RU2553656C2

RU2553656C2 - Фосфорамидатные производные нуклеозидов

Info

Publication number: RU2553656C2
Application number: RU2012117829/04A
Authority: RU
Inventors: Тим Хьюго Мария Йонкерс; Пьер Жан-Мари Бернар Рабуассон; Коэн Вандик; Микаэль Пелькман; Бенгт Кристьян СУНД; Хорст Юрген Вехлинг; ПИНЬЮ Педро Мануэл ПАСУШ; Анна Винквист; Карл Магнус Нильссон
Original assignee: ЯНССЕН ПРОДАКТС, Эл.Пи.; Медивир Аб
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2015-06-20
Also published as: ES2614932T3; RU2012117829A; AU2010302971A1; EP2483288B1; US20120225839A1; CA2774754A1; US8552021B2; EP2483288A2; CN102686599A; WO2011039221A2; AU2010302971B2; CN102686599B; BR112012007122A2; WO2011039221A3; CA2774754C

Abstract

Изобретение относится к соединениям для лечения гепатита С формулы I:

его стереоизомерным формам, фармацевтически приемлемым солям или сольватам, где R¹ представляет собой водород; R² представляет собой водород, нафтил или фенил, необязательно замещенный 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из галогена и C₁-C₆алкила; R³ и R⁴ представляют собой водород или C₁-C₆алкил; R⁵ представляет собой C₁-C₁₀алкил, необязательно замещенный C₁-C₆алкоксигруппой, C₃-C₇циклоалкил или бензил; R⁸ представляет собой водород. Предложены новые эффективные против гепатита С соединения и композиции на их основе. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым нуклеозидным соединениям, которые являются ингибиторами полимеразы вируса гепатита С (HCV), и к их применению при лечении или при профилактике HCV.

Предпосылки создания изобретения

HCV представляет собой одноцепочечный (+)РНК вирус с геномом, содержащим около 9600 оснований, принадлежащий к вирусному семейству Flaviviridae, к роду гепатовирусов. Фрагмент NS5B полигена РНК кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) с молекулярной массой 65 кДа, которая необходима для репликации вируса. Как последствие первоначальной острой инфекции, у большинства инфицированных пациентов развивается хронический гепатит из-за того, что происходит репликация HCV преимущественно в гепатоцитах, но без явного цитопатического проявления. В частности, недостаток интенсивного ответного действия Т-лимфоцитов и сильная предрасположенность вируса к мутации, по всей видимости, способствуют высокой скорости развития хронического инфекционного процесса. Хронический гепатит может развиваться в фиброз печени, приводящий к циррозу, конечной стадии заболевания печени, и в HCC (гепатоклеточную карциному), что делает его основной причиной необходимости трансплантации печени.

Существует шесть основных генотипов HCV и более 50 подтипов, которые географически по-разному распределены. HCV генотипа 1 представляет собой преобладающий генотип в Европе и США. Экстенсивная генетическая гетерогенность HCV обуславливает существенные осложнения при диагностике и изучении симптомов течения болезни, может служить объяснением трудностей в создании вакцины и недостаточную действенность существующей в настоящее время терапии.

Передача HCV может происходить при контакте с зараженной кровью или препаратами крови, например, вследствие переливания крови или внутривенного применения лекарственного препарата. Внедрение диагностических тестов, применяемых при скрининге крови, приводит к тенденции понижения числа случаев пост-инфузионного HCV. Несмотря на то, что обеспечивается медленное развитие конечной стадии заболевания печени, существующие инфекции будут представлять собой серьезную медицинскую проблему и экономическое бремя на десятилетия.

Существующая в настоящее время терапия HCV основывается на (пегилированном) интерфероне-альфа (IFN-α) в комбинации с рибавирином. Эта комбинированная терапия дает устойчивый вирусологический ответ у более чем 40% пациентов, инфицированных HCV генотипа 1, и, приблизительно, в 80% пациентов, инфицированных HCV генотипов 2 и 3. Кроме ограниченной эффективности против HCV генотипа 1, эта комбинированная терапия имеет существенные побочные эффекты и плохо переносима многими пациентами. Большинство побочных эффектов включают подобные гриппу симптомы, гематологические нарушения и психоневрологические симптомы. Следовательно, существует потребность в более эффективных, удобных и лучше переносимых методах лечения.

Опыт применения лекарственных средств против HIV, в частности ингибиторов HIV протеазы, указывает, что недостаточно оптимальная фармакокинетика и сложный режим дозировки незамедлительно приводят к неумышленным неудачам в соблюдении терапевтических рекомендаций. Это в свою очередь обозначает, что на 24 часу самая низшая точка концентрации (минимум концентрации в плазме) для соответствующих лекарственных средств при HIV состоянии часто опускается ниже IC₉₀ или ED₉₀ пороговой величины для большей части суток. Следует принять во внимание, что на 24 часу самый низший уровень значений, по крайней мере, для IC₅₀, и более реально, для IC₉₀ или ED₉₀, весьма важен для сдерживания проявления «ускользнувших» от лекарственного средства мутантов. Достижение необходимой фармакокинетики и метаболизма лекарственного средства, которые обеспечивают такие самые низшие уровни значений, определяют точные перспективы создания лекарственного средства.

РНК-зависимая полимераза NS5B (RdRp) является существенной для репликации одноцепочечной, положительной смысловой РНК-геномной. Этот фермент вызывает особый интерес у специалистов в области медицинской химии. Известны как нуклеозидные, так и ненуклеозидные ингибиторы NS5B.

Нуклеозидные ингибиторы могут действовать или как терминатор цепи биосинтеза или как конкурентный ингибитор, который мешает связыванию нуклеотида с полимеразой. Чтобы функционировать в качестве терминатора цепи нуклеозидный аналог должен поглощаться клеткой и превращаться in vivo в трифосфат для соответствия сайту связывания нуклеотида с полимеразой. Это превращение в трифосфаты обычно осуществляется посредством клеточных киназ, которые привносят дополнительные структурные требования к потенциальному ингибитору нуклеозидной полимеразы. Кроме того, это ограничивает прямую оценку нуклеозидов в качестве ингибиторов репликации HCV при испытаниях на клетках, способных к фосфорилированию in situ.

Несколькими исследовательскими группами были предприняты усилия для выявления нуклеозидов, являющихся ингибиторами HCV полимеразы, но, несмотря на то, что для небольшого количества соединений начали проводить клинические испытания, ни одно соединение не прошло весь путь до регистрации. В числе проблем, из-за которых нуклеозиды, имеющие своей мишенью HCV, сталкиваются с трудностями их продвижения, представляются следующие: токсичность, мутагенность, отсутствие селективности, низкая эффективность, низкая биодоступность, недостаточно оптимальные режимы дозировки и получающиеся в результате большие масса таблетки и стоимость товара.

Ряд патентов и патентных заявок, а также и научных публикаций раскрывают аналоги нуклеозидов, обладающие ингибирующей активностью по отношению к HCV. WO 2007/020193 раскрывает фосфорамидатные производные определенных нуклеозидов. WO 2008/043704 раскрывает 4-амино-1-((2R,3S,4S,5R)-5-азидо-4-гидрокси-5-гидроксиметил-3-метил-тетрагидрофуран-2-ил)-1H-пиримидин-2-ин и его сложноэфирные производные в качестве ингибиторов полимеразы HCV. WO 2009/067409 раскрывает 2',4'-замещенные нуклеозиды в качестве противовирусных средств.

Существует потребность в ингибиторах HCV, которые могут преодолеть недостатки существующей в настоящее время терапии HCV, такие как побочные эффекты, ограниченная эффективность, возникновение устойчивости и неудачи из-за несоблюдения предписанного режима терапии, а также могут способствовать устойчивому вирусологическому ответу.

Настоящее изобретение касается фосфорамидатных производных 1-((2R,3S,4S,5R)-5-азидо-4-гидрокси-5-гидроксиметил-3-метил-тетрагидрофуран-2-ил)-1H-пиримидин-2,4-диона, которые являются ингибиторами HCV с полезными свойствами, касающимися одного или нескольких следующих параметров: противовирусная эффективность, благоприятный профиль развития устойчивости, отсутствие токсичности и генотоксичности, подходящие фармакокинетика и фармакодинамика, такие как повышенные концентрации моно- или трифосфатных аналогов в печени, повышенная абсорбция, в частности, адсорбция клетками печени, и простота получения препарата и введения.

Описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, предложены ингибиторы полимеразы HCV, которые могут быть представлены формулой I:

включая любые возможные их стереоизомеры, где:

R¹ представляет собой водород, -C(=О)R⁶ или -C(=О)CHR⁷-NH₂;

R² представляет собой водород; или C₁-C₆алкил или фенил, причем последний является необязательно замещенным 1, 2 или 3 заместителями, каждый из которых, независимо друг от друга, выбирают из галогена, C₁-C₆алкила, C₂-C₆алкенила, C₁-C₆алкокси, гидрокси- и аминогруппы; или R² представляет собой нафтил; или R² представляет собой индолил;

R³ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, бензил;

R⁴ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, бензил; или

R³ и R⁴ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C₃-C₇циклоалкил;

R⁵ представляет собой C₁-C₁₀алкил, необязательно замещенный C₁-C₆алкоксигруппой; или R⁵ представляет собой C₃-C₇циклоалкил; бензил; или фенил, необязательно замещенный 1, 2 или 3 заместителями, каждый из которых, независимо друг от друга, выбирают из гидрокси-, C₁-C₆алкокси-, амино-, моно- и диC₁-C₆алкиламиногрупп;

R⁶ представляет собой C₁-C₆алкил;

R⁷ представляет собой C₁-C₆алкил;

R⁸ представляет собой водород или галоген;

или их фармацевтически приемлемая соль или сольват.

Дополнительная особенность изобретения заключается в предоставлении соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата для применения при лечении или профилактике инфекции HCV. Или предлагается применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции HCV. Репрезентативные генотипы HCV в контексте лечения или профилактики, в соответствии с изобретением, включают генотип 1b (распространенный в Европе) или 1a (распространенный в Северной Америке). С другой точки зрения, изобретение предоставляет способ лечения или профилактики инфекции HCV, а именно генотипа 1a или 1b, указанный способ включает введение соединения в количестве, которое является эффективным для лечения HCV или для обеспечения профилактики против HCV.

Дополнительное описание изобретения

Одна подгруппа соединений включает соединения формулы I, или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R¹ представляет собой водород. Другая подгруппа включает соединения формулы I, или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R¹ представляет собой C₂-C₆ ацильную группу, такую как ацетил, пивалоил или, предпочтительно, изобутирил. Другая подгруппа включает соединения формулы I, или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R¹ представляет собой α-аминоацильную группу, полученную из L-аминокислоты, такой как L-аланин, L-лейцин, L-изолейцин или L-валин.

Другая подгруппа соединений включает такие соединения формулы I или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R² представляет собой фенил, необязательно замещенный 1, 2 или 3 заместителями, которые независимо друг от друга выбирают из галогена, C₁-C₆алкила и C₂-C₄алкенила, или в которых R² представляет собой нафтил. Представляют интерес соединения формулы I или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R² представляет собой фенил, нафтил или фенил, замещенный метилом, изопропилом и хлором, последний, более конкретно, представляет собой 3-метил-4-хлор-6-изопропилфенил. Другая подгруппа соединений включает соединения формулы I или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R² представляет собой водород.

В соединениях формулы I, или в любых подгруппах соединений, указанных в этом документе, группа -NH-C(R³)(R⁴)-CO- образует аминокислотный остаток, который включает природные и неприродные аминокислотные остатки. Особый интерес представляют такие аминокислотные остатки, в которых R³ представляет собой водород. Если в последнем случае R⁴ отличается от водорода, тогда конфигурация ассиметрического атома углерода, связанного с R³ и R⁴, предпочтительно, такая как у L-аминокислоты. Примеры -NH-C(R³)(R⁴)-CO- представляют собой остатки глицина (Gly), аланина (Ala), 1,1-диметилглицина, валина (Val), изолейцина (Ile) и фенилаланина (Phe), а именно, их L-форму, такую как L-Ala, L-Val, L-Ile и L-Phe. Пример аминокислотного остатка, в котором R³ и R⁴ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C₃-C₇циклоалкил, представляет собой 1,1-циклопропиламинокислоту.

Одна подгруппа соединений включает соединения формулы I или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых R³ представляет собой водород или C₁-C₆алкил, и R⁴ представляет собой водород или C₁-C₆алкил; или в которых R³ представляет собой водород или C₁-C₄алкил, и R⁴ представляет собой водород или C₁-C₄алкил; или в которых R³ представляет собой водород или C₁-C₄алкил, и R⁴ представляет собой водород. Конкретная подгруппа из числа вышеуказанных представляет собой такую, в которой R⁴ представляет собой водород и в которой углерод, связанный с R³ и R⁴, имеет L-конфигурацию. В одном примере осуществления изобретения, в соединениях формулы I, или в любых подгруппах соединений формулы I, R³ представляет собой метил или разветвленный C₁-C₆алкил, такой как изопропил или изобутил, и R⁴ представляет собой водород, или в которых R³ представляет собой метил и R⁴ представляет собой водород, или в которых R³ представляет собой метил и R⁴ представляет собой метил. Также представляют интерес соединения формулы I или любые подгруппы соединений, указанных в этом документе, в которых группа -NH-C(R³)(R⁴)-CO- образует -NH-CH₂-CO- (Gly), L-изомер -NH-CH(CH₃)-CO- (L-Ala), или -NH-C(CH₃)₂-CO- (α,α-диметилглицил); а именно L-Ala или α,α-диметилглицил, более конкретно L-Ala.

Один пример осуществления изобретения касается соединений формулы I, или любых подгрупп соединений I, указанных в этом документе, в которых R⁵ представляет собой C₁-C₁₀алкил, необязательно замещенный C₁-C₄алкокси-группой, или R⁵ представляет собой C₃-C₇циклоалкил (а именно, C₅-C₆циклоалкил), или бензил, а именно, в котором R⁵ представляет собой метил, этил, н-пропил, 2-бутилпентил, циклопентил, циклогексил или бензил. Представляют интерес такие R⁵ группы, в которых C₁-C₆алкильный фрагмент, такой как метил или этил, представляет собой замещенный алкоксигруппой, такой как метокси или этокси, например, R⁵ представляет собой CH₃-О-CH₂-CH₂-.

Один пример осуществления изобретения касается соединений формулы I, или любых подгрупп соединений I, указанных в этом документе, в которых R⁶ представляет собой C₁-C₄алкил, или в которых R⁶ представляет собой изопропил.

Один пример осуществления изобретения касается соединений формулы I, или любых подгрупп соединений I, указанных в этом документе, в которых R⁷ представляет собой C₁-C₄алкил, или в которых R⁷ представляет собой метил; следующая подгруппа соединений касается таких, в которых R⁷ представляет собой такой, как указано в этом документе, и -C(=О)CHR⁷-NH₂ имеет L-конфигурацию.

Один пример осуществления изобретения касается соединений формулы I, или любых подгрупп соединений I, указанных в этом документе, в которых R⁸ представляет собой водород или йод; или R⁸ представляет собой водород.

Конкретные подгруппы соединений формулы I представляют собой такие, где:

R¹ представляет собой водород;

R² представляет собой фенил, замещенный 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга выбираемыми из C₁-C₆алкила, галогена и C₂-C₄алкенила; -NH-C(R³)(R⁴)-CO- образует L-Ala или α,α-диметилглицил;

R⁵ представляет собой C₁-C₁₀алкил, C₁-C₆алкил, замещенный C₁-C₆алкоксигруппой; C₃-C₇циклоалкил или бензил;

R⁸ представляет собой водород или йод.

Другие конкретные подгруппы соединений формулы I представляют собой такие, где:

R¹ представляет собой водород;

R² представляет собой фенил, фенил, замещенный двумя C₁-C₄алкилами и галогеном, или нафтил;

-NH-C(R³)(R⁴)-CO- образует L-Ala или α,α-диметилглицил;

R⁵ представляет собой C₁-C₁₀алкил, C₁-C₄алкил, замещенный C₁-C₄алкоксигруппой, C₅-C₆циклоалкил или бензил.

R⁸ представляет собой водород.

R¹ представляет собой водород; R² представляет собой водород; -NH-C(R³)(R⁴)-CO- образует L-Ala или α,α-диметилглицил; R⁵ представляет собой C₁-C₈алкил, C₁-C₄алкил, замещенный C₁-C₄алкоксигруппой, циклопентил, циклогексил или бензил; R⁸ представляет собой водород.

Конкретные подгруппы соединений формулы I представляют собой такие, в которых:

R¹ представляет собой водород; R² представляет собой водород; -NH-C(R³)(R⁴)-CO- образует L-Ala; R⁵ представляет собой C₁-C₈алкил, циклопентил, циклогексил или бензил; R⁸ представляет собой водород.

Конкретные подгруппы соединений формулы I представляют собой соединения с 1-1 по 1-35, перечисленные в таблице 1 приведенной ниже, включая их фармацевтически приемлемые соли и сольваты.

Соединения формулы I имеют несколько хиральных центров и представлены в этом документе в виде конкретного изомера. Также это относится и к некоторым промежуточным соединениям, применяемым в получении соединений формулы I, где промежуточные соединения могут иметь один или несколько хиральных центров. Однако, соединения формулы I, или какие-либо промежуточные соединения, применяемые в их получении, имеющие, по крайней мере, один хиральный центр, могут содержать небольшие количества других стереоизомеров, т.e. стереоизомеров с различной хиральностью одного или нескольких ассиметрических центров. Общее количество других стереоизомеров, в частности, не должно превышать 25% или 20%, или 10%, или 5%, или 2%, или 1%, или 0,5%, или 0,1 масс.%.

Также хиральность может быть и в заместителях, такая, например, как хиральность, обусловленная заместителями в,

например, у атома углерода, имеющего R³ и R⁴ (где R³ и R⁴ различны), или у атома фосфора. Фосфорный хиральный центр может быть представлен как R_p или S_p, или смесью таких стереоизомеров, включая рацематы.

Также могут существовать диастереоизомеры, получающиеся как результат существования хирального фосфорного центра и хирального углеродного атома.

Абсолютная конфигурация каждого из хиральных центров может быть определена с использованием известных в данной области техники способов, таких как, например, дифракция рентгеновских лучей или ЯМР, и/или исходя из применения исходных веществ с известной стереохимией. Чистые стереоизомерные формы соединений и промежуточных соединений этого изобретения могут быть получены посредством применения методик, известных в данной области техники. Например, энантиомеры могут быть отделены один от другого путем селективной кристаллизации их диастереомерных солей с оптически активными кислотами или основаниями. Их примеры представляют собой винную кислоту, дибензоилвинную кислоту, дитолилвиннную кислоту и камфорсульфоновую кислоту. Альтернативно, энантиомеры могут быть разделены хроматографическими методами с использованием хиральных неподвижных фаз. Указанные химически чистые стереоизомерные формы также могут быть получены из соответствующих химически чистых стереоизомерных форм подобранных исходных веществ, при условии, что реакция протекает стереоспецифично. Предпочтительно, в том случае, если необходим определенный стереоизомер, синтезировать указанное соединение посредством стереоспецифических способов получения. Для этих способов предпочтительно использовать энантиомерно чистые исходные вещества.

Диастереомерные рацематы соединений формулы I могут быть получены в разделенном виде посредством общепринятых способов. Подходящие физические способы разделения, которые успешно могут быть использованы, представляют собой, например, селективную кристаллизацию и хроматографию, например, колоночную хроматографию.

Фармацевтически приемлемые аддитивные соли включают терапевтически активные кислотно-аддитивные и основно-аддитивные солевые нетоксичные формы соединений формулы I. Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть стандартно получены посредством обработки основной формы такой подходящей кислотой. Подходящие кислоты включают, например, неорганические кислоты, такие как галогенводородные кислоты, например, хлористоводородная или бромистоводородная кислота, серная, азотная, фосфорная и им подобные кислоты; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, пропионовая, гидроксиуксусная, молочная, пировиноградная, щавелевая (т.e. этандиовая), малоновая, янтарная (т.e. бутандиовая кислота), малеиновая, фумаровая, яблочная (т.e. гидроксибутандиовая кислота), винная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая, памовая и им подобные кислоты. И наоборот, указанные солевые формы при обработке подходящим основанием могут быть превращены в свободные основные формы.

Соединения формулы I, содержащие кислотный протон, могут также быть превращены в их нетоксичные солевые формы присоединения металла или амина при обработке подходящими органическими или неорганическими основаниями. Подходящие основные солевые формы включают, например, аммонийные соли, соли щелочного или щелочноземельного металла, например, литиевые, натриевые, калиевые, магниевые, кальциевые соли и им подобные, соли с органическими основаниями, например, бензатином, N-метил-D-глюкамином, гидрабаминовые соли и соли с аминокислотами, такими как, например, аргинин, лизин и им подобные.

Термин "сольваты" охватывает любые фармацевтически приемлемые сольваты, которые способны образовать соединения формулы I, а также и их соли. Такие сольваты представляют собой, например, гидраты, алкоголяты, например, этаноляты, пропаноляты, включая н-пропаноляты и изопропаноляты, и им подобные.

Некоторые соединения формулы I также могут существовать в виде их таутомерных форм. Уридиновое основание представляет собой пример такой формы. Несмотря на то, что не было подробного указания в вышеприведенной формуле, такие формы предназначены для включения в объем настоящего изобретения.

Как используется в этом документе, "C₁-C₄алкил" как группа или часть группы, обозначает насыщенные углеводородные радикалы с прямой или разветвленной цепью, имеющие от 1 до 4 атомов углерода, такие как, например, метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-бутил, 2-метил-l-пропил, 2-метил-2-пропил. "C₁-C₅алкил" охватывает C₁-C₄алкильные радикалы и их высшие гомологи, имеющие 5 атомов углерода, такие как, например, 1-пентил, 2-пентил,3-пентил, 2-метил-1-бутил и им подобные. "C₁-C₆алкил" охватывает C₁-C₄алкильные радикалы и их высшие гомологи, имеющие 5 или 6 атомов углерода, такие как, например, 1-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 1-гексил, 2-гексил, 2-метил-1-бутил, 2-метил-1-пентил, 2-этил-1-бутил, 3-метил-2-пентил и им подобные. Из числа C₁-C₆алкилов представляет интерес C₁-C₄алкил.

C₁-C₁₀алкил охватывает C₁-C₆алкильные радикалы и их высшие гомологи, имеющие 7-10 атомов углерода, а именно, разветвленные гомологи, такие как 2-пропилпентил. Среди C₁-C₁₀алкилов представляют интерес C₁-C₈алкилы (которые охватывают C₁-C₆алкильные радикалы и их высшие гомологи, имеющие 7-8 атомов углерода) или C₁-C₆алкилы.

"C₂-C₆алкенил" как группа или часть группы, обозначает насыщенные углеводородные радикалы с прямой или с разветвленной цепью, имеющие от 1 до 6 атомов углерода и одну двойную связь, такие как, например, этенил, 1-пропенил, 2-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 2-метил-1-пропенил, 2-метил-2-пропенил, 4-пентенил, 3-пентенил, 5-гексенил, 4-гексенил, 3-гексенил и им подобные. Одна из подгрупп C₂-C₆алкенилов включает C₂-C₆алкенильные радикалы, в которых углерод, через который группа связана с остальной частью молекулы, является насыщенным. Другую подруппу составляют C₂-C₄алкенилы, которые представляют собой алкенильные радикалы с атомами углерода в количестве от двух до четырех. Другие подгруппы C₂-C₆алкенилов включают C₂-C₆алкенильные или C₂-C₄алкенильные группы, в которых углерод, через который группа связана с остальной частью молекулы, является насыщенным.

"C₁-C₄алкокси" обозначает радикал -О-C₁-C₄алкил, в котором C₁-C₄алкил является таким, как определено выше. Представляющие интерес C₁-C₄алкоксильные радикалы включают, но не ограничиваются только перечисленными, метокси, этокси, н-пропокси и изопропокси.

"C₃-C₇циклoалкил" включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил. Представляют интерес циклопропил, циклопентил и циклогексил.

"C₂-C₆ацил", как группа или часть группы, обозначает C₁-C₅алкильную группу, которая присоединена к карбонильной группе одинарной связью, и включает, например, ацетил, пропаноил, бутаноил, изобутаноил, пентаноил, гексаноил, пиваноил и им подобные. Номенклатура C₂-C₆ацильных фрагментов, перечисленных выше, может быть другой, такой как, например, изобутаноил также может быть обозначен как изобутирил.

Термин "галоген" является общим для фтора, хлора, брома и йода.

Как используется в данном документе, обозначение "(=О)" или "оксo" образует карбонильный фрагмент в случае присоединения к углеродному атому. Следует отметить, что атом только тогда может иметь заместитель в виде оксо-группы, когда валентность атома это допускает.

Следует отметить, что положения радикалов в любом фрагменте молекулы, используемом в определениях могут быть где угодно в таком фрагменте, при условии, что он является химически стабильным. В том случае, когда перемена происходит более чем 1 раз в любом фрагменте, тогда каждое определение является независимым.

Настоящее изобретение также включает изотопномеченные соединения формулы I или любой подгруппы формулы I, где один или несколько атомов заменены изотопом, отличающимся от обычного изотопа(ов), обнаруженного в природе. Примеры таких изотопов включают изотопы водорода, такие как ²H и ³H; углерода, такие как ¹¹C, ¹³C и ¹⁴C; азота, такие как ¹³N и ¹⁵N; кислорода, такие как ¹⁵O, ¹⁷O и ¹⁸O; фосфора, такие как ³¹P и ³²P, серы, такой как ³⁵S; фтора, такой как ¹⁸F; хлора, такой как ³⁶Cl; брома, такие как ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br и ⁸²Br; и йода, такие как ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I и ¹³¹I. Изотопномеченные соединения изобретения могут быть получены посредством таких способов, которые аналогичны способам, описанным в этом документе, при использовании соответствующих изотопномеченных реагентов или исходных веществ, или посредством методик, известных в данной области техники. Выбор изотопа, включаемого в изотопномеченное соединение, зависит от конкретного применения этого соединения. Например, для проведения биологических испытаний распределения в тканях используют включение таких радиоактивных изотопов, как ³H или ¹⁴C. Для приборов, получающих изображение за счет радиоактивного излучения, будет пригоден позитрон-излучающий изотоп, такой как ¹¹C, ¹⁸F, ¹³N или ¹⁵O. Включение дейтерия может обеспечить большую метаболическую стабильность, приводящую в результате, например, к возрастанию in vivo периода полувыведения соединения или к снижению требуемой дозировки.

Всякий раз, когда используются в этом документе, термины "соединения формулы I" или "представленные здесь соединения", или "подгруппы соединений формулы I", или аналогичные термины, подразумевается, что они включают соединения формулы I или их подгруппы, а также их соли и сольваты.

Соединения формулы I могут быть получены посредством взаимодействия производного нуклеозида (1b) с хлорфосфорамидатом (1a), как представлено на схеме 1.

Схема 1

Конденсацию производного нуклеозида (1b) с хлорфосфорамидатом (1a) проводят в реакционно-инертном растворителе, таком как простой эфир, например диэтиловый, тетрагидрофуран (ТГФ) или метилтетрагидрофуран (MeТГФ), или галогенсодержащий углеводород, например дихлорметан, в присутствии основания, такого как N-метилимидазол или ему подобных, получая фосфорамидат формулы (I). Альтернативно реагент Гриньяра, например t-BuMgCl, можно использовать в качестве основания, в этом случае реакцию, как правило, проводят в растворителе, представляющем собой простой эфир, например ТГФ или MeТГФ.

Производные нуклеозидов 1b, где R¹ отличен от водорода, могут быть получены, как проиллюстрировано схемой 2.

Схема 2

Производные нуклеозидов (1b), где R¹ представляет собой H, могут быть получены посредством гидролиза 3' и 5' сложноэфирных групп в диэфире (2a) (полученном, например, как описано в WO 2008/043704), используя способ гидролиза сложного эфира, например, посредством обработки аммиаком в этаноле. Производные нуклеозидов (1b), имеющие заместитель в положении 3', т.e. когда R¹ представляет собой -C(=О)R⁶ или -C(=О)CR⁷-NH₂, где R⁶ и R⁷ являются такими, как определено выше, могут быть получены из диольного нуклеозида (2b) путем последовательных стадий введения защиты - ацилирования - снятия защиты. Например, селективная защита первичной гидрокси-группы с помощью тритильной или монометокситритильной (MMT) группы, или им подобной, посредством обработки тритил-вводящим агентом, например, галогенидом, таким как хлорид, в присутствии основания, такого как пиридин, последующее ацилирование по 3'-гидрокси группе с использованием подходящих для ацилирования условий позволяет получить 3'-ацилированные производные. Нуклеозиды (2c), имеющие сложноэфирную группу в 3'-положении, т.е. R¹ в формуле (1a) представляет собой -C(=О)R⁶, удобно получать посредством реакции 5'-защищенного нуклеозида с алкилангидридом формулы (R⁶CO)₂О в присутствии основания, такого как пиридин или ему подобные. Нуклеозиды (2d), имеющие аминокислоту в 3'-положении, т.e. R¹ в формуле (1a) представляет собой -C(=О)CR⁷-NH₂, могут быть получены посредством реакции 5'-защищенного нуклеозида с N-защищенной алифатической аминокислотой в присутствии подходящего пептидосвязующего реагента, такого как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC)), или ему подобных. В завершении всего удаление 5'-О-защитной группы и, в случае, когда R¹ был введен для получения N-защищенной аминокислоты, N-защитной группы, используя подходящие условия в соответствии примененными защитными группами, такие как кислотная обработка в случае тритильной или монометокситритильной защитной группы, затем обеспечивает получение 3'-ацилированных производных (2c) и (2d). Соединения формулы I, где R¹ представляет собой -C(=О)R⁶ или -C(=О)CR⁷-NH₂, альтернативно могут быть получены посредством проведения, в первую очередь, конденсации хлорфосфорамидата (1a) с дигидроксисоединением (2b) и посредством введения после этого необходимого 3'-заместителя.

Хлорфосфорамидаты (1a) могут быть получены двумя последовательными стадиями, исходя из фосфороксихлорида, как проиллюстрировано на схеме 3, где R^2a обозначает то же самое, что и R², но не является водородом, и R³, R⁴ и R⁵ являются такими, как определено выше.

Схема 3

Конденсация POCl₃ со спиртом R^2aOH в реакционноинертном растворителе, таком как Et₂О, обеспечивает получение алкилокси- или арилокси-фосфордихлоридата (3a). Последующая реакция с аминокислотным производным (3b), в котором R⁵ является таким, как определено выше, или R⁵ может быть защитной группой для карбоксильной группы кислоты, которая удаляется и замещается необходимой R⁵ группой, обеспечивает получение хлорфосфорамидата (1a). Эти реакции проводятся в реакционноинертном растворителе, таком как вышеуказанные растворители в связи с получением соединений формулы I.

В следующем аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество соединения формулы I, как указано в этом документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Терапевтически эффективное количество в этом контексте представляет собой такое количество, которое является достаточным для воздействия в качестве профилактической меры против инфекции HCV, для стабилизации или ослабления инфекции HCV у инфицированных субъектов или субъектов в состоянии риска заражения. И еще в следующем аспекте это изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, как указано в этом документе, который включает тщательное смешивание фармацевтически приемлемого носителя с терапевтически эффективным количеством соединения формулы I, как указано в этом документе.

Для того, чтобы получить фармацевтические композиции этого изобретения, эффективное количество индивидуального соединения, необязательно в виде аддитивной соли или в виде металлокомплекса, в качестве активного ингредиента объединяют при тщательном смешивании с фармацевтически приемлемым носителем, этот носитель можно использовать в широко разнообразных формах, в зависимости от требуемой для введения формы препарата. Эти фармацевтические композиции необходимы в виде единичной дозированной формы в особенности удобной для перорального введения, для ректального введения, для введения через кожу или для парентеральной инъекции. Например, при получении композиций в пероральной дозированной форме может применяться любая, обычно используемая фармацевтическая среда, такая как, например, вода, гликоли, масла, спирты и им подобные в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры, эмульсии и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, лубриканты, связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и им подобные в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Из-за простоты введения таблетки и капсулы представляют собой преимущественные пероральные единичные дозированные формы, в случае которых конечно же используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций, как правило, носитель будет включать стерильную воду, по крайней мере, в большей его части, однако же могут быть включены и другие ингредиенты, например, способствующие растворимости. Растворы для инъекций, например, могут быть получены таким образом, что носитель включает солевой раствор, раствор глюкозы или смесь солевого и глюкозного растворов. Суспензии для инъекций также могут быть получены таким образом, что в этом случае могут использоваться подходящие жидкие носители, суспендирующие агенты и им подобные. Также охватываются твердые формы препаратов, предназначенные для превращения непосредственно перед применением в жидкие лекарственные формы. В композициях, удобных для введения через кожу, носитель необязательно включает усиливающее проникновение вещество и/или подходящее увлажняющее вещество, необязательно объединенные с подходящими дополнительными компонентами любой природы с меньшим относительным содержанием, причем эти дополнительные компоненты не привносят ощутимого вредного воздействия на кожу.

Соединения настоящего изобретения также могут вводится посредством пероральной ингаляции или инсуффляции с использованием каких-либо способов и композиций, известных из уровня техники для доставки таким путем. Таким образом, в большинстве случаев соединения настоящего изобретения могут быть введены в легкие в форме раствора, суспензии или сухого порошка, предпочтение отдается раствору. Любая система, разработанная для доставки растворов, суспензий или сухих порошков посредством пероральной ингаляции или инсуффляции подходит для введения представленных здесь соединений.

Особо предпочтительной представляется разработка технологии получения препаратов на основе вышеуказанных фармацевтических композиций в виде единичной дозированной формы для простоты введения и равномерности дозирования. Единичная дозированная форма в контексте настоящего документа, обозначает физически дискретные единицы, подходящие в качестве однородных дозировок, причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного ингредиента, рассчитанное, чтобы вызвать требуемый терапевтический эффект в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Примеры таких единичных дозированных форм представляют собой таблетки (включая таблетки с насечкой или покрытые оболочкой таблетки), капсулы, пилюли, суппозитории, пакетики с порошком, пластинки, растворы или суспензии для инъекций и им подобные, и их многочисленные отдельные виды.

Соединения формулы I проявляют антивирусные свойства. Вирусные инфекции и связанные с ними заболевания, которые можно излечить посредством применения соединений и способов настоящего изобретения, включают такие инфекции, причиной которых являются HCV и другие патогенные флавивирусы, такие как вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Денге (типы 1-4), вирус энцефалита Сент-Луис, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Муррея, вирус Западного Нила и Куньян вирус. Заболевания, связанные с HCV, включают прогрессирующий фиброз печени, воспаление и некроз, приводящие к циррозу, последней стадии заболевания печени, и гепатоклеточную карциному НСС, и заболевания, связанные с другими патогенными флавивирусами, включая желтую лихорадку, лихорадку Денге, геморрагическую лихорадку и энцефалит. Кроме того, ряд соединений этого изобретения, как предполагается, активны против мутантных штаммов HCV.

В дополнение к вышесказанному, многие соединения этого изобретения демонстрируют подходящий фармакокинетический профиль и обладают благоприятными свойствами в отношении биодоступности, включая приемлемый период полувыведения, площадь под кривой (AUC) и пиковые значения характеристик, и характеризуются отсутствием неблагоприятных проявлений, таких как недостаточно быстрое проникновение и задержка в тканях.

Противовирусная активность in vitro в отношении HCV для соединений формулы I может быть протестирована на клеточной модели HCV в системе контроля репликации, основываясь на публикации Lohmann et al. (1999) Science 285:110-113, с дополнительными модификациями, описанными в публикации Krieger et al. (2001) Journal of Virology 75:4614-4624 (включены в этот документ путем ссылок), что в дальнейшем подтверждено примерами в разделе примеров. Эта модель, несмотря на то, что не представляет собой в полной мере всеохватывающую модель инфекции HCV, является широко применяемой в качестве наиболее понятной и эффективной модели автономной репликации РНК вируса HCV, доступной в настоящее время. Соединения, проявляющие противо-HCV активность в этой клеточной модели, рассматривают в качестве кандидатов для последующей разработки лечения HCV инфекций у млекопитающих. Следует обратить внимание на то, что важно отличать соединения, которые специфически препятствуют функционированию HCV, от таких соединений, которые вызывают цитотоксическое или цитостатическое воздействия в модели репликации HCV, и в качестве последствия этого вызывают снижение концентрации РНК вируса HCV или концентрации связанного с этим репортерного фермента. Биологические испытания, известные в области определения цитотоксичности на клеточном уровне, базируются, например, на активности митохондриальных ферментов с использованием красителей, флуоресцирующих при окислительно-восстановительных процессах, таких как резазурин. Более того, прибор для подсчета клеток показывает оценку неселективного ингибирования активности связанного с этим репортерного гена, такого как ген люциферазы светлячка. Подходящие типы клеток можно снабдить посредством стабильной трансфекции геном-репортером люциферазы, у которого экспрессия зависит от конститутивно активного генного промотера, и такие клетки можно использовать в качестве счетчика при проведении отбора для исключения неселективных ингибиторов.

Благодаря антивирусным свойствам, а именно, анти-HCV свойствам, соединения формулы I и их фармацевтически приемлемые соли или сольваты, применимы при лечении инфицированных вирусом пациентов, а именно, вирусом, который представляет собой HCV, и применимы для профилактики вирусных инфекций, а именно, HCV инфекций. Как правило, соединения настоящего изобретения могут найти применение при лечении теплокровных животных, инфицированных вирусами, а именно флавивирусами, такими как HCV.

Соединения настоящего изобретения следовательно могут применяться в качестве лекарственного средства. Настоящее изобретение также относится к применению соединений этого изобретения в производстве лекарственного средства для лечения или предотвращения вирусной инфекции, а именно, HCV инфекции.

Настоящее изобретение кроме того относится к способу лечения теплокровных животных, инфицированных вирусом, или подвергающихся риску инфицирования вирусом, а именно, HCV, причем указанный способ включает введение противовирусноэффективного количества соединения формулы I, как определено в этом документе. Указанное применение в качестве лекарственного средства или способ лечения включают систематическое введение инфицированным вирусом HCV субъектам или субъектам, восприимчивым к вирусным инфекциям, количества соединения, которое эффективно для борьбы с патологическими состояниями, связанными с вирусной инфекцией, а именно, с HCV инфекцией.

Как правило, предполагают, что противовирусное эффективное дневное количество должно составлять от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг массы тела, или от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг массы тела, или от 0,5 мг/кг до 5 мг/кг массы тела. Может быть уместно вводить необходимую дозу в виде двух, трех, четырех или более суб-доз через определенные интервалы времени в течение дня. Указанные суб-дозы могут быть в виде единичных дозированных форм, например, содержащих от 1 до 1000 мг, и в частности, от 5 до 200 мг активного ингредиента на единичную дозированную форму.

Изобретение также относится к комбинации соединения формулы I, его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтически приемлемого сольвата и другого противовирусного соединения, а именно, другого противо-HCV соединения. Термин "комбинация" может относиться к продукту, содержащему (a) соединение формулы I, как определено выше, и (b) необязательно, другой противо-HCV ингибитор, в качестве комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения инфекций HCV.

Анти-HCV соединения, которые могут применяться в таких комбинациях, включают нуклеозидные или ненуклеозидные ингибиторы полимеразы вируса HCV, ингибиторы протеазы HCV, ингибиторы геликазы HCV, ингибиторы слияния вируса HCV с клеткой. Другие агенты, которые могут использоваться в таких комбинациях, включают интерферон-α (IFN-α), пегилированный интерферон-α и рибавирин.

Любая из вышеуказанных комбинаций может быть получена в виде формы фармацевтической композиции, которая включает вышеописанные активные ингредиенты и носитель, как описано выше. Каждый из активных ингредиентов может быть включен в композицию в индивидуальном виде, и композиции могут быть введены совместно, или одна композиция, содержащая оба активных ингредиента и необходимые дополнительные активные ингредиенты, может быть предоставлена. В первом примере комбинации также могут быть получены в виде комбинированных препаратов для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии HCV. Указанные композиции могут быть в любой из вышеописанных форм. В одном примере осуществления изобретения оба ингредиента включены в одну дозированную форму в качестве комбинации с фиксированной дозировкой.

Индивидуальные компоненты комбинаций настоящего изобретения могут быть введены раздельно в различные моменты времени в течение курса терапии, или одновременно в виде раздельных или единичных комбинированных форм. Предпочтительно, когда раздельные дозированные формы вводятся одновременно.

Соединения формулы I или комбинации, описанные в этом документе, включая и такие, которые содержат другие противо-HCV средства, также могут быть объединены с агентом, обладающим положительным воздействием на лекарственный метаболизм и/или фармакокинетику, что улучшает биодоступность, например, с ритонавиром или с его фармацевтически приемлемой солью. Ритонавир можно применять в виде отдельной композиции или совместно с одним или несколькими активными агентами комбинаций настоящего изобретения. Массовое соотношение соединения формулы I и ритонавира может быть в диапазоне от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:10 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 1:6, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 6:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 4:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 3:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 2:1.

ПРИМЕРЫ

Нижеприведенные примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения. Символ Bn обозначает бензил.

Пример 1

3 г 1-нафтола загружали в 3-горлую колбу и растворяли в Et₂О (60 мл) в атмосфере N₂. К раствору добавляли POCl₃ (1 экв.) и полученный в результате раствор охлаждали до -78ºC. К холодному раствору по каплям добавляли (приблизительно за 15 мин) Et₃N (1 экв.). Реакцию оставляли на ночь до достижения комнатной температуры и затем отфильтровывали белое твердое вещество, промывали Et₂О, при этом полностью исключая контакт с влагой. Объединенные эфирные фазы концентрировали в вакууме, остаток перерастворяли в CH₂Cl₂ (120 мл) в атмосфере N₂. К этому раствору добавляли гидрохлорид бензилового эфира L-аланина (1 экв.) и смесь охлаждали до -78ºC. Туда же затем добавляли по каплям (приблизительно за 45 мин) Et₃N (1 экв.). Реакцию оставляли на ночь до достижения комнатной температуры. Растворитель удаляли в вакууме, при этом полностью исключая контакт с влагой, и остаток пропускали через сухой силикагель, элюируя смесью растворителей EtOAc/гептан:7/3. Фракции, содержащие продукт, концентрировали в вакууме, при этом полностью исключая контакт с влагой, и остаток растворяли в сухом тетрагидрофуране (ТГФ), получая стандартный раствор с концентрацией, приблизительно соответствующей той, которая применима к раствору в следующей реакции.

Пример 2: Получение фосфорхлоридов

К перемешиваемому раствору этилового эфира L-аланина хлористоводородной соли (5 г, 32,5 ммоль, высушенной в вакууме в течение 48 ч) в дихлорметане (50 мл) приблизительно при -78ºC по каплям добавляли раствор фенилдихлорфосфата (5,7 г, 27 ммоль, 4,05 мл) в дихлорметане (20 мл) в течение 5 минут. К полученному в результате раствору добавляли раствор триэтиламина (8,2 г, 81 ммоль, 11,3 мл) в дихлорметане (20 мл) в течение 30 мин. Полученное твердое вещество оставляли для медленного достижения комнатной температуру в течение 2 ч, затем реакционную массу наносили прямо на колонку. Колоночная хроматография (диаметр: 7 см, SiО₂: 100 г, элюент для заполнения колонки: этилацетат в i-гексане 20%) остатка с использованием этилацетата в i-гексане (ступенчатый градиент 20-30%) позволяла отделиться от побочных продуктов, таких как фосфордиамидатов. Соответствующие целевые фракции (контроль по ТСХ: i-гексан - EtOAc, 3:2, продукт выходит первым как пятна на базовой линии, затем следуют диамидаты, которые продвигаются по пластинке ТСХ) концентрировали, получая (2S)-этил-2-(хлор(фенокси)фосфориламино)пропаноат, бесцветное маслообразное вещество (2,16 г, 7,4 ммоль, 27%). Продукт разбавляли дихлорметаном до 0,25 M готового для хранения раствора и его можно хранить в холодильнике не более месяца.

ЯМР-спектр (400 МГц, 298 K, CDCl₃): ¹H, δ 1,23-1,37 (м, 3H), 1,52 (2 д, 3H), 4,08-4,37 (м, 4 H), 7,21-7,29 (м, 3H), 7,37 (м, 2H).

³¹P, δ 7,60 и 7,96 (2 с, не использовали P стандарт).

Фосфохлорамидатные промежуточные соединения в случае соединений таблицы 1 получали аналогично.

Пример 3

Соединения с 1-1 по 1-35 (смотрите таблицу 1) синтезировали с использованием указанного ниже способа. В большинстве случаев после очистки соединения получали в виде смесей диастереомеров с рацемической конфигурацией на атоме фосфора. В случае, когда диастереомеры могут быть разделены, не ставилась задача определения абсолютной конфигурации

К раствору 1-(5-азидо-4-гидрокси-5-гидроксиметил-3-метил-тетрагидрофуран-2-ил)-1H-пиримидин-2,4-диона (0,88 г, 3,1 ммоль) в дихлорметане (17 мл) и N-метилимидазола (0,76 г, 9,3 ммоль, 0,74 мл) при, приблизительно, -70ºC по каплям добавляли (2S)-этил-2-(хлор(фенокси)фосфориламино)пропаноат (16 мл 0,25 M раствора в дихлорметане) в течение 35 мин, при этом поддерживая температуру в диапазоне от -70 до -60ºC. Затем реакционной смеси давали медленно нагреться до 5-10ºC и ее контролировали с помощью ТСХ (9:1 и 95:5 дихлорметан-метанол, УФ-детектор). В итоге по истечении 130 мин реакционную смесь концентрировали на силикагеле. Остаток очищали колоночной хроматографией (диаметр: 4 см, SiО₂: 70 г, элюент для заполнения колонки: дихлорметан), используя ступенчатый градиент метанола в дихлорметане (0-10%). В этом случае в первую очередь элюировалась смесь 3'-, 3',5'- и одного изомера 5'-фосфорамидата, затем смесь диастереоизомеров 5'-фосфорамидатов, впоследствии элюировался один изомер 5'-флсфлрамидата и последним элюировался непрореагировавший нуклеозид (0,3 г, 1,06 ммоль).

Дальнейшая очистка вещества с использованием препаративной ЖХ (Колонка: Phenomex Synergi 10 мкм, MAX-RP, 80A, размер: 100×30 мм, скорость элюента: 25 мл/мин, градиент: 30-60% ацетонитрил в воде в течение 20 мин) позволяла отделить нежелательные дизамещенные нуклеозиды и 3'-региоизомеры от желательных 5'-фосфорамидатов. Подходящие целевые фракции концентрировали и подвергали лиофилизации из диоксана, затем делили на нижеуказанные остатки: первым элюировался 5'-диастереомер, в итоге представляющий собой белое порошкообразное вещество (27 мг, 0,05 ммоль, 2%), смесь 5'-диастереомеров, в итоге представляющая собой белое твердое вещество (0,35 г, 21%) и во вторую очередь элюировался диастереомер, в итоге представляющий собой белое твердое вещество (33 мг, 2%).

ЯМР-спектр элюированного в первую очередь диастереомера (400 МГц, 298 K, CDCl₃): ¹H, δ 0,94 (д, 3H), 1,26 (т, 3H), 1,38 (д, 3H), 2,74 (м, 1H), 3,75 (д, 1H, NH), 3,84-4,25 (м, 4H, H-3', α-H, CH₃CH₂O), 4,37 (дд, 1H, H-5'), 4,48 (дд, 1H, H-5''), 5,59 (д, 1H), 6,40 (ушир.с, 1H, H-1'), 7,17-7,39 (м, 6H), 9,15 (с, 1H, NH).

³¹P, δ 3,44 (с, не использовали внутренний P стандарт).

Лазерная ионизация - масс-спектрометрия: рассчитано для C₂₁Н₂₇N₆O₉P: 539,16. Найдено: 539,12 [Μ+Η].

ЯМР-спектр элюированного во вторую очередь диастереомера (400 МГц, 298 K, CDCl₃): ¹H, δ 1,01 (д, 3H), 1,26 (т, 3H), 1,38 (д, 3H), 2,77 (м, 1H), 3,92-4,24 (м, 5H, NH, H-3', α-H, CH₃CH₂O), 4,42 (д, 2H, H-5' и H-5''), 5,67 (д, 1H), 6,41 (ушир.с, 1H, H-1'), 7,16-7,43 (м, 6H).

Лазерная ионизация - масс-спектрометрия: рассчитано для C₂₁Н₂₇N₆O₉P: 539,16. Найдено: 539,12 [M+H].

Элюированный в первую очередь диастереомер обозначен как диастереомер 1, и элюированный во вторую очередь диастереомер обозначен как диастереомер 2.

ЯМР-спектры других выбранных примеров:

Соединение 1-2

Энантиомерночистое соединение

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д. 1,00 (д, J=7,0 Гц, 3H) 1,18-1,22 (м, 6H) 1,43 (д, J=6,8 Гц, 3H) 2,28 (с, 3H) 2,68-2,81 (м, 1H) 3,17 (spt, J=6,9 Гц, 1H) 3,69 (ушир.с, 1H) 3,97-4,09 (м, 2H) 4,14 (n, J=10,8 Гц, 1H) 4,39 (д, J=8,6 Гц, 2H) 5,14 (д, J=12,3 Гц, 1H) 5,17 (д, J=12,3 Гц, 1H) 5,67 (д, J=8,0 Гц, 1H) 6,38 (ушир.с, 1H) 7,21-7,39 (м, 8H) 8,99 (ушир.с, 1H).

Соединение 1-6

Смесь диастереомеров

¹H-ЯМР (500 MГц, 298 K, ДМСО-d₆): ¹H, δ 0,85 (м, 3H, 2'β-CH₃), 1,21 (д, 3H, CH₃CH-), 1,47-1,75 (м, 8H, 4×CH₂), 2,63 (м, 1H, H-2'), 3,79 (м, 1H, CH₃CH-), 3,98 (ушир.с, 1H, H-3'), 4,38 (м, 2H, H-5', 5''), 5,02 (м, 1H, (-CH₂)₂-CH-O), 5,55 (м, 1H, H-5), 5,92 (м, 1H, OH-3'), 6,13 (м, 1H, -NH-P), 6,29 (ушир.с, 1H, H-1'), 7,20 (м, 3H, Ar-H), 7,36 (м, 2H, Ar-H), 7,52 (дд, 1H, H-6), 11,46 (с, 1H, O=C-NH-C=O).

Соединение 1-13

Смесь диастереомеров (6:4)

¹H-ЯМР (500 MГц, 298 K, CDCl₃): δ 0,93 (м, 3H, CH₃CH₂-), 1,03 (д, 3H, 2'β-CH₃), 1,37 (м, 2H, CH₃CH₂-), 1,51-1,69 (м, 8H, (CH₃)₂C и -CH₂CH₂CH₂O-), 2,75 (м, 1H, H-2'), 3,61 (д, -NH-P основной), 3,74 (д, -NH-P незначительный), 3,88-4,20 (м, 3H, H-3' и -CH₂CH₂O-), 4,30-4,51 (м, 2H, H-5', 5''), 5,54 (д, H-5 незначительный), 5,66 (д, H-5 основной), 6,39 (ушир.с, 1H, H-1'), 7,10-7,47 (м, 6H, Ar-H и H-6), 8,67 (ушир.с, 1H, O=C-NH-C=O).

Соединение 1-19

Энантиомерночистое соединение

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 0,98 (д, J=6,8 Гц, 3H) 1,16-1,22 (м, 6H) 1,42 (д, J=7,2 Гц, 3H) 2,28 (с, 3H) 2,69-2,81 (м, 1H) 3,15 (spt, J=6,9 Гц, 1H) 3,63 (ушир.с, 1H) 3,87 (т, J=10,4 Гц, 1H) 3,97-4,07 (м, 1H) 4,08-4,18 (м, 1H) 4,33-4,40 (м, 1H) 4,43-4,49 (м, 1H) 5,14 (д, J=12,3 Гц, 1H) 5,19 (д, J=12,3 Гц, 1H) 5,54 (д, J=8,1 Гц, 1H) 6,39 (ушир.с, 1H) 7,07 (д, J=8,1 Гц, 1H) 7,24 (с, 1H) 7,25 (с, 1H) 7,30-7,40 (м, 5H) 8,75 (ушир.с, 1H).

Соединение 1-24

Смесь диастереомеров (6:4)

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д. 0,99 (д, J=7,0 Гц, 1,2H) 1,03 (д, J=6,8 Гц, 1,8H) 1,20-1,24 (м, 6H) 1,28 (т, J=7,1 Гц, 3H) 1,40-1,44 (м, 3H) 2,30 (с, 1,2 H) 2,31 (с, 1,8H) 2,71-2,83 (м, 1H) 3,18 (дкв., J=13,7, 7,0 Гц, 1H) 3,58 (д, J=6,8 Гц, 0,6H) 3,69 (д, J=6,8 Гц, 0,4H) 3,79 (т, J=10,5 Гц, 0,4H) 3,89-4,11 (м, 2,6H) 4,13-4,27 (м, 2H) 4,35-4,52 (м, 2H) 5,55 (д, J=8,0 Гц, 0,4H) 5,68 (д, J=8,2 Гц, 0,6H) 6,40 (ушир.с, 1H) 7,09 (д, J=8,2 Гц, 0,6H) 7,24 (с, 1H) 7,25 (с, 1H) 7,29 (д, J=8,0 Гц, 0,4H) 8,60 (ушир.с, 1H).

Соединение 1-25

Смесь диастереомеров

¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ м.д. 0,86 (ушир.с, 3H) 1,27 (д, J=6,3 Гц, 3H) 2,55-2,63 (м, 1H) 3,85-4,19 (м, 4H) 4,33-4,51 (м, 2H) 5,02-5,13 (м, 2H) 6,13-6,28 (м, 1H) 7,13-7,37 (м, 10H) 7,91 (ушир.с, 1H) 8,40 (ушир.с, 1H).

Соединение 1-35

Смесь диастереомеров

¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ м.д. 0,77-0,96 (м, 6H), 1,21-1,34 (м, 2H), 1,39 (д, J=15,41 Гц, 6H), 1,45-1,58 (м, 2H), 2,54-2,66 (м, 1H), 3,91-4,05 (м, 2H), 4,15 (ушир.с, 1H), 4,27-4,62 (м, 2H), 5,66-6,04 (м, 2H), 6,18 (ушир.с, 1H), 7,08-7,27 (м, 3H), 7,35 (м, J=7,00, 7,00, 7,00 Гц, 2H), 7,95 (ушир.с, 1H), 11,84 (ушир.с, 1H).

Пример 4: Получение соединений, в которых R²=H

Раствор соединения 1-3 (234 мг, 0,38 ммоль) и NH₄F (235 мг, 6,46 ммоль) в изопропаноле (9 мл) и воду (9 мл) нагревали до 95ºC. ВЭЖХ показала завершение реакции спустя, приблизительно, 1 ч. После упаривания неочищенное вещество подвергали процессу очистки с помощью препаративной ЖХ-масс-спектрометрии, получая 129 мг (59%) соединения 1-9. Условия проведения препаративной ЖХ: колонка: Gemini-NX, 5 мкм, C18, 110A, подвижная фаза: MeOH/H₂О (10 ммоль NH₄Ac): от 60/40 до 80/20 в течение 8 мин.

¹H-ЯМР-спектр (500 MГц, 298 K, ДМСО-d₆): δ 0,84 (м, 9H, 2'β-CH₃ и 2×CH₃), 1,18-1,30 (м, 11H, -CHCH₃ и 4×CH₂), 1,61 (м, 1H, -CH(CH₂)₃), 2,60 (м, 1H, H-2'), 3,23 (-NH-P), 3,71 (м, 1H, -CHCH₃), 3,85-4,06 (м, 5H, H-5', 5'', H-3', -CHCH₂O-), 5,60 (д, 1H, H-5), 6,18 (ушир.с, 1H, H-1'), 7,68 (д, 1H, H-6).

Биологические примеры

Проведение испытаний в процессе репликации

Соединения формулы (I) проверялись на их активность в ингибировании репликации РНК вируса HCV в испытаниях на клетках. Испытания демонстрируют, что соединения формулы I проявляют активность против функционирования репликонов HCV в клеточной культуре. Испытание на клетках может быть основано на экспрессии гена в составе бицистронной конструкции, как описано в работе Lohmann et al. (1999) Science vol. 285 pp. 110-113, с использованием модификаций, описанных в работе Krieger et al. (2001) Journal of Virology 75: 4614-4624, при стратегии многоцелевого скрининга. Анализы репликона Bartenschlager являются коммерчески доступными от фирмы ReBLikon GmbH (Mainz, Germany).

По сути дела, способ заключался в следующем.

При биологических испытаниях использовали стабильно трансфицированную клеточную линию Huh-7 luc/neo (далее в этом документе обозначаемую как Huh-Luc). Эта клеточная линия содержит в себе кодирующую RNA экспрессируемую бицистронную конструкцию, включающую NS3-NS5B фрагменты дикого типа немутантного HCV типа 1b, полученные при трансляции внутририбосомального доступного участка (IRES) из вируса энцефаломиокардита (EMCV), находящиеся перед участком репортерного гена (FfL-люциферазы), и участок гена селектируемого маркера (neo^R, неомицинфосфотрансферазы). На ограничивающих конструкцию 5' и 3' концах содержатся NTRs (нетранслируемые участки) генома HCV генотипа 1b. Функционирующая культура клеток, содержащих репликон, в присутствии G418 (neo^R) зависит от процесса репликации РНК вируса HCV. Стабильно трансфицированные репликоном клетки, в которых экспрессируется HCV РНК, имеющая высокий уровень автономной репликации, кодирующая, помимо всего прочего, люциферазу, применяли для скрининга антивирусных свойств соединений.

Содержащие репликон клетки высевали в луночные планшеты в присутствии тестируемых и контрольных соединений, которые добавляли в различных концентрациях. Далее проводили инкубацию в течение трех дней, репликацию HCV определяли с помощью измерения активности люциферазы (используя стандартные субстраты и реагенты для анализа люциферазы, и микропланшетную установку для визуализации Perkin Elmer ViewLux™ ultraHTS). Содержащие репликон клетки в контрольных культурах имели высокий уровень экспрессии гена люциферазы в отсутствии какого-либо ингибитора. Ингибирующая активность соединения в отношении активности люциферазы контролировали на клетках Huh-Luc, обеспечивая возможность построения графической зависимости «доза - характеристика получаемой активности» для каждого тестируемого соединения. Величины EC₅₀ рассчитывали, эти величины представляют собой количество соединения, требуемое для снижения уровня определяемой люциферазной активности на 50%, или, более конкретно, представляют способность генетически связанного HCV репликона РНК к репликации. В тех случаях, когда соединение формулы (I) тестировали более одного раза в испытаниях процесса репликации, среднее значение всех тестовых результатов приведено в таблице 1.

Соединения, перечисленные в нижеприведенной таблице, представляют собой рацемические смеси фосфорсодержащих энантиомеров (которые также можно назвать как "Смесь диастереомеров"). В ряде примеров эти энантиомеры разделяли без определения точной стереохимии заместителей у атома фосфора. Такие соединения обозначены как диастереомер 1 (для диастереомера, элюированного в первую очередь) или 2 (для диастереомера, элюированного во вторую очередь). В некоторых случаях смесь диастереомеров получали такую, что она была обогащена одним из диастереомеров.

Таблица 1
Номер соединения	R²	R³	R⁴	R⁵	EC₅₀ 1b ET (мкмM)	CC₅₀ Huh-7 (мкмM)	Результат ЖХ-масс-спектрометрии [M+H]+
I-1	фенил	CH₃	H	бензил	5,95	>100	601,1
I-2		CH₃	H	бензил	6,10	29,5	691+693
Диастереомер 1
I-3	фенил	CH₃	H		8,06	30,7	623,1
I-4	фенил	CH₃	H	бутил	9,33	>98,3	567,1
I-5	фенил	CH₃	H	пентил	9,48	>98,3	581,3
I-6	фенил	CH₃	H	циклопентил	10,47	>98,3	579,3
I-7	фенил	CH₃	H	циклогексил	11,21	>98,3	593,1
I-8	фенил	CH₃	H	этил	11,95	>98,3	539,1
Диастереомер 1
I-9	H	CH₃	H		15,81		547,2
I-10	фенил	CH₃	H	пропил	12,87	>98,3	553,1
I-11	нафтил	CH₃	H	бензил	13,83	>100	649 (M-H)^-
I-12	фенил	CH₃	CH₃	бензил	13,92	>100	615,1
I-13	фенил	CH₃	CH₃	бутил	13,13	88,5	581,1
I-14	фенил	CH₃	H	изо-пропил	14,86	>100	553,1
I-15	4-хлорфенил	CH₃	H		15,33	>100	657+659
I-16	фенил	CH₃	H	этил	16,38	>98,3	539,1
Смесь диастереомеров
I-17	фенил	CH₃	H	этил	17,30	>98,3	539,1
Диастереомер 2
I-18	фенил	CH₃	H	метил	26,96	>98,3	525,1
I-19		CH₃	H	бензил	27,63	47,2	691-693
Диастереомер 2
I-20	фенил	этил	H	бутил	28,01	>73,9	581,1
I-21	фенил	этил	H	бензил	29,15	81,8	615,1
I-22		CH₃	H	бензил	31,73	60,5	691-693
Смесь диастереомеров
I-23	фенил	CH₃	H	CH₃-O-(CH₂)₂-	32,10	>98,3	567,1 [M-H]
I-24		CH₃	H	этил	37,67	55,0	629-631
I-26	фенил	этил	H	метил	74,67	>98,3	539,0
I-27	H	этил	H	изо-пропил	>98,36		491,0
I-28	фенил	CH₃	CH₃	изо-пропил	>98,36	>98,36	567,1
I-29	H	этил	H	метил	>98,36	>98,36	463,1
I-30	H	CH₃	H	пропил	>98,36	>98,36	477,1
I-31	фенил	CH₃	H	трет-бутил	>98,36	>98,36	567,2
I-32	H	CH₃	CH₃	бутил	>98,36		505,1
I-33	H	этил	H	бензил	>98,36		539,1
I-34	фенил	этил	H	изо-пропил	>98,36	>98,36	567,1
I-35	фенил	H	CH₃	бутил	49,89	>98,3	707

В вышеприведенной таблице 1 группа

, в которой R³ представляет собой СН₃ и R⁴ представляет собой водород, т.е.

представляет собой -L-Ala (-L-аланил)

Номер соединения	Структура	EC₅₀ 1b ET (мкM)	CC₅₀ Huh-7 (мкM)	Результат ЖХ-масс-спектрометрии [M+H]+
I-25		57,32	>98,3	725,1 [M-H]^-

Испытания ингибирования

Ферментные испытания с различными HCV NS5 конструктами описаны в патентах EP 842276, EP 858833 и EP 1037974. В полимеразных испытаниях обычно используют полимеразу, пул нуклеотидтрифосфатов и праймер/матрицу. Нуклеозидные тестируемые соединения, как правило, должны быть синтетически фосфорилированы до трифосфатов, что представляет собой методику достаточно трудную. Патент EP 1350276 описывает испытания репортерного гена, которые предназначены для того, чтобы избежать недостатки испытаний выделенного фермента.

Аккумуляция трифосфата

Соединения можно испытать на внутриклеточную аккумуляцию противовирусных активных трифосфатных продуктов, например, путем введения соединения в подходящие человеческие клетки, такие как гепатоциты, инкубация для внутриклеточного проникновения, чтобы дать возможность клеточным киназам осуществить трифосфорилирование, исходя из фосфатной группы, и лизиса клеток, и экстракции.

Claims

1. Соединение формулы I:

или его стереоизомерная форма,
где R¹ представляет собой водород;
R² представляет собой водород; или фенил, последний является необязательно замещенным 1, 2 или 3 заместителями, каждый из которых, независимо друг от друга, выбирают из галогена и C₁-C₆алкила; или R² представляет собой нафтил;
R³ представляет собой водород, C₁-C₆алкил;
R⁴ представляет собой водород, C₁-C₆алкил; R⁵ представляет собой C₁-C₁₀алкил, необязательно замещенный C₁-C₆алкоксигруппой; или R⁵ представляет собой C₃-C₇циклоалкил; бензил;
R⁸ представляет собой водород;
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.

2. Соединение по п. 1, где R³ представляет собой водород и R⁴представляет собой метил, или где R³ представляет собой метил и R⁴ представляет собой водород, или где R³ и R⁴, оба, представляют собой метил.

3. Соединение по любому предшествующему пункту, где R⁵представляет собой C₁-C₁₀алкил, C₃-C₇циклоалкил или бензил.

4. Соединение по п. 1, где R¹ представляет собой водород; R²представляет собой водород; -NH-C(R³)(R⁴)-СО- образует L-Ala или α,α-диметилглицил; R⁵ представляет собой C₁-C₈алкил, C₁-C₄алкил, замещенный C₁-C₄алкоксигруппой, циклопентил, циклогексил или бензил; R⁸ представляет собой водород.

5. Соединение по п. 1, где R¹ представляет собой водород; R² представляет собой водород; -NH-C(R³)(R⁴)-СО- образует L-Ala; R⁵ представляет собой C₁-C₈алкил, циклопентил, циклогексил или бензил; R⁸ представляет собой водород.

6. Соединение по п. 5, где R⁵ представляет собой циклопентил или циклогексил.

7. Комбинация соединения по любому из пп. 1-6 и другого противо-HCV соединения в качестве комбинированного лекарственного средства для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении HCV инфекций.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей репликацию РНК вируса HCV активностью, содержащая соединение формулы I, как определено в любом из пп. 1-6, и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, дополнительно содержащая, по крайней мере, одно дополнительное HCV противовирусное средство.

10. Применение соединения по любому из пп. 1-6 для производства лекарственного средства для лечения или профилактики HCV инфекции.

11. Соединение по п. 1 для применения в качестве лекарственного средства.

12. Соединение по п. 1 для применения при лечении или профилактике HCV инфекции.