RU2557290C2

RU2557290C2 - Новые агонисты npr-b

Info

Publication number: RU2557290C2
Application number: RU2012116531/04A
Authority: RU
Inventors: Франк ОСТЕРКАМП; Хайко ХАВЛИШ; Герд ХУММЕЛЬ; Тобиас КНАУТЕ; Ульф РАЙМЕР; Ульрих РАЙНЕКЕ; Уве РИХТЕР; Бернадетт ЗИМОН; Эдгар ШПЕКЕР; Маркус ВОЙШНИК; Марк Р. ХЕЛЛБЕРГ
Original assignee: Шайр Орфан Терапис ГмбХ
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2010-09-23
Publication date: 2015-07-20
Also published as: JP5893561B2; ZA201201630B; KR20120091110A; US8546523B2; RU2012116531A; MX2012003398A; US20170313743A1; UY32902A; CN102548574A; JP2013505937A; US20130345394A1; MX370645B; TW201630619A; US9169293B2; TWI625126B; BR112012006579A2; US10196423B2; EP2480247A4; US20110077381A1; JP2017137362A

Abstract

Изобретение относится к новым пептидам, их фармацевтическим композициям и применению в способе снижения внутриглазного давления и способе лечения или профилактики офтальмологических заболеваний, опосредованных натрийуретическими пептидами или белками. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

Description

ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ

По настоящей заявке испрашивается на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным номером 61/245960, поданной 25 сентября 2009 г.

1. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение, главным образом, относится к новым соединениям, которые применимы для лечения и профилактики нарушений, опосредованных натрийуретическими пептидами или белками. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым пептидам, фармацевтическим композициям, содержащим один или несколько новых пептидов, описанных в настоящей публикации, и к их применению в способах лечения или профилактики глазных болезней, таких как глаукома, гипертензия глаза и оптические нейропатии, сердечнососудистое заболевание, болезнь почек, заболевание легких и другие нарушения, опосредованные натрийуретическими пептидами или белками.

2. ОПИСАНИЕ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Натрийуретические пептиды (NP) образуют семейство циклических пептидных гормонов, которые впервые были описаны в связи с их участием в регуляции натрийуреза, диуреза и регуляции кровяного давления. К настоящему времени открыты четыре натрийуретических пептида у человека, т.е. атриальный натрийуретический пептид (ANP; SEQ ID NO: 1), натрийуретический пептид B-типа или натрийуретический пептид головного мозга (BNP; SEQ ID NO: 2), натрийуретический пептид C-типа (CNP; SEQ ID NO: 3) и уродилатин (SEQ ID NO: 4) (смотри фиг. 1; и Cho et al., 1999, Heart Dis. 1: 305-328). Все NP синтезируются в виде препрогормонов, которые активируются протеолитическим расщеплением перед их высвобождением в кровоток. NP связываются с рецепторами натрийуретических пептидов (NPR), группой из 3 разных связанных с мембранами рецепторов с гуанилилциклазной активностью (Pandey 2005, Peptides 26: 901-932).

ANP впервые открыт в качестве фактора, снижающего кровяное давление, в гомогенатах предсердий крыс в 1981 году (de Bold 1981, Life Sci. 28: 89-94). Пре-про-ANP человека (SEQ ID NO: 5) содержит 151 аминокислоту и сохраняется после отщепления N-конца в виде состоящего из 126 аминокислот про-ANP (SEQ ID NO: 6), преимущественно в предсердных гранулах. Растяжение сердца вследствие общей объемной перегрузки индуцирует быстрое высвобождение ANP из мест хранения. После секреции в кровяное русло C-концевая часть про-ANP отщепляется атриальной пептидазой с образованием биологически активной состоящей из 28 аминокислот форме ANP (SEQ ID NO: 1) (Yan 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 8525-8529). Оставшаяся N-концевая часть может быть дополнительно расщеплена на 3 разных гормона, т.е. длительно действующий натрийуретический пептид (LANP, аминокислоты 1-30; SEQ ID NO: 7), сосудорасширяющий пептид (VSDL, аминокислоты 31-67; SEQ ID NO: 8) и калийуретический пептид (KP, аминокислоты 79-98; SEQ ID NO: 9) (Vesely 2004, Eur. J. Clin. Invest. 34: 674-682).

После открытия BNP в головном мозге свиней в качестве фактора, который проявляет активность, расслабляющую гладкую мускулатуру (Sudoh T., 1988, Nature 332: 78), намного более высокую тканевую экспрессию обнаружили в препаратах желудочков сердца (Mukoyama 1991, J. Clin. Invest. 87: 1402-1412), что привело к заключению о том, что BNP, подобно ANP, является пептидным гормоном сердца. Хотя BNP можно обнаружить в запасных гранулах в предсердиях, экспрессия в желудочках подвергается транскрипционной регуляции (Tamura 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 4239-4244). Синтез пре-про-BNP индуцируется растяжением стенки сердца и приводит к образованию пептида длиной 134 аминокислоты (SEQ ID NO: 10), который затем расщепляется неизвестной протеазой, образуя про-BNP длиной 108 аминокислот (SEQ ID NO: 11). Дополнительное расщепление высвобождает активный 32-аминокислотный C-концевой фрагмент BNP (SEQ ID NO:2) и неактивный 76-аминокислотный N-концевой фрагмент, также называемый NT-pro-BNP (SEQ ID NO: 12). До настоящего времени не обнаружено известных вариантов сплайсинга BNP человека.

CNP был выделен из головного мозга свиньи почти через 10 лет после открытия ANP (Sudoh 1990, Biochem Biophys Res Comm. 168: 863-870). Он экспрессируется, главным образом, в центральной нервной системе и эндотелиальных клетках. В отличие от других NP CNP почти не присутствует в ткани сердца, что дополнительно свидетельствует о паракринной функции в отношении тонуса сосудов и роста мышечных клеток. Состоящая из 126-аминокислот молекула предшественника pro-CNP (SEQ ID NO: 13) процессируется внутриклеточной эндопептидазой до зрелого состоящего из 53 аминокислот пептида CNP-53 (SEQ ID NO: 14), который является наиболее распространенной формой в головном мозге (Totsune 1994, Peptides 15: 37-40), эндотелиальных клетках (Stingo, 1992, Am. J. Phys. 263: H1318-H1321) и сердце (Minamino 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 535-542). И в спинномозговой жидкости (Togashi 1992, Clin. Chem. 38: 2136-2139) и в плазме крови человека (Stingo 1992, Am. J. Phys. 263: H1318-H1321) наиболее распространенной формой является CNP-22 (SEQ ID NO: 3), который образуется из CNP-53 под действием неизвестной внеклеточной протеазы. В отличие от других NP в CNP-22 отсутствует C-концевое удлинение 17-аминокислотного цикла (смотри фиг. 1).

ANP (SEQ ID NO: 1), BNP (SEQ ID NO: 2) и CNP (SEQ ID NO: 3) имеют высоко консервативные аминокислотные последовательности у разных видов позвоночных (смотри фиг. 1; и Cho 1999, Heart Dis. 1: 305-328). NP инактивируются двумя разными механизмами, т.е. ферментативным расщеплением посредством нейтральных эндопептидаз и связыванием с рецептором, ответственными за клиренс NP (NPR-C; SEQ ID NO: 15), с последующей интернализацией и внутриклеточным распадом NP (Stoupakis 2003, Heart Dis. 5: 215-223).

После открытия натрийуретических пептидов ANP, BNP и CNP были описаны и клонированы их специфичные рецепторы, рецепторы натрийуретических пептидов -A, -B и -C (NPR-A, -B, -C) (Fuller 1988, J. Biol. Chem. 263: 9395-9401; Chang 1989 Nature 341: 68-72; Chinkers 1989, Nature 338: 78-83). NPR-A (SEQ ID NO: 16) предпочтительно связывает ANP и BNP, в то время как NPR-B (SEQ ID NO: 17) наиболее специфичен для CNP, и NPR-C (SEQ ID NO: 15) связывает все натрийуретические пептиды (Koller 1991, Science 252: 120-123).

Первичные структуры NPR-A и NPR-B содержат внеклеточный связывающий лиганд домен, трансмембранный домен, внутриклеточный домен, гомологичный киназе, содержащий сайты фосфорилирования, и C-концевой гуанилатциклазный домен (обзор в публикации Misono 2005, Peptides 26: 957-68). Последний домен позволяет классифицировать NPR-A и NPR-B в качестве гуанилатциклаз фракции частиц, также известных как GC-A и GC-B (E.C.4.6.1.2). Напротив, в NPR-C отсутствуют внутриклеточные домены гомологии, но появляется все больше доказательств роли NPR-C не только в качестве скавенджер-рецептора для натрийуретических пептидов, но для функционального связывания с ингибирующими G-белками и фосфоинозитидного обмена (Maack 1987, Science 238: 675-678; Murthy and Makhlouf 1999, J. Biol. Chem. 274: 17587-17592; Anand-Srivastava 2005, Peptides 26: 1044-1059). Отражая степень гомологии последовательностей натрийуретических пептидов, рецепторы натрийуретических пептидов проявляют высокую степень гомологии по своим внеклеточным связывающим лиганды доменам, при этом согласно расчетам сходство между NPR-A и NPR-B составляет 41% и сходство между NPR-A и NPR-C составляет 29% (van den Akker 2001, J. Mol. Biol. 311: 923-937).

Связывание лигандов с NPR требует наличия димера гликозилированных субъединиц рецептора (Fenrick et al. 1994, Mol. Cell. Biochem. 137: 173-182; Kuhn 2003, Circ. Res. 93: 700-709), и после связывания происходит конформационное изменение, приводящее к активации гуанилатциклазных доменов. Затем активность гуанилатциклаз фракции частиц регулируется фосфорилированием (смотри обзор в публикации Kuhn 2003, Circ. Res. 93: 700-709). Фосфорилирование NPR является максимальным в основном состоянии, тогда как после связывания лиганда следует дефосфорилирование и последующая десенсибилизация рецептора.

Натрийуретические рецепторы экспрессируются во многих тканях организма. NPR-A, NPR-B и NPR-C присутствуют в сердечнососудистой системе и почках, при этом NPR-C является наиболее распространенным подтипом рецепторов, на долю которого приходится 80% экспрессии NPR в некоторых тканях. NPR-B присутствует на особенно высоком уровне в эпифизе, семенниках и яичниках крыс. Лиганды NPR-A и NPR-B индуцируют независимое от эндотелия расширение сосудов, при этом ANP и BNP, главным образом, действуют на артериальные сосуды. Напротив, мишень CNP, главным образом, является венозная система, за исключением коронарных артерий, расслабление которых наступает в ответ на введение CNP (Marton et al. 2005, Vascul. Pharmacol. 43: 207-212). Важно, что индукция гипотензии посредством активации NPR-B требует в 10 раз более высоких концентраций лиганда по сравнению со снижением кровяного давления в ответ на активацию NPR-A (Wei et al. 1993, Am. J. Physiol. 264: H71-H73; Woods and Jones 1999, Am. J. Physiol. 276: R1443-R1452). Расслабление гладкой мускулатуры посредством активации NPR-B была обнаружена в различных тканях, включая кровеносные сосуды, семенные канальцы и матку. Также сокращение ткани трабекулярной сети глаза уменьшается при активации рецепторов натрийуретических пептидов, что подтверждает функциональное сходство трабекулярной сети и гладкомышечных клеток (Stumpff and Wiederholt 2000, Ophthalmologica 214: 33-53).

Другим основным органом-мишенью для натрийуретических пептидов является почка. Лиганды NPR-A индуцируют натрийурез и диурез посредством двойного механизма (обзор в Beltowski and Wojcicka 2002, Med. Sci. Monit. 8: RA39-RA52): (1) повышенной экскреции натрия благодаря сниженному обратному захвату ионов натрия в дистальных канальцах, впоследствии также приводящему к удерживанию большего количества воды в конечной моче; и (2) расширения подводящих и сопутствующего сужения отводящих клубочковых капилляров, увеличивающего скорость гломерулярной фильтрации за счет снижения перфузии почек (Endlich and Steinhausen 1997, Kidney Int. 52: 202-207). В отличие от NPR-A-специфичных лигандов NPR-B-специфичные лиганды не индуцируют значимого натрийуреза и диуреза и, кроме того, проявляют специфичность в отношении регуляции потока в клубочках: показано, что CNP расширяет как подводящие, так и отводящие капилляры в клубочках, таким образом увеличивая поток крови в почках, но не гломерулярную фильтрацию (Endlich and Steinhausen 1997, Kidney Int. 52: 202-207).

Кроме влияния активации NP-рецепторов (NPR) на кровяное давление и функцию почек, сильное влияние натрийуретических пептидов на процессы пролиферации в различных типах клеток документально подтверждено в литературе. Антипролиферативные свойства активации NPR документально доказаны для гладкомышечных клеток сосудов, фибробластов различного происхождения, мезангиальных клеток, злокачественных клеток и хондроцитов (обзор в публикации Schulz 2005, Peptides 26: 1024-1034). По меньшей мере, в случае VSMC доказательство участия фактора транскрипции GAX в регуляции пролиферации показало, какие внутриклеточные механизмы могут быть вовлечены в регуляцию роста посредством NPR (Yamashita et al. 1997, Hypertension 29: 381-387). Несмотря на то, что рост ткани, главным образом, регулируется пролиферативной активностью, для некоторых органов характерно варьирование размера клеток, влияющее на массу ткани. Это может быть физиологическим процессом, как во время эндохондриального окостенения, когда хондроциты созревают, подвергаясь гипертрофии, или патологическим явлением, как случае гипертрофии сердца, которое часто предшествует хронической сердечной недостаточности. Оба указанных выше явления гипертрофии регулируются NPR-B. Недостаточность NPR-B вызывает карликовость вследствие аномального эндохондриального окостенения, характеризуемого уменьшением размера зоны гипертрофии эпифизарной пластинки роста (Bartels et al. 2004, Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34; Tamura et al. 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 17300-17305).

Наоборот, частичный нокаут NPR-B у крыс стимулировал гипертрофию сердца, т.е. гипертрофию кардиомиоцитов (Langenickel et al. 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. 103: 4735-4740).

Натрийуретические пептиды, обладающие активностью по отношению к натрийуретическим рецепторам, позднее также были обнаружены в различных тканях. Например, ANP открыт в начале 1980-х годов в качестве эндогенного диуретического и сосудорасширяющего пептида, основная циркулирующая форма которого состоит из 28 аминокислот (SEQ ID NO: l). Затем были открыты другие натрийуретические пептиды, такие как BNP (SEQ ID NO: 2) и CNP (SEQ ID NO: 3). Показано присутствие натрийуретических пептидов и их рецепторов в тканях глаза, особенно в тканях, вовлеченных в регуляцию внутриглазного давления (ВГД). Например, в глазах крыс и кроликов обнаружены мРНК ANP, BNP и CNP, а также NPR-A, NPR-B и NPR-C в цилиарных отростках, сетчатке и сосудистой оболочке (Mittag et al. 1987, Curr. Eye Res. 6: 1189-1196; Nathanson 1987, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28: 1357-1364; Fernandez-Durango et al. 1995, Exp. Eye Res. 61: 723-729). Сходные результаты получены в случае цилиарных отростков быка и культивируемых цилиарных эпителиальных клеток быка. (Millar et al. 1997, J. Ocul. Pharmacol. Ther. 13: 1-11; Shahidullah and Wilson 1999, Br. J. Pharmacol. 127: 1438-1446). Присутствие пептидов и их рецепторов в цилиарном эпителии свидетельствует о том, что они могут играть роль в образовании водянистой влаги.

Кроме цилиарных отростков рецепторы натрийуретических пептидов также были обнаружены в тканях, ассоциированных с вытеканием водянистой влаги. Сайты связывания ANP были локализованы в продольных волокнах цилиарной мышцы морской свинки. (Mantyh et al. 1986, Hypertension. 8: 712-721). В культивируемых TM и цилиарных мышечных клетках человека CNP является наиболее сильным и эффективным в отношении стимуляции продукции циклического ГМФ, что свидетельствует о присутствии функционального NPR-B. Активация такого рецептора снижает индуцируемый карбахолом приток кальция. (Pang et al. 1996, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37: 1724-1731). Такой результат предполагает, что активация NPR-B должна вызывать расслабление таких тканей. Действительно, CNP значимо снижает индуцируемое карбахолом сокращение цилиарных мышц обезьян и человека (Ding and Abdel-Latif, 1997, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38: 2629-2638). Изменение сократительной способности TM и цилиарной мышцы может влиять на возможность вытекания водянистой влаги.

Показано, что циклический ГМФ и соединения, которые повышают уровень циклического ГМФ в тканях глаза, такие как доноры окиси азота, снижают ВГД (Nathanson 1988, Eur. J. Pharmacol. 147: 155-156; Becker 1990, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31: 1647-1649; Nathanson 1992, J. Pharmacol. Exp. Ther. 260: 956-965; Stein and Clack 1994, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 2765-2768). Так как натрийуретические пептиды значительно увеличивают продукцию циклического ГМФ, было выдвинуто предположение, что они также снижают ВГД. За последние 20 лет было показано, что натрийуретические пептиды являются высоко эффективными в качестве средств, снижающих ВГД. Например, разные исследователи независимо показали, что интравитреальная инъекция ANP у кроликов последовательно и значимо снижает ВГД. Такой эффект длится в течение многих часов. (Sugrue and Viader, 1986, Eur J Pharmacol. 130: 349-350; Mittag et al. 1987, Сиrr Eye Res. 6: 1189-1196; Nathanson 1987 Invest Ophthalmol Vis Sei. 28: 1357-1364; Korenfeld and Becker 1989, Invest Ophthalmol Vis Sei. 30: 2385-2392; Takashima et al. 1996, Invest Ophthalmol Vis Sei. 37: 2671-2677). Влияние ANP на ВГД коррелирует с увеличением продукции циклического ГМФ в радужной оболочке-цилиарном теле (Korenfeld and Becker 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 2385-2392). Интравитреальная инъекция BNP (Takashima et al. 1996, Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2671-2677) или CNP (Takashima et al. 1998, Exp. Eye Res. 66: 89-96) также высоко эффективна в снижении ВГД. Показано, что кроме интравитреальной инъекции субконъюнктивальная (Yang et al. 1997, Chin. J. Ophthalmol. 33: 149-151) или внутрикамерная (Sugrue and Viader 1986, Eur. J. Pharmacol. 130: 349-350; Fernandez-Durango et al. 1999, Eur. J. Pharmacol. 364: 107-113) инъекция натрийуретических пептидов также снижает глазное давление. Системное введение ANP кролику (Tsukahara et al. 1988, Ophthalmologica 197: 104-109) или человеку (Diestelhorst and Krieglstein 1989, Int. Ophthalmol. 13: 99-101) также снижает ВГД. К сожалению, невозможно было доставить такие пептиды местно из-за их неспособности проникать в роговицу. Таким образом, такие сильные и эффективные соединения, снижающие ВГД, не были разработаны для такого применения.

Существует потребность в новых агонистах NPR-B, обладающих улучшенной биодоступностью по сравнению с выделенными или синтезированными натрийуретическими пептидами, которые можно применять для лечения опосредованных натрийуретическими пептидами нарушений, таких как глазные нарушения, связанные с диабетом нарушения, сосудистые нарушения, сердечные и сердечнососудистые патологии, воспаление и другие нарушения, описанные в настоящей публикации. Новые агонисты NPR-B, композиции и способы согласно настоящему изобретению удовлетворяют такую потребность.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым агонистам NPR-B, также называемым в настоящем описании миметиками или соединениями, подобными натрийуретическим пептидам, которые терапевтически применимы для снижения внутриглазного давления (ВГД) и лечения других нарушений, при которых активация рецептора натрийуретического пептида типа B может быть полезной. В частности, изобретение относится к новым агонистам NPR-B, которые активируют рецептор натрийуретического пептида типа B (NPR-B). Изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим такие новые агонисты NPR-B. Композиции, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой офтальмологические композиции для применения в способах лечения или профилактики конкретных глазных болезней, таких как глаукома, предпочтительно благодаря снижению внутриглазного давления, с использованием таких новых агонистов NPR-B. Альтернативно композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять в способах лечения или профилактики сердечнососудистых нарушений, заболевания почек, заболевания легких, нарушений скелета, бесплодия и других нарушений, опосредованных натрийуретическими пептидами или белками.

Изобретение отчасти основано на данных, полученных авторами изобретения, о том, что новые агонисты NPR-B, описанные в настоящей публикации, могут обеспечивать улучшенную биодоступность, повышенную химическую стабильность и повышенную метаболическую стабильность в жидкостях или тканях организма благодаря их значительно уменьшенному молекулярному размеру по сравнению с известными натрийуретическими пептидами. Некоторые варианты настоящей заявки, главным образом, относятся к новым пептидам, содержащим модифицированные аминокислоты, которые связываются и активируют NPR-B с высокой специфичностью, которые более подробно описаны в настоящей публикации.

В частности, предполагается, что любое ограничение, обсуждаемое в связи с одним вариантом осуществления изобретения, можно применить к любому другому варианту осуществления изобретения. Кроме того, любую композицию согласно изобретению можно применять в любом способе согласно изобретению, и любой способ согласно изобретению можно применять для получения или применения любой композиции согласно изобретению.

В используемом в настоящем описании смысле термин «агонист NPR-B» относится к новым молекулам, описанным в настоящей публикации, которые активируют NPR-B с высокой эффективностью.

Термин «или» в формуле изобретения используют для обозначения «и/или», если ясно не указано, что он относится только к альтернативным вариантам или альтернативный вариант взаимно исключен, хотя описание поддерживает определение, которое относится к отдельным альтернативам и «и/или».

На протяжении настоящего описания термин «примерно» используют для указания того, что значение включает стандартное отклонение ошибки для устройства и/или способа, используемого для определения значения.

В используемом в настоящем описании смысле форма единственного числа может означать один или несколько, если ясно не указано иное. В используемом в формуле изобретения смысле в случае сочетания со словом «содержащий» слова в единственном числе могут означать один или больше чем один. В используемом в настоящем описании смысле «другой» может означать, по меньшей мере, второй или больше.

Другие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут понятны из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и представляют предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, так как различные изменения и модификации, не отходящие от сути и не выходящие за рамки объема изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области на основании подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Следующие фигуры образуют часть настоящего описания и включены для того, чтобы дополнительно продемонстрировать некоторые аспекты настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять при обращении в одному или нескольким таким чертежам в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов, приведенном в настоящей публикации.

Фиг. 1. Иллюстрирует аминокислотную последовательность ANP (SEQ ID NO: 1), BNP (SEQ ID NO: 2) и CNP (SEQ ID NO: 3).

Фиг. 2. Иллюстрирует влияние CNP, ANP, BNP и мини-ANP (SEQ ID NO: 18) на продукцию циклического ГМФ в клетках GTM-3. Показано, что клетки GTM-3 экспрессируют NPR-B (Pang et al. 1996, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37: 1724-1731). Клетки обрабатывали CNP (треугольники), ANP (квадраты), BNP (ромбы) и мини-ANP (кружки). Символы представляют средние значения и стандартные отклонения. Самая высокая концентрация используемых соединений составляла 45 мкМ в случае ANP, BNP и мини-ANP и 5 мкМ в случае CNP. Значения EC₅₀ определяли, используя логистическое уравнение с 4 параметрами. EC₅₀ CNP=38,8 нМ, EC₅₀ ANP=1,63 мкМ, EC₅₀ BNP=1,18 мкМ, EC₅₀ мини-ANP>45 мкМ. Emax (максимальную активацию) каждого соединения определяли относительно максимальной активации CNP, т.е. Emax CNP=100%, Emax ANP=15%, Emax BNP=20% и Emax мини-ANP=0%.

Фиг. 3. Иллюстрирует влияние CNP, ANP, BNP и мини-ANP на продукцию циклического ГМФ в трансфицированных NPR-A-клетках 293-T. Трансфицированные NPR-A клетки 293-T обрабатывали CNP (треугольники), ANP (квадраты), BNP (ромбы) и мини-ANP (кружки). Символы представляют средние значения и стандартные отклонения. EC₅₀ определяли, используя логистическое уравнение с 4 параметрами. EC₅₀ ANP=73,0 нМ, EC₅₀ CNP=1,60 мкМ, EC₅₀ BNP=1,85 мкМ, EC₅₀ мини-ANP=1,54 мкМ.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ

Настоящее изобретение отчасти основано на обнаружении того, что новые агонисты NPR-B, имеющие улучшенную биодоступность по сравнению с известными натрийуретическими пептидами, применимы для снижения повышенного внутриглазного давления и лечения глаукомы. Таким образом, настоящее изобретение, главным образом, относится к новым агонистам NPR-B и их применению в способах лечения или профилактики нарушений, опосредованных натрийуретическими пептидами или белками. В одном особенно предпочтительном варианте новые агонисты NPR-B, описанные в настоящей публикации, готовят в виде препарата для лечения глазных болезней, таких как глаукома, предпочтительно посредством снижения повышенного внутриглазного давления, часто ассоциированного с глаукомой, с использованием фармацевтической композиции, которая содержит один или несколько новых агонистов NPR-B, которые описаны в настоящей публикации. В других предпочтительных вариантах новые агонисты NPR-B, описанные в настоящей публикации, готовят в виде препарата для лечения других опосредуемых натрийуретическими пептидами или белками нарушений, таких как сердечнососудистые нарушения, нарушения почек, нарушения легких, нарушения скелета, нарушения репродуктивной функции и фиброз.

Отличительным признаком всех известных NP является состоящий из 17 аминокислот цикл, который образуется благодаря внутримолекулярному цистеиновому мостику (смотри фиг. 1). Полагают, что целостность циклической структуры NP необходима для функциональной активности, т.е. преобразованной рецептором NP продукции цГМФ. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые линейные пептиды, такие как новые пептиды, описанные в настоящей публикации, обладающие повышенной химической и метаболической стабильностью и улучшенной биодоступностью по сравнению с известными NP, применимы для лечения опосредованных натрийуретическими пептидами или белками нарушений.

A. Новые пептиды

Настоящее изобретение относится к новым агонистам NPR-B, обладающим биологической активностью, которая улучшена в некоторых аспектах по сравнению с биологической активностью известных натрийуретических пептидов. Новые пептиды согласно изобретению включают обычные и необычные аминокислоты. Обычные аминокислоты обозначают согласно их стандартным трехбуквенным кодам, которые указаны в таблице 1 ниже.

Необычные аминокислоты обозначают согласно трехбуквенному коду или используя другое сокращение, когда они присутствуют в новых агонистах NPR-B согласно изобретению. В таблице 2, ниже, приведено полное название, трехбуквенный код или сокращение и структура каждой необычной аминокислоты, встречающейся в последовательностях новых пептидов, описанных в настоящей публикации.

Таблица 2 Список сокращений необычных аминокислот и других химических структур
Название	Сокращение	Структура
(S)-2-((S)-3-амино-2,5-диоксопирролидин-1-ил)-5-гуанидинопентановая кислота	Dim-Arg
рац-2-амино-4- морфолинобутановая кислота	AR-385-017
(S)-2-амино-3-(2H- тетразол-5-ил)пропановая кислота	AR-314-145
рац(1S,2S)-2- (октилкарбамоил) циклогексанкарбоновая кислота	AR-314-171
рац(1S,2S)-2- (гексилкарбамоил) циклогексанкарбоновая кислота	AR-314-170
рац(1R,2S)-2- октилкарбамоил) циклогексанкарбоновая	AR-314-169

кислота
(S)-2-(6-октанамидо-1-оксоизоиндолин-2-ил)-3-фенилпропановая кислота	AR-385-008
(S)-2-(4-октанамидо-1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-3-фенилпропановая кислота	AR-314-172
(S)-2-(5-октанамидо-1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-3-фенилпропановая кислота	AR-385-042
(S,S)-2-(3-метил-3-октаноиламино-2-оксопирролидин-1-ил)-3-фенилпропионовая кислота	AR-314-102
2-(7-октаноил-1-оксо-2,7-диазаспиро [4.5]дец-2-ил)-3-фенилпропионовая кислота	AR-314-087
1-(3-метилбутил) пиперазин	AR-201-124
циклогептилпирролидин-2-илметиламин	ES-283-049

(S)-аминотиофен-2-илуксусная кислота	BB727
(R)-аминотиофен-2-илуксусная кислота	BB726
2-октилсульфанил-пропионовая кислота	AR-201-073
5-пентилсульфанил-метилоксазол-2-карбоновая кислота	AR-201-072
4-(4-бутилтиазол-2-иламино)бензойная кислота	AR-201-069
4-(5-бутилтиазол-2-иламино)бензойная кислота	AR-201-068
2-гексиламинооксазол-4-карбоновая кислота	AR-201-062
2-гексаноил-аминооксазол-4-карбоновая кислота	AR-201-059
3-гексилоксиизоксазол-5-карбоновая кислота	AR-201-058
2-гексаноиламино-изоникотиновая кислота	AR-201-054
1-карбоксиэтиловый эфир	AR-201-049

октановой кислоты
1-карбокси-2-фенилэтиловый эфир додекановой кислоты	AR-201-048
(R)-2-амино-4-(пиперидин-1-ил)бутановая кислота	abu(pip)
8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота	Adx
(2,3,4,5,6-пентагидрокси-гексилиденаминоокси) уксусная кислота	Gluc-Aoa
5-((4S)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентановая кислота	74
адамантан-2-иламин	504
циклогексиламин	558
циклопентиламин	559
2-((1S,2R,4R)-бицикло[2.2.1]гептан-2-ил)уксусная кислота	779

2-фенетилбензойная кислота	785
додекановая кислота	832
анилин	873
октансульфонилхлорид	933
гексилхлорформиат	1270
3-фенилпропионовая кислота	1281
4-фенилмасляная кислота	1319
5-фенилпентановая кислота	1320
4-циклогексилмасляная кислота	1339
3-циклогексил-пропионовая кислота	1340
(S)-3,3-диметилбутан-2-амин	1381
2-(гексиламино) уксусная кислота	1625-Ac
1-бензиловый эфир пиперидин-1,2-	1695

дикарбоновой кислоты
4-метилциклогексиламин	1859
(1R,2R)-2-метилциклогексанамин	1860
[2-(2-метоксиэтокси) этокси]уксусная кислота	1888
(1R,2R,4R)-бицикло [2.2.1]гептан-2-амин	1906
(2-метоксиэтокси) ацетилхлорид	1913
(1R,2R)-2-(бензилокси) циклогексанамин	1934
(S)-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-амин	2118
(S)-3-метилпиперидин	2137
4-(4-метоксифенил) масляная кислота	2553
(1R,2R,4R)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1] гептан-2-амин	2797
2-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-	2857-Ac

пентагидрокси-гексиламино) уксусная кислота
циклобутиламин	2906
(S)-2-циклопентил-гексановая кислота	3218
3-амино-4-гидроксибензойная кислота	3421
1-этилпропиламин	3791
(R)-2-метилбутан-1-амин	3806
2-этилбутиламин	3816
3-(4-бромфенил) пропионовая кислота	4703
(4-бутоксифенил) уксусная кислота	4734
(1S,2R)-2-аминоцикло-гексанкарбоксамид	5116
(1R,2S)-этил 2-аминоцикло-гексанкарбоксилат	5118

(1R,2R)-этил 2-аминоцикло-гексанкарбоксилат	5119
1-пропилбутиламин	5121
(S)-3-амино-1-этилазепан-2-он	5164
декановая кислота	5587
(2-бутоксиэтокси) уксусная кислота	6013
(E)-додец-2-еновая кислота	6014
(Z)-додец-5-еновая кислота	6015
(2S)-2-октилциклопропан-карбоновая кислота	6056
3-октилсульфанил-пропионовая кислота	6057
7-бутилсульфанил-гептановая кислота	6058
3-(октан-1-сульфинил)пропионовая кислота	6059
3-(октан-1-сульфонил)пропионовая	6059(0)

кислота
рац-6-гидроксидекановая кислота	(6071-OH)
рац-7-гидроксидодекановая кислота	(6072-OH)
5-бутил-2H-пиразол-3-карбоновая кислота	6182
2-пентилбензооксазол-5-карбоновая кислота	6988
(R)-2-аминобутановая кислота	abu
3-амино-1-карбоксиметилпиридин-2-он	Acp
(S)-2-((S)-3-амино-2-оксопирролидин-1-ил)-3-фенилпропановая кислота	AFL
(S)-2-((R)-3-амино-2-оксопирролидин-1-ил)-3-фенилпропановая кислота	aFL
(R)-2-((R)-3-амино-2-оксопирролидин-1-ил)-3-фенилпропановая кислота	afL

2-аминоизомасляная кислота	Aib
2-аминоиндан-2-карбоновая кислота	Aic
рац-α-метиллейцин	Aml
(R)-α-метилпролин	Amp
1-аминометил-циклопропанкарбоновая кислота	Amcp
4-аминопиперидин-4-карбоновая кислота	Apc
4-амино-1-(2-аминоэтил)пиперидин-4-карбоновая кислота	Apc(Ae)
4-амино-1-этилпиперидин-4-карбоновая кислота	Apc(Et)
4-амино-1-метилпиперидин-4-карбоновая кислота	Apc(Me)
(2S,4S)-4-аминопирролидин-2-карбоновая кислота	Apr

азетидин-3-карбоновая кислота	Az3
(S)-азетидин-2-карбоновая кислота	Aze
(R)-азетидин-2-карбоновая кислота	aze
β-аланин	Bal
(S)-β-гомолизин	Bhk
(2S,4R)-4-(бензилокси)пирролидин-2-карбоновая кислота	Bhp
(R)-β-гомолейцин	Ble
рац-2-амино-3-фенилмасляная кислота	Bmf
(S)-2-((S)-3-(карбоксиметил)-2-оксопиперазин-1-ил)-5-гуанидинопентановая кислота	cDR
(S)-β-циклогексилаланин	Cha

циклогептиламин	Che
(S)-циклогексилглицин	Chg
(2S,4S)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота	Chy
(S)-2-амино-2-циклопропилуксусная кислота	Cpa
(S)-2-амино-2-циклопентилуксусная кислота	Cpg
рац-(3R,4S)-цис-метанпролин	Cpp
(S)-2-амино-3-(трет-бутилтио)пропановая кислота	ctb
(S)-2-амино-3-сульфопропановая кислота	Cya
(R)-2,4-диаминобутановая кислота	dab

(R)-2-амино-3-(неопентиламино) пропановая кислота	dap(1464)
(R)-2-амино-3-(бис(2-аминоэтил)амино) пропановая кислота	dap(6263)2
(R)-2-амино-3-(бис((1H-имидазол-2-ил)метил)амино) пропановая кислота	dap(3846)2
(R)-2-амино-3-(пиперидин-4-илметиламино) пропановая кислота	dap(6238)
((R)-2-амино-4-(диметиламино)бутановая кислота	dab(Me2)
(R)-2,3-диаминопропановая кислота	dap
(S)-2-амино-3-(диметиламино) пропановая кислота	Dap(Me2)
(R)-2-амино-3-(диметиламино) пропановая кислота	dap(Me2)

2-амино-2-этилмасляная кислота	Deg
2-аминоакриловая кислота	Dha
(S)-2,5-дигидро-1H-пиррол-2-карбоновая кислота	Dhp
(R)-2,2-диметилтиазолидин-4-карбоновая кислота	Dtp
(S)-3,4-дихлорфенилаланин	Eaa
(S)-2-(3-амино-2-оксоазепан-1-ил)уксусная кислота	Eah
рац-имидазолидин-2-карбоновая кислота	Eal
(S)-4-метил-2-((S)-6-оксо-1,7-диазаспиро[4.4]нонан-7-ил)пентановая кислота	Eam
рац-1-амино-2,3-дигидро-1H-инден-1-карбоновая кислота	Eao

2,3-дигидро-1H-индол-2-карбоновая кислота	Eat
(2S,4S)-4-фенилпирролидин-2-карбоновая кислота	Eay
(R)-тиазолидин-4-карбоновая кислота	Eaz
1-аминоцикло-пропанкарбоновая кислота	Ebc
(R)-2-амино-3-(метилсульфанил) пропановая кислота	Ebe
1-аминоцикло-пентанкарбоновая кислота	Eca
2-амино-3-пиперидин-4-илпропионовая кислота	Egg
1-аминоцикло-гексанкарбоновая кислота	Egz
(1S,3R)-3-аминоцикло-гексанкарбоновая кислота	Fio

транс-4-(аминометил)цикло-гексанкарбоновая кислота	Fir
аминопиперидин-3-илуксусная кислота	Fhy
(S)-2-амино-2-(пиперидин-4-ил)уксусная кислота	Fhz
(2S,4S)-4-фторпирролидин-2-карбоновая кислота	Fpr
4-аминомасляная кислота	Gab
(R)-2-амино-3-гуанидинопропановая кислота	gdp
(2S,4R)-4-гуанидинопирролидин-2-карбоновая кислота	Gup
(2S,3S)-3-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота	H3p
гексановая кислота	Hex

(S)-гомофенилаланин		Hfe
(S)-2-аминооктановая кислота		Hgl
(R)-2-аминооктановая кислота		hgl
(S)-2-амино-5-метилгексановая кислота		Hle
(S)-гомосерин		Hsc
(R)- гомосерин		hse
(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота	Hyp
пиперидин-4-карбоновая кислота	Inp
додекан	Lau
(R)-2-амино-6-(диметиламино) гексановая кислота	lys(Me2)
3-аминометилбензойная кислота	Mam

(R)-2-амино-4-(метилсульфонил) бутановая кислота	metO₂
(S)-мета-хлорфенилаланин	Mcf
(S)-4-гидрокси-3-йодфенилаланин	Miy
(S)-мета-метилфенилаланин	Mmf
(S)-3-(3-пиридил)аланин	Mpa
(3-аминофенил)уксусная кислота	Mpe
(S)-мета-трифторметил-фенилаланин	Mtf
(R)-2-амино-4-гуанидинобутановая кислота	nar
рац-(2,3-дигидроксипропиламино) уксусная кислота	Nbhp
4-бутилтиазол	Nbt
(3-гидроксипропиламино)	Nhpr

уксусная кислота
фенетиламиноуксусная кислота	NHfe
(S)-пара-нитрофенилаланин		Nif
рац-нипекотиновая кислота		Nip
(S)-норлейцин		Nle
(R)-норлейцин		nle
(S)-N-метилаланин		Nma
(S)-N-метиласпарагиновая кислота		Nmd
(S)-N-метилфенилаланин		Nmf
(S)-N-метилизолейцин		Nmi
(S)-N-метиллизин		Nmk

(S)-N-метиллейцин	Nml
(S)-N-метиларгинин	Nmr
(S)-2-амино-4,4-диметилпентановая кислота	Npg
4,4-диметил-2-метиламинопентановая кислота	SH-112-158
бензиламиноуксусная кислота	NPhe
(S)-4-метил-2-(пропиламино) пентановая кислота	Npl
(S)-норвалин	Nva
(R)-норвалин	nva
октановая кислота	Occ
октан	Oct
(2S,3aS,7aS)-октагидро-1H-индол-2-карбоновая кислота	Oic

(S)-3-(2-пиридил)аланин	Opa
(S)-орнитин	Orn
(R)-орнитин	orn
(R)-2-амино-5-(диметиламино) пентановая кислота	orn(Me2)
(S)-ортотрифторфенилаланин	Otf
пиперазин-1-илуксусная кислота	Paa
(S)-пара-аминофенилаланин	Paf
(4-аминометил) бензойная кислота	Pam
(S)-пара-бромфенилаланин	Pbf
(2S,3R)-3-аминопирролидин-2-карбоновая кислота	Pca
(S)-пара-хлорфенилаланин	Pcf

(S)-парафторфенилаланин	Pff
(S)-фенилглицин	Phg
(S)-пипеколиновая кислота	Pip
(R)-пипеколиновая кислота	pip
(S)-пара-метилфенилаланин	Pmf
(S)-пара-метоксифенилаланин	Pmy
(S)-3-(4-пиридил)аланин	Ppa
(4-аминофенил)уксусная кислота	Ppe
(S)-2-амино-3-(фосфоноокси) пропановая кислота	Pse
(2S,3R)-2-амино-3-(фосфоноокси)бутановая кислота	Pth

саркозин	Sar
5-бутилтиазол	Sbt
(S)-нипекотиновая кислота	Sni
(2S,4R)-4-аминопирролидин-2-карбоновая кислота	Tap
(2S,4R)-4-(диметиламино) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(2Me)
(2S,4R)-4-ацетамидопирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Ac)
(2S,4R)-4-(2-аминоэтиламино) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Ae)
(2S,4R)-4-(S)-3-амино-3-карбоксипропанамидо) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Asp(-))

4-(3-аминопропиламино) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Ap)
(2S,4R)-4-(3-аминопропанамидо) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Bal)
(2S,4R)-4-(диэтиламино) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Et2)
(2S,4R)-4-(этиламино)пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(Et)
(2S,4R)-4-(2-аминоацетамидо) пирролидин-2-карбоновая кислота	Tap(G)
(S)-α-трет-бутилглицин	Tbg
(R)-α-трет-бутилглицин	tbg
(2S,4R)-4-фторпирролидин-2-карбоновая кислота	Tfp

(S)-2-тиенилаланин	Thi
(S)-3-тиенилаланин	Thk
(S)-тиазолидин-4-карбоновая кислота	Thz
(S)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота	Tic
4-аминотиазол-2-карбоновая кислота	Tnc
(S)-2,3-диаминопропионовая кислота (удлинение боковой цепи)	Udp

Новые агонисты NPR-B согласно изобретению содержат общую аминокислотную последовательность формулы I:

B-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Z

(I),

где

B выбран из группы, состоящей из H, R^b1-, R^b2-C(O)-, R^b2-S(O₂)-, R^b3-Baa-;

Baa означает обычную α-аминокислоту, необычную α-аминокислоту или β-аминокислоту;

R^b1 выбран из C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₁₂-алкенила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₁₂-алкиларила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH или OR^b6; C₁-C₁₂-алкинила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; арил-C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₁₂-алкил-C₃-C₈-циклического алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₃-C₆-циклического алкил-C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₉-алкилтио-C₂-C₁₀-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₉-алкилсульфонил-C₁-C₄-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₉-алкилсульфоксил-C₁-C₁₀-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; CH₃-(CH₂)_qb-O-[-CH₂-(CH₂)_nbO]_mb-CH₂-(CH₂)_pb-, 2-тиазоло-группы, необязательно замещенной C_1-8-алкилом;

qb=0-3,

nb=1-3,

mb=1-3,

pb=1-3;

R^b2 выбран из C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₁₂-алкенила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; арил-C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₁₂-алкинила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₁₂-алкиларила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH или OR^b6; C₁-C₁₂-алкил-C₃-C₈-циклического алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₃-C₆-циклического алкил-C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₉-алкилтио-C₁-C₁₀-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₉-алкилсульфонил-C₁-C₁₀-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом; C₁-C₉-алкилсульфоксил-C₁-C₄-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом, CH₃-(CH₂)_qb-O-[-CH₂-(CH₂)_nbO]_mb-CH₂-(CH₂)_pb-;

qb=0-3,

nb=1-3,

mb=1-3,

pb=0-3;

R^b3 выбран из H, R^b1-, R^b2-C(O)- или R^b2-S(O₂)-;

R^b4, R^b5 и R^b6 независимо выбраны из группы, состоящей из H или C₁-C₄-алкила, и

Xaa₁ выбран из группы, состоящей из прямой связи, обычной α-аминокислоты; необычной α-аминокислоты; β-аминокислоты; γ-аминокислоты; или остатка формулы IIa-y:

,

R^1a выбран из H, C₁-C₆-алкила;

R^1b выбран из H, C₁-C₆-алкила, необязательно замещенного OH, гидрокси-C₁-C₆-алкила, необязательно замещенного OH;

R^1c выбран из H, C₁-C₆-алкила;

R^1d выбран из H, C₁-C₆-алкила;

R^1a и R^1b вместе могут образовывать гетероциклическое кольцо;

n¹ равно 0-3;

Xaa₂ означает аминокислотный остаток формулы IIIa-g:

,

где

R^2a выбран из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила, изопропила, C₁-C₂-алкил-C₃-C₇-циклоалкила и арил-C₁-C₂-алкила;

R^2b и R^2c независимо выбраны из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила и изопропила, при условии, что, по меньшей мере, один из R^2b и R^2c означает H;

R^2d означает от 0 до 3 заместителей, при этом каждый такой заместитель независимо выбран из группы, состоящей из H, Cl, F, Br, NO₂, NH₂, CN, CF₃, OH, OR^2e и C₁-C₄-алкила;

R^2a и R^2b или R^2a и R^2c вместе могут образовывать гетероциклическое кольцо;

R^2e выбран из группы, состоящей из метила, этила, пропила и изопропила; или

Xaa₁ и Xaa₂ вместе могут быть выбраны из аминокислотного остатка формулы IVa-b:

;

Xaa₃ выбран из группы, состоящей из Gly, Ala, обычной D-α-аминокислоты, необычной D-α-аминокислоты и аминокислотного остатка формулы Va:

,

где R^3a выбран из группы, состоящей из H или C₁-C₄-алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из H, -(CH₂)_n3a-X^3a;

n3a равно 1-5;

X^3a выбран из группы, состоящей из H, NR^3cR^3d;

R^3c и R^3d независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, -(C=N)-NH₂ и -(CH₂)_n3bX^3b;

n3b равно 1-4;

X^3b выбран из группы, состоящей из NR^3eR^3f, C₅-C₆-гетероарила, C₄-C₇-гетероциклила, -NHC(=N)NH₂;

R^3e и R^3f независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила,

где R^3e и R^3f могут образовывать циклическую структуру;

R^3a и R^3b могут быть связаны с образованием циклической структуры;

или R^3a и R^3b могут быть связаны с гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из N, O и S, с образованием гетероциклической структуры;

или

Xaa₂ и Xaa₃ вместе могут быть выбраны из аминокислотного остатка формулы Vb:

,

где R^3g означает от 0 до 3 заместителей, при этом каждый такой заместитель независимо выбран из группы, состоящей из H, Cl, F, Br, NO₂, NH₂, CN, CF₃, OH, OR^3h и C₁-C₄-алкила;

R^3h выбран из группы, состоящей из C₁-C₄-алкила.

Xaa₄ означает аминокислотный остаток формулы VIa-h:

,

где R^4a выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, который может быть замещен остатком, выбранным из группы, состоящей из OH, CO₂R^4c, C(=O)-NH₂, 5-6-членного гетероарила, C₁-C₁₀-алкила, C₅-C₈-циклоалкил-C₁-C₁₀-алкила и C₅-C₈-циклоалкила, -(CH₂)_n4a-X^4a;

n^4a равно 1 или 2;

R^4b выбран из группы, состоящей из H и метила;

R^4c выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₃-алкила; и

X^4a означает OH, CO₂R^4d, NR^4eR^4f, SR^4g, 4-имидазоил, 4-гидроксифенил;

R^4d, R^4e и R^4f независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₃-алкила;

R^4g выбран из группы, состоящей из C₁-C₃-алкила;

m4a и m4b независимо выбраны из 0 или 1;

R^4h означает C₂-C₆-алкил;

или

Xaa₃ и Xaa₄ вместе могут быть выбраны из аминокислотных остатков формулы VIb-h;

Xaa₅ означает аминокислотный остаток формулы VII:

,

где R^5a означает (CH₂)_n5a-X^5a;

n5a равно 1-6;

X^5a выбран из группы, состоящей из H, NH₂ и аминосодержащего C_4-7-алифатического гетероциклического кольца;

R^5b выбран из группы, состоящей из H и метила;

R^5c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и где R^5c и R^5a могут объединяться с образованием четырех-шестичленного гетероциклического кольца или могут быть связаны с гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из N, O и S, с образованием моноциклической или бициклической гетероциклической структуры; при этом указанное гетероциклическое кольцо может иметь от 0 до 3 заместителей, при этом каждый заместитель независимо выбран из группы, состоящей из OH, OR^5d, F, C₁-C₄-алкила, -NHC(=NH)NH₂, арила и NR^5eR^5f;

R^5d выбран из C₁-C₄-алкила, C₁-C₄-алкиларила;

R^5e выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила, -C(=O)(CH₂)_n5b-X^5b, -CH₂(CH₂)_n5c-X^5b;

R^5f выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила, -CH₂(CH₂)_n5d-X^5c;

n5b выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3 и 4;

n5c и n5d независимо выбраны из группы, состоящей из 2, 3 и 4;

X^5b и X^5c независимо выбраны из группы, состоящей из H, NR^5gR^5h;

R^5g и R^5h независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила;

Xaa₆ означает аминокислотный остаток формулы VIIIa-d:

,

где R^6a выбран из группы, состоящей из C₁-C₈-алкила, арил-C₁-C₄-алкила, C₄-C₇-циклоалкил-C₁-C₄-алкила, C₁-C₄-алкил-S(C₁-C₄-алкила) и C₄-C₇-циклоалкила, где указанный C₁-C₈-алкил и C₄-C₇-циклоалкил могут быть замещены остатком, выбранным из группы, состоящей из OH, O(C₁-C₄-алкила), S(C₁-C₄-алкила) и NR^6dR^6e;

R^6b означает H;

R^6c выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила;

R^6d и R^6e независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила;

где R^6a и R^6c могут образовывать циклическую структуру, которая может быть замещена остатком, выбранным из группы, состоящей из OH, C₁-C₄-алкила, NH₂ и F;

или R^6a и R^6c могут быть связаны с гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из N, O и S, с образованием гетероциклической структуры;

или

Xaa₅ и Xaa₆ вместе могут означать аминокислотный остаток формулы VIIIe:

Xaa₇ означает аминокислотный остаток формулы IXa-b:

,

где R^7a выбран из группы, состоящей из C₁-C₄-алкила, C₃-C₇-циклоалкила, 2-тиенила, (CH₂)_n7a-X^7a и C₁-C₄-алкила, замещенного OH;

R^7b означает H и 2-тиенил;

R^7c выбран из группы, состоящей из H и метила;

R^7d означает C₁-C₄-алкил;

n^7a выбран из группы, состоящей из 1 и 2;

X^7a выбран из группы, состоящей из 2-тиенила, C(=O)OR^7e, C(=O)NH₂, S(=O)₂OH, OS(=O)₂OH, B(OH)₂, P(=O)(OH)₂ и OP(=O)(OH)₂;

где R^7e выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила;

Xaa₈ означает аминокислотный остаток формулы Xa-g:

,

где R^8a выбран из группы, состоящей из (CH₂)_m8a-X^8a и C₄-C₇-азотсодержащего алифатического гетероциклического кольца;

m^8a=1-5;

X^8a выбран из группы, состоящей из H, NH₂ и -NHC(=NH)NH₂;

R^8b выбран из группы, состоящей из H и метила;

R^8c выбран из группы, состоящей из H, NH₂ и OH;

Y^8a выбран из группы, состоящей из CH(R^8d) и S;

R^8d выбран из группы, состоящей из H, арила и OH;

Y^8b выбран из группы, состоящей из CH(R^8e) и NH;

R^8e выбран из группы, состоящей из H, NH₂ и OH;

Y^8c выбран из группы, состоящей из CH₂ и NR^8f;

R^8f выбран из группы, состоящей из H, -C(=NH)NH₂ и -C(=O)CH₂NH₂;

Xaa₇ и Xaa₈ вместе могут означать аминокислотный остаток формулы Xh:

Xaa₉ выбран из группы, состоящей из прямой связи и аминокислотного остатка формулы XIa-c,

,

где R^9a выбран из группы, состоящей из C₁-C₅-алкила и C₄-C₇-циклоалкила;

R^9b выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₅-алкила;

и где R^9a и R^9b могут образовывать 5-7-членное циклоалкильное кольцо;

R^9c выбран из группы, состоящей из H, метила;

или

Xaa₈ и Xaa₉ вместе могут означать остаток формулы XId:

и

Z выбран из группы, состоящей из H, OR^11a, NHR^11b, обычной α-аминокислоты, необычной α-аминокислоты, β-аминокислоты; и пептида, состоящего из 2-30 аминокислот, выбранных из группы, состоящей из обычных α-аминокислот, необычных α-аминокислот и β-аминокислот;

где R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, C₄-C₈-циклоалкила, C₇-C₁₂-бициклоалкила, C₇-C₁₂-циклоалкиларила, C₁-C₄-алкил-C₄-C₈-циклоалкила или остатка формулы XIIa-c:

Специалистам в данной области будет понятно, что в используемом в настоящем описании смысле фраза «необязательно замещен» означает, что остаток, к которому относится такая фраза, может быть незамещенным, или он может быть замещен некоторыми конкретными дополнительными остатками. Например, фраза «C₁-C₁₂-алкил, необязательно замещенный NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклическим алкилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом» относится к соединению C₁-C₁₂-алкила, который либо не замещен, либо замещен остатком, выбранным из группы, состоящей из NR^b4R^b5, OH, OR^b6, C₃-C₈-циклического алкила, арила, гетероарила и гетероциклила. Соединение гексан можно считать C₆-алкильным соединением, которое не замещено, тогда как соединение 3-гексанол является C₆-алкильным соединением, которое замещено по третьему атому углерода остатком OH.

В некоторых предпочтительных агонистах NPR-B согласно изобретению:

B выбран из группы, состоящей из R^b1-, R^b2-C(O)-;

R^b1 выбран из C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5;

R^b2 выбран из C₁-C₁₂-алкила, необязательно замещенного NR^b4R^b5;

R^b4 и R^b5 независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила, и

Xaa₁ выбран из группы, состоящей из прямой связи, обычной α-аминокислоты; необычной α-аминокислоты; β-аминокислоты; или остатка, выбранного из группы, состоящей из остатков формулы IIa, IIs, IIt, IIu и IIv:

,

R^1a выбран из H, C₁-C₆-алкила;

R^1c выбран из H, C₁-C₆-алкила;

n¹ равно 0-3; и

Xaa₂ означает аминокислотный остаток формулы IIIa или формулы IIIb:

,

где

R^2b и R^2c независимо выбраны из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила и изопропила, при условии, что, по меньшей мере, один из R^2b и R^2c представляет собой H;

R^2e выбран из группы, состоящей из метила, этила, пропила и изопропила; и

Xaa₃ означает аминокислотный остаток формулы Va:

,

n3a равно 1-5;

X^3a выбран из группы, состоящей из H, NR^3cR^3d;

n3b равно 1-4;

и

Xaa₄ означает аминокислотный остаток формулы VIa:

,

где R^4a выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, который может быть замещен остатком, выбранным из группы, состоящей из OH, CO₂R^4c, C(=O)-NH₂, 5-6-членного гетероарила, C₁-C₁₀-алкила, C₅-C₈-циклоалкил-C₁-C₁₀-алкила и C₅-C₈-циклоалкила;

n^4a равно 1 или 2;

R^4b выбран из группы, состоящей из H и метила;

,

где R^5a означает (CH₂)_n5a-X^5a;

n5a равно 1-6;

R^5b выбран из группы, состоящей из H и метила;

R^5c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и где R^5c и R^5a могут объединяться с образованием четырех-шестичленного гетероциклического кольца, при этом указанное гетероциклическое кольцо может иметь от 0 до 2 заместителей, при этом каждый заместитель независимо выбран из группы, состоящей из OH, OR^5d, F, C₁-C₄-алкила, -NHC(=NH)NH₂, арила и NR^5eR^5f;

R^5d выбран из C₁-C₄-алкила, C₁-C₄-алкиларила;

n5b выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3 и 4;

R^5g и R^5h независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила; и

Xaa₆ означает аминокислотный остаток формулы VIIIa:

,

где R^6a выбран из группы, состоящей из C₁-C₈-алкила, арил-C₁-C₄-алкила, C₄-C₇-циклоалкил-C₁-C₄-алкила, C₁-C₄-алкил-S(C₁-C₄-алкила) и C₄-C₇-циклоалкила, где указанный C₁-C₈-алкил и C₄-C₇-циклоалкил могут быть замещены остатком, выбранным из группы, состоящей из OH, O(C₁-C₄-алкила), S(C₁-C₄-алкила);

R^6b означает H;

R^6c выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила; и

Xaa₇ означает аминокислотный остаток формулы IXa:

,

где R^7a выбран из группы, состоящей из C₁-C₄-алкила, C₃-C₇-циклоалкила, 2-тиенила и C₁-C₄-алкила, замещенного OH;

R^7b означает H и 2-тиенил;

R^7c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и

Xaa₈ означает аминокислотный остаток формулы X(a)-(g):

,

где R^8a означает (CH₂)_m8a-X^8a;

m^8a=1-5;

R^8b выбран из группы, состоящей из H и метила; и

,

R^9b выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₅-алкила;

или R^9a и R^9b могут образовывать 5-7-членное циклоалкильное кольцо;

R^9c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и

Z означает NHR^11b,

где R^11b выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, C₄-C₈-циклоалкила, C₇-C₁₂-бициклоалкила, C₇-C₁₂-циклоалкиларила, C₁-C₄-алкил-C₄-C₈-циклоалкила или остатка формулы XIIa-c:

В более предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения B выбран из группы, состоящей из R^b1 и R^b2-C(O)-;

R^b1 выбран из группы, состоящей из C₆-C₁₀-алкила и C₆-C₁₀-алкила, замещенного NR^b4R^b5;

R^b2 выбран из C₆-C₁₀-алкила и C₆-C₁₀-алкила, замещенного NR^b4R^b5;

R^b4 и R^b5 независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила; и

Xaa₁ выбран из группы, состоящей из прямой связи, обычной α-аминокислоты; необычной α-аминокислоты; β-аминокислоты; остатка формулы IIa, остатка формулы IIs, остатка формулы IIt, остатка формулы IIu и остатка формулы IIv:

,

где R^1a выбран из H и C₁-C₄-алкила;

R^1b выбран из H, C₁-C₄-алкила, необязательно замещенного OH, и гидрокси-C₁-C₄-алкила, необязательно замещенного OH;

R^1c выбран из H, C₁-C₆-алкила;

n¹ равно 0, 1; и

Xaa₂ означает аминокислотный остаток формулы III:

,

где

R^2d означает от 0 до 3 заместителей, при этом каждый такой заместитель независимо выбран из группы, состоящей из H, Cl, F, Br, CN, CF₃, OH, OR^2e и C₁-C₄-алкила;

,

R^3b выбран из группы, состоящей из H и -(CH₂)_n3a-X^3a;

n3a равно 1-5;

X^3a выбран из группы, состоящей из H и NR^3cR^3d;

R^3c и R^3d независимо выбраны из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила и -(C=N)-NH₂;

и

,

где R^4a выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, который может быть замещен остатком, выбранным из группы, состоящей из OH и CO₂R^4c;

R^4b выбран из группы, состоящей из H и метила;

,

где R^5a означает (CH₂)_n5a-X^5a;

n5a равно 1-6;

R^5b выбран из группы, состоящей из H и метила;

R^5c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и где R^5c и R^5a могут объединяться с образованием четырех-шестичленного гетероциклического кольца, при этом указанное гетероциклическое кольцо может иметь от 0 до 2 заместителей, при этом каждый заместитель независимо выбран из группы, состоящей из OH, F, C₁-C₄-алкила, -NHC(=NH)NH₂, арила и NR^5eR^5f;

R^5e выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила, -C(=O)(CH₂)_n5b-X^5b и -CH₂(CH₂)_n5c-X^5b;

n5b выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3 и 4;

X^5b и X^5c независимо выбраны из группы, состоящей из H и NR^5gR^5h;

R^5g и R^5h независимо выбраны из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила; и

,

где R^6a выбран из группы, состоящей из C₁-C₈-алкила, арил-C₁-C₄-алкила, C₄-C₇-циклоалкил-C₁-C₄-алкила и C₄-C₇-циклоалкила, где указанный C₁-C₈-алкил и C₄-C₇-циклоалкил могут быть замещены остатком, выбранным из группы, состоящей из OH и O(C₁-C₄-алкила);

R^6b означает H;

Xaa₇ означает аминокислотный остаток формулы IX:

,

R^7b означает H и 2-тиенил;

R^7c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и

Xaa₈ означает аминокислотный остаток формулы Xa:

,

где R^8a означает (CH₂)_m8a-X^8a;

m^8a=1-5;

Xaa₉ выбран из группы, состоящей из прямой связи и аминокислотного остатка формулы Xia:

,

R^9c выбран из группы, состоящей из H и метила;

и

Z означает NHR^11b,

где R^11b выбран из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, C₄-C₈-циклоалкила, C₇-C₁₂-бициклоалкила, C₇-C₁₂-циклоалкиларила и C₁-C₄-алкил-C₄-C₈-циклоалкила.

Последовательности предпочтительных новых агонистов NPR-B согласно изобретению приведены в изобретении в обычной форме пептидной последовательности, которая понятна специалисту в данной области. Например, трехбуквенный код обычной аминокислоты или сокращение необычной аминокислоты указывает на присутствие конкретной аминокислоты в конкретном положении в последовательности молекулы, при этом связь каждой аминокислоты со следующей и/или предыдущей аминокислотой указана дефисом. Дефис, который означает химическую связь, обычно амидную связь, означает удаление OH из 1-карбоксильной группы аминокислоты, когда он помещен справа от сокращения, и означает удаление H из 2-аминогруппы (или единственной аминогруппы в случае аминокислот, в которых отсутствует 2-аминогруппа, например, Bal) аминокислоты, когда он помещен слева от сокращения. Понятно, что обе модификации могут быть применимы к одной аминокислоте.

В случае дополнительных функциональных групп в боковых цепях обычных или необычных аминокислот для образования пептидных связей используются только 2-аминогруппа и/или 1-карбоксильная группа.

C-концы новых агонистов NPR-B, описанных в настоящей публикации, показаны в развернутой форме при добавлении либо OH, либо NH₂, либо сокращения для конкретного концевого амина, отделенных дефисом справа от сокращения C-концевой аминокислоты.

Такие конкретные концевые амины представлены в таблице 2 в виде полных формул и к ним применяют сходные правила в отношении дефисов и их структуры в контексте пептида, например,

3791=NH₂-CH(CH₂-CH₃)-CH₂-CH₃

-3791=-NH-CH(CH₂-CH₃)-CH₂-CH₃.

N-концы новых пептидов, описанных в настоящей публикации, показаны в развернутой форме при добавлении либо H (в случае свободного N-конца), либо сокращения для конкретной концевой карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты или другой концевой группы перед символом N-концевой аминокислоты.

Указанные конкретные карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты или другие концевые группы, подобные алкилу, приведены в таблице 2 в виде полных формул, и к ним применяют сходные правила в отношении дефисов и их структуры в контексте пептида, например,

Hex=гексановая кислота

Hex-=гексаноил-.

В случае обычных аминокислот и некоторых необычных аминокислот использовали 3-буквенный код, при этом первая буква указывает стереохимию альфа-атома C. Например, заглавная первая буква указывает, что в пептидной последовательности присутствует L-форма аминокислоты, тогда как строчная первая буква указывает, что в пептидной последовательности присутствует D-форма соответствующей аминокислоты.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения новый агонист NPR-B представляет собой состоящий из 8-13 аминокислот пептид, имеющий последовательность, указанную в таблице 3. Агонистическая активность предпочтительных соединений также приведена в таблице 3 и систематизирована на основе следующих исходных положений:

Сначала проверяли данные об агонистической активности каждого соединения, чтобы определить, удовлетворяет ли оно критериям для активности группы A. Если соединение не удовлетворяло критериям для активности группы A, его проверяли в отношении критериев группы B. Если оно не удовлетворяло критериям для активности группы A или активности группы B, его в конце концов проверяли в отношении критериев группы C. Если оно не удовлетворяло критериям активности группы C, его не включали в таблицу 3.

Все примеры в таблице 3 представляют линейные пептиды, записанные применимым трехбуквенным кодом. В случае необычных аминокислот и других химических остатков использовали сокращения, которые перечислены в таблице 2. Активности in vitro, указанные в таблице 3, получены в результате экспериментов, осуществленных согласно способам, описанным в примере 4.

В некоторых вариантах агонистов NPR-B согласно изобретению в соединении формулы 1:

B будет выбран из связи, Occ, Oct, Sbt, 1319, 1320 и 5587;

Xaa₁ будет выбран из Gly, AR-201-49, AR-201-68, ala, abu, his, aze, pro, pip, thz, thi, asn, ser, His, Ala, Ser, Bal, Sni, Az3 и Gab;

Xaa₂ будет выбран из Phe, Pcf, Nmf, Pbf, Pff, Pmf, Eaa, Mcf, Thk и Mtf;

Xaa₃ будет выбран из Gly, Aib, Ebc, обычной D-α-аминокислоты и необычной D-α-аминокислоты и предпочтительно будет выбран из Gly, Fhy, Ape, Egz, Aib, Ebc, ala, lys, lys(Me2), arg, leu, nle, ctb, abu, AR-385-12, Egg, ser, orn, orn(Me2) и dap(Me2);

Xaa₄ будет выбран из Leu, Nva, Nle, Hle, Npg, Cha и Ala;

Xaa₅ будет выбран из Lys, Orn, Hly, Hpa, Dab, Arg, N(алкил)производных любой из предшествующих аминокислот, Nmk, Hpr, Pro, Tfp, Apr, Eaz, Hyp, Tap, Tap(G), Tap(Bal), Tap(Et), Tap(Ae), Tap(Ap), Amp, Pip и Chy;

Xaa₆ будет выбран из связи, Leu, Ile, Nml, Tap, Npg, SH-158, Dap(Me2), Cpg, Val, Tbg, Chg, Hle, Nle и N(алкил)производных любой из предшествующих аминокислот;

Xaa₇ будет выбран из Asp, Val, BB725, BB727, Ser, Thr и Cya;

Xaa₈ будет выбран из Arg, Nmr, Pro, Eaz, Pca, Orn, Fhz, Har, Nar, Cyr, Mmr, Dmr, Bmr, Opy и N(алкил)производных любой из предшествующих аминокислот;

Xaa₉ будет выбран из Ile, Tbg, Deg, Egz, Aml, 1860, Che, Nmi, Leu, Val, Ecb и Eca; и

Xaa₁₀ будет выбран из связи, Ser и его N(алкил)производного.

Предпочтительные агонисты NPR-B согласно настоящему изобретению представляют собой пептиды с активностью группы B, которые приведены в таблице 3 выше. Наиболее предпочтительные агонисты NPR-B согласно настоящему изобретению представляют собой пептиды с активностью группы A, которые приведены в таблице 4 ниже.

B. Заболевания, подвергаемые лечению и/или профилактике

Настоящее изобретение также относится к способам лечения или профилактики заболеваний у субъекта, которые включают введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, которая содержит один или несколько агонистов NPR-B, которые описаны в настоящей публикации, при этом заболеванием является одно из указанных далее заболеваний. Субъектом может быть млекопитающее, такое как человек, примат, корова, лошадь, собака, кошка, мышь или крыса. В конкретных вариантах субъектом является человек.

1. Определения

«Лечение» и «осуществление лечения» относится к применению или введению лекарственного средства субъекту или осуществлению процедуры или способа по отношению к субъекту в целях получения терапевтической пользы в случае заболевания или связанного со здоровьем состояния. Термин «терапевтическая польза», используемый на протяжении настоящей заявки, относится ко всему, что стимулирует или улучшает самочувствие субъекта при медицинском лечении его состояния. Термин включает без ограничения уменьшение частоты появления или тяжести признаков или симптомов заболевания. Терапевтическая польза также включает уменьшение признаков или симптомов, ассоциированных с глаукомой, у субъекта с глаукомой. Например, терапевтическую пользу для пациента с глаукомой получают, когда нет дальнейшего прогрессирования нарушения поля зрения в пораженном глазу или имеет место замедление скорости прогрессирования нарушения поля зрения в пораженном глазу или улучшение зрения.

«Заболеванием» или «связанным со здоровьем состоянием» может быть любое патологическое состояние части тела, органа или системы, возникающее в результате любой причины, такой как инфекция, травма, генетический дефект, связанное с возрастом ухудшение функций тела и/или стресс под влиянием условий окружающей среды. Причина может быть известна или не известна. Примеры заболеваний включают глаукому, ретинопатии, травмы глаза и оптические нейропатии. Таким образом, специалисту в данной области понятно, что лечение может улучшать состояние при заболевании, но при этом может не приводить к полному излечению заболевания.

Термины «профилактика» и «предотвращение» используют в настоящем описании в соответствии с их обычным и прямым значением, чтобы обозначить «осуществление действия до» или само такое действие. В контексте конкретного заболевания или связанного со здоровьем состояния такие термины относятся к применению или введению средства, лекарственного средства или лекарства субъекту или осуществлению процедуры или способа по отношению к субъекту в целях блокирования или минимизации наступления заболевания или связанного со здоровьем состояния. Например, человека, для которого существует риск развития глаукомы глаза (такого как человек с гипертензией глаза), можно лечить агонистом NPR-B, который описан в настоящей публикации, в целях блокирования или минимизации появления признаков или симптомов глаукомы (т.е., в целях профилактики глаукомы). В конкретном варианте профилактика относится к снижению повышенного внутриглазного давления, блокированию выявляемого повреждения зрительного нерва в результате глаукомы у субъекта, снижению скорости потери зрения у субъекта или остановке потери зрения у субъекта. Субъектом может быть субъект, у которого, как известно или как предполагается, нет конкретного заболевания или связанного со здоровьем состояния на момент введения соответствующего профилактического средства. Субъектом может быть, например, субъект, не имеющий известного заболевания или связанного со здоровьем состояния (т.е., здоровый субъект). В некоторых вариантах субъект ранее имел заболевание, которое лечили в прошлом, и в настоящее время известно или подозревается, что у него нет заболевания.

Специалисты в данной области легко поймут, что некоторые термины или родовые термины подразумевают сумму различных заболеваний. Такие обобщающие термины не являются ограничением, и можно рассматривать каждое заболевание отдельно и его можно лечить или осуществлять профилактику соединениями согласно настоящему изобретению.

2. Глаукома и гипертензия глаза

Глаукома является второй основной причиной слепоты во всем мире (Thylefors and Negrel 1994, Bull World Health Organ. 72: 323-326). Открытоугольная глаукома (ОУГ) и закрытоугольная глаукома вместе образуют вторую основную причину слепоты во всем мире (Quigley and Broman, 2006 Br. J. Ophthalmol. 90: 262-267). Закрытоугольная глаукома больше распространена в Азиатской популяции (Foster et al. 2000, Arch. Ophthalmol. 118: 1105-11), тогда как открытоугольная глаукома больше встречается среди чернокожих пациентов (Leske et al. 2007, Ophthalmic Epidemiol. 14: 166-172). Глаукома является прогрессирующим заболеванием, при котором риск потери зрения возрастает с увеличением продолжительности заболевания. С учетом старения популяции во всем мире можно предполагать, что влияние такого приводящего к слепоте нарушения в будущем возрастет.

Патологическое состояние, называемое глаукомой, представляет собой семейство заболеваний, характеризуемых непрерывной потерей зрительной функции вследствие необратимого повреждения зрительного нерва. Более конкретно, глаукома приводит к оптической нейропатии, приводящей к утрате функции ганглиозных клеток сетчатки (RGC) с последующей апоптозной гибелью клеток и прогрессирующим увеличением потери зрения. Морфологически или функционально отличающиеся типы глаукомы обычно характеризуются повышенным внутриглазным давлением (ВГД), которое считают важным фактором риска патологического течения заболевания. Нарушение нормального оттока водянистой влаги, приводящее к повышенному ВГД, является неотъемлемой частью патофизиологии глаукомы. Гипертензия глаза является состоянием, при котором ВГД повышено, но не происходит явной потери зрительной функции; считают, что для таких пациентов существует высокий риск возможного развития потери зрения, ассоциированного с глаукомой. Некоторые пациенты с глаукоматозной скотомой имеют относительно низкое ВГД. Таким пациентам с так называемой глаукомой с нормальным давлением или глаукомой с низким давлением также могут быть полезны средства, которые снижают и контролируют ВГД.

Глаукому обычно идентифицируют по изменениям ВГД, дефектам поля зрения и/или изменениям глазного дна в области диска зрительного нерва. Повышенное ВГД, встречающееся у большинства пациентов с глаукомой, является результатом морфологических и биохимических изменений в трабекулярной сети (TM), ткани, фильтрующей водянистую влагу, расположенной в углу между радужной оболочкой и роговицей глаза. По мере прогрессирования глаукомы происходит утрата клеток TM и нарастания внеклеточных продуктов, которые ингибируют нормальный отток водянистой влаги, приводя к повышению ВГД. Кроме повышенного ВГД, другие факторы, такие как генетические дефекты, могут приводить к механической деформации головки зрительного нерва (ONH), в конце концов приводящей к экскавации ONH и потере RGC и их аксонов. Точный механизм такого патологического процесса в настоящее время неизвестен. Предполагалось, что снижение ВГД у пациентов, у которых диагностирована глаукома, по меньшей мере, на 20-30% будет снижать прогрессирующее усугубление заболевания на 50-60% (Quigley 2005 Ophthalmology 112: 1642-1643). Без правильного диагноза и лечения глаукома может прогрессировать до общей необратимой слепоты.

Сначала большинство пациентов с открытоугольной глаукомой лечили одним или несколькими из широкого множества местных глазных или пероральных гипотензивных медикаментозных средств, которые действуют, увеличивая отток водянистой жидкости и/или снижая образование водянистой жидкости, или используя хирургические способы, такие как лазерная тробекулопластика и фильтрующая операция. Схемы лечения, доступные в настоящее время для пациентов, у которых наблюдается повышенное ВГД, независимо от причины, обычно включают местное применение от одного раза в сутки до нескольких раз в сутки одной или нескольких глазных капель или таблеток, содержащих низкомолекулярное соединение, снижающее ВГД. Также можно назначать таблетки, которые снижают образование водянистой влаги, от двух до четырех раз в сутки. Обычно назначаемые при глаукоме лекарственные средства включают холинергические агонисты, адренергические агонисты, бета-адренергические блокаторы, ингибиторы карбоангидразы и аналоги простагландина. Хотя указанные классы лекарственных средств эффективны в регулировании ВГД, каждый из них имеет определенные ограничения, связанные с эффективностью и неблагоприятными эффектами. Например, бета-адренергические блокаторы не снижают ВГД ночью; многие пациенты с глаукомой не отвечают на конкретный класс лекарственного средства; и для большинства пациентов с глаукомой требуется применение сочетания лекарственных средств. Кроме того, многие лекарственные средства вызывают местное раздражение глаза, такое как жжение, горение, зуд, слезоотделение, гиперемия конъюнктивы, ощущение инородного тела, затуманенное зрение и боль в глазу. Некоторые иногда индуцируют системные побочные эффекты. Следовательно, действительно существует постоянная потребность в новых и улучшенных средствах лечения глаукомы.

Термины «глаукома» и «глаукоматозная оптическая нейропатия» и «глаукоматозная ретинопатия» в используемом в настоящем описании смысле взаимозаменяемы. Глаукома относится к заболеванию, характеризуемому непрерывной потерей зрительной функции вследствие необратимого повреждения ганглиозных клеток сетчатки и зрительного нерва. Основным фактором риска развития глаукомы и связанной утраты зрительной функции является повышенное внутриглазное давление. Существуют разные типы глаукомы, включая первичную открытоугольную глаукому (ПОУГ), закрытоугольную глаукому и врожденную/связанную с аномалиями развития глаукому.

В используемом в настоящем описании смысле термин «внутриглазное давление» или «ВГД» относится к давлению содержимого внутри глаза. В нормальном человеческом глазу ВГД обычно находится в диапазоне от 10 до 21 мм Hg. ВГД у людей варьирует, например, оно может стать повышенным вследствие анатомических проблем, воспаления глаза, в качестве побочного эффекта лекарственного средства или вследствие генетических факторов. «Повышенным» внутриглазным давлением в настоящее время считают давление ≥21 мм Hg, которое также считают основным фактором риска развития глаукомы.

Однако у некоторых людей с повышенным ВГД глаукома может не развиваться, и считают, что у них имеет место офтальмогипертензия. «Офтальмогипертензия» в используемом в настоящем описании смысле относится к состоянию, при котором внутриглазное давление в глазу человека выше, чем нормальное, но зрительный нерв и поля зрения находятся в нормальных границах. Такие люди могут быть предрасположены к развитию потери зрительной функции, которая обычно ассоциирована с глаукомой. В используемом в настоящем описании смысле термины «предрасположены» или «предрасположенность» относятся к человеку или субъекту, у которого имеется или для которого существует риск развития повреждения зрительного нерва или повреждения сетчатки, которое ассоциировано с повышенным внутриглазным давлением.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики глазной болезни у субъекта, которые включают введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, которая содержит один или несколько агонистов NPR-B, которые описаны в настоящей публикации, при этом глазной болезнью является глаукома, повышенное внутриглазное давление или офтальмогипертензия. Субъектом может быть млекопитающее, такое как человек, примат, корова, лошадь, собака, кошка, мышь или крыса. В конкретных вариантах субъектом является человек.

В предпочтительных аспектах агонисты NPR-B согласно изобретению будут снижать внутриглазное давление, ассоциированное с глаукомой. Глаукома может представлять собой любой тип глаукомы, такой как первичная открытоугольная глаукома, закрытоугольная глаукома, глаукома с нормальным давлением, врожденная глаукома, неоваскулярная глаукома, индуцируемая стероидами глаукома или глаукома, связанная с травмой (например, глаукома, вызванная клетками-тенями, или глаукома, связанная с отслойкой сосудистой оболочки глаза).

Настоящее изобретение также относится к способам снижения внутриглазного давления у субъекта, включающим введение субъекту фармацевтически эффективного количества композиции, содержащей агонист NPR-B, описанный в настоящей публикации, при котором снижается внутриглазное давление. В конкретных вариантах субъектом является человек. Например, в конкретных вариантах человек является пациентом с офтальмогипертензией или повышенным ВГД.

3. Недостаточности CNP как в случае диабета

Диабетическая нефропатия является прогрессирующим заболеванием почек, возникающим в результате длительного сахарного диабета. Экспериментальные данные показывают, что натрийуретические пептиды играют патофизиологическую роль в гломерулярных аномалиях, наблюдаемых при сахарном диабете. Сверхэкспрессия BNP предотвращала диабетическую нефропатию в индуцированной стрептозотоцином мышиной модели диабета (Makino et al. 2006, Diabetologia, 49: 2514-2524). В другом исследовании на крысах с индуцированным стрептозотоцином диабетом, концентрации мРНК CNP в сердце снижались в 2,6 раза (Walther et al. 2000, J. Mol. Endocrinol. 24: 391-395). В генетической модели диабета на мышах с диабетом без ожирения, в мезангиальных клетках, полученных от мышей с диабетом, наблюдали конститутивную сверхэкспрессию NPR-C; такая сверхэкспрессия была ассоциирована с пониженным ответом в виде продукции цГМФ на обработку ANP или CNP (Ardaillou et al. 1999, Kidney Int. 55: 1293-1302).

4. Состояния с гиперпролиферацией гладкомышечных клеток сосудов

Аномальный рост гладкомышечных клеток сосудов (VSMC) является общей причиной многих заболеваний сосудов. Нарушение баланса между ингибиторами роста и стимуляторами роста приводит к гиперпролиферации таких клеток, и вазоактивные вещества, включая натрийуретические пептиды, по-видимому, играют основную роль в данном процессе. Ранние экспериментальные данные свидетельствуют, что связанные с гуанилилциклазой рецепторы натрийуретических пептидов опосредуют антипролиферативную активность натрийуретических пептидов по отношению к росту гладкомышечных клеток сосудов (Hutchinson et al. 1997, Cardiovasc. Res. 35: 158-167). Эксперименты ex vivo показали прямое ингибирование роста VSMC крыс при действии CNP (Furuya et al. 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177: 927-931). Кроме того, миграция VSMC крыс может быть ингибирована CNP (Ikeda et al. 1997, Arterioscler. Thromb. Vase Biol. 17: 731-736). Перенос гена CNP приводил к уменьшению пролиферации VSMC в бедренных артериях свиней in vivo, и влияние даже превышало влияние применения пептида CNP (Pelisek et al. 2006, J. Gene Med. 8: 835-844). В другом сообщении перенос гена CNP приводил к подавлению ремоделирования сосудов в коронарных артериях свиней in vivo (Morishige et al. 2000, J. Am. Coll. Cardiol. 35: 1040-1047), таким образом, дополнительно усиливая обоснование применения CNP для прекращения гиперпролиферации VSMC.

5. Патологии сердца, в частности сердечная недостаточность и гипертрофия

Множество данных подтверждают центральную патофизиологическую роль натрийуретических пептидов в сердечнососудистых заболеваниях и, в частности, в сердечной недостаточности. Преимуществом концентрирования внимания на CNP при таких показаниях является неизменная реактивность NPR-B, в то время как показано, что активность NPR-A снижена при таком состоянии (Dickey et al. 2007, Endocrinology. 148: 3518-3522, Nakamura et al. 1994, Circulation. 90: 1210-1214). Тот факт, что содержание CNP в плазме повышено у пациентов с сердечной недостаточностью (Del Ry et al. 2005, Eur. J. Heart. Fail. 7: 1145-1148, Del Ry et al. 2007, Peptides. 28: 1068-1073), интерпретируют как часть компенсаторного сосудорасширяющего ответа периферических сосудов (Del Ry et al. 2005, Eur. J. Heart Fail. 7: 1145-1148, Wright et al. 2004, Hypertension. 43: 94-100). Традиционное лечение сердечной недостаточности нацелено на поддержание функции сердца посредством предотвращения утраты кардиомиоцитов и гипертрофии. CNP способен поддерживать функцию сердца благодаря положительному влиянию на жизнеспособность кардиомиоцитов (Rosenkranz et al. 2003, Cardiovasc Res. 57: 515-522, Tokudome et al. 2004, Endocrinology. 145: 2131-2140). CNP также снижал фиброз сердца (Horio et al. 2003, Endocrinology. 144: 2279-2284), при этом эффект был сильнее, чем при действии ANP или BNP. Результаты исследований на собаках показали возможное инотропное действие CNP (Beaulieu et al. 1997, Am. J. Physiol. 273: H1933-1940), что подтверждает предполагаемую способность CNP лечить сердечную недостаточность.

Гипертрофия сердца представляет собой увеличение органа вследствие увеличения объема его мышечных волокон. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что CNP осуществляет важные аутокринные и паракринные функции в сердце и коронарном кровообращении (D'Souza et al. 2004, Pharmacol. Ther. 101: 113-129). Показано, что введение CNP in vivo улучшает сердечную функцию и ослабляет ремоделирование сердца после инфаркта миокарда у крыс (Soeki et al. 2005, J. Am. Coll. Cardiol. 45: 608-616). В другом недавнем исследовании показано, что CNP способен уменьшать реактивную гипертрофию кардиомиоцитов после экспериментального инфаркта миокарда у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих CNP в кардиомиоцитах (Wang et al. 2007, Eur. J. Heart Fail. 9: 548-557).

6. Сердечнососудистые патологии, в частности атеросклероз, гипертензия, эндотелиальная дисфункция и тромботические события

Атеросклероз является хронической воспалительной реакцией в стенках артериальных кровеносных сосудов. Полученные in vitro данные свидетельствуют, что CNP играет роль ингибитора в пролиферации и миграции гладкомышечных клеток сосудов (Furuya et al. 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177: 927-931, Shinomiya et al. 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 1051-1056). Натрийуретический пептид типа C ингибировал утолщение неоинтимы в поврежденных артериях кроликов и крыс in vivo (Furuya et al. 1995, Ann. NY Acad. Sci. 748: 517-523, Ueno et al. 1997, Circulation. 96: 2272-2279). В экспериментальной модели атеросклероза у кроликов, локальная инфузия CNP приводила к сохранению эндотелиальной функции и предотвращению утолщения неоинтимы, которое в норме возникает в результате повреждения эндотелия (Gaspari et al. 2000, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27: 653-655).

Легочная гипертензия является прогрессирующим заболеванием, характеризуемым повышенным давлением в артериальной системе легких. Обычное лечение заключается в применении сосудорасширяющих веществ. Способность CNP расслаблять артерии, вероятно, благодаря прямому взаимодействию с VSMC, было показано ранее на изолированных коронарных артериях свиней (Marton et al. 2005, Vascul. Pharmacol. 43: 207-212). Более конкретно, CNP способен ослаблять индуцированную монокроталином легочную гипертензию у крыс и повышать жизнеспособность (Itoh et al. 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170: 1204-1211), даже если лечение с использованием CNP начинали через 3 недели после появления симптомов.

Эндотелиальная дисфункция играет важную роль в развитии атеросклероза и рестеноза. В модели на кроликах с признаками, сходными с признаками ранней стадии атеросклероза или рестеноза, хроническое периартериальное введение ANP или CNP предотвращало эндотелиальную дисфункцию и развитие неоинтимы (Gaspari et al. 2000, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27: 653-655, Barber et al. 2005, J. Vase Res. 42: 101-110).

Предотвращение тромботических событий важно при лечении сердечнососудистых заболеваний. Противотромботическое действие CNP хорошо известно (Ahluwalia et al. 2004, Basic Res. Cardiol. 99: 83-89). Образование тромба было значительно подавлено в присутствии CNP в аутологичных трансплантатах яремных вен кролика (Ohno et al. 2002, Circulation. 105: 1623-1626). В модели поврежденных при введении баллона сонных артериях кролика показано, что CNP проявляет противотромботическую активность, вероятно, посредством увеличения продукции NO при усилении экспрессии индуцируемой NO-синтазы (Qian et al. 2002, Circ. Res. 91: 1063-1069).

7. Стимуляция артериогенеза

Артериогенез относится к росту коллатеральных артериол в функциональные коллатеральные артерии и связан с повышенным кровяным давлением и увеличенным потоком, вызывающим сдвиговое напряжение на стенку артериол. Стимуляция такого процесса представляет собой методику лечения окклюзионных заболеваний артерий (van Royen et al. 2001, Cardiovasc. Res. 49: 543-553). Полезное действие ANP на коронарный коллатеральный кровоток показано ранее (Kyriakides et al. 1998, Clin. Cardiol. 21: 737-742).

8. Воспаление, в частности, снижение уровня медиаторов воспаления, например, TNF-альфа, других цитокинов или любого типа медиатора воспаления

Несколько публикаций свидетельствуют о роли CNP в модулировании воспалительных реакций: в модели поврежденных при введении баллона сонных артерий кролика экспрессия CNP in vivo снижала экспрессию маркера воспаления ICAM-1 и снижала инфильтрацию макрофагов, возможно, вследствие усиления образования NO (Qian et al. 2002, Circ Res 91: 1063-1069). В другом исследовании в гладкомышечных клетках аорты крыс in vitro CNP усиливал активацию транскрипции iNOS, индуцированной воспалительными цитокинами (интерлейкином-1 и фактором некроза опухолей-α), и следовательно, продукцию NO (Marumo et al. 1995, Endocrinology. 136: 2135-2142). Инфузия CNP у крыс с острым экспериментальным миокардитом приводила к снижению инфильтрации CD68-позитивных воспалительных клеток и пониженным уровням хемоаттрактантного белка-1 моноцитов в миокарде и сыворотке (Obata et al. 2007, Biochem. Biophys. Res. Commun. 356: 60-66). Благодаря избирательному ослаблению экспрессии P-селектина CNP подавлял у мышей роллинг лейкоцитов, индуцированный IL-1β или гистамином, быстрым, обратимым и зависимым от концентрации образом (Scotland et al. 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 14452-14457). В модели индуцированного блеомицином фиброза легких у мышей инфузия CNP заметно снижала уровни IL-1β в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (Murakami et al. 2004, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L1172-1177).

9. Патологическая адгезия лейкоцитов на эндотелии и диапедез в ткани

В мышиных мезентериальных посткапиллярных венулах in vivo у животных с высокой базальной активацией лейкоцитов (у мышей, нокаутированных по эндотелиальной синтазе окиси азота) или при острых воспалительных состояниях (индуцированных IL-1β или гистамином) CNP подавлял базальный роллинг лейкоцитов быстрым, обратимым и зависимым от концентрации образом. CNP также способен ингибировать взаимодействия тромбоцитов-лейкоцитов (Scotland et al. 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 14452-14457). В модели индуцированного блеомицином фиброза легких у мышей инфузия CNP в течение 14 дней значимо ингибировала инфильтрацию макрофагов в альвеолярные и интерстициальные области (Murakami et al. 2004, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L1172-1177). Также известно, что CNP снижает экспрессию молекул клеточной адгезии, таких как ICAM-1 (Qian et al. 2002, Circ. Res. 91: 1063-1069) и P-селектин (Scotland et al. 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 14452-14457), что дополнительно подтверждает его роль в модулировании молекул адгезии.

10. Заболевание почек, в частности, почечная недостаточность, почечная недостаточность вследствие сниженной перфузии почек, гломерулонефрит и фиброз почек

Ранее была показана локальная продукция CNP и экспрессия рецептора CNP в клубочках (Terada et al. 1994, Am. J. Physiol. 267: F215-222, Lohe et al. 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6: 1552-1558, Mattingly et al. 1994, Kidney Int. 46: 744-747, Dean et al. 1994, Am. J. Physiol. 266: F491-496), в клетках почек (Zhao et al. 1994, Kidney Int. 46: 717-725) и в мезангиальных клетках (Suga et al. 1992, Hypertension, 19: 762-765), что свидетельствует о роли в физиологии почек. При некоторых состояниях уровни CNP в плазме и моче изменяются. Уровень CNP в плазме и моче возрастает при нефротическом синдроме (Cataliotti et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 283: F464-472), уровень CNP возрастал в моче при циррозе с почечной недостаточностью (Gulberg et al. 2000, Gut. 47: 852-857), уровни CNP в почках и моче возрастали при экспериментальном диабете (Shin et al. 1998, J. Endocrinol. 158: 35-42), и уровни NP повышались при хроническом заболевании почек, но снижались после гемодиализа или трансплантации (Horl 2005, J. Investig. Med. 53: 366-370).

Польза применения CNP при таких показаниях, как почечная недостаточность и отказ в работе почек, обусловлена его способностью приводить к расслаблению гладких мышц в артериальных кондуитах (Drewett et al. 1995, J. Biol. Chem. 270: 4668-4674, Madhani et al. 2003, Br. J. Pharmacol. 139: 1289-1296), к расширению вен (Chen and Burnett 1998, J. Cardiovasc. Pharmacol. 32 Suppl. 3: S22-28, Wei et al. 1993, J. Clin. Invest. 92: 2048-2052) и расширению как приносящих, так и выносящих артериол в клубочках, как показано в гидронефротических почках крыс (Endlich and Steinhausen 1997, Kidney Int. 52: 202-207).

Гломерулопатии, подобные гломерулонефриту, обычно ассоциированы с пролиферацией мезангиальных клеток и инфильтрацией лейкоцитов (Buschhausen et al. 2001, Cardiovasc. Res. 51: 463-469). Ингибирующее действие CNP на инфильтрацию лейкоцитов вследствие понижающей регуляции ICAM-1 было показано ранее (Qian et al. 2002, Circ. Res. 91: 1063-1069, Buschhausen et al. 2001, Cardiovasc. Res. 51: 463-469). Кроме того, все NP оказывали антипролиферативное влияние на мезангиальные клетки in vitro в исследованиях на клетках крыс (Suganami et al. 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12: 2652-2663). In vivo инфузия CNP ослабляла опосредованный иммунной системой гломерунефрит в крысиной мезангиопролиферативной модели анти-Thy 1.1 (Canaan-Kuhl et al. 1998, Kidney Int. 53: 1143-1151). В еще одном исследовании CNP ингибировал пролиферацию мезангиальных клеток клубочков, секрецию MCP-1 и снижал продукцию коллагена IV мезангиальными клетками (Osawa et al. 2000, Nephron. 86: 467-472).

Ингибирующее влияние CNP на пролиферацию мезангиальных клеток клубочков (Suganami et al. 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12: 2652-2663, Canaan-Kuhl et al. 1998, Kidney Int. 53: 1143-1151, Osawa et al. 2000, Nephron. 86: 467-472) свидетельствует о его применимости для лечения фиброза почек.

11. Заболевания печени, в частности, портальная гипертензия, цирроз печени, асциты печени, фиброз печени и гепаторенальный синдром

Данные о локальной системе натрийуретических пептидов в печени человека получены на основе анализа мРНК; могут быть выявлены специфичные транскрипты для всех трех NPR, а именно NPR-A, NPR-B и NPR-C, наряду с мРНК для ANP и CNP, но не BNP (Vollmar et al. 1997, Gut. 40: 145-150). При хронических заболеваниях печени полагают, что звездчатые клетки печени играют роль в патогенезе фиброза печени и портальной гипертензии (Friedman 1993, N. Engl. J. Med. 328: 1828-1835), приобретают фенотип миофибробластов, пролиферируют и синтезируют компоненты, ассоциирующие с фиброзом. Показано, что активация NPR-B под действием CNP в миофибробластных звездчатых клетках печени ингибирует рост и сокращение (Tao et al. 1999, J. Biol. Chem. 274: 23761-23769), что свидетельствует о том, что при хронических заболеваниях печени CNP может противодействовать фиброгенезу в печени и ассоциированной портальной гипертензии.

Цирроз печени является результатом хронического заболевания печени, характеризуемого заменой печеночной ткани тканью фиброзного рубца. Присутствие CNP в почках и моче человека (Mattingly et al. 1994, Kidney Int. 46: 744-747) свидетельствует о роли CNP в гомеостазе жидкости и электролитов и, вероятно, о роли в нарушениях функции почек у пациентов с циррозом печени. Уровень CNP в моче пациентов с циррозом с нарушенной функцией почек возрастал, тогда как уровни в плазме были нормальными (Gulberg et al. 2000, Gut. 47: 852-857). У пациентов с циррозом инфузия ANP снижала давление в воротной вене и увеличивала кровоток в печени, являющийся показателем снижения внутрипеченочного сопротивления потоку в воротной вене (Brenard et al. 1992, J. Hepatol. 14: 347-356). Введение фармакологических доз CNP крысам с циррозом значимо снижало давление в воротной вене и сопротивление периферических сосудов и увеличивало сердечный выброс (Komeichi et al. 1995, J. Hepatol. 22: 319-325).

Многие нарушения могут вызывать асциты, но наиболее распространен цирроз. Следовательно, лечение таких нарушений, как цирроз печени, в конечном итоге поможет избежать асцитов.

Согласно теории вазодилатации гепаторенальный синдром является результатом влияния систем вазоконстрикторов, действующих на почечное кровообращение. Вследствие такой повышенной активности систем вазоконстрикторов перфузия почек и скорость клубочковой фильтрации заметно снижаются, тогда как функция канальцев сохраняется. Таким образом, любое вещество, которое увеличивает перфузию почек и/или скорость клубочковой фильтрации, подходит для применения в случае гепаторенального синдрома.

12. Заболевания легких, в частности, легочная гипертензия, астма и фиброз легких

Показано, что CNP локально синтезируется в тканях легких и поэтому может оказывать влияние на проходимость дыхательных путей (Suga et al. 1992, Circ. Res. 71: 34-39). CNP in vitro на порядок более эффективен чем ANP в отношении продукции цГМФ в культивируемых гладкомышечных клетках аорты.

Легочная гипертензия является прогрессирующим заболеванием, характеризуемым повышенным давлением в артериальной системе легких. Обычное лечение заключается в применении сосудорасширяющих веществ. Способность вызывать расслабление артерий, вероятно, вследствие прямого взаимодействия с VSMC, показана ранее в изолированных коронарных артериях свиней (Marton et al. 2005, Vascul. Pharmacol. 43: 207-212). Более конкретно, CNP способен ослаблять индуцированную монокроталином легочную гипертензию у крыс и повышать жизнеспособность (Itoh et al. 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170: 1204-1211), даже если лечение с использованием CNP начинали через 3 недели после появления симптомов.

В модели индуцированной овальбумином астмы у морских свинок CNP был способен значимо ингибировать бронхоконстрикцию и капиллярное просачивание зависимым от дозы образом (Ohbayashi et al. 1998, Eur. J. Pharmacol. 346: 55-64). У астматиков in vivo Fluge с соавторами смогли продемонстрировать зависимые от дозы бронходилатирующие свойства внутривенного натрийуретического пептида (Fluge et al. 1995, Regul. Pept. 59: 357-370).

В модели индуцированного блеомицином фиброза легких у мышей инфузия CNP заметно ослабляла фиброз, как показано по значимому снижению оценки в баллах по шкале Эшкрофта и снижению содержания гидроксипролина в легких (Murakami et al. 2004, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287: L1172-1177). Иммуногистохимия на срезах легких выявила значимо сниженную инфильтрацию макрофагов в альвеолярные и интерстициальные области. Заметно сниженное количество Ki-67-позитивных клеток в фиброзных повреждениях легкого дополнительно подтверждает точку зрения об антипролиферативном влиянии CNP на фиброз легких.

13. Проблемы мужской и женской фертильности, в частности, эректильная дисфункция, стимуляция мужской фертильности и стимуляция женской фертильности

Пенильная эрекция зависит от расслабления гладкой мышцы пещеристого тела, одной из губчатых областей кавернозной ткани. Присутствие NPR-B в мембране пещеристого тела крыс и кроликов показано Kim с соавторами (Kim et al. 1998, J. Urol. 159: 1741- 1746). Kim с соавторами также показали, что CNP может запускать продукцию цГМФ в такой ткани, и что при этом CNP намного более эффективен, чем BNP и ANP. Также показано, что NPR-B локализован в пещеристом теле полового члена человека; в исследованиях с использованием инкубации органов на полосках мышц пещеристого тела CNP в концентрации от 0,1 нМ до 1 мкМ приводил к расслаблению гладких мышц от 5% до 40% (Kuthe et al. 2003, J. Urol. 169: 1918-1922); дополнительное подтверждение роли CNP в эректильной дисфункции получено в недавнем исследовании, показывающем, что уровни CNP ассоциированы с присутствием, тяжестью и продолжительностью эректильной дисфункции (Vlachopoulos et al. 2008, Eur. Urol., в печати).

Обоснование применения CNP для стимуляции мужской фертильности основано на его возможной функции в кровоснабжении семенников, модулировании развития зародышевых клеток и подвижности сперматозоидов и его роли в пенильной эрекции (которая описана выше). CNP обнаружен в семенной плазме некоторых видов (Hosang and Scheit 1994, DNA Cell Biol. 13: 409-417, Chrisman et al. 1993, J. Biol. Chem. 268: 3698-3703); клетки Лейдига человека, расположенные вблизи семенных канальцев в семенниках, содержат CNP и рецептор NPR-B (Middendorff et al. 1996, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 4324-4328). CNP способен увеличивать уровни тестостерона in vitro в очищенных клетках Лейдига мыши (Khurana and Pandey 1993, Endocrinology, 133: 2141-2149), а также in vivo в вене яичка у мужчин (Foresta et al. 1991, J. Clin. Endocrinol. Metab. 72: 392-395). Поскольку тестостерон активирует инициацию, протекание и поддержание сперматогенеза, то, следовательно, CNP оказывает непосредственное влияние на сперматогенез. Местная инъекция натрийуретических пептидов in vivo крысам вызывала зависимое от дозы увеличение кровотока в семенниках (Collin et al. 1997, Int. J. Androl. 20: 55-60).

Предположение о функция CNP в оплодотворении, беременности и эмбриональном развитии сначала было сделано после выявления CNP в семенной плазме свиней (Chrisman et al. 1993, J. Biol. Chem. 268: 3698-3703). Дальнейшие исследования выявили экспрессию рецепторов NPR-A и -B в плаценте человека (Itoh et al. 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 602-607) и ее модулирование в яичниках и матке крыс в ходе эстрального цикла (Huang et al. 1996, Am. J. Physiol. 271: H1565-1575, Dos Reis et al. 1995, Endocrinology, 136: 4247-4253, Noubani et al. 2000, Endocrinology, 141: 551-559). У мышей концентрации мРНК CNP в матке возрастали во время беременности, тогда как в яичниках уровни снижались по сравнению с контрольными небеременными мышами (Stepan et al. 2001, Regul. Pept. 102: 9-13). В плаценте и миометрии человека CNP экспрессировался независимо от срока беременности в третьем триместре. При беременности с задержкой внутриутробного развития наблюдали противоположную регуляцию CNP в плаценте и миометрии, что свидетельствует о специфичной для органа функции пептида в репродуктивной ткани человека (Stepan et al. 2002, Fetal Diagn. Ther. 17: 37-41). Такая функция была подтверждена при исследовании нокаутированных по NPR-B мышей; самки мышей были бесплодными вследствие нарушения развития половых путей самок (Tamura et al. 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 17300-17305).

14. Преэклампсия и/или преждевременные роды

Преэклампсия, гипертензивное нарушение при беременности, обычно ассоциировано с повышенным кровяным давлением и поражает примерно 2-8% беременных. Неполноценное поступление крови к плаценте приводит к эндотелиальной дисфункции, в конечном счете, приводящей к повреждению материнского эндотелия и почек и печени. При тяжелой преэклампсии уровни BNP повышены, что может отражать напряжение желудочка и/или субклиническую дисфункцию сердца, ассоциированную с таким состоянием (Resnik et al. 2005, Am. J. Obstet. Gynecol. 193: 450-454). У беременных с задержкой внутриутробного развития или преэклампсии наблюдается противоположная регуляция CNP со снижением в плаценте и увеличением в миометрии по сравнению с состоянием нормальной беременности (Stepan et al. 2002, Fetal Diagn. Ther. 17: 37-41), тогда как уровни CNP в плазме матери оставались постоянными; полученные данные могут свидетельствовать о компенсаторной или причинной специфичной для органа функции пептида в репродуктивной ткани человека при таких патофизиологических состояниях, что свидетельствует о том, что применение CNP может быть полезным.

15. Нарушения роста скелета, в частности, низкий рост (карликовость).

Карликовость может быть вызвана более чем 200 разными патологическими состояниями. Натрийуретический пептид C-типа, действующий через свой рецептор, NPR-B, играет важную роль в росте трубчатых костей (Olney 2006, Growth Horm. IGF Res. 16 Suppl. A: S6-14), так как он стимулирует эндохондриальное окостенение (Tamura et al. 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 17300-17305, Miyazawa et al. 2002, Endocrinology, 143: 3604-3610). Спонтанная аутосомная рецессивная точечная мутация в гене CNP, называемая аномалией длинных костей (lbab), вызывает тяжелую карликовость у мышей (Yoder et al. 2008, Peptides. 29: 1575-1581, Tsuji et al. 2008, Biochem. Biophys. Res Commun. 376: 186-190). Полное отсутствие CNP у мышей приводило к карликовости и ранней гибели (Chusho et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021).

16. Дефекты передачи сигнала FGF-R (рецептора, полученного из тромбоцитов фактора роста), в частности, гиперактивность FGF-R или недостаточность CNP или остеокрина или пониженный уровень CNP или остеокрина в пластинках роста длинных костей

Исследования in vitro и ex vivo показали, что CNP действует в пластинке роста. CNP, наиболее вероятно синтезируемый пролиферирующими хондроцитами (Chusho et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021), действует локально, стимулируя дальнейшую пролиферацию. Известно, что в качестве противоположного элемента путь FGF/FGFR-3 негативно регулирует эндохондриальное окостенение посредством активации пути MAP-киназ Erk, таким образом ингибируя пролиферацию хондроцитов и продукцию хрящевого матрикса (Krejci et al. 2005, J. Cell Sci. 118: 5089-5100). Целенаправленная сверхэкспрессия CNP в хондроцитах корректирует карликовость в мышиной модели ахондроплазии с активированным рецептором фактора роста фибробластов 3 в хряще, свидетельствуя о прямом взаимодействии их путей передачи сигнала (Yasoda et al. 2004, Nat Med. 10:80-86). Кроме того, Ozasa с соавторами обнаружили, что CNP способен антагонизировать активацию каскада MAPK под действием FGF, делая путь CNP/NPR-B привлекательным в качестве новой терапевтической мишени при лечении ахондроплазии (Ozasa et al. 2005, Bone. 36: 1056-1064). CNP также частично антагонизировал FGF2-индуцированную экспрессию, высвобождение и активацию некоторых ремодулирующих матрикс молекул, включая несколько металлопротеиназ матрикса. Независимо от передачи сигнала FGF CNP симулировал повышающую регуляцию образования матрикса (Krejci et al. 2005, J. Cell Sci. 118: 5089-5100).

Остеокрин является специфичным лигандом клиренс-рецептора натрийуретического пептида NPR-C, который модулирует рост костей (Thomas et al. 2003, J. Biol. Chem. 278: 50563-50571). Благодаря блокированию клиренс-функции NPR-C он вызывает локальное повышение уровней CNP, приводя к пролиферации хондроцитов (Moffatt et al. 2007, J. Biol. Chem. 282: 36454-36462).

Итак, существуют серьезные доводы в пользу применения CNP, чтобы компенсировать сверхактивные рецепторы FGF и в случае недостаточности или пониженных уровней CNP или остеокрина.

17. Артрит, в частности, дегенеративные заболевания хрящевой ткани, остеоартрит и дегенерация хряща и артрит в ответ на травматическое повреждение хряща

Обоснованием применения натрийуретических пептидов для лечения и/или профилактики артритных заболеваний является обнаружение того, что CNP вовлечен в рост скелета, в частности, в образование внеклеточного хрящевого матрикса (Chusho et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021, Yasoda et al. 2004, Nat. Med. 10: 80-86), который способен стабилизировать поврежденный хрящ.

Показано, что истощение CNP приводит к нарушению роста костей, подобно нарушению, наблюдаемому в случае ахондропластических костей, со сходной гистологической картиной уменьшенной толщины слоев пролиферирующих и гипертрофических хондроцитов в пластинке роста (Chusho et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021). Целевая сверхэкспрессия CNP в хондроцитах противодействовала развитию карликовости в мышиной модели ахондроплазии с активированным рецептором фактора роста фибробластов 3 в хряще. CNP корректировал сниженный синтез внеклеточного матрикса в пластинке роста посредством ингибирования MAPK-пути передачи сигнала FGF, приводя к стимуляции синтеза глюкозаминогликана и коллагена хряща (типа II) (Yasoda et al. 2004, Nat. Med. 10: 80-86).

В хондроцитах крыс при хондросаркоме после опосредованной FGF2 задержки роста CNP опосредовал ингибирование индукции MMP и стимулировал синтез внеклеточного матрикса (Krejci et al. 2005, J. Cell Sci. 118: 5089-5100, Ozasa et al. 2005, Bone, 36: 1056-1064), оба эффекта приводили к общему увеличению внеклеточного матрикса хряща (Krejci et al. 2005, J. Cell Sci. 118: 5089-5100).

18. Конструирование ткани и регенерация хряща, в частности, в случае размножения хрящевых клеток ex vivo до получения количества клеток, достаточного для того, чтобы снова трансплантировать клетки пациенту

CNP обладает стимулирующей активностью по отношению к синтезу глюкозаминогликана и коллагена хряща (типа II) в хондроцитах (Krejci et al. 2005, J. Cell Sci. 118: 5089-5100, Yasoda et al. 2004, Nat Med. 10: 80-86), признаком, который полезен для регенерации хряща in vivo. Чтобы получить ex vivo ткань из ограниченного количества клеток, которые могут быть выделены из организма человека, для терапевтических целей, он также должен стимулировать пролиферацию клеток. В основной публикации Waldman с соавторами сообщалось, что в культурах 3D высокой плотности низкие дозы CNP (от 10 до 100 пМ) вызывали пролиферацию хондроцитов с увеличением клеточности до 43% при самой высокой дозе. Более высокие дозы CNP (10 нМ), главным образом, стимулировали накопление матрикса, не затрагивая клеточность ткани (Waldman et al. 2008, Tissue Eng. Part A. 14: 441-448). Таким образом, CNP подходит в качестве модулятора как пролиферации хондроцитов, так и накопления ECM во время роста хряща in vitro.

19. Конструирование ткани и регенерация кости, в частности, для ускорения срастания костей или для улучшения регенерации костной ткани

Роль системы NPR-B/CNP в качестве важного регулятора роста костей установлена в нескольких публикациях: у нокаутированных по NPR-B мышей наблюдали сниженный рост костей (Tamura et al. 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 17300-17305, Pfeifer et al. 1996, Science, 274: 2082-2086); у мышей с делецией гена CNP также наблюдали сниженный рост костей, и такой фенотип может быть снят при сверхэкспрессии CNP в хондроцитах (Chusho et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021); сверхэкспрессия BNP у мышей приводила к чрезмерному росту скелета (Suda et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2337-2342). Более конкретно, CNP способен стимулировать пролиферацию хондроцитов и образование матрикса (Krejci et al. 2005, J. Cell Sci. 118: 5089-5100, Ozasa et al. 2005, Bone, 36: 1056-1064). Используя органную культуру большеберцовых костей зародышей мышей, модель эндохондриального окостенения in vitro, рост длинных костей стимулировали, используя CNP (Yasoda et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 11695-11700).

Итак, экспериментальные данные убедительно подтверждают применимость CNP для регенерации костей.

20. Модулирование активности нейронов, в частности, в случае замещения «центральной нервной функции» CNP

Широкое распространение рецептора NPR-C в стволе головного мозга свидетельствует об участии NPR-C в нейромодулирующем действии натрийуретических пептидов (Abdelalim et al. 2008, Neuroscience, 155: 192-202), которые, как было показано, вызывают разнообразные периферические эффекты в случае применения на головном мозге (Puurunen and Ruskoaho 1987, Eur. J. Pharmacol. 141: 493-495, Bianciotti et al. 2001, Regul. Pept. 102: 127-133). Интрацеребровентрикулярное введение атриального натрийуретического пептида анестезированным крысам, например, приводило к стимуляции секреции кислоты в желудке, которая полностью прекращалась при ваготомии, что свидетельствует об участии блуждающего нерва (Puurunen and Ruskoaho 1987, Eur. J. Pharmacol. 141: 493-495). В двух исследованиях Sabbatini с соавторами церебровентрикулярное введение CNP крысам зависимым от дозы образом усиливало экзокринную выработку панкреатического сока посредством активации рецептора NPR-C и ваго-вагального рефлекса (Sabbatini et al. 2005, Eur. J. Pharmacol. 524: 67-74, Sabbatini et al. 2007, Eur. J. Pharmacol. 577: 192-202), таким образом, имитируя влияние эндогенного CNP.

21. Злокачественная опухоль, использование ингибирования пролиферации опухолевых клеток, в частности, клеток глиомы, клеток нейробластомы, клеток аденокарциномы, клеток аденокарциномы в головном мозге, поджелудочной железе и простате, клеток меланомы и клеток карциномы почек

В нескольких публикациях показано присутствие рецепторов натрийуретических пептидов на опухолевых клетках, что свидетельствует о возможности влияния на пролиферацию таких клеток посредством применения CNP, как было показано на ряде других типов клеток.

Ранее полученные данные исследований in vitro на культивируемых клетках глиомы крыс показали присутствие рецепторов на таких клетках, которые подвергались наиболее сильной активации под действием CNP, т.е. продуцировали цГМФ (Eguchi et al. 1992, Eur. J. Pharmacol. 225: 79-82). В другой линии клеток, линии опухолевых клеток гипофиза AtT-20, единственным натрийуретическим рецептором на поверхности клеток был рецептор NPR-B. CNP стимулировал продукцию цГМФ в таких клетках AtT-20 до 200 раз (Gilkes et al. 1994, Biochem. J. 299 (Pt 2): 481-487).

С помощью Вестерн-иммуноблоттинга идентифицировали рецепторы NPR-A и NPR-C в клетках аденокарциномы ободочной кишки человека. Применение 1 мМ ANP на таких клетках приводило к снижению до 97% количества клеток в течение 24 часов, что свидетельствует об антипролиферативной активности (Gower et al. 2005, Int. J. Gastrointest. Cancer. 36: 77-87).

CNP вызывал 39% снижение количества клеток мелкоклеточного рака легкого в концентрации 100 мкМ. Механизм ингибирования роста предположительно основан на ингибировании синтеза ДНК, частично опосредованном цГМФ (Vesely et al. 2005, Eur. J. Clin. Invest. 35: 388-398).

В еще одном типе клеток, в клетках карциномы почек человека, CNP также снижал количество клеток в концентрации 100 мкМ на 10%. Такой эффект поддерживался без пролиферации клеток в течение трех суток после обработки CNP. Все три типа рецепторов натрийуретических пептидов, NPR-A, NPR-B и NPR-C, были выявлены на клетках рака почек (Vesely et al. 2006, Eur. J. Clin. Invest. 36: 810-819).

22. Фиброз, в частности, фиброз легких, фиброз почек, фиброз сердца, фиброз печени или системный фиброз/склероз

В нескольких исследованиях, посвященных изучению явлений фиброза в разных системах органов, показано, что применение натрийуретических пептидов, в частности, CNP, оказывало полезное влияние на прогрессирование заболевания. Более общим эффектом CNP-опосредованного образования цГМФ в фибробластах является блокирование активации каскада протеинкиназ, активируемых митогенами (Chrisman and Garbers 1999, J. Biol. Chem. 274: 4293-4299), что может быть использовано для лечения любого вида фиброза, в частности, полиорганного системного фиброза/склероза; возможность лечения фиброза одного органа с использованием CNP подтверждается следующими данными.

В модели индуцированного блеомицином фиброза легких у мышей инфузия CNP заметно снижала уровни воспалительного IL-1β в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, ингибировала инфильтрацию макрофагов в альвеолярные и интерстициальные области и заметно ослабляла фиброз, как показано по значимому снижению оценки в баллах по шкале Эшкрофта и снижению содержания гидроксипролина в легких (Murakami et al. 2004, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287: L1172-1177).

Что касается фиброза почек, то было описано, что CNP оказывал ингибирующее влияние на пролиферацию мезангиальных клеток клубочков (Suganami et al. 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12: 2652-2663, Canaan-Kuhl et al. 1998, Kidney Int. 53: 1143-1151, Osawa et al. 2000, Nephron. 86: 467-472). В частности, CNP также ингибировал секрецию MCP-1 и снижал продукцию коллагена IV мезангиальными клетками клубочков (Osawa et al. 2000, Nephron. 86: 467-472).

Фиброз сердца, характеризуемый пролиферацией интерстициальных фибробластов и биосинтезом компонентов внеклеточного матрикса в желудочках сердца, является следствием процессов ремоделирования. Soeki с соавторами показали, что применение CNP улучшало функцию сердца и защищало от ремоделирования сердца после инфаркта миокарда у крыс (Soeki et al. 2005, J. Am. Coll. Cardiol. 45: 608-616). In vitro в фибробластах сердца CNP оказывал подавляющее действие на пролиферацию фибробластов и продукцию внеклеточного матрикса, при этом эффект был сильнее, чем в случае ANP или BNP (Horio et al. 2003, Endocrinology, 144: 2279-2284).

Полагают, что при хронических заболеваниях печени звездчатые клетки печени играют роль в патогенезе фиброза печени и портальной гипертензии (Friedman 1993, N. Engl. J. Med. 328: 1828-1835), приобретают фенотип миофибробластов, пролиферируют и синтезируют компоненты, ассоциируют с фиброзом. Показано, что активация NPR-B под действием CNP в миофибробластных звездчатых клетках печени ингибирует рост и сокращение (Tao et al. 1999, J. Biol. Chem. 274: 23761-23769), что свидетельствует о том, что при хронических заболеваниях печени CNP может противодействовать фиброгенезу.

C. Фармацевтические препараты

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, один новый агонист NPR-B, описанный в настоящей публикации, относятся к лечению или профилактике заболевания у субъекта, которое ассоциировано с повышенным ВГД, глаукомы, офтальмогипертензии и/или утраты ганглиозных клеток сетчатки.

1. Эффективное количество

В используемом в настоящем описании смысле термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству средства, которое будет активировать функцию и/или активность рецептора натрийуретического пептида типа B. Новые агонисты NPR-B, описанные в настоящей публикации, снижают внутриглазное давление или позволяют лечить офтальмогипертензию у пациентов, имеющих повышенное ВГД или офтальмогипертензию. Таким образом, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для того, чтобы заметно и многократно ослаблять, снижать, минимизировать или ограничивать степень любого заболевания, ассоциированного с повышенным внутриглазным давлением или офтальмогипертензией, такого как любое из заболеваний, обсуждаемых выше.

Способы лечения и/или профилактики будут заключаться в лечении индивидуума с использованием эффективного количества композиции, содержащей терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного агониста NPR-B согласно изобретению. Терапевтически эффективное количество, главным образом, описано как такое количество, которое, как известно или как предполагается, является полезным в отношении уменьшения признаков или симптомов заболевания. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективным количеством обычно является количество, которое, как известно или как предполагается, полезно в отношении уменьшения признаков или симптомов глаукомы и ассоциированного повреждения зрительного нерва или сетчатки у субъекта. Предполагается, что лечение агонистами NPR-B будет стабилизировать или улучшать зрительную функцию (на основании измерения остроты зрения, поля зрения или на основании другого способа, известного специалисту в данной области).

В некоторых вариантах эффективное количество агониста NPR-B, которое можно вводить субъекту, включает дозу примерно от 1 микрограмм/кг массы тела до примерно 500 микрограмм/кг массы тела или больше на одно введение и дозу в любом производном диапазоне.

2. Препараты

Для способов, описанных в настоящей публикации агонист NPR-B может быть приготовлен любым образом, известным специалистам в данной области. В композициях, описанных в настоящей публикации, концентрация агониста NPR-B может представлять собой любую концентрацию, которая, как известно или предполагается специалистами в данной области, полезна для лечения и/или профилактики глазной болезни, ассоциированной с повышенным внутриглазным давлением или офтальмогипертензией.

Фактическое дозовое количество композиции согласно настоящему изобретению, вводимое субъекту, можно определить по физическим и физиологическим показателям, таким как масса тела, тяжесть состояния, тип заболевания, подвергаемого лечению, предыдущее или настоящее терапевтическое вмешательство, индивидуальность пациента и путь введения. Лечащий врач, отвечающий за введение, в любом случае будет определять концентрацию активного ингредиента(ов) в композиции и подходящую дозу (дозы) для конкретного пациента.

В некоторых неограничивающих вариантах офтальмологические фармацевтические композиции могут содержать, например, по меньшей мере, примерно 0,03% (массовых или объемных) активного ингредиента. В других вариантах активный ингредиент может составлять примерно от 0,001% до примерно 75% (массовых или объемных) единицы дозирования или примерно от 0,01% до примерно 60% и может входить в любой производный диапазон. В более конкретных вариантах фармацевтическая композиция может содержать примерно от 0,03% до примерно 2,0% (массовых или объемных) активного ингредиента. В более конкретных вариантах композиция содержит примерно от 0,05% до примерно 1,5% (массовых или объемных) активного ингредиента. В следующих вариантах композиция содержит примерно от 0,05% до примерно 1,2% (массовых или объемных) активного ингредиента.

Доза может содержать любое количество фармацевтической композиции, которое, как известно или как предполагается, является терапевтически полезным. Например, доза может составлять от 1 микрограмма/кг массы тела до примерно 500 микрограмм/кг массы тела или больше на одно введение, и доза может быть в любом производном диапазоне. При необходимости, которая определяется специалистом в данной области, доза может быть многократной, что добиться требуемого терапевтического эффекта. Например, дозу можно повторять один раз, два раза, три раза и так далее. В некоторых вариантах дозу вводят дважды в сутки, три раза в сутки, четыре раза в сутки или более часто. В следующих вариантах дозу вводят через день, дважды в неделю, один раз в месяц или с более длительными интервалами.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции, описанные в настоящей публикации, могут содержать более одного агониста NPR-B. Специалисту в данной области может быть известно получение и введение фармацевтических композиций, которые содержат более одного терапевтического средства. В некоторых вариантах композиция содержит один или несколько дополнительных терапевтических средств, которые не являются агонистами NPR-B.

Кроме агонистов NPR-B композиции согласно настоящему изобретению необязательно содержат один или несколько эксципиентов. Эксципиенты, обычно используемые в фармацевтических композициях, включают без ограничения носители, средства для тоничности, консерванты, хелаторы, буферные средства, поверхностно-активные вещества и антиоксиданты.

Специалисту в данной области будет понятно, что композиции согласно настоящему изобретению могут содержать любое количество сочетаний ингредиентов (например, активное средство, полимеры, эксципиенты и т.д.). Также предполагается, что концентрации таких ингредиентов могут варьировать. В неограничивающих аспектах процентное содержание каждого ингредиента в композиции можно вычислить по массе или объему от общей массы или объема композиции. Специалисту в данной области будет понятно, что концентрации могут варьировать в зависимости от добавления, замены и/или удаления ингредиентов из данной композиции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конкретное количество агониста NPR-B вводят, используя композиции, описанные в настоящей публикации.

Фраза «фармацевтически приемлемый носитель» известна в данной области и относится, например, к фармацевтически приемлемым веществам, композициям или наполнителям, таким как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующее вещество, участвующее в переносе или транспортировке любой добавки или композиции или ее компонента из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами добавки и не наносящим вреда пациенту.

Любой из множества носителей можно использовать в препаратах согласно настоящему изобретению, включая воду, смеси воды и смешиваемых с водой растворителей, таких как C1-7-алканолы, растительные масла или минеральные масла, содержащие от 0,5 до 5% нетоксичных водорастворимых полимеров, натуральные продукты, такие как желатин, альгинаты, пектины, трагакантовая камедь, камедь карайя, ксантановая камедь, каррагенин, агар и аравийская камедь, производные крахмала, такие как ацетат крахмала и гидроксипропил-крахмал, а также другие синтетические продукты, такие как поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поливинилметиловый эфир, полиэтиленоксид, предпочтительно поперечно сшитая полиакриловая кислота, смеси таких полимеров. Концентрация носителя обычно составляет от 1 до 100000-кратной концентрации активного ингредиента.

Подходящие средства для корректировки тоничности включают маннит, хлорид натрия, глицерин, сорбит и тому подобные. Подходящими консервантами являются сложный эфир п-гидроксибензойной кислоты, хлорид бензалкония, бромид бензододециния, поликватерний-1 и тому подобные. Подходящие хелатирующие средства включают эдетат натрия и тому подобные. Подходящие буферные средства включают фосфаты, бораты, цитраты, ацетаты и тому подобные. Подходящие поверхностно-активные вещества включают ионогенные и неионогенные поверхностно-активные вещества, при этом предпочтительны неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полиоксиэтилированные производные касторового масла и оксиэтилированный третичный октилфенолформальдегидный полимер (тилоксапол). Подходящими антиоксидантами являются сульфиты, аскорбаты, BHA и BHT. Композиции согласно настоящему изобретению необязательно содержат дополнительное активное средство.

В конкретных вариантах композиции подходят для применения для глаз млекопитающих. Например, для глазного введения препарат может быть в виде раствора, суспензии, геля или мази.

В предпочтительных аспектах композиции, которые содержат агонисты NPR-B, могут быть приготовлены для местного применения на глазах в водном растворе в форме капель. Термин «водный» обычно означает водную композицию, в которой носитель содержит >50%, более предпочтительно >75% и, в частности, >90% масс. воды. Такие капли можно применять из ампулы, содержащей одну дозу, которая предпочтительно может быть стерильной и, следовательно, делающей ненужными бактериостатические или бактерицидные компоненты в препарате. Альтернативно, капли можно применять из флакона, содержащего несколько доз, который предпочтительно может иметь устройство, которое удаляет консервант из препарата по мере его доставки, такие устройства известны в данной области.

В других аспектах компоненты согласно изобретению могут быть доставлены в глаз в виде концентрированного геля или в сходном наполнителе, который образует растворимые вставки, которые помещают с нижней стороны век.

Композиции согласно настоящему изобретению также могут быть приготовлены в виде растворов, которые подвергаются фазовому переходу в гель при введении в глаз.

Кроме одного или нескольких агонистов NPR-B композиции согласно настоящему изобретению могут содержать другие ингредиенты в качестве эксципиентов. Например, композиции могут содержать одно или несколько фармацевтически приемлемых буферных средств, консервантов (включая консервирующие добавки), неионогенных средств для корректировки тоничности, поверхностно-активных веществ, солюбилизаторов, стабилизаторов, повышающих комфортность средств, полимеров, смягчителей, средств для корректировки pH и/или скользящих веществ.

Для местного применения на глазах препараты предпочтительно являются изотоничными или слабо гипотоническими, чтобы противодействовать гипертоничности слез, вызванной испарением и/или заболеванием. Композиции согласно настоящему изобретению обычно имеют осмоляльность в диапазоне 220-320 миллиосмоль/кг, и предпочтительно имеют осмоляльность в диапазоне 235-260 миллиосмоль/кг. Композиции согласно изобретению имеют pH в диапазоне 5-9, предпочтительно 6,5-7,5 и наиболее предпочтительно 6,9-7,4.

Препараты, описанные в настоящей публикации, могут содержать один или несколько консервантов. Примеры консервантов включают четвертичные аммониевые соединения, такие как хлорид бензалкония или хлорид бензоксония. Другие примеры консервантов включают алкилртутные соли тиосалициловой кислоты, такие как, например, тиомерсал, нитрат фенилртути, ацетат фенилртути или борат фенилртути, перборат натрия, хлорит натрия, парабены, такие как, например, метилпарабен или пропилпарабен, спирты, такие как, например, хлорбутанол, бензиловый спирт или фенилэтанол, производные гуанидина, такие как, например, хлоргексидин или бигуанид полигексаметилена, перборат натрия или сорбиновая кислота.

В некоторых вариантах агонисты NPR-B готовят в виде композиции, которая содержит один или несколько слезозаменителей. Различные слезозаменители известны в данной области и включают без ограничения: мономерные полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль и этиленгликоль; полимерные полиолы, такие как полиэтиленгликоль; сложные эфиры целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза и гидроксипропилцеллюлоза; декстраны, такие как декстран 70; водорастворимые белки, такие как желатин; виниловые полимеры, такие как поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и повидон; и карбомеры, такие как карбомер 934P, карбомер 941, карбомер 940 и карбомер 974P. Препарат согласно настоящему изобретению можно использовать с контактными линзами или другими офтальмологическими продуктами.

В некоторых вариантах композиции, описанные в настоящей публикации, имеют вязкость 0,5-10 сП, предпочтительно 0,5-5 сП и наиболее предпочтительно 1-2 сП. Такая относительно низкая вязкость обеспечивает удобство применения продукта, при этом продукт не вызывает мутности и легко подвергается обработке при производстве, транспортировке и операциях заливки.

3. Путь введения

Введение композиций согласно изобретению может быть осуществлено любым способом, известным специалистам в данной области, однако предпочтительно локальное введение. Предполагается, что можно использовать все локальные пути доставки в глаза, включая местное, субконъюнктивальное, периокулярное, ретробульбарное, субтеноновое, внутрикамерное, интравитреальное, внутриглазное, субретинальное, околосклеральное и супрахориоидальное введение. Подходящим может быть системное или парентеральное введение, включая без ограничения внутривенное, подкожное, внутримышечное введение и пероральную доставку. Наиболее предпочтительным способом введения может быть интравитреальная или субтеноновая инъекция растворов или суспензий или интравитреальное или субтеноновое размещение биологически разрушаемых или биологически неразрушаемых устройств или местное глазное введение растворов или суспензий или заднее околосклеральное введение гелевого препарата.

В свете настоящего описания специалистам в данной области будет понятно, что могут быть осуществлены очевидные модификации вариантов, описанных в настоящей публикации, не отходя от сути и не выходя за рамки объема изобретения. Все варианты, описанные в настоящей публикации, могут быть осуществлены без чрезмерного экспериментирования с учетом настоящего описания. Полный объем изобретения изложен в описании и его эквивалентных вариантах. Описание не следует рассматривать как излишне сужающее объем охраны, на который дает право настоящее изобретение.

Хотя показан и описан конкретный вариант осуществления изобретения, многочисленные изменения и альтернативные варианты могут быть придуманы специалистами в данной области. Соответственно, изобретение можно воплотить в других конкретных формах, не отходя от его сути или существенных признаков. Описанные варианты во всех отношениях необходимо считать только иллюстративными, а не ограничивающими. Поэтому объем изобретения указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в приведенном выше описании. Все изменения пунктов формулы изобретения, которые подпадают под значение и попадают в диапазон эквивалентов формулы изобретения, входят в ее объем. Кроме того, все опубликованные документы, патенты и заявки, упоминаемые в настоящем описании, включены в виде ссылки так, как будто представлены в полном виде.

D. Вторичные формы терапии

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения субъект получает одну или несколько вторичных форм терапии, направленной на лечение или профилактику конкретного заболевания глаз.

Содержащая агонист NPR-B офтальмологическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена вместе с другим средством или другим способом терапии. Например, введение человеку композиции, содержащей агонист NPR-B, согласно настоящему изобретению может предшествовать, может следовать или может быть одновременным с использованием других способов лечения глаукомы, повышенного внутриглазного давления или офтальмогипертензии. В некоторых вариантах агонист NPR-B готовят в одной и той же композиции вместе со вторичной формой терапии. В других вариантах агонист NPR-B готовят отдельно от вторичной формы терапии. Специалисту в данной области известны протоколы введения более чем одной формы фармакологического средства для лечения субъекту с заболеванием и известны способы приготовления более чем одного фармакологического средства в виде одной композиции.

Примерами вторичных терапевтических средств являются без ограничения: средств против глаукомы, такие как бета-блокаторы, включая тимолол, бетаксолол, левобетаксолол, картеолол, миотики, включая пилокарпин, ингибиторы карбоангидразы, простагландины, серотонергические средства, мускариновые средства, допаминергические агонисты, адренергические агонисты, включая апраклонидин и бримонидин; средства против ангиогенеза; противоинфекционные средства, включая хинолоны, такие как ципрофлоксацин и аминогликозиды, такие как тобрамицин и гентамицин; нестероидные и стероидные противовоспалительные средства, такие как супрофен, диклофенак, кеторолак, римексолон и тетрагидрокортизол; факторы роста, такие как фактор роста нервов (NGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), полученный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF); иммунодепрессанты; и противоаллергические средства, включая олопатадин. Информацию, относящуюся к препаратам олопатадина, можно найти в патенте США 6995186, публикации заявки на выдачу патента США № 2005/0158387 и публикации заявки на выдачу патента США № 2003/0055102, каждая из которых специально включена в виде ссылки. Офтальмологическое лекарственное средство может присутствовать в форме фармацевтически приемлемой соли, такой как малеат тимолола, тартрат бримонидина или диклофенак натрия.

Другие примеры вторичного терапевтического средства включают ингибитор рецепторной тирозинкиназы (RTK). Примеры ингибиторов RTK описаны в публикации заявки на выдачу патента США № 2006/0189608 и в патенте США № 7297709, которые специально включены в настоящее описание в виде ссылки. В предпочтительных вариантах ингибитором рецепторной тирозинкиназы является N-[4-[3-амино-1H-индазол-4-ил]фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина.

В других конкретных вариантах вторичным терапевтическим средством является простагландин или аналог простагландина. Например, аналогом простагландина может быть латанопрост, биматопрост, унопростон или травопрост.

В конкретных вариантах вторичным терапевтическим средством является стероид. Например, стероидом может быть глюкокортикоид, прогестин, минералокортикоид или кортикостероид. Примеры кортикостероидов включают кортизон, гидрокортизон, преднизон, преднизолон, метилпреднизон, триамцинолон, фторметалон, дексаметазон, медризон, бетаметазон, лотепреднол, флуоцинолон, флуметазон или мометазон. Другие примеры стероидов включают андрогены, такие как тестостерон, метилтестостерон или даназол. Вторичным терапевтическим средством также может быть глюкокортикоид, который не имеет типичных побочных эффектов глюкокортикоидов, такой как кортизен. Предпочтительные кортизены для применения в способах согласно изобретению включают ацетат анекортава и дезацетат анекортава. Часто стероиды вводят в виде сложноэфирных, ацетальных или кетальных пролекарств, многие из которых являются нерастворимыми в воде. Вторичные терапевтические средства могут быть направлены на лечение или профилактику одного заболевания или могут быть направлены на лечение или профилактику двух или больше заболеваний.

Кроме использования фармакологических средств могут быть выполнены хирургические операции в сочетании с введением агонистов NPR-B. Одной из таких хирургических операций может быть лазерная трабекулопластика или трабекулэктомия. В случае лазерной трабекулопластики энергию лазера направляют на несколько отдельных пятен в трабекулярной сети. Полагают, что энергия лазерного излучения стимулирует метаболизм трабекулярных клеток и изменяет внеклеточный матрикс в трабекулярной сети.

Другой хирургической операцией может быть фильтрующая хирургия. При использовании фильтрующей хирургии делают отверстие в склере вблизи угла. Такое отверстие позволяет водянистой жидкости вытекать из глаза альтернативным путем. Наиболее распространенным фильтрующим способом является трабекулэктомия. При трабекулэктомии делают разрез конъюнктивы; конъюнктива представляет собой прозрачную ткань, которая покрывает склеру. Конъюнктиву отодвигают в сторону, раскрывая склеру до лимба. Получают расщепленный склеральный лоскут и высекают на половину толщины в роговицу. Переднюю камеру вводят под склеральный лоскут и участок глубоких слоев склеры и/или трабекулярной сети вырезают. Склеральный лоскут снова свободно вшивают на место. Конъюнктивальный разрез плотно закрывают. После операции водянистая жидкость проходит через отверстие, под склеральным лоскутом, который оказывает некоторое сопротивление, и собирается в увеличенном пространстве под конъюнктивой, называемом подушечкой. Затем жидкость либо всасывается через кровеносные сосуды в конъюнктиву, либо проходит через конъюнктиву в слезную пленку.

E. Примеры

Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области следует понимать, что способы, описанные в следующих далее примерах, представляют методики, которые, как обнаружено автором изобретения, хорошо работают при практическом осуществлении изобретения, и, следовательно, можно считать, что они образуют предпочтительные способы для практического воплощения изобретения. Однако в свете настоящего описания специалистам в данной области будет понятно, что могут быть осуществлены многочисленные изменения конкретных вариантов, которые описаны, и все же получить подобный или сходный результат, не отходя от сути и не выходя за рамки объема изобретения.

ПРИМЕР 1

Материалы и способы

Материалы и способы, а также общие способы дополнительно проиллюстрированы следующими примерами:

Растворители:

Использовали растворители указанного качества без дополнительной очистки.

Ацетонитрил (градиентная чистота, J.T. Baker); дихлорметан (для синтеза, VWR); диэтиловый эфир (для синтеза, VWR); N,N-диметилформамид (LAB, VWR); диоксан (для синтеза, Aldrich); метанол (для синтеза, VWR).

Вода: Milli-Q Plus, Millipore, деминерализованная.

Реагенты:

Используемые реагенты приобретали у Advanced ChemTech (Bamberg, Germany), Sigma-Aldrich-Fluka (Deisenhofen, Germany), Bachem (Heidelberg, Germany), J.T. Baker (Phillipsburg, USA), Iris Biotech (Marktredwitz, Germany), Lancaster (Griesheim, Germany), VWR (Darmstadt, Germany), NeoMPS (Strasbourg, France), Novabiochem (Bad Soden, Germany, 2003, Merck Biosciences, Darmstadt, Germany) и Acros (Geel, Belgium, дистрибьютор Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany), Peptech (Cambridge, MA, USA), Synthetech (Albany, OR, USA), Pharmacore (High Point, NC, USA), Anaspec (San Jose, CA, USA) и использовали в указанном качестве без дополнительной очистки.

Коммерчески недоступные необычные аминокислоты получали согласно стандартным протоколам либо в виде строительных блоков для твердофазного синтеза, либо путем дериватизации коммерчески доступных аминокислот во время твердофазного синтеза.

Если не указано иное, концентрации приведены в виде процентов по объему.

Анализ пептидов согласно настоящему изобретению:

Анализ пептидов осуществляли способами аналитической ВЭЖХ с последующей регистрацией в ESI-МС или MALDI-МС. Для аналитической хроматографии использовали систему Hewlett Packard 1100 и ESI-МС (масс-спектрометр типа ионная ловушка Finnigan LCQ). Использовали гелий в качестве газа для столкновения в ионной ловушке. Для хроматографического разделения использовали колонку RP-18 (Vydac (Merck) при 30°C. Для всех хроматограмм использовали бинарный градиент (5-95% B, линейный, A: 0,1% ТФУ в воде, и B: 0,1% ТФУ в CH₃CN). УФ-регистрацию проводили при λ=220 нм.

Анализы с использованием ВЭЖХ/МС осуществляли, используя линейный градиент от 95:5 до 5:95 (A: 0,1% ТФУ в воде и B: 0,1% ТФУ в ацетонитриле); использовали колонки RP от компаний Phenomenex или Waters (Typ Luna C-18, 3 мкм, 2,00×50 мм, набор колонок Symmetry C18 колонка MV, 5 мкм, 4,6×250 мм, соответственно); для ESI-МС-измерения использовали масс-спектрометр ThermoFinnigan Advantage и/или LCQ Classic (в обоих случаях ионные ловушки). В случае ESI-ионизации гелий служил в качестве газа для столкновения в ионной ловушке. В случае MALDI-МС-анализов использовали масс-спектрометр Applied Biosystems Voyager RP MALDI с α-циано-4-гидроксикоричной кислотой в качестве матрицы внутренней калибровки.

Очистка пептидов с использованием препаративной ВЭЖХ:

Разделения в случае препаративной ВЭЖХ осуществляли, используя колонки Varian PLRP-S (10 мкм, 100 Å) (15×25 мм или 150×50 мм) и следующие растворители для градиента: A: 0,05% ТФУ в H₂O, и B: 0,05% ТФУ в CH₃CN.

Таблица 4 Сокращения:
AAV - общий способ, Ac - ацетил, Acm - ацетамидометил, ДХМ - дихлорметан,

DIC - диизопропилкарбодиимид,
DIPEA - N,N-диизопропилэтиламин,
ДМФА - N,N-диметилформамид,
ДМСО - диметилсульфоксид,
Экв. - эквивалент (эквиваленты),
ESI - ионизация в электроспрее,
Фиг. - фигура,
Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил,
Час - час (часы),
HATU - O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат,
HBTU - O-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат,
HOBt - 1-гидроксибензотриазол,
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,
MALDI - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация,
Me - метил,
мин - минута (минуты),
мл - миллилитр,
МС - масс-спектрометрия,
М.м. - молекулярная масса,
NMP - N-метилпирролидон,
Ph - фенил,
ОФ - обращенная фаза,
^tBu - трет-бутил,
ТГФ - тетрагидрофуран,

TIPS - триизопропилсилан,
ТФУ - трифторуксусная кислота,
УФ - ультрафиолет.

ПРИМЕР 2

Синтез пептидов

Линейные пептиды синтезировали, используя Fmoc-tBu-методику. Синтез осуществляли либо вручную в полипропиленовых шприцах, либо используя автоматический синтезатор (Syro из Multisyntech, Witten или Sophas из Zinsser-Analytic, Frankfurt).

Для получения пептидов, несущих C-концевую карбоновую кислоту, C-концевую аминокислоту либо связывали с тритилхлоридной смолой (примерно 100 мг смолы; нагрузка реакционно-способных групп примерно 1,5 ммоль/г; связывание с 0,8 эквивалентами Fmoc-аминокислоты и 3,0 эквивалентами DIPEA в ДХМ в течение 2 часов; нагрузка первой аминокислоты примерно 0,2-0,4 ммоль/г), либо со смолой Ванга (100-200 мг смолы; нагрузка реакционно-способных групп примерно 0,6 ммоль/г; связывание с 4 эквивалентами Fmoc-аминокислоты, 4 эквивалентами DIC и 3 эквивалентами NMI в ДМФА в течение 3 часов; нагрузка первой аминокислоты примерно 0,2-0,6 ммоль/г).

Для получения пептидов, несущих C-концевой амид карбоновой кислоты, первую аминокислоту связывали со смолой путем удаления Fmoc-защиты Fmoc-амидной смолы Ринка (примерно 100 мг смолы, нагрузка примерно 0,5 ммоль/г; удаление Fmoc-защиты с использованием 20% пиперидина в ДМФА в течение 20 минут) и последующим связыванием Fmoc-аминокислоты (взаимодействие с 5 эквивалентами Fmoc-аминокислоты; 5 эквивалентами HBTU или 5 эквивалентами HATU и 10 эквивалентами DIPEA в NMP в течение 30-60 минут, и указанную стадию необязательно повторяли).

После связывания первой аминокислоты осуществляли синтез пептида, при необходимости повторяя последовательность стадий, состоящую из удаления Fmoc-защиты и связывания соответствующей Fmoc-аминокислоты или карбоновой кислоты. Для удаления Fmoc-защиты смолу обрабатывали 20% пиперидином в ДМФА в течение 20 минут. Связывание аминокислот осуществляли посредством взаимодействия с 5 эквивалентами аминокислоты, 5 эквивалентами HBTU или 5 эквивалентами HATU и 10 эквивалентами DIPEA в ДМФА в течение 30-60 минут. Каждую стадию связывания необязательно повторяли.

Для введения N-концевой ацетильной группы пептид со свободным N-концом, связанный со смолой, инкубировали с раствором 10% ангидрида уксусной кислоты и 20% DIPEA в ДМФА в течение 20 минут. Для введения N-концевой сульфонильной группы пептид со свободным N-концом, связанный со смолой, инкубировали с раствором 2 эквивалентов соответствующего сульфонилхлорида и 4 эквивалентами DIPEA в ДМФА или ДХМ в течение 30 минут, и такую обработку повторяли один раз.

Для отщепления пептида от смолы и защитных групп боковых цепей в смесь добавляли 95% ТФУ, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS или сходный раствор. Наконец, неочищенный пептид выделяли либо выпариванием ТФУ с использованием роторного испарителя, либо преципитацией с помощью метил-трет-бутилового эфира при 0°C.

ПРИМЕР 3

Индуцированная NPR-A продукция циклического ГМФ в стабильно трансфицированной клетке

Чтобы оценить специфичность соединений в отношении активации NPR, использовали клетки 293-T человека, трансфицированные NPR-A (Potter and Garbers 1992, J. Biol. Chem. 267: 14531-14534) в экспериментах по стимуляции.

В указанном гомогенном анализе клетки стимулируют в суспензии тестируемым соединением и определяют продукцию циклического ГМФ (цГМФ), и в результате вычисляют значения EC50. ANP, встречающийся в природе лиганд NPR-A, используют в качестве внутреннего контроля и для определения максимальной продукции цГМФ клетками, что позволяет вычислять значения активации для тестируемых соединений по сравнению с ANP.

Подготовка клеток: Трансфицированные NPR-A клетки 293-T промывают один раз фосфатно-солевым буфером (PBS) и открепляют от стенок флакона для культуры ткани площадью 75 см², добавляя 3 мл раствора для неферментативной диссоциации клеток (Sigma-Aldrich) и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре. Открепленные клетки собирают в 20 мл PBS и центрифугируют в течение 10 минут при 200×g при комнатной температуре. Клетки ресуспендируют в смеси среды DMEM/среды Хама F12 с добавлением 1 мМ IBMX (Medium) и доводят до плотности 1,25×10⁵ клеток/мл и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре.

Стимуляция клеток: 20 мкл клеток (2,5×10³ клеток) добавляют в каждую лунку 96-луночного оптического планшета для культуры ткани с белым дном (Nunc, Germany). Добавляют 10 мкл разбавленного соединения и клетки стимулируют в течение 25 минут при комнатной температуре. Стимуляцию останавливают добавлением 20 мкл лизирующего буфера (реагент включен в набор для анализа цГМФ).

Определение цГМФ: Количество продуцированного цГМФ в клетках определяют, используя набор для анализа HitHunterTM (DiscoveRX) согласно инструкциям производителя.

Разбавление соединений: Для определений EC₅₀ клетки в лунках в двух повторах стимулируют серийными разведениями исходного раствора соединения в 10 мМ ДМСО. Разведения готовят в среде с добавлением IBMX (1 мМ). Конечная концентрация соединения в анализе находится в диапазоне от 45 мкМ до 20 нМ. ANP в качестве соединения для внутреннего стандарта использовали в концентрациях в диапазоне от 5 мкМ до 310 пМ.

ПРИМЕР 4

Индуцированная NPR-B продукция циклического ГМФ в клетках трабекулярной сети человека с глаукомой (GTM-3)

Эффективность соединений в активации NPR-B оценивали в функциональном анализе, используя клетки GMT-3, эндогенно экспрессирующие NPR-B (Pang, Shade et al. 1994). В данном анализе определяют зависимую от дозы продукцию циклического ГМФ (цГМФ) и определяют значения EC₅₀. Встречающийся в природе лиганд NPR-B, т.е. CNP, используют в качестве внутреннего контроля и для определения максимальной продукции цГМФ клетками, которая позволяет вычислять значения активации для тестируемых соединений по сравнению с CNP.

Подготовка клеток: В оптический 96-луночный планшет для культуры ткани с белым дном (Nunc, Germany) высевают по 1,5×10⁵ клеток/лунку в среде MEM Дульбекко (DMEM, Biochrom) с добавлением гентамицина (0,056 мг/мл) и инкубируют в течение 18 часов с 10% CO₂ в увлажненной атмосфере.

Стимуляция клеток: Среду из культуры клеток аспирируют и каждую лунку промывают 200 мкл среды DMEM/Хама F12 (Gibco). Затем в каждую лунку вносят 200 мкл среды с добавлением 1,5 мМ IBMX (3-изобутил-1-метилксантин, Sigma) и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавляют 25 мкл разбавленного соединения и клетки стимулируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Стимуляцию останавливают аспирацией среды и добавлением 20 мкл лизирующего буфера (реагент включен в набор для анализа цГМФ).

Определение цГМФ: Количество продуцированного цГМФ в клетках определяют, используя набор для анализа HitHunter^TM (DiscoveRX) согласно инструкциям производителя.

Разбавление соединений: Для определений EC₅₀ клетки в лунках в двух повторах стимулируют серийными разведениями исходного раствора соединения в 10 мМ ДМСО. Разведения готовят в среде с добавлением IBMX (1,5 мМ). Конечная концентрация соединения находится в диапазоне от 45 мкМ до 20 нМ. Высоко активные соединения, например, CNP, используют для стимуляции в концентрациях в диапазоне от 5 мкМ до 6 нМ.

ПРИМЕР 5

Эффективность у кроликов

Одну каплю объемом 30 мкл образца тестируемого препарата вводили в глаза кроликам (n=8-10). Внутриглазное давление (ВГД) оценивали в каждом глазу в 0 часов, непосредственно перед введением дозы, и снова ежечасно вплоть до 4 часов после введения дозы. Эффективность данного препарата определяли на основании различия между данными ВГД, зарегистрированными перед обработкой в 0 часов, и данными, зарегистрированными после обработки. Максимальное снижение ВГД в процентах более чем на 15% отмечено символом «+». Максимальное снижение ВГД менее чем на 15% указано символом «-».

Результаты, полученные с использованием новых соединений согласно изобретению в описанных выше анализах, приведены в таблице 5 ниже.


HCl-соль за исключением *ТФУ; доза составляет 300 мкг местно в
глаза, за исключением (##); кролики DB, за исключением NZA, оценки 1-4 (4=ВГД может не быть); "" указана фаза гипертензии; (n=#R) означает количество отвечающих из 10-12 тестированных животных; 1% - +супензия, ++ раствор.

Все способы, описанные и заявленные в настоящей публикации, могут быть подготовлены и выполнены без излишнего экспериментирования в свете настоящего описания. Хотя способы согласно настоящему изобретению были описаны в отношении предпочтительных вариантов, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть осуществлены изменения способов, описанных в настоящей публикации, не отходя от принципов, сути и не выходя за рамки объема изобретения. Более конкретно, будет понятно, что некоторые средства, которые являются химически и физиологически родственными, могут быть использованы для замены средств, описанных в настоящей публикации, при этом могут быть достигнуты такие же или сходные результаты. Подразумевается, что все такие сходные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, входят в объем, образуют сущность и соответствуют принципам изобретения, которые определены в прилагаемой формуле изобретения.

Все публикации, цитированные в настоящем описании, в той мере, в которой они описывают подробности способов или другие подробности в дополнение к указанным в настоящей публикации, специально включены в настоящее описание в виде ссылки.

Claims

1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из

2. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из

3. Соединение формулы:

где
В выбирают из группы, состоящей из R^b1- и R^b2-C(O)-, где:
R^b1 выбирают из группы, состоящей из C₆-C₁₀-алкила и C₆-C₁₀-алкила, замещенного NR^b4R^b5;
R^b2 выбирают из группы, состоящей из C₆-C₁₀-алкила и C₆-C₁₀-алкила, замещенного NR^b4R^b5; и
R^b4 и R^b5 независимо выбирают из группы, состоящей из Н и C₁-C₄-алкила;
R^1a выбирают из H и C₁-C₄-алкила; и
R^1b выбирают из H, C₁-C₄-алкила, необязательно замещенного OH, и гидрокси-C₁-C₄-алкила, замещенного OH; или альтернативно,
R^1a и R^1b вместе образуют гетероциклическое кольцо;
n¹ представляет собой 0 или 1;
R^2a выбирают из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила, изопропила, C₁-C₂-алкил-C₃-C₇-циклоалкила и арил-C₁-C₂-алкила;
R^2b и R^2c независимо выбирают из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила, и изопропила, при условии, что по меньшей мере один из R^2b и R^2c представляет собой H;
R^2d означает от 0 до 3 заместителей, при этом каждый такой заместитель независимо выбран из группы, состоящей из H, Cl, F, Br, CN, CF₃, OH, OR^2e и C₁-C₄-алкила, где R^2e выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила и изопропила;
R^3a выбирают из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила; и
R^3b выбирают из группы, состоящей из H и - (CH₂)_n3a-X^3a, где
n3a равно 1-5; и
X^3a выбирают из группы, состоящей из H и NR^3cR^3d, где R^3c и R^3d независимо выбирают из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила и -(C=N)-NH₂; или альтернативно,
R^3a и R^3b связаны с образованием циклической структуры; или альтернативно,
R^3a и R^3b связаны с гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из N, O и S, с образованием гетероциклической структуры;
R^4a выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₈-алкила, который необязательно замещен фрагментом, выбранным из группы, состоящей из OH и CO₂R^4c, где R^4c выбирают из группы, состоящей из H и C₁-C₃-алкила;
R^4b выбирают из группы, состоящей из Н и метила;
R^5a означает (CH₂)_n5a-X^5a,
где n5a равно 1-6; и
X^5a выбран из группы, состоящей из H, NH₂ и аминосодержащего C₄-C₇-алифатического гетероциклического кольца; и
R^5c выбран из группы, состоящей из Н и метила; или альтернативно,
R^5c и R^5a объединяются с образованием 4-6-членного гетероциклического кольца, где указанное гетероциклическое кольцо имеет от 0 до 2 заместителей, при этом каждый заместитель независимо выбирают из группы, состоящей из OH, F, C₁-C₄-алкила, -NHC(=NH)NH₂, арила и NR^5eR^5f, где
R^5e выбирают из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила, -C(=O)(CH₂)_n5b-X^5b и -CH₂(CH₂)_n5c-X^5b; и
R^5f выбирают из группы, состоящей из H, C₁-C₄-алкила и -CH₂(CH₂)_n5d-X^5c; где
n5b выбирают из группы, состоящей из 1, 2, 3 и 4;
n5c и n5d независимо выбирают из группы, состоящей из 2, 3, и 4; и
X^5b и X^5c независимо выбирают из группы, состоящей из Н и NR^5gR^5h; где R^5g и R^5h независимо выбирают из группы, состоящей из H и C₁-С₄-алкила;
R^5b выбирают из группы, состоящей из Н и метила;
R^6a выбирают из группы, состоящей из C₁-C₈-алкила, арил-C₁-C₄-алкила, C₄-C₇-циклоалкил-C₁-C₄-алкила и C₄-C₇-циклоалкила, где каждый из C₁-C₈-алкила и C₄-C₇-циклоалкила необязательно замещают фрагментом, выбранным из группы, состоящей из OH и O(C₁-C₄-алкил);
R^6b означает H;
R^6c выбран из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила;
R^7a выбран из группы, состоящей из C₁-C₄-алкила, C₃-C₇-циклоалкила, 2-тиенила, (CH₂)_n7a-X^7a и C₁-C₄-алкила, замещенного OH, где
n^7a выбирают из группы, состоящей из 1 и 2; и
X^7a выбирают из группы, состоящей из 2-тиенила, C(=O)OR^7e, C(=O)NH₂, S(=O)₂OH, OS(=O)₂OH, B(OH)₂, P(=O)(OH)₂ и OP(=O)(OH)₂, где R^7e выбирают из группы, состоящей из H и C₁-C₄-алкила;
R^7b означает H или 2-тиенил;
R^7c выбирают из группы, состоящей из H и метила;
R^8a означает (CH₂)_m8a-X^8a, где m^8a=1-5;
X^8a выбирают из группы, состоящей из Н, NH₂ и NHC(=NH)NH₂;
R^8b выбирают из группы, состоящей из H и метила;
R^9a выбирают из группы, состоящей из C₁-C₅-алкила и C₄-C₇-циклоалкила; и
R^9b выбирают из группы, состоящей из H и C₁-C₅-алкила; или альтернативно,
R^9a и R^9b образуют 5-7-членное циклоалкильное кольцо;
R^9c выбран из группы, состоящей из Н и метила; и
R^11b выбирают из группы, состоящей из H, C₁-C₈-алкила, C₄-C₈-циклоалкила, C₇-C₁₂-бициклоалкила, C₇-C₁₂-циклоалкиларила и C₁-C₄-алкил-C₄-C₈-циклоалкила.

4. Соединение по п. 3, где соединение имеет формулу:

5. Соединение по п. 4, где:
В означает R^b2-C(O)- и R^b2 означает C₆-C₁₀-алкил; и R^11b выбирают из группы, состоящей из H и C₁-C₈-алкила.

6. Соединение по п. 3, где соединение представляет собой:

7. Способ снижения внутриглазного давления у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-6.

8. Способ лечения офтальмологического заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп. 1-6, где указанное офтальмологическое заболевание представляет собой глаукому, повышенное внутриглазное давление и гипертензию глаза.