practice, nutrient media are widely used for the cultivation of corynebacteria: Vinogradsky nitrite agar, Soton's medium, blood agar, blood-tellurite agar, Klauberg II medium, Buchin's medium, etc.

Накопленные научные и практические данные по лабораторному выявлению указанных таксонов не позволяют определить универсальную, простую в изготовлении, доступную и эффективную питательную среду для их культивирования, поэтому для повышения результативности приходиться пользоваться несколькими средами [5].The accumulated scientific and practical data on the laboratory identification of these taxa do not allow us to determine a universal, easy to manufacture, affordable and effective nutrient medium for their cultivation, therefore, to increase the efficiency, several media must be used [5].

Предложенный нитритный агар по Виноградскому по прописи согласно инструкций [2] с добавлением н-алканов (гексодекан C₁₆H₃₄) в количестве 2% и синтетическая среда Сотона по прописи с добавлением 2%-ной смеси углеводородов (Октан (C₁₈H₁₈), Ундекан (C₁₁H₂₄), Тетрадекан (C₁₄H₃₄), Гексадекан (C₁₆H₃₄)), имеют существенные недостатки. Углеводороды имеют разные температурные параметры кипения, в связи с чем стерилизовать в термостате их приходится по отдельности при разных температурных режимах, что создает определенные трудности при их подготовке. Кроме того, среды отличаются слабыми ростовыми свойствами.The proposed nitrite agar according to Vinogradsky according to the instructions according to the instructions [2] with the addition of n-alkanes (hexodecane C ₁₆ H ₃₄ ) in an amount of 2% and the synthetic medium of Soton according to the recipe with the addition of a 2% mixture of hydrocarbons (Octane (C ₁₈ H ₁₈ ) , Undecane (C ₁₁ H ₂₄ ), Tetradecane (C ₁₄ H ₃₄ ), Hexadecane (C ₁₆ H ₃₄ )) have significant drawbacks. Hydrocarbons have different boiling temperature parameters, and therefore they have to be individually sterilized in a thermostat at different temperature conditions, which creates certain difficulties in their preparation. In addition, the media are characterized by weak growth properties.

Кровяной агар, состоящий из расплавленного и охлажденного до 45-50°C питательного агара с добавлением 5-10% дефибринированной или цельной свежи взятой крови животного, имеет низкие ингибирующие свойства по отношению к сопутствующей микрофлоре.Blood agar, which consists of nutrient agar melted and cooled to 45-50 ° C with the addition of 5-10% defibrinated or whole freshly taken animal blood, has low inhibitory properties with respect to concomitant microflora.

Указанные недостатки относятся и к кровяно-теллуритовому агару, отличающееся от кровяного агара наличием 2 мл 2% раствора теллурита калия (K₂T_eO₃).These drawbacks also apply to the blood-telluritovomu agar, blood agar characterized by the presence of 2 ml of 2% solution of potassium tellurite (K ₂ T _e O _3).

Среда Клауберг II отличается сложностью в изготовлении и непрактичностью. К 100 мл 3% расплавленного питательного агара добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Химически чистый глицерин, требуемый для приготовления глицериновой смеси, необходимо стерилизовать при 110°C в течение 30 мин.The Klauberg II environment is difficult to manufacture and impractical. To 100 ml of 3% molten nutrient agar add 3 ml of a 2% solution of potassium tellurite, 10 ml of glycerin mixture and 50 ml of varnish blood. The chemically pure glycerin required to prepare the glycerin mixture must be sterilized at 110 ° C for 30 minutes.

Изготовление среды осложняется еще и тем, что нужно предварительно приготовить лаковую кровь из дистиллированной воды и дефибринированной крови животного, что сопряжено с дополнительными расходами и временем. Видимые колонии на данной среде появляются не раньше 48 ч.The manufacture of the medium is further complicated by the fact that it is necessary to pre-prepare lacquered blood from distilled water and defibrinated blood of the animal, which is associated with additional costs and time. Visible colonies in this medium appear no earlier than 48 hours.

К недостаткам сывороточного агара, состоящего из питательной среды с 10-15% лошадиной или бычьей стерильной сывороткой, относятся низкие дифференцирующие свойства на фоне обильного роста сопутствующей микрофлоры.The disadvantages of serum agar, consisting of a nutrient medium with 10-15% horse or bovine sterile serum, are low differentiating properties against the background of the abundant growth of concomitant microflora.

Наиболее близким к заявляемой среде является сухая хинозольная среда Бучина (производства НПО « Питательные среды) г. Махачкала [4].Closest to the claimed medium is the dry quinosol medium of Buchin (produced by the NGO "Nutrient Mediums") of Makhachkala [4].

Состав:Structure:

Панкреатический гидролизат килькиSprat pancreatic hydrolyzate 30,6 г30.6 g Натрия хлоридSodium chloride 5,0±0,05 г5.0 ± 0.05 g D-глюкозаD-glucose 15,0 г15.0 g Водный голубойWater blue 0,25 г0.25 g Натрий углекислыйSodium carbonate 0,4±0,05 г0.4 ± 0.05 g Агар микробиологическийMicrobiological agar 8,0±1,0 г8.0 ± 1.0 g pH 7,4±0,2pH 7.4 ± 0.2 Дистиллированная водаDistilled water До 1 лUp to 1 liter 5% стерильной дефибринированой крови человека или животных5% sterile defibrinated human or animal blood

К недостаткам данной среды относятся низкая высеваемость проб из объектов внешней среды (почва, корма, навоз, вода и т.д.), а также проб биоматериала (кровь, молоко, слизь и т.д.). Кроме того, среда содержит 2 вида минеральных солей, что по нашему мнению недостаточно для качественного обеспечения коринебактерий необходимыми микро- и макроэлементами [1].The disadvantages of this environment include low seed rate of samples from environmental objects (soil, feed, manure, water, etc.), as well as samples of biomaterial (blood, milk, mucus, etc.). In addition, the medium contains 2 types of mineral salts, which, in our opinion, is insufficient for the quality supply of corynebacteria with the necessary micro and macro elements [1].

Целью изобретения является повышение эффективности культивирования коринебактерий в лабораторных условиях на среде с измененным химическим составом.The aim of the invention is to increase the efficiency of cultivation of corynebacteria in the laboratory on an environment with a modified chemical composition.

Поставленная цель достигается тем, что сухая хинозольная среда Бучина, для выделения и дифференциации коринебактерий, содержащая панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид, D-глюкозу, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, дистиллированную воду и 5% стерильной дефибринированной крови человека или животных, готовится на основе геотермальной воды в качестве дополнительного источника минеральных солей, которой заменяется 100% дистиллированной воды.This goal is achieved by the fact that Buchina’s dry chinosol medium, for isolation and differentiation of corynebacteria, containing sprat pancreatic hydrolyzate, sodium chloride, D-glucose, blue water, sodium carbonate, microbiological agar, distilled water and 5% sterile defibrinated human or animal blood, It is prepared on the basis of geothermal water as an additional source of mineral salts, which is replaced by 100% distilled water.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известного заменой дистиллированной воды геотермальной и расширением солевого состава за счет большего содержания микро- и макроэлементов в геотермальной воде. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна».Comparative analysis with the prototype allows us to conclude that the claimed composition of the medium differs from the known one by the replacement of distilled water with geothermal and the expansion of salt composition due to the higher content of micro and macro elements in geothermal water. Thus, the claimed technical solution meets the criterion of "novelty."

Расширенный лабораторный анализ геотермальной воды (фотометрия, потенциометрия, атомно-абсорбционная спектрометрия, комплексометрия и тд.) показал качественное и количественное отличие данной воды от дистиллированной по микро- и макроэлементам. Суммарное значение анионов составляло - 1,6771 г/л (NH₄, Na, К, Mg, Са, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni), катионов - 3,4732 г/л (Cl, Br, I, SO₄, HCO₃, HPO₄, NO₃). Кроме того, в геотермальной воде содержится нейтральные и кислые битумы (2,5 мг/л), гумусовые вещества (7,1 мг/л) как источник углеводородов. Для углеводородокисляющих микроорганизмов, к которым относятся и коринебактерий, источник углеводородов улучшает ростовые свойства предлагаемой среды и благоприятно влияет на размножение коринебактерий [3].Advanced laboratory analysis of geothermal water (photometry, potentiometry, atomic absorption spectrometry, complexometry, etc.) showed a qualitative and quantitative difference between this water and distilled micro- and macroelements. The total value of anions was 1.6771 g / l (NH ₄ , Na, K, Mg, Ca, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni), cations - 3.4732 g / l (Cl, Br, I , SO ₄ , HCO ₃ , HPO ₄ , NO ₃ ). In addition, neutral and acidic bitumen (2.5 mg / l), humic substances (7.1 mg / l) as a source of hydrocarbons are contained in geothermal water. For hydrocarbon-oxidizing microorganisms, which include corynebacteria, the hydrocarbon source improves the growth properties of the proposed medium and favorably affects the reproduction of corynebacteria [3].

При экспериментальной проверке были испытаны среды, наиболее часто используемые для культивирования коринебактерий.During experimental testing, the media most commonly used for the cultivation of corynebacteria were tested.

Предлагаемую среду готовили следующим образом: 60 г сухой хинозольной среды Бучина (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследвоания. - М.: Медицина, 1982, с.68 :панкреатический гидролизат кильки - 30,6 г, натрия хлорид 5± 0,05 г, D-глюкоза - 15,0 г, водный голубой - 0,25 г, натрий углекислый - 0,4±0,05 г, агар микробиологический - 8,0±1,0 г (рН 7,4±0,2) (2)) растворяют в геотермальной воде, добавляют общий объем до 1 л, размешивают, доводят до кипения, кипятят в течение 2 мин до полного растворения агара и образования крупнопузырчатой быстро оседающей пены. После охлаждения до 50°C добавляют к объему 5% стерильной дефибринированной крови человека или животного. Тщательно размешивают, не допуская образование пены, разливают в чашки Петри. После застывания среду слегка подсушивают в термостате при температуре (37±1)°C в течение 40-60 мин. Цвет готовой среды темно-синий. Хранят среду в холодильнике, используют в течение 3-4 суток. Рост культуры наблюдают через 24-48 ч. На месте роста культуры среда окрашивается в фиолетовый цвет, а колонии в синий.The proposed medium was prepared as follows: 60 g of Buchin's dry quinosol medium (Handbook of microbiological and virological research methods. - M .: Medicine, 1982, p. 68: sprat pancreatic hydrolyzate - 30.6 g, sodium chloride 5 ± 0.05 g D-glucose - 15.0 g, water blue - 0.25 g, sodium carbonate - 0.4 ± 0.05 g, microbiological agar - 8.0 ± 1.0 g (pH 7.4 ± 0.2 ) (2)) is dissolved in geothermal water, the total volume is added to 1 liter, stirred, brought to a boil, boiled for 2 minutes until the agar is completely dissolved and coarse bubble is formed rapidly settling th foam. After cooling to 50 ° C, 5% sterile defibrinated human or animal blood is added to the volume. Stir thoroughly, avoiding the formation of foam, pour into Petri dishes. After solidification, the medium is slightly dried in a thermostat at a temperature of (37 ± 1) ° C for 40-60 minutes. The color of the finished medium is dark blue. Store the medium in the refrigerator, use within 3-4 days. Culture growth is observed after 24-48 hours. At the site of culture growth, the medium turns purple and the colonies blue.

Остальные среды готовили по прописи авторов [2].The rest of the medium was prepared according to the authors' recipe [2].

Оценку сред проводили посевом тест-штаммов и свежевыделенных культур коринебактерий. В качестве музейного штамма использовали Corynebacterium xerosis N1911, Corynebacterium ulcerans N675, а нативным материалом служили лабораторные штаммы, выделенные из объектов внешней среды (почва, корма, навоз и кровь крупного рогатого скота).Assessment of the media was carried out by seeding test strains and freshly isolated cultures of corynebacteria. Corynebacterium xerosis N1911, Corynebacterium ulcerans N675 were used as a museum strain, and laboratory strains isolated from environmental objects (soil, feed, manure, and cattle blood) were used as native material.

Культуру каждого штамма высевали в 5 чашках Петри (колбы) каждой среды. Для соблюдения равнозначности опыта материал высевали равными дозами (500 клеток в 0,1 мл). При учете результатов провели сравнительный анализ эффективности сред изучаемых образцов с предлагаемым по скорости и интенсивности роста, по величине колоний и ингибирующим к сопутствующей микрофлоре свойствам. Результаты учитывали через 24 и 48 ч. Опыты повторялись двукратно. Результаты лабораторных исследований приведены в таблице.The culture of each strain was seeded in 5 Petri dishes (flasks) of each medium. To maintain the equivalence of the experiment, the material was seeded in equal doses (500 cells in 0.1 ml). When taking into account the results, we conducted a comparative analysis of the effectiveness of the media of the studied samples with the proposed growth rate and intensity, the size of the colonies and the properties inhibiting to the accompanying microflora. The results were taken into account after 24 and 48 hours. The experiments were repeated twice. The results of laboratory tests are shown in the table.

СредыWednesday Показатель прорастания колоний в (++++)Colony germination rate in (++++) Величина колоний в мм через 48 чThe size of the colonies in mm after 48 hours 24 ч24 h 48 ч48 h Тест-штаммыTest strains Нативный материалNative material Тест-штаммыTest strains Нативный материалNative material 1. Нитритный агар1. Nitrite agar -- -- ++ ++ 1,6-1,91.6-1.9 2. Среда Сотона2. Wednesday Sotona -- -- ++ ++ 2,1-2,32.1-2.3 3. Клауберг II3. Clauberg II -- ++ ++ ++++ 1,0-2,41.0-2.4 4. Кровяной агар4. Blood agar ++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ 1,5-2,51.5-2.5 5. Кровяной-теллуритовый агар5. Blood-tellurite agar ++++++ ++++++ ++++++++ ++++++++ 2,2-3,42.2-3.4 6. Сывороточный агар6. Serum Agar ++++++ ++++++ ++++++++ ++++++++ 2,1-3,02.1-3.0 7. Среда Бунина7. Wednesday Bunin ++ ++++ ++++ ++++++ 2,5-3,32.5-3.3 8. Предлагаемая среда8. Suggested environment ++++++ ++++ ++++++ ++++++ 2,7-3,52.7-3.5 Примечание:Note: ++++++++ - Сплошной рост. Колоний не поддаются подсчету- Solid growth. Colonies are not countable ++++++ - Обильный рост (от 20 до 46 колоний)- Abundant growth (from 20 to 46 colonies) ++++ - Умеренный рост (от 12 до 23 колоний)- Moderate growth (from 12 to 23 colonies) ++ - Скудный рост(от 2 до 6 колоний)- Poor growth (from 2 to 6 colonies)

Рост колоний на среде Бучина формировался на первые сутки от 2 до 6 колоний с тест-штаммами и умеренным ростом с нативным материалом от 12 до 23 колоний. На вторые сутки количество колоний в чашках с наливным материалом увеличилось от 20 до 46 колоний.Colony growth on Buchin's medium was formed on the first day from 2 to 6 colonies with test strains and moderate growth with native material from 12 to 23 colonies. On the second day, the number of colonies in cups with bulk material increased from 20 to 46 colonies.

По ростовым свойствам кровяной и кровяно-теллуритовые агары не уступают среде Бучина, но рост колоний формировался на фоне низких ингибирующих свойств по отношению к сопутствующей микрофлоре.By the growth properties, blood and blood-tellurite agars are not inferior to Buchin's medium, but the growth of the colonies was formed against the background of low inhibitory properties with respect to the concomitant microflora.

Низкими дифференцирующими свойствами обладает и сывороточный агар, где обнаружили обильный рост сопутствующей микрофлоры на вторые сутки.Serum agar also possesses low differentiating properties, where they found an abundant growth of concomitant microflora on the second day.

Эффективность Нитритного агара и среды Сотона была самой низкой. Слегка заметное однородное помутнение обнаружили на средах через 48 ч.The effectiveness of Nitrite agar and Soton medium was the lowest. Slightly noticeable uniform turbidity was found on the media after 48 hours.

Предлагаемая среда показала высокие дифференцирующие и ингибирующие свойства. Колонии появились на 1 сутки в количестве от 20 до 46 в чашках с тест штаммами и до 23 колонии с нативным материалом. На 2 сутки картина практически не изменилась, что является показателем высокой ингибирующей активности. Рост отличался не только числом, но и характером и размером колоний.The proposed medium showed high differentiating and inhibitory properties. Colonies appeared on 1 day in an amount of from 20 to 46 in plates with test strains and up to 23 colonies with native material. On day 2, the picture practically did not change, which is an indicator of high inhibitory activity. Growth differed not only in number, but also in the nature and size of the colonies.

Таким образом, проведенные исследования показали, что среда, приготовленная на основе геотермальной воды, приводит к ускоренному росту коринебактерий на фоне высокой активности ингибирующей постороннюю микрофлору свойств, что в конечном итоге показывает значительную эффективность. Кроме того, на изготовление среды не требуется ощутимых материальных затрат, так как геотермальная вода в условиях Дагестана доступна для любой бактериологической лаборатории.Thus, the studies showed that the medium prepared on the basis of geothermal water leads to an accelerated growth of corynebacteria against the background of high activity of properties inhibiting extraneous microflora, which ultimately shows significant efficiency. In addition, the production of the medium does not require tangible material costs, since geothermal water in Dagestan is available for any bacteriological laboratory.

Список литературыBibliography

1. Баратов М.О., Ахмедов М.М, Сакидибиров О.П. Сравнительное изучение наиболее часто используемых сред для выделения коринебактерий. // Мат. Всероссийской научно-практической конференций «Повышение продуктивности с/х. животных и птицы на основе инновационных достижений)). - Новочеркасск, 2009 г.1. Baratov M.O., Akhmedov M.M., Sakidibirov O.P. A comparative study of the most commonly used media for the isolation of corynebacteria. // Mat. All-Russian scientific-practical conferences “Improving agricultural productivity. animals and birds based on innovative achievements)). - Novocherkassk, 2009

2. Биргер М.О., Ведьмина Е.А, Влодавец В.В. и др. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. // М.: Медицина, 1982, с. 68.2. Birger M.O., Witch E.A., Wlodavets V.V. et al. Handbook of microbiological and virological research methods. // M .: Medicine, 1982, p. 68.

3. Высоцкий В.В., Мазурова И.К., Шмелева Е.А Сравнительное электронно-микроскопическое изучение 8 представителей рода Corynebacterium, выращенных на твердой питательной среде в стационарной фазе развития. //Микробиология. 1976, №7. С. 121-125.3. Vysotsky VV, Mazurova IK, Shmeleva EA. Comparative electron microscopic study of 8 representatives of the genus Corynebacterium grown on solid nutrient medium in a stationary phase of development. //Microbiology. 1976, No. 7. S. 121-125.

4. Меджидов М.М. и др. Сухие микробиологические питательные среды. // Каталог. Махачкала-1998 г.4. Mejidov M.M. and other Dry microbiological culture media. // Directory. Makhachkala-1998

5. Шапелева Р.Г., Андреева З.М, Сокольникова Г.П. и др. Сравнительное изучение питательных сред для выделения коринебактерий. //Журнал микробиология, 1989. №5. С. 62-64.5. Shapeleva R.G., Andreeva Z.M., Sokolnikova G.P. et al. Comparative study of culture media for the isolation of corynebacteria. // Journal of Microbiology, 1989. No. 5. S. 62-64.

Claims

Culture medium for the cultivation of corynebacteria, containing sprat pancreatic hydrolyzate, sodium chloride, D-glucose, blue water, sodium carbonate, microbiological agar, water and 5% sterile defibrinated human or animal blood, characterized in that it is water and an additional source of mineral salts contains geothermal water in the following quantities, g / l:
Sprat pancreatic hydrolyzate 30.6 Sodium chloride 5.0 ± 0.05 D-glucose 15.0 Water blue 0.25 Sodium carbonate 0.4 ± 0.05 Microbiological agar 8.0 ± 1.0 _P H 7.4 ± 0.2 Geothermal water up to 1 l 5% sterile defibrinated human or animal blood