RU2484134C2 - Клеточные линии, содержащие их композиции для лечения меланом, способы получения композиций и способы лечения - Google Patents
Клеточные линии, содержащие их композиции для лечения меланом, способы получения композиций и способы лечения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2484134C2 RU2484134C2 RU2009141593/10A RU2009141593A RU2484134C2 RU 2484134 C2 RU2484134 C2 RU 2484134C2 RU 2009141593/10 A RU2009141593/10 A RU 2009141593/10A RU 2009141593 A RU2009141593 A RU 2009141593A RU 2484134 C2 RU2484134 C2 RU 2484134C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mel
- cells
- deposited
- cell lines
- cell
- Prior art date
Links
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 title claims abstract description 80
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 317
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 98
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 78
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 75
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 claims description 5
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 4
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 claims description 3
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 16
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 16
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 14
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 13
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 12
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 11
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 8
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 8
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 6
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 102000003805 Chemokine CCL19 Human genes 0.000 description 5
- 108010082161 Chemokine CCL19 Proteins 0.000 description 5
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 5
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 BCG Substances 0.000 description 4
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 4
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 4
- 208000013228 adenopathy Diseases 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 3
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000005866 Exanthema Subitum Diseases 0.000 description 3
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 208000036485 Roseola Diseases 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 101000854908 Homo sapiens WD repeat-containing protein 11 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 2
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 206010059282 Metastases to central nervous system Diseases 0.000 description 2
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 102100020705 WD repeat-containing protein 11 Human genes 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 238000011961 computed axial tomography Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005016 dendritic process Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N (2s)-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylb Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-O 1-nitrotetrazol-2-ium Chemical compound [O-][N+](=O)[NH+]1C=NN=N1 KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 235000007173 Abies balsamea Nutrition 0.000 description 1
- 208000025978 Athletic injury Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 239000004857 Balsam Substances 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 101100504320 Caenorhabditis elegans mcp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000008789 Direct Bilirubin Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108030000917 Glutamine-pyruvate transaminases Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 244000018716 Impatiens biflora Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 description 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 206010027465 Metastases to skin Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010041738 Sports injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100030306 TBC1 domain family member 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N bromochloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Br GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 1
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464491—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5152—Tumor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/876—Skin, melanoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Клеточные линии меланомы человека, такие как Mel-XY1, депонированная в DSMZ под №DSM ACC2830, Mel-XY2, депонированная в DSMZ под №DSM ACC2831, Mel-XY3, депонированная DSMZ под №DSM ACC2832, и Mel-ХХ4, депонированная DSMZ под № DSM ACC2829, облучают для получения популяций с апоптотическим и некротическим фенотипом. Полученные клеточные линии используют в различных сочетаниях для лечения злокачественных заболеваний, а именно для лечения меланомы человека. Также указанные популяции облученных клеток сокультивируют с аутологичными дендритными клетками для последующего совместного введения пациенту, страдающему меланомой. Изобретение позволяет индуцировать стойкий противораковый иммунный ответ у млекопитающего, страдающего меланомой. 8 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 10 ил., 5 пр.
Description
ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ
Настоящее изобретение относится к клеточным линиям, содержащим их композициям для лечения меланом, способам получения композиций и к способам лечения. Более конкретно, изобретение относится к различным клеточным линиям меланомы человека для лечения злокачественных заболеваний, где клеточные линии представляют собой: (a) Mel-XY1 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7 B 38124 Braunschweig, Germany, 23 марта 2007 года под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7 B 38124 Braunschweig, Germany, 23 марта 2007 года под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7 B 38124 Braunschweig, Germany, 23 марта 2007 года под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrabe 7 B 38124 Braunschweig, Germany, 23 марта 2007 года под регистрационным номером DSM ACC2829) или (e) их субпопуляции. Клеточные линии могут быть облученными, с получением, таким образом, популяций с апоптотическим фенотипом и популяций с некротическим фенотипом таких клеточных линий. Композиции могут содержать адъюванты и/или иммуномодуляторы и/или аутологичные дендритные клетки.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время предпринято множество попыток и используют множество средств для исследования в области иммунотерапии злокачественных опухолей. Важные существующие данные указывают на центральную роль T-лимфоцитов в эффективных иммунных ответах на злокачественную опухоль (Oliver RT, Nouri AM. T; Cancer Surv 1992; 13:173-204). В связи с этим использовали лечение аллогенными клетками отдельно, с адъювантами или в сочетании с некоторыми цитокинами.
С другой стороны известно, что дендритные клетки (DC) представляют собой антигенпрезентирующие клетки, которые могут инициировать T-клеточный ответ вследствие их исключительной способности стимулировать наивные T-лимфоциты (Schuler G, Steinman RM. J Exp. Med 1997; 186:1183-7, и Banchereau J, Steinman RM. Nature 1998; 392:245-52).
Несколькими авторами на моделях на мышах и у человека было показано, что DC поглощают апоптотические клетки и, таким образом, представляют антигены для образования комплексов HLA класса I/пептиды, позволяющих индукцию цитотоксических T-лимфоцитов (Albert МЛ, Pearce SF, Francisco LM, Sauter B, Roy P, Silverstein RL, Bhardwaj N. J Exp Med. 1998, 188: 1359-1368; Chen Z, Moyana T, Saxena A, Warrington R, Jia Z, Xiang J. Int J Cancer. 2001, 93: 539-548, и Shaif-Muthana M, McIntyre C, Sisley K, Rennie I, Murray A. Cancer Res. 2000, 60: 6441-6447). Для этого процесса существенно, что апоптотические клетки индуцируют созревание дендритных клеток (DC), однако многие авторы информировали, что апоптотические клетки человека не вызывают созревания DC, или индуцируют утрату созревания таких как DC (Pietra G, Mortarini R, Parmiani G, Anichini A. Cancer Res 2001, 61: 8218-8226; Labarriere N, Bretaudeau L, Gervois N, Bodinier M, Bougras G, Diez E, Lang F, Gregoire M, Jotereau F. Int J Cancer 2002, 101: 280-286 и Demaria S, Santori FR, Ng B, Liebes L, Formenti SC, Vukmanovic S. J Leukoc Biol. 2005, 77: 361-368).
В патенте США 6187306, выданном Pardoll et al., описан способ лечения меланомы и защиты от нее, который включает применение по меньшей мере одной или нескольких аллогенных клеточных линий, экспрессирующих иммунодоминантные антигены меланомы, где клеточная линия модифицирована таким образом, чтобы она экспрессировала цитокины, и введение такой трансформированной линии пациенту, имеющему меланому или подверженному риску возникновения заболевания. Несмотря на важность используемой клеточной линии или клеточных линий, которые экспрессируют большинство иммунодоминантных антигенов, не описана новая клеточная линия или сочетание клеточных линий, экспрессирующих большинство таких антигенов. Изобретение включает по существу трансформированные клеточные линии, экспрессирующие цитокины, такие как GM-CSF.
В патенте США 5882654 и патенте США 5840317 описаны облученные клеточные линии меланомы, используемые в качестве аллогенных вакцин. Описанное лечение достигает уровней у пациентов NED ниже 50% (16/37) и демонстрирует эффективную противоопухолевую активность гуморального типа.
В патенте США 2006/0034811, выданном Wallack et al., описаны вакцины, содержащие антигенпрезентирующие клетки, нагруженные лизированными или перфорированными опухолевыми клетками, включающими цитозоль и мембраны. Опухолевые клетки могут представлять собой клетки пациента, клеточные линии или клетки, инфицированные рекомбинантным вирусом осповакцины, кодирующим IL-2. В патенте США 2006/0140983, выданном Palucka et al., описана композиция, индуцирующая иммунитет у пациентов со злокачественной опухолью, которая содержит выделенные и очищенные антигенпрезентирующие клетки, примированные для экспонирования одного или нескольких белков теплового шока, и погибшие опухолевые клетки. Антигенпрезентирующие клетки представляют собой дендритные клетки, и опухолевые клетки могут представлять собой сингенные или аллогенные клетки, например, клеточные линии. В этом документе описана необходимость поглощения белков теплового шока с помощью разрушения опухолевых клеток посредством нагревания. В представленных способах анализа не описано обязательно, что композиция обладает индуцирующей иммунитет активностью у пациентов с меланомой.
В патенте США 6602709, выданном Albert et al., описано применение апоптотических клеток для представления антигенов дендритным клеткам для индукции T-клеток. Способ пригоден для индукции антигенспецифических цитотоксических T-хелперных лимфоцитов. Дендритные клетки примируются апоптотическими клетками или их фрагментами, и они способны процессировать и представлять процессированные антигены, и индуцировать активность цитотоксических T лимфоцитов, которые можно использовать в качестве терапевтических вакцин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящего изобретения представлено несколько клеточных линий меланомы человека для лечения злокачественных заболеваний, где клеточные линии представляют собой (a) Mel-XY1 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированную Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829) или (e) их субпопуляции. Клеточные линии могут быть облученными, с получением, таким образом, популяций с апоптотическим фенотипом и популяций таких линий с некротическим фенотипом.
В другом аспекте настоящего изобретения представлена композиция для лечения меланомы, где такая композиция содержит по меньшей мере одну аллогенную клеточную линию меланомы, например (a) Mel-XY1 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829) или их сочетания, где такие клеточные линии не способны пролиферировать. Также композиция может содержать эксципиенты, адъюванты, такие как БЦЖ, и иммуномодуляторы, такие как GM-CSF или IFNα. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит сочетание четырех аллогенных клеточных линий меланомы: (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832) и (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), где такие клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать. В другом предпочтительном варианте осуществления представлена композиция по изобретению, содержащая сочетания трех аллогенных клеточных линии меланомы: (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831) и (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), где клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать.
В другом аспекте настоящего изобретения представлена композиция для адъювантного лечения меланомы, где такая композиция содержит по меньшей мере одну аллогенную клеточную линию меланомы, например (a) Mel-XY1 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), и их сочетания, и где такие клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать. Также композиция может содержать эксципиенты, адъюванты, такие как БЦЖ, и иммуномодуляторы, такие как GM-CSF и/или IFNα. В одном предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению содержит сочетание аллогенных клеточных линий меланомы (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832) и (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), где такие клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению содержит сочетание аллогенных клеточных линий меланомы: (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831) или (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), где такие клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать.
В другом аспекте настоящего изобретения представлена композиция для лечения меланом человека, содержащая зрелые аутологичные дендритные клетки, аутологичные дендритные клетки, нагруженные клетками по меньшей мере аллогенной клеточной линии меланомы человека, апоптотические клетки такой по меньшей мере одной гетерологичной клеточной линии меланомы человека. Клеточная линия меланомы человека представляет собой одну или несколько из следующих линий: (a) Mel-XY1 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829) или (e) их субпопуляции.
В другом аспекте изобретения представлена композиция для адъювантного лечения меланомы человека, содержащая зрелые дендритные клетки, дендритные клетки, нагруженные клетками по меньшей мере одной аллогенной клеточной линии меланомы человека, апоптотические клетки одной гетерологичной клеточной линии меланомы человека и некротические клетки одной гетерологичной клеточной линии меланомы человека. Клеточная линия меланомы представляет собой одну или несколько из следующих клеточных линий: (a) Mel-XY1 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированная в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829) или их субпопуляции.
В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения композиции, где такой способ осуществляют в следующих стадиях:
a) размораживание и культивирование клеточных линий (a) Mel-XY1 (Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832);
b) смешивание этих трех клеточных линий;
c) облучение этих трех клеточных линий;
d) добавление адъювантов и эксципиентов к смесям клеточных линий. Также способ может включать на стадии a) добавление клеточной линии (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829).
В другой задаче настоящего изобретения представлен способ получения композиции, который включает стадии:
a) размораживания и культивирования клеточных линий (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832) и Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829);
b) смешивания таких клеточных линий;
c) облучения таких клеточных линий;
d) получения аутологичных дендритных клеток; и
e) со-культивирования в течение некоторого времени аутологичных дендритных клеток с облученными клеточными линиями стадии c).
В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ индуцирования противоопухолевого иммунного ответа у пациентов, имеющих меланому, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества сочетания клеточных линий (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831) и (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), где такие клеточные линии не способны пролиферировать. Введение можно проводить вместе с адъювантами и/или иммуномодуляторами.
В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ индуцирования противоопухолевого иммунного ответа у пациентов, имеющих меланому, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества сочетания клеточных линий (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), где такие клеточные линии не способны пролиферировать.
В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ индуцирования противоопухолевого иммунного ответа у пациентов, имеющих меланому, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества аутологичных дендритных клеток, со-культивированных в течение от 6 до 72 часов, и сочетания клеточных линий: (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), где такие клеточные линии не способны пролиферировать.
ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На фиг.1 представлен иллюстративный пример результатов гамма-облучения смеси клеточных линий по изобретению в отношении индукции апоптоза и некроза (клетки Apo-Nec). На панели A представлены необлученные клетки, и на панели B представлены клетки после гамма-облучения 70 Грэй и окрашивания аннексином V-FITC и IP (иодидом пропидия). Ранние апоптотические клетки определяют как аннексин V-FITC+/IP-, а некротические клетки были двойными положительными.
На фиг.2 представлен график Каплана-Мейера для пациентов, которым вводили композицию по изобретению DC/Apo-Nec.
На фиг.3 представлена пролиферация лимфоцитов in vitro в ответ на аутологичные опухолевые клетки, представленные DC. Результаты представлены в качестве средних значений ± SD cpm (число импульсов в минуту) для трех значений. Лимфоциты с фитогемаглютинином (PHA), имеющие более 7×104 cpm, инкубировали в качестве положительных контролей.
На фиг.4 представлено окрашивание тетрамером на антигены Melan A/MART-1 и gp100. На панели A представлены результаты, полученные для образцов PBMN от пациентов с HLA-A*0201, участвующих в тестировании. *ND означает: нет данных вследствие недостаточного количества CD8+ T-клеток в образцах после применения. На панели B показано повышение CD8+ HLA T-лимфоцитов/тетрамерный пептид+ в PBMC от пациента #2. Количества соответствуют проценту CD8+ HLA/тетрамерный пептид+. PBMC с HLA-A*0201 от здоровых доноров окрашивали в качестве контролей.
На фиг.5 представлено внутрицитоплазматическое измерение IL-10 и IL-12 в клетках Apo-Nec по изобретению. На панели A представлены результаты FACS для DCin, и на панели B представлены результаты FACS для клеток DC/Apo-Nec.
На фиг.6 представлена экспрессия антигена HMB45 и Mart-1 в линии Mel-XY1 и в производных клонах этой клеточной линии. Три верхние панели соответствуют клеточной линии, а три нижние панели соответствуют клонам. Столбец 1 соответствует клеточной линии и контрольным клонам, столбец 2 соответствует клеточной линии с экспрессией HMB45 и клонам соответственно; и столбец 3 соответствует клеточной линии с экспрессией Mart-1 и клонам.
На фиг.7 представлен биоптат меланомы от пациента #100. На панели A представлено изображение с низким увеличением (25X), где можно видеть положительные и отрицательные по Ag gp100 опухолевые клетки; на панели B представлена экспрессия гетерогенного gp100, где можно видеть клетки с высокой, умеренной и нулевой экспрессией (400x); на панели C представлена экспрессия гетерогенного Ag MART-1, где можно видеть клеточный клон с высокой экспрессией, окруженный отрицательными клетками (400x).
На фиг.8 представлен график Каплана-Мейера для пациентов, которым вводили композицию Apo-Nec по изобретению.
На фиг.9 представлены метастазы в кожу, вырезанные у пациента #200, которому вводили композицию Apo/Nec по изобретению, в дополнение к GM-CSF и БЦЖ. На панели A представлены макрофаги в некротической области опухоли (1), инфильтрированной лимфоцитами, контактирующими с опухолевыми клетками (2), и жизнеспособной области опухоли (3). На панели B представлен фрагмент 100x области с высокой инфильтрацией опухоли, на панели C представлен фрагмент 400x той же области, где наблюдают инфильтрирующие лимфоциты, на панели D представлен фрагмент того же метастаза, где большая его часть является некротизированной с макрофагами, нагруженными меланином (1), и жизнеспособная область (2) (25X).
На фиг.10 представлены изображения компьютерной аксиальной томографии пациента #300, которому вводили композицию Apo-Nec по изобретению в дополнение к БЦЖ. На панели A стрелкой показано расположение метастаза в легком, а на панели B представлено изображение аксиальной томографии, полученное через 5 месяцев.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В этой заявке термины "сочетание" и "смесь" являются взаимозаменяемыми.
Когда в настоящем изобретении приводятся композиции, которые модифицируют иммунную систему у млекопитающих, необходимо понимать, что эти композиции также известны специалисту в данной области как вакцинные композиции, клеточные вакцины или просто вакцины.
Четыре клеточные линии по изобретению были депонированы согласно Будапештскому договору в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ 23 марта 2007 года под следующими регистрационными номерами: клеточная линия Mel-XY1 DSM ACC2830, линия Mel-XY2 DSM ACC2831, линия Mel-XY3 DSM ACC2832 и линия Mel-XX4 DSM ACC2829.
Результаты анализов по охарактеризации клеточных линий представлены в следующей таблице.
Таблица 1 | ||||
ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ | ||||
МАРКЕР | XY1 | XY2 | XY3 | XY4 |
Gp100 (Hm B45) | ND | ТВ | + | + |
Gp (PCR) | + | + | + | + |
Тирозиназа (PCR) | + | + | + | + |
MART-1 (PCR) | + | - | + | - |
MAGE-1 (PCR) | ND | - | + | + |
S100 | + | + | + | + |
Виментин | ND | + | + | + |
CEA | ND | + | + | ND |
GD2 | + | + | + | + |
GD3 | + | + | + | + |
P53 | + | + | + | + |
MIA | + | + | + | + |
MCP-1 | - | + | + | + |
TRP-2 | + | + | ND | + |
MDR1 | - | ND | - | - |
HLA класса I | A02/23 B18/B37 |
A30/33 B18/B65 |
A02/23 B18 |
A24(9)/23(19) B18/B65(14) |
HLA класса II | GR7/DR11 GR52/DR53 |
GR1/DR1 | GR11 DR13 GR52 |
GR1/DR11 |
Онкогенность у голых мышей | + | + | + | + |
Рост в колониях на мягком агаре | ++ | ++ | ++++ | ++ |
Из охарактеризации клеточной линии MEL-XY1 следует, что клетки растут в качестве гетерогенного амеланотического клеточного монослоя по размеру и форме, где большинство из них являются кубическими или удлиненными и без отростков. Они являются немного меланотическими при высокой плотности. Клетки MEL-XY1 образуют значительное количество колоний в полутвердом агаре. Клетки MEL-XY1 являются онкогенными у бестимусных мышей (голых) и не образуют метастазы.
Из охарактеризации клеточной линии MEL-XY2 следует, что клетки растут до размеров гетерогенного амеланотического клеточного слоя. Клетки являются небольшими и менее многочисленными, многоядерными и с выступающими ядрами. Также видны клетки с характерными для меланомы дендритными отростками. При росте с высокой плотностью, они могут накапливаться и образовывать микроопухоли. Клетки MEL-XY2 являются онкогенными у бестимусных мышей (голых) и не образуют метастазы.
Из охарактеризации клеточной линии MEL-XY3 следует, что клетки растут в виде монослоя. Клетки являются однотипными, небольшими и частично округлыми. Вырастая с высокой плотностью, они могут скапливаться и образовывать микроопухоли. Клетки MEL-XY3 образуют множество колоний в полутвердом агаре. Клетки MEL-XY3 являются онкогенными у бестимусных мышей (голых) и не образуют метастазы.
Из охарактериации клеточной линии Mel-XX4 следует, что эта клеточная линия растет в виде веретенообразного монослоя с высокой плотностью. При низкой плотности, в ней заметны дендритные отростки, сходные с меланоцитами. Клетки являются меланотическими, и некоторые из них имеют множество ядер с выступающим ядром. Время удвоения популяции составляет 172-173 часов, и они образуют колонии в анализе на мягком агаре.
Когда клеточную линию Mel-XX4 по изобретению трансплантировали голым мышам (с иммунной супрессией), получали опухолевые клеточные линии in vivo. Серийные пассажи от исходных опухолей продемонстрировали, что у 100% животных с трансплантатами в течение первого месяца развились опухоли. Рост опухоли был медленным и через 84 суток достигал среднего значения 372±63 мм3. Клеточная линия Mel-XX4 по изобретению является онкогенной при подкожной инъекции в количестве 3×106 клеток.
Из анализа модального числа хромосом следует следующее: линия MEL-XY1 по изобретению демонстрирует разброс в числе хромосом (между 105 и 110), и, таким образом, четкое модальное число не было ясным (самцы). Линия MEL-XY2 по изобретению демонстрирует бимодальную тенденцию с числами хромосом 89 и 91 (самцы). Клеточная линия MEL-XY3 по настоящему изобретению демонстрирует модальное число (самцы). Наиболее частые изменения числа представляли собой отсутствие хромосом в парах 2 и 6 и дополнительные хромосомы в парах 20 и 22. Клеточная линия MEL-XY4 по изобретению демонстрирует модальное число 57-58 (самки).
Исследовали индукцию гамма-облучением апоптоза в клеточных линиях по изобретению. Применение облучения 50 Грэй было достаточным для тотального подавления клоногенной способности каждой клеточной линии по изобретению в мягком агаре. Не выявили значимых отличий в степени индукции апоптоза/некроза, когда клетки облучали 70 или 100 Грэй. На фиг.1A показано, что необлученные клетки меланомы содержали между 6-9% ранних апоптотических клеток, характеризующихся окраской Anexin-V+/IP- (нижняя правая панель). После облучения при 70 Грэй и культивирования в течение 72 ч, получали 45-53% ранних апоптотических клеток (см. фиг.1 B, нижняя правая панель). Аннексин-V и IP окрашивали некротические клетки с возрастанием от 7,5% в необлученных клетках до приблизительно 15% в облученных клетках (верхние левые панели). Таким образом, в настоящей патентной заявке облученные клетки меланомы по изобретению называют клетками Apo-Nec, и композиция, содержащая одну или несколько из любых из клеточных линий Apo-Nec (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и/или Mel-XX4), известна как композиция Apo-Nec.
Облучение клеток позволяет получить клетки, неспособные пролиферировать, пригодные для изготовления композиций, таких как композиция Apo-Nec по изобретению. Специалисту в данной области очевидно, что композиция Apo-Nec по изобретению может содержать любую из клеточных линий по изобретению или их различные сочетания. В предпочтительном варианте осуществления композиция Apo-Nec по изобретению содержит смесь или сочетание клеточных линий Mel-XY1, Mel-XY2 и Mel-XY3. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция Apo-Nec по изобретению содержит смесь или сочетание клеточных линий Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и Mel-XX4. Смесь предпочтительных клеточных линий Apo-Nec по изобретению обеспечивает сочетание множества антигенов, индуцирующих превосходный противоопухолевый иммунный ответ.
Неожиданно, сочетание опухолевых антигенов, представляемых смесью четырех клеточных линий Apo-Nec по изобретению, индуцирует специфический T-клеточный иммунный ответ против опухоли и позволяет достигнуть отсутствия заболевания у 80% пациентов, при введении им композиции Apo-Nec по изобретению (см. фиг.8).
Линии по изобретению также использовали для получения композиции по изобретению, известной как DC/Apo-Nec, которая содержит по меньшей мере одну из клеточных линий по изобретению и аутологичные дендритные клетки.
В предпочтительном варианте осуществления клеточные линии представляют собой различные сочетания линий Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и Mel-XX4. В качестве неограничивающего примера сочетание может содержать смесь клеточных линий Mel-XY1 и Mel-XY2, или смесь линий Mel-XY1, Mel-XX4. В предпочтительном варианте осуществления сочетание клеточных линий содержит смесь клеточных линий Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и Mel-XX4; таким образом, присутствуют четыре типа клеток.
В предпочтительном варианте осуществления композиция DC/Apo-Nec по изобретению содержит сочетание облученных клеточных линий Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3, Mel-XX4 и аутологичные дендритные клетки.
Конкретное сочетание четырех клеточных линий по изобретению обеспечивает уникальный источник нативных антигенов для нагрузки дендритных клеток, кроме того, предоставляя антигены клоногенных клеток. Необходимо учитывать, что сочетание четырех облученных клеточных линий по изобретению не только обеспечивает конкретное сочетание нативных антигенов, но также содержит конкретное сочетание клеточных популяций, где присутствует приблизительно 50% апоптотических клеток и приблизительно 15% некротических клеток. Это сочетание популяций индуцирует созревание DC.
Исследование I стадии композиции DC/Apo-Nec по изобретению проводили у 16 пациентов с меланомой, характеристики которых представлены в таблице 2.
Средний возраст составлял 42 года (в диапазоне от 17 до 60 лет). Введение проводили пяти женщинам и одиннадцати мужчинам. Один из пациентов имел меланому стадии IIC AJCC, восемь имели меланому стадии III, и семь имели меланому стадии IV. Пациенты #5 и #11 подвергались хирургической операции по удалению метастазов в легком; пациент #16 имел подкожные метастазы, и пациентам #1, #10 и #15 была проведена лучевая терапия в подмышечной области после хирургической операции вследствие разрыва капсулы лимфатического узла. Группам из четырех пациентов проводили введение и промывание 5, 10, 15, или 20×106 дендритных клеток (CD), со-культивированных с клетками Apo-Nec (композиция DC/Apo-Nec по изобретению). Каждому пациенту вводили раз в две недели дозу композиции DC/Apo-Nec (0,3 мл) без адъювантов. Пациент #7 был исключен из протокола после второго применения вследствие быстрого прогрессирования заболевания после спортивной травмы на правом бедре и неконтролируемой инфекции; этот пациент не был заменен.
Незрелые дендритные клетки (DCin) продемонстрировали следующий паттерн: 95,1±3,6% были CD14-/CD11c+, и 70±6% были CD1a+. Оцененная чистота составляла приблизительно 60%.
Из 1×108 PBMC, посеянных в бессывороточной среде, получили приблизительно 3×106 DC.
Когда DCin, полученные от пациентов, и клетки, содержащиеся в композиции DC/Apo-Nec по изобретению, охарактеризовали, было выявлено, что 42,3%±13,7 клеток Dcin от пациентов (n=15) были способны фагоцитировать клетки Apo-Nec по изобретению. Фагоцитоз клеток Apo-Nec оценивали с помощью электронной микроскопии, наблюдая целые клетки Apo-Nec или их части в вакуолях DC.
Способность клеток Apo-Nec по изобретению влиять на процесс созревания происходящих из моноцитов клеток DC исследовали посредством измерения специфичных маркеров DC-клеток проточной цитометрией (FACS) (FACSCalibur , BD Biosciences, San Jose, CA). Фагоцитоз клеток Apo-Nec по изобретению привел к зрелому фенотипу DC-клеток по сравнению с контролями, инкубированными с LPS. О зрелости DC-клеток свидетельствовало повышение экспрессии CD83, CD80, CD86, HLA класса I и II и CD40. После фагоцитоза, было выявлено снижение эндоцитоза FITC-Dx, составляющее 75,2%±16, по сравнению с DCin.
Экспрессия рецептора 7 хемокинов (мотив C-C) (CCR7) повышалась в DC после фагоцитоза клеток Apo-Nec по изобретению у всех пациентов, и это было связано с миграцией CD-клеток in vitro в направлении MIP-3β. Клетки DCin (9,6% CCR7+, MFI: 23,3) мигрировали в направлении MIP-1α, но не в направлении MIP-3β; напротив, клетки DC/Apo-Nec (81,8% CCR7+, MFI: 41,2) отчетливо мигрировали в направлении MIP-3β, но не в направлении MIP-1α.
За исключением пациента #6, у которого был показан низкий выход PBMC, и, таким образом, дозу клеток DC/Apo-Nec 10×106 нельзя было получить и необходимо было вводить дозы 3×106 клеток на применение, всем остальным пациентам вводили ожидаемые дозировки композиции DC/Apo-Nec по изобретению: группа 1: 5×106, группа 2: 10×106, группа 3: 15×106 и группа 4: 20×106. Композиция DC/Apo-Nec по изобретению хорошо переносилась, и слабые выявленные случаи токсичности всегда имели степень 1. В областях применения были выявлены слабые местные реакции и DTH, состоящие из эритемы и папул. Ни у одного из пациентов не развивались проявления аутоиммунного заболевания (таблица 3).
Таблица 3 | ||||
Токсичность, ассоциированная с применением композиции DC/Apo-Nec по изобретению | ||||
Симптомы | Композиция 5×106 |
Композиция 10×106 | Композиция 15×106 | Композиция 20×106 |
Усталость | 1/4 | 1/3 | 0/4 | 0/4 |
Головная боль | 1/4 | 0/3 | 0/4 | 0/4 |
Озноб | 1/4 | 0/3 | 0/4 | 0/4 |
Колики в животе | 0/4 | 0/3 | 0/4 | 1/4 |
Локальная реакция | 4/4 | 3/3 | 4/4 | 4/4 |
Астения | 0/4 | 1/3 | 0/4 | 0/4 |
Тошнота | 0/4 | 0/3 | 0/4 | 1/4 |
Боль в животе | 0/4 | 0/3 | 0/4 | 1/4 |
Рвота | 0/4 | 0/3 | 0/4 | 1/4 |
Анорексия | 0/4 | 1/3 | 0/4 | 0/4 |
Диарея | 0/4 | 0/3 | 0/4 | 1/4 |
Миалгия | 1/4 | 0/3 | 1/4 | 0/4 |
После наблюдения в среднем в течение 41,5 месяцев после хирургической операции (между 25 и 71 месяцами), у пациентов стадии IIC не было выявлено признаков заболевания (NED); 7/8 (87,5%) стадии III пациенты были NED, и у 7/7 пациентов стадии IV было показано прогрессирование заболевания (см. фиг.2).
Реакции DTH оценивали для каждого применения гетерологичных клеток Apo-Nec по изобретению и оценивали интенсивность реакции с помощью показателя DTH, как описано в примерах. Только у 6/15 пациентов была выявлена небольшая реакция DTH перед применением против клеток Apo-Nec по изобретению. В анализах DTH было показано, что применение клеток Apo-Nec индуцирует специфическую реактивность у всех пациентов, поскольку показатель DTH был значимо выше после применения второй дозы композиции DC/Apo-Nec, по сравнению с основными реакциями, наблюдаемыми после первого применения (критерий Манна-Уитни P=0,029, n=15). Показатели DTH были более высокими у пациентов NED, чем у пациентов с прогрессированием заболевания (P=0,28, критерий суммы рангов Манна-Вилкоксона).
Увеличение количества клеток DC/Apo-Nec на применение не приводило к значимому увеличению показателя DTH.
До и после применения не наблюдали гуморального ответа против живых клеток меланомы, содержащихся в композиции по изобретению, оцениваемого анализом FACS. Также оценивали наличие реактивных антител против клеток Apo-Nec в сыворотке до и после применения способом вестерн-блоттинга. У четырех пациентов (#3, #4, # и #16) наблюдали и выявили только слабую полосу белка меланомы (>200 кДа) в сыворотке после применения, и она не была обнаружена в клеточных экстрактах рака молочной железы, используемых в качестве неспецифического контроля.
Аутологичная клеточная линия меланомы была получена для пациента #1, и, таким образом, можно оценить вероятность применения у такого пациента клеток DC/Apo-Nec, индуцирующих пролиферативный ответ лимфоцитов против его собственных клеток. Пролиферацию лимфоцитов оценивали после инкубации лимфоцитов в течение 5 суток до и после применения клеток Apo-Nec#1 (облученных опухолевых клеток от пациента #1, полученных как описано в разделе "Примеры"). На фиг.3 показано, что после применения пролиферация лимфоцитов в ответ на клетки DC/Apo-Nec#1 была более высокой по сравнению с предварительным применением лимфоцитов, что позволяет предположить, что после применения клеток DC/Apo-Nec происходит специфическая иммунизация против опухолевых антигенов, представленных клетками Apo-Nec, которые также присутствуют в опухоли пациента #1.
Семь из 15 пациентов, включенных в исследование, имели гаплотип HLA-A*0201 класса I, и это позволило исследовать ограниченный HLA опухолеспецифический ответ в образцах их собственных PBMC. Ответ против gp100, и специфические CD8+ T-клетки Melan A/MART-1, индуцированные композицией CD/Apo-Nec, оценивали посредством специфического связывания тетрамеров HLA/пептидов и секреции IFN-γ, измеряемой посредством ELISpot непосредственно в образцах периферической крови.
У 5/7 пациентов было получено достаточное количество PBMC до применения (за 7 суток до первого применения) и после применения (через 15 суток после четвертого применения) для анализа присутствия специфических CD8+ T-лимфоцитов, реактивных к gp100, и Melan A/MART-1 посредством окрашивания тетрамерами. Результаты представлены на фиг.4A. У пациентов #2 и #6 значительно повышалась частота специфических к gp100 и Melan A/MART-1 CD8+ T-клеток после применения до уровня более 1%, и они все еще оставались NED (53 и 36 месяцев соответственно, после хирургической операции), а у пациентов #5, #8 и #16 было снижено окрашивание тетрамером перед применением, и у всех из них после применения заболевание прогрессировало (фиг.3A). На фиг.4 B приведен пример с результатами пациента #2. Процентное количество CD8+ T-клеток, распознающих gp100 или пептид Melan A/Mart-1, возрастало после применения от 0,17 и 0,26 до 1,15, и 1,16 соответственно. В проводимом эксперименте не наблюдали реактивности в тех же условиях у здоровых положительных по HLA-A*0201 доноров.
Высвобождение IFN-γ анализировали в ELISpot тотальных PBMC до и после применения после инкубации в течение 24 ч с аутологичными DC-клетками, стимулированными gp100 или Melan A/MART-1, и с использованием пептидов вируса гриппа в качестве контроля (flu58-66). В этом анализе оценку проводили у 5/7 пациентов с HLA-A*0201. Было выявлено, что у двух пациентов (#5 и #16) индуцировался IFN-γ после применения композиции DC/Apo-Nec по изобретению, секретируемый CD8+ T-клетками, специфичными к gp100 и Melan a/MART-1. У пациентов #5 и #16 индуцировались CD8+ T-клетки, секретирующие IFN-γ, с частотами 7-3,5×10-4. У пациента #2 было выявлено большое количество CD8+ T-клеток, специфичных к gp100 и Melan A/MART-1 до и после применения. У этого пациента все еще не было заболевания через 54 месяца после хирургической операции. У пациентов #8 и #15 было показано низкое количество в исходный момент (до применения), и не было выявлено изменений после четырех применений композиции DC/Apo-Nec по изобретению.
Баланс между IL-12 и IL-10 в клетках DC/Apo-Nec по изобретению количественно определяли посредством FACS в различные моменты времени после фагоцитоза, и после обработки в течение 8 часов брефелдином A для внутрицитоплазматического накопления цитокинов. Как представлено на фиг.5, только 6,1% DCin продуцируют IL-12, но через 32 ч. Из со-культуры в 30,8% клеток DC/Apo-Nec была индуцирована продукция IL-12. С другой стороны, 81,6% DCin содержали цитокины в цитоплазме, и они не были модифицированы после фагоцитоза. Двойные положительные клетки, продуцирующие IL-10 и IL-12, составляли 27,8% через 24 часа (см. фиг.5).
Композиция DC/Apo-Nec по изобретению была безопасной и хорошо переносилась пациентами.
Композиция DC/Apo-Nec по изобретению индуцировала клеточные ответы у пациентов, поскольку реакция DTH при использовании клеток Apo-Nec в качестве иммуногенов возрастала у всех пациентов после второго применения, по сравнению с исходными значениями.
85% пациентов (стадия IIc и III), которым вводили композицию DC/Apo-Nec по изобретению, не имели заболевания после наблюдения в среднем в течение 41,5 месяцев, когда им проводили введение после хирургической операции (см. фиг.2). Композиция DC/Apo-Nec по изобретению сама по себе пригодна для лечения пациентов с меланомой и также пригодна в качестве адъюванта после радикальных способов лечения, поскольку она стимулирует иммунный ответ у пациента, где иммунная система устраняет все оставшиеся опухолевые клетки, защищая пациента от возможных рецидивов. Более конкретно, композиция DC/Apo-Nec по изобретению пригодна для лечения пациентов на стадиях IIB, IIC и III, которые обладают меньшей опухолевой массой, и она пригодна в качестве адъюванта после радикальных способов терапии для пациентов на стадии IV.
Специалисту в данной области очевидно, что композицию DC/Apo-Nec по изобретению можно применять для лечения меланомы человека; также ее можно применять в качестве адъюванта вместе с другими способами лечения и в качестве стимулятора иммунной системы, например, в зависимости от стадии у пациента и стадии лечения.
Важной является необходимость указать, что сочетание клеток Apo-Nec по изобретению индуцирует созревание аутологичных DC-клеток. Смесь или сочетание клеток Apo-Nec по изобретению является хорошим источником антигенов меланомы для нагрузки дендритных клеток. Следует отметить, что дендритные клетки созревают только при контакте и фагоцитозе сочетания клеток Apo-Nec по изобретению, без добавления дополнительных стимулов, например таких, как интерлейкин-1, фактор некроза опухоли-α, лиганд CD40 или простагландин E, которые обычно используют в качестве обеспечивающего созревание коктейля. DC, фагоцитирующие клетки Apo-Nec по изобретению, повышают миграцию in vitro в ответ на хемокин MIP-3β и внутриклеточную продукцию IL-12. Клетки DC/Apo-Nec по изобретению способны представлять перекрестные нативные опухолевые антигены специфическим к антигенам CTL.
Как указано выше, фагоцитоз клеток Apo-Nec посредством DCin у каждого пациента индуцировал созревание таких DC.
С другой стороны, клеточные линии по изобретению анализировали в отношении их клоногенной способности. Колонии клеточной линии MEL-XY3 по изобретению в мягком агаре присутствуют, обладая гетерогенной морфологией с низкой адгезией между клетками. Наблюдают низкую долю меланотических колоний. Колонии клеточной линии MEL-XY1 по изобретению в мягком агаре присутствуют в виде компактной морфологии с высокой адгезией между содержащимися в них клетками. Меланотические колонии наблюдают редко.
В качестве способа охарактеризации колоний сравнивали уровни экспрессии антигенов меланомы, нормализованные к экспрессии β-актина, в клеточных линиях по изобретению и в колониях таких клеточных линий в мягком агаре. Результаты охарактеризации клонов представлены в таблице 4 и на фиг.6.
Таблица 4 | ||||
Сравнительное исследование экспрессии антигена между клеточными линиями по изобретению и клоногенными линиями по изобретению | ||||
Клеточные линии | ||||
Антигены дифференцировки меланомы | линия MEL-XY3 | колонии MEL-XY3 | линия MEL-XY1 | колонии MEL-XY1 |
MARTI | + + + | + | + | + |
MAGEl | + | ND | + | ND |
NYESO-1 | ++++ | + | + | + |
GP100 | + | ++ | + | + |
TYR | + | ND | + | ND |
TRP2 | +* | +* | +* | +* |
B-АКТИН | + | + | + | + |
ND: нет данных *данные еще не нормализованы |
Как можно видеть, в популяции и в каждой клеточной линии по изобретению существует субпопуляция клоногенных клеток, и эти клоногенные клетки также включены в объем настоящего изобретения. Наличие клоногенных клеток может обеспечить у пациента типические антигены недифференцированных клеток, также называемых стволовыми клетками.
Гетерогенность меланомных опухолей является высокой, таким образом, для иммунной терапии является основополагающим применение комплексных смесей антигенов, обеспечиваемых смесью или сочетанием клеточных линий и их субпопуляций. В качестве примера на фиг.7 представлен биоптат первичной меланомы, свидетельствующий о гетерогенности таких опухолей при сравнении экспрессии меланоцитических антигенов дифференцировки.
Когда пациентом вводят композицию Apo-Nec по изобретению вместе с БЦЖ в качестве адъюванта и GM-CSF в качестве иммуномодулятора согласно схеме, описанной ниже в разделе "Примеры", было выявлено, что у 75% пациентов (стадии IIC и III) отсутствовало заболевание при наблюдении максимально в течение 51 месяцев (см. фиг.8), и токсичность был низкой и имела только степень 1.
Представлены иллюстративные результаты от одного пациента с выбранным протоколом. Пациентом #200 является женщина европеоидной расы в возрасте 67 лет, пришедшая в ноябре 2003 года. В июне 2002 года, у нее была проведена хирургическая операция на увеличенном невусе на спине. Гистология выявила меланому кожи, уровня Clark IV, уровня Breslow 5,7 мм. В августе 2002 года, были выявлены некоторые разрастания, которые были удалены. Пациенту вводили Apo-Nec + БЦЖ + GM-CSF, с количеством GM-CSF 600 мкг (на композицию) и лечение закончили с небольшой токсичностью. При последнем клиническом обследовании на спине был выявлен ожидаемый узелок, который был удален, и его микроскопическое изображение представлено на фиг.9. Наблюдали интенсивную лимфоидную инфильтрацию с остающимися жизнеспособными областями опухоли, но также с интенсивным некрозом ткани опухоли и присутствием макрофагов, нагруженных меланином.
В качестве примера также представлены результаты пациента, которому вводили композицию Apo-Nec по изобретению + БЦЖ + IFN-α. Пациентом #300 является мужчина в возрасте 17 лет, который пришел с левой паховой аденопатией. Через два месяца проводили другое вырезание в левой паховой области, где было получено 4/11 узелков с метастазами меланомы. Ему проводили лечение интерлейкином-2 в низких дозах.
Через 14 месяцев после второго удаления был выявлен рецидив в левой паховой связке, и снова провели хирургическую операцию, где было выделено 5/7 узелков с метастазами меланомы. Пациент испытывал боль в спине. Компьютерная аксиальная томография выявила ретроперитонеальную аденопатию, и была проведена химиотерапия по схеме Дартмута. После окончания химиотерапии его начали лечить композицией Apo-Nec по изобретению + БЦЖ. Через 14 месяцев после начала лечения композицией по изобретению был выявлен узелок в левой паховой области. Ему провели хирургическую операцию, и были выявлены метастазы меланомы с выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией. Пациента продолжали лечить композицией Apo-Nec+IFN-α. На фиг.10 показана ремиссия узла в левом легком. В настоящее время пациента является здоровым.
Настоящее изобретение относится к клеточным линиям меланомы, которые в сочетании экспрессируют большинство ассоциированных с меланомой антигенов, к композициям, содержащим такие облученные линии, и к композициям, содержащим аутологичные DC, полученные ex vivo, которые фагоцитируют смесь апоптотических/некротических клеток меланомных клеточных линий.
Это изобретение лучше проиллюстрировано с помощью представленных ниже примеров, которые не следует понимать как ограничение его объема. Напротив, должно быть хорошо понятно, что могут быть упомянуты другие варианты осуществления, модификации и эквиваленты, которые после прочтения настоящего описания могут быть предложены специалистом в данной области без отклонения от сущности настоящего изобретения и/или объема прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1
Получение, установление и поддержание клеточных линий по изобретению
Mel-XY1: Линия Mel-XY1 была получена от пациента-мужчины европеоидной расы, из метастаза в легком, вторичного по отношению к первичной меланоме на спине. Пациент погиб через два года вследствие метастазов в головной мозг.
Mel-XY2: Возраст пациента, от которого получена линия, составлял 44 года, и он являлся мужчиной европеоидной расы, имеющим изъязвленную меланому на спине (уровень Clark III). Через два года у него одновременно развились подмышечная аденопатия и метастазы в легком. Подмышечная аденопатия была удалена, диссоциирована, и эти клетки дали начало клеточной линии.
Mel-XY3: пациент являлся мужчиной европеоидной расы в возрасте 43 лет, у которого развилась первичная меланома плеча. Через два года появился метастаз в подмышечном лимфатическом узле. Пациенту проводили химиотерапию посредством DTIC без видимого клинического ответа. Подмышечные метастазы удалили, и клетки дали начало клеточной линии Mel-XY3.
Mel-XX4: она была получена при хирургической операции по поводу паховой аденопатии у белой женщины в возрасте 33 лет, где эта аденопатия была диагностирована как метастаз меланомы. Первичная опухоль была неизвестна. Через пятнадцать месяцев пациент имел рецидив в паховом лимфатическом узле. Объемный меланотический узел был удален, нарезан на небольшие фрагменты, жировая и соединительная ткани были удалены, и фрагменты были суспендированы в модифицированной способом Игла среде Дульбекко (DMEM), механически разделены под давлением на нейлоновом сите, и клеточные агрегаты ферментативно обрабатывали в течение ночи при 37°C.
Клетки ресуспендировали в культуральной среде для меланомы, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) (Natocor, Cordoba, Argentina), высевали в 25-см2 культуральные флаконы и инкубировали при 37°C при увлажнении и в атмосфере 5% CO2-95% в воздухе. Через 24 часа культуральную среду удаляли для устранения неприкрепившихся клеток.
Суспензию клеток пропускали четыре раза через колонки с антифибробластными микросферами (Miltenyi Biotec, Germany). Полученные клетки назвали Mel-XX4.
Поддержание четырех клеточных линий по изобретению (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и Mel-XX4) проводили посредством культивирования в смеси среда для меланомы DMEM:питательная смесь F12 (1:1), дополненной 2 мМ глутамином, 20 нМ селенитом натрия, 100 мкМ аскорбиновой кислотой, 0,3 мг/мл галактозы, 0,15 мг/мл пирувата натрия и 5 мкг/мл инсулина), 100 МЕ/мл пенициллина, 10 мкг/мл стрептомицина, помимо 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Natocor, Cordoba, Argentina) в лаборатории GMP Centro de Investigaciones Oncologicas-FUCA.
Клоны CTL (ограниченные по HLA A*0201), специфичные к антигенам Melan A/MART-1 (M27: AAGIGILTV) и gp100 (G154: KTWGQYWQV) размножали в среде RPMI с 10% сывороткой человека с инактивированными АВ и антибиотиками, в течение 14-суточных циклов с использованием 30 нг/мл антитела против CD3 (OKT-3, BD Biosciences), и серии 300 МЕ/мл IL-2 (Chiron BV, Amsterdam, Netherlands) каждые 3 суток.
Пример 2
Охарактеризация клеточной линии:
Кинетика роста in vitro:
104 клеток культивировали в лунках 24-луночных планшетов (Corning). Каждые 2-3 суток клетки обрабатывали ЭДТА (0,02%), собирали и посчитывали. Время удвоения популяции оценивали из наклона кривой роста в ходе экспоненциальной фазы.
Клоногенность
Независимый от прикрепления рост клеток определяли способом на мягком агаре (Hamburger, and Slamon, Science 197: 461, 1977). 3-10×103 клеток культивировали в верхнем слое. Планшеты инкубировали в течение 21 суток, а затем подпитывали каждые сутки 50 мкл культуральной среды. Колонии из более чем 36 клеток подсчитывали под микроскопом.
Охарактеризация антигенов меланомы посредством иммуноцитохимии (ICC) и FACS
Для оценки ICC экспоненциально растущие клетки обрабатывали ЭДТА, центрифугировали, фиксировали формальдегидом, погружали в парафин и нарезали на тонкие срезы. В качестве контроля использовали нормальные образцы тканей пациента.
Ткани и клетки анализировали с помощью моноклональных антител (Mabs) против кератинов, виментина и gp100/HMB 45 (Biogenex), MARTl/Melan-A (Dako), и с помощью поликлональных антител против S100 (Biogenex).
Реакции визуализировали с помощью комплексов авидин-биотин (Vectastain ABC). Эндогенные пероксиды блокировали с помощью 0,6% H2O2.
Реакции непрямой иммунофлуоресценции проводили ресуспендированием обработанных ЭДТА клеток. После блокирования нормальной сывороткой козы, разбавленной до 10%, клетки инкубировали с первичными антителами, промывали, инкубировали со вторичными антителами (антитело против иммуноглобулинов козы с FITC (Dako), промывали, фиксировали в 1% параформальдегиде, и анализировали посредством FACS (FACS Vantage SE, Becton-Dickinson, USA). Первичные антитела представляли собой Mab против p53 мыши (DO-7, BD Pharmingen), антитело против GD2 3F8, антитело против GD3 R24. В случае p53, в клетках повышали проницаемость. Антигены лейкоцитов человека (HLA) класса I и класса II типировали посредством PCR-SSP.
Определение ассоциированного с меланомой антигена посредством RT-PCR:
Тотальную РНК экстрагировали с помощью Trizol (Invitrogen). Для инициации синтеза кДНК, к 1-3 мкг РНК добавляли соответствующие праймеры и инкубировали с 200 Е фермента MMLV-RT (Promega), 25-40 E RNAsin (Promega) и 250-500 мкМ dNTP (Invitrogen) в течение 5 мин при 70°С, а затем в течение 60 мин при 42°С. Аликвоты кДНК (2-10 мкл) амплифицировали с помощью ДНК-полимеразы Taq (Invitrogen), с использованием специфических пар праймеров.
Специфические праймеры представлены ниже:
Тирозинкиназа
β-актин
Антисмысловые праймеры представлены в нижней строке. Для детекции тирозина также амплифицировали аликвоту 1/100 от первой реакции PCR со внутренними праймерами (гнездовая PCR).
Продукты PCR анализировали в агарозных гелях и окрашивали бромидом этидия; размер фрагментов вычисляли посредством сравнения с размером, наблюдаемым для маркеров ДНК PM размером 100 п.о. (Promega).
Цитогенетический и цитомолекулярный анализ:
Клетки, соответствующие четырем линиям по изобретению, инкубировали для цитогенетического анализа при экспоненциальном росте в колхицине (0,1 мкг/мл) при 37°С в течение 8-16 ч, собирали с помощью раствора трипсин-ЭДТА и обрабатывали в соответствии со стандартными протоколами. Использовали способ G-полос. Идентификацию хромосом проводили согласно International System for Human Cytogenic Nomenclature (Mitelman, 1995 ISCN.: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, (ed. S Karger, Basel).
Пример 3
Получение дендритных клеток (DC) из моноцитов, их охарактеризация и нагрузка клетками Apo-Nec
Дендритные клетки получали из лейкоцитной пленки или продуктов лейкофереза от здоровых доноров. Периферические мононуклеарные клетки (PBMC) очищали с помощью градиента плотности Fycoll-Hypaque. PBMC суспендировали в свежей бессывороточной среде AIM-VTM (Invitrogen) и оставляли прикрепляться в культуральных флаконах (TPP, Germany). Через 2 ч при 37°C неприкрепившиеся клетки удаляли, и прикрепленные моноциты культивировали в течение 5 суток в AIM-V, дополненной 800 Е/мл rhuGM-CSF и 50 нг/мл IL-4 (Peprotech, Mexico), получая, таким образом, CDin. Изменения фенотипа анализировали под световым микроскопом и с помощью FACS. Для индукции контролируемого созревания DCin добавляли 2 мкг/мл LPS (липополисахариды J5 E. coli, Sigma, St. Louis, CA), и в конце клетки культивировали в течение 48 ч.
Охарактеризацию фенотипа DC-клеток проводили, когда клетки находились в незрелом состоянии (DCin), и после анализа фагоцитоза апоптотических/некротических клеток (клеток Apo-Nec) посредством окрашивания 5×105 клеток антителами, меченными флуорохромами, против антигенов CD14, CD11c, CD1a, HLA класса II, CD80, CD86, CD83, CD40, HLA класса I, и CCR7 (BD Biosciences, San Jose, CA) с помощью анализа FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Соответствующие изотипические контроли представляли собой IgG2a крысы с PE, и IgG1 и IgG2a мыши (BD Biosciences, San Jose, CA). Также анализировали экспрессию CD83 в DC, фагоцитирующих клетки Apo/Nec с использованием немеченого моноклонального антитела против CD83 (IgG1), и соответствующего изотипического антитела в качестве контроля; для проявления использовали антитело против IgG1 мыши-PerCP (BD Biosciences, San Jose, CA).
Способность DC к эндоцитозу оценивали посредством инкубации 1 x 106 DC с 1 мг/мл декстрана, конъюгированного с FITC (Dx-FITC) (Sigma, St Louis, CA) в течение 30 мин при 37°С. После инкубации клетки промывали посредством PBS и анализировали с помощью FACS. Контроли включали DC, инкубированные с Dx-FITC в течение 30 мин при 4°С для ингибирования процесса эндоцитоза; с другой стороны, в анализе базовым считали включение в 0 момент времени. Включение DX-FITC (эндоцитоз) количественно определяли посредством FACS.
Оценка фагоцитоза DC-клеток:
Клетки DCin со-культивировали с клетками Apo-Nec (полученными, как показано выше) в свежей среде AIM-V в различные моменты времени. В некоторых способах анализа DC окрашивали красным цветом с помощью PKH26, и клетки Apo-Nec окрашивали зеленым цветом с помощью PKH67 (Sigma, St. Louis, CA). Анализ посредством FACS проводили после со-культивирования, и процентное количество DC, фагоцитирующих клетки Apo-Nec, определяли как процентное количество двойных положительных клеток. Для каждого цвета получали соответствующие контроли. Контроль неспецифического связывания клеток Apo-Nec с DC проводили посредством инкубации клеток при 4°С в течение тех же периодов времени.
Миграция DC in vitro:
Миграцию DC in vitro анализировали до и после со-культивирования с клетками Apo-Nec с использованием 48-луночной камеры для хемотаксиса (AP 48 Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD). 10 нг/мл MIP-1α или MIP-3β (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), разбавленного в RPMI, помещали в нижний отдел. Базовую миграцию анализировали помещением в нижнюю камеру RPMI. DC высевали в верхнюю камеру (3×104 CD/лунка) в RPMI. Между верхней и нижней камерой помещали поликарбонатную мембрану с размером пор 5 мкм (Neuroprobe, Inc., Bethesda, MD). Через 90 мин при 37°С, клетки с верхней стороны мембраны удаляли, и мигрировавшие клетки, прикрепленные к нижней стороне мембраны, окрашивали 10% красителем Гимза, разбавленным в нейтральной воде. Мембраны сушили на воздухе, помещали на предметное стекло с помощью канадского бальзама, и с использованием микроскопа количественно определяли длины миграции. Анализировали пять полей на лунку с 40X увеличением, и анализировали по 3 лунки/условие. Статистический анализ проводили с помощью критерия Стьюдента.
Электронная микроскопия:
Процесс фагоцитоза также исследовали с помощью электронной микроскопии. Образцы со-культуры фиксировали с помощью 2,5% глутаральдегида в 0,1 M фосфатном буфере, и после фиксации проводили окрашивание 1% тетроксидом осмия, их промывали два раза дистиллированной водой, и подвергали контрастному окрашиванию 5% ацетатом уранила в течение 2 ч. После промывания и дегидратации, образцы погружали в смолу (Durkupan). Получали ультратонкие срезы (70-90 нм), помещали на медные сита и подвергали контрастному окрашиванию с помощью цитрата свинца Рейнольда. Сита анализировали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Zeiss 109. Альтернативно, для получения изображений полных ячеек получали тонкие срезы (0,5 мкм) на ультрамикротоме (Reichert-Jung), окрашивали 0,4% толуидином синим, 0,1M карбонатным буфером, помещали на Durkupan, и анализировали с помощью светового микроскопа (1000x). Изображения получали с помощью цифровой камеры Sony Cybershot Digital (5 Мегапикселей), и обрабатывали с помощью программы Adobe photoshop 6.0.
Анализ перекрестного представления in vitro, секреция IFN-γ:
Очищали 98% CD14+ моноцитов от доноров с HLA A*0201 с использованием микросфер против CD14 (Miltenyi Biotec, Germany), и дифференцировали в клетки DCin посредством культивирования в течение 5 суток, как описано выше. Клетки DCin инкубировали с клетками Apo-Nec в течение 6, 12, 24 и 48 ч, и повергали воздействию специфичных к MelanA/MART-1, или gp100 клонов CTL в 1 мл среды AIMV в течение ночи. Секрецию IFN-γ в супернатант определяли в трех параллельных анализах способом ELISA (OptEIA IFN-γ, Pharmingen BD Biosciences, San Diego, CA) в соответствии с инструкциями поставщика. Для каждого эксперимента получали калибровочную кривую, и концентрацию в образце вычисляли с использованием дважды логарифмического регрессионого анализа, и с использованием программного обеспечения Cembal 2.2. Контроли включали: DC плюс 20 мкг/мл пептидов MART-1 или gp100, жизнеспособные клеточные линии меланомы с HLA A*0201+, экспрессирующие антигены MART-1 и gp100 (положительные контроли) или клетки DC, культивированные с неспецифическими пептидами, и жизнеспособные клеточные линии меланомы с HLA A*0201+, не экспрессирующие соответствующие антигены (отрицательные контроли).
Определение внутрицитоплазматических цитокинов IL-10 и IL-I2:
DC, меченные PKH26 (красный) со-культивировали с клетками Apo-Nec, меченными PKH67, в различные моменты времени (6, 12, 24 и 48 ч). Измерение накопленных цитокинов проводили способом внутриклеточной иммунофлуоресценции после блокирования их продукции брефелдином A (8 ч) после культивирования (Golgi Plug, BD Biosciences, San Jose CA). Повышали проницаемость клеток с помощью 0,05% сапонина, и окрашивали с помощью антитела против IL10 (изотип IgG2a крысы)-APC, и антитела против субъединицы p40-p70 IL12 (изотип IgG1 мыши)-PerCp (BD Biosciences, San Jose, CA). Популяцию с двойной окраской PKH26/PKH67 отбирали для исследований посредством FACS, и цитокины оценивали в такой популяции в эксперименте с помощью четырех цветов. Со-культуру при 4°С использовали в качестве контроля.
Пример 4
Получение композиций по изобретению и схемы применения:
Композиция Apo-Nec:
Облучение клеточных линий:
Четыре клеточных линии по изобретению (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и Mel-XX4) облучали гамма-излучением при 70 Грэй (Siemens, Instituto Alexander Fleming, Buenos Aires, Argentina), а затем клетки замораживали (50% DMEM, 40% альбумин человека и 10% DMSO) в жидком азоте до применения.
В день применения клеток их размораживали, промывали и изготавливали в виде доз композиции с 5 - 10×106 клеток каждой выделенной клеточной линии по изобретению или их сочетания, ресуспендируя их в среде DMEM.
300 мкл инъецировали внутрикожно.
Композиция DC/Apo-Nec:
Получение апоптотических/некротических опухолевых клеток:
Облученные и замороженные клетки (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 и Mel-XX4), как описано выше, размораживали и высевали в среде для меланомы плюс 10% эмбриональная телячья сыворотка до завершения апоптотического процесса. После культивирования в течение 72 ч клетки открепляли со дна флаконов, промывали, подсчитывали и ресуспендировали в свежей бессывороточной среде AIMVTM (therapeutic grade, GIBCO, Invitrogen Corporation, Grand Island, N.Y). Апоптоз и некроз анализировали способом связывания аннексина-V FITC и включения иодида пропидия (IP) (набор для детекции апоптоза с помощью аннексина-V, BD Biosciences, San Jose, CA), и анализировали посредством FACS. Клоногенные анализы в мягком агаре проводили в шести экземплярах (1,5×104 клеток/лунка) для анализа способности к пролиферации в облученных клетках по сравнению с необлученными контрольными клетками.
5, 10, 15 и 20×106 DC, в соответствии с каждой дозой для пациентов, со-культивировали с клетками Apo-Nec в среде AIMV в течение 48 ч при 37°С. В день применения со-культивированные клетки центрифугировали со скоростью 1200 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали в среде DMEM (300 мкл) и инъецировали внутрикожно в одну из четырех конечностей с интактным дренажем лимфатических узлов.
Контроль качества и анализы стерильности проводили для всех препаратов композиции.
Пример 5
Схема исследования у пациентов и критерии селекции
Исследования у пациентов проводили для оценки токсичности, выживаемости и иммунного ответа на лечение. Исследования были одобрены Institutional Revision Council of Instituto Alexander Fleming и этической комиссией. Критериями выживаемости были (a) кожная меланома, подтвержденная гистологией, на стадиях IIB, IIC, III или IV (AJCC); (b) пациенты с минимальным или не поддающимся детекции заболеванием (ND) после хирургической операции, обследованные с помощью компьютерной аксиальной томографии, и показателями фермента лактатдегидрогеназы (LDH). В исследование могли быть включены пациенты с неизвестной первичной меланомой; (c) возраст между 15 и 60 лет; (d) ожидаемая продолжительность жизни >6 месяцев; (e) результат (ECOG) 0 или 1; (f) пациенты стадии III, которых ранее лечили IFN-α, у которых лечение было закончено или прекращено вследствие прогрессирования заболевания, токсичности или любой другой клинической причины, или пациенты, у которых не начинали лечение IFN-α за шесть месяцев до хирургической операции; (g) надлежащий венозный доступ для процедуры лейкофереза, (h) лабораторные критерии включения представляли собой: гемоглобин > 10 г%; количество лейкоцитов >4800/мм3, тромбоциты > 150000/мм3; общий и прямой билирубин, щавелевоуксусные трансаминазы, глутамин-пируватные трансаминазы <1,5 раз выше наибольшего значения нормы; LDH <450 мЕ/мл; i) отсутствие беременности, с β-HCG в сыворотке, определенным за одну неделю до каждого применения у женщин в доменопаузальном периоде; (i) креатинин < 1,4 мг%; (k) отсутствие химиотерапевтической, лучевой терапии или биологической терапии в течение предшествующего месяца; (k) отсутствие лечения кортикостероидами или нестероидными противовоспалительными средствами (AINE); (l) отсутствие активных метастазов в головном мозге; (m) нормальная ЭКГ; (n) все пациенты должны были подписать информированное согласие.
Оценка пациентов и схема лечения:
Базовую оценку пациента проводили за 35 суток до первого применения. Клиническая оценка включала полный клинический анамнез, физикальный осмотр, электрокардиограмму (ECG), компьютерную аксиальную томографию (грудь, живот, таз и головной мозг), определение стадии опухоли, размера опухоли и документирование областей заболевания, химический анализ крови и гематологический анализ. Отобранных пациентов подвергали лейкоферезу для получения PBMC, в целях получить DC.
Пациентам проводили 4 введения DC/Apo-Nec с интервалами в 2 недели. Инокуляцию проводили внутрикожно (300 мкл), и при каждой дозе проводили тест DTH, состоящий в инокуляции в верхнее плечо между 5 и 20×106 клеток DC/Apo-Nec без адъюванта. Показатели жизнедеятельности и кожные реакции DTH анализировали через 2, 24 и 48 ч после применения. Состояние пациента исследовали на 70 сутки посредством брюшной ультразвуковой эхографии и рентгена грудной полости и протокол завершали на 75 сутки клиническим обследованием.
Для применения клеток Apo/Nec по изобретению пациентам проводили внутрикожную инъекцию (id) в одну конечность с интактными лимфатическими узлами. Двадцати (20) пациентам вводили дозу rhGM-CSF 400 мкг (100 мкг в сутки, четверо суток). В день применения, 0,1 мл hGM-CSF смешивали с Apo-Nec (16×106 облученных клеток в 0,3 мл) и БЦЖ (1×106 колониеобразующих единиц) в 0,05 мл. В ходе следующих 3 суток, 0,1 мл rhGM-CSF инъецировали внутрикожно в область применения. Каждому пациенту проводили 4 введения, разделенных 3 неделями, а затем 1 введение композиции каждые два месяца в течение года, 1 введение композиции каждые три месяца на второй год, а затем продолжали 1 введением композиции каждые 6 месяцев.
Статистический анализ:
Все неблагоприятные результаты классифицировали согласно общим критериям токсичности National Cancer Institute (NCI).
Оцениваемую группу определили как все пациенты, которым проведено четыре введения. Поскольку большинство данных от пациентов не подчинялись нормальному распределению, общие данные анализировали с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона. Значения DTH для различных групп, в которых вводили различные количества DCs/Apo-Nec, сравнивали между каждой группой с одной переменной с помощью ANOVA и критерия множественных сравнений Даннета. Значимым считали значение P<0,05.
Способы оценки иммунного ответа подвергнутых лечению пациентов:
Для оценки иммунного ответа пациента получали сыворотку за 7 суток до введения (предварительная сыворотка), и на 15 сутки после окончания введения (конечная сыворотка), и образцы хранили при -80°С. Клетки PBMC очищали с помощью градиента Ficoll-Hypaque и последующего центрифугирования после лейкофереза (до применения), или из 100 мл крови, полученной через 15 суток после последней дозы (после применения), PBMC замораживали в 50% DMEM, 40% альбумине человека и 10% DMSO до применения в иммунологических анализах. Типирование HLA-A*0201 проводили после инкубации образцов пациента с моноклональными антителами против HLA*A0201 мыши, конъюгированными с FITC (BD-Pharmingen, San Jose, CA).
Реакция DTH:
В каждый день введения проводили тестирование DTH на предплечье с помощью 2×106 клеток Apo-Nec, и реакцию оценивали через 2, 24 и 48 ч после применения. Были приняты следующие показатели интенсивности DTH: 0: эритема <0,5 см; 1: розеола 0,5-1,0 см; (2) розеола 1,0-2,0 см; 3: розеола >2,0 см, или папулезная эритема <1,5 см; 4: папулезная эритема >1,5 см. Конечный DTH соответствует сумме всех отдельных интенсивностей DTH/4.
Анализ пролиферации:
PBMC до и после применения композиции получали с помощью градиента плотности Ficoll-Hypaque, и хранили замороженными в жидком азоте до применения. Клетки размораживали для анализа и инкубировали в среде AIM-V (Gibco, Grand Island, NY) в течение 1 ч при 37°С. 5×105 клеток высевали в 96-луночные планшеты в присутствии или отсутствии фитогемагглютинина (PHA) (5 мкг/мл) (Gibco, Grand Island, NY) и инкубировали при 37°С в течение 72 ч. В течение последних 16 ч клетки обрабатывали (3H)dThd (Amersham, 1 мкКи/лунка), и после лизиса клеток с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика измеряли включенную в ДНК радиоактивность (Cell Harvester, Nunc, Rochester, NY).
Определение цитокинов:
Концентрации IL-10 и IL-12 в сыворотке пациентов определяли до применения (сыворотка перед применением) и через две недели после четвертого применения (сыворотка после применения). Сыворотку замораживали при -80°С до проведения анализа ELISA (OptEIA IL-10 и IL-12, BD Biosciences, San Diego, CA). Для каждого анализа получали калибровочную кривую, и концентрацию в образце вычисляли посредством дважды логарифмического регрессионного анализа с использованием программного обеспечения Cembal 2.2.
Измерение IFN-γ способом ELISpot:
Клетки CD14+ очищали в качестве стимуляторов из PBMC положительных по HLA-A2 пациентов с использованием микросфер, покрытых антителами против CD14 (Miltenyi Biotec, Paris, France), культивировали в течение 5 суток в синтетической среде SYN-H (AbCys, Paris, France) с 100 нг/мл GM-CSF, и 20 нг/мл IL-4, и подвергали созреванию с помощью 10 мкг/мл LPS в течение дополнительных 48 ч. Зрелые DC обрабатывали в течение 1 ч при 37°C 10 мкг/мл соответствующего пептида, разбавленного в среде SYH-H, промывали и смешивали с PBMC до достижения соотношения E/T пациентов, равного 10:1, с использованием всего 105 CD8+ лимфоцитов/лунка.
96-луночные планшеты покрывали нитроцеллюлозой (MAIPS 450; Millipore, Bedford, MA) в течение ночи при 4°C с 10 мкг/мл mAb человека против IFN-γ (Mabtech, Nacka, Sweden) в карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6, промывали и блокировали средой IMDM+10% сывороткой человека с Ат (Biowest, Nuaille, France) в течение 1 ч при 37°C. Эффекторные клетки высевали в 100 мкл среды, и добавляли клетки-мишени до достижения соотношения E/T, составляющего 10:1, всего в количестве 200 мкл/лунка. После инкубации в течение 24 ч, лунки промывали 5 раз 0,1% Tween-20 в PBS. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с 1 мкг/мл биотинилированных mAb мыши против IFN-γ человека (Mabtech) в PBS/HSA (0,4 г/л). После нескольких промываний 0,1% Tween-20 в PBS, добавляли 1:1000 щелочную фосфатазу-стрептавидин (Mabtech) в PBS/HSA, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали, и добавляли синий субстрат, представляющий собой 5-бром-4-хлор-3-индолфосфат/нитротетразолий, на 30 минут при комнатной температуре (Mabtech). Проявление цвета останавливали промыванием планшетов водой. После высыхания CD8+ T-клетки, секретирующие IFN-γ, подсчитывали, визуализировали посредством цветного пятна на нитро-целлюлозной мембране, с использованием автоматической считывающий системы с визуализацией для ELISpot (AID, Strassberg, Germany).
Окрашивание тетрамерами HLA/пептидами:
Для идентификации колоний CD8+ T-лимфоцитов, специфичных к MART-1 (AAGIGILTV) или gp-100 (KTWGQYWQV), использовали тетрамеры HLA-A0201, конъюгированные с PE (фикоэритрином), или APC (аллофикоцианином), соответственно. Процесс окрашивания проводили при 37°С в течение 15 минут и клетки сразу помещали на лед. Затем образцы инкубировали с антителом против CD8 с FITC (BD Biosciences, San Jose CA) при 4°C в течение дополнительных 40 минут, и анализировали посредством FACS. Положительные контроли получали с помощью клонов CTL (ограниченных по HLA A*0201), специфичных к антигенам MART-1 (M27: AAGIGILTV) и gp100 (G154: KTWGQYWQV), размножаемых 14-суточными циклами в среде RPMI в присутствии антител против CD3 (OKT-3, BD Biosciences) в количестве 30 нг/мл, и серии IL-2 (Chiron BV) 300 МЕ/мл каждые 3 суток с 10% сывороткой человека с инактивированными AB и антибиотиками. Отрицательные контроли представляли собой образцы PBMC от здоровых доноров с HLA-A0201.
Определение гуморального ответа:
Жизнеспособные клетки, содержащие клетки Apo-Nec, смешивали в равных соотношениях, блокировали 10% сывороткой кролика в течение 30 мин, и инкубировали с сывороткой до и после применения, разбавленной 1/10 на 1 ч при 4°С. Затем их промывали и клетки инкубировали с антителом против иммуноглобулина человека (IgG+A+M), полученного у кроликов (DakoCytomation, Glostrup, DK) в течение 1 ч при 4°C. Клетки промывали, фиксировали в 1% параформальдегиде и анализировали посредством FACS. Альтернативно сначала повышали проницаемость клеток с помощью сапонина в количестве 0,05% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) в PBS на стадии блокирования, и добавляли 0,05% сапонин/PBS после стадии реакции. В качестве первого антительного контроля использовали нормальную сыворотку.
Из клеточных линий Apo-Nec по изобретению получали экстракты белка. Клеточные осадки замораживали при -80°C, размораживали и обрабатывали в течение 20 мин при 4°C лизирующим буфером (50 мМ Tris-CIH, pH 7,5, 1% NP4O, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ PMSF). Суспензию гомогенизировали с помощью Polytron (Brinkmann Instruments, USA), и центрифугировали в течение 40 мин при 10000 g. Супернатант хранили в качестве аликвот, замороженных при -20°C. Концентрацию белка измеряли способом Лоури. Аналогично получали экстракты клеточной линии карциномы молочной железы человека IIB-BR-G.
Белковые экстракты (50 мкг) анализировали в градиенте 3%-12% SDS-PAGE, и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (размер пор 0,45 мкм, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). После блокирования 3% обезжиренным коровьим молоком (Moliko, Argentina), их инкубировали в течение ночи при 4°C с сывороткой пациента, разбавленной 1/10. После нескольких промываний мембраны инкубировали с антителами человека против IgG+A+M, полученными у козы, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (Zymed, San Francisco, CA), и проявленными с помощью 4-Cl-нафтола и H2O2.
Гистопатологический анализ метастазов меланомы:
Погруженные в парафин биоптаты использовали для анализа лимфоидных клеток и инфильтрации DC-клеток. От трех до пяти срезов окрашивали гематоксилином/эозином или подвергали иммунному окрашиванию антителами против CD4 (клон 1F6), против CD8 (клон C8E-144b), против CD20 (клон L26), против CD1a (клон 010) (DakoCytomation, Glostrup, DK) и против CD57 (клон NK1, Zymed, San Francisco, CA), и проявляли реагентом ABC, и диаминобензидином (DAB), или Novared в качестве субстрата (Vectastain, Vector, Burlingame, CA). В качестве контроля проводили реакции без первичных антител. Срезы анализировали с помощью микроскопа Olympus BX40.
Claims (21)
1. Сочетание клеточных линий меланомы человека для лечения злокачественных заболеваний, отличающееся тем, что такое сочетание включает клеточную линию (a) Mel-XY1 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2832) и (d) Mel-XX4 (депонированную в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), где такие клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать.
2. Сочетание клеточных линий по п.1, отличающееся тем, что клеточные линии a), b), c) и d) содержат популяцию клеток с апоптотическим фенотипом.
3. Сочетание клеточных линий по п.2, отличающееся тем, что популяция апоптотических клеток содержит от 35% до 60% таких клеток.
4. Сочетание клеточных линий по п.1, отличающееся тем, что клеточные линии a), b), c) и d) содержат популяцию клеток с некротическим фенотипом.
5. Сочетание клеточных линий по п.4, отличающееся тем, что популяция некротических клеток содержит от 10% до 25% таких клеток.
6. Композиция для лечения меланомы, отличающаяся тем, что она содержит сочетание аллогенной клеточной линии меланомы (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM АСС2832), (d) Mel-ХХ4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829), где такие клеточные линии являются облученными и не способны пролиферировать.
7. Композиция для лечения меланомы, отличающаяся тем, что она содержит зрелые аутологичные дендритные клетки, аутологичные дендритные клетки, нагруженные сочетанием гетерологичных клеточных линий меланомы человека, апоптотические клетки такого сочетания гетерологичной клеточной линии меланомы человека и некротические клетки такого сочетания гетерологичной клеточной линии меланомы человека, где сочетание клеточных линий состоит из (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM АСС2832) и (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829).
8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что зрелые дендритные клетки имеют фенотип CD 14-, CD11c+, CD1a+ и CD83+.
9. Способ получения композиции по п.6, характеризующийся стадиями:
a) размораживания и культивирования клеточных линий (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM АСС2832); (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829);
b) облучения этих клеточных линий;
c) добавления адъювантов и/или иммуномодуляторов для смешивания клеточных линий.
a) размораживания и культивирования клеточных линий (a) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM АСС2832); (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829);
b) облучения этих клеточных линий;
c) добавления адъювантов и/или иммуномодуляторов для смешивания клеточных линий.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что клетки облучают при 50-100 Грэй.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что адъювант представляет собой БЦЖ.
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что иммуномодулятор выбран из группы, включающей GM-CSF, G-CSF, IFNα, циклофосфамид и их смеси.
13. Способ получения композиции по п.7, характеризующийся стадиями:
a) размораживания и культивирования клеточных линий (а) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Ме1-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM АСС2832); и (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829);
b) облучения этих клеточных линий;
c) получения аутологичных дендритных клеток; и
d) сокультивирования в течение некоторого времени аутологичных дендритных клеток с клеточными линиями, облученными на стадии b).
a) размораживания и культивирования клеточных линий (а) Mel-XY1 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2830), (b) Ме1-XY2 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM АСС2832); и (d) Mel-XX4 (депонированной в Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии DSMZ под регистрационным номером DSM ACC2829);
b) облучения этих клеточных линий;
c) получения аутологичных дендритных клеток; и
d) сокультивирования в течение некоторого времени аутологичных дендритных клеток с клеточными линиями, облученными на стадии b).
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что клетки облучают при 50-100 Грэй.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что сокультивирование проводят при температуре от 35 до 39°C, и в течение периода времени от 6 до 72 ч.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что на стадии d) соотношение между аутологичными дендритными клетками и клеточными линиями составляет от 1:1 до 3:1.
17. Способ по п.13, отличающийся тем, что дендритные клетки стадии d) содержат незрелые дендритные клетки.
18. Способ по п.9 или 13, отличающийся тем, что он включает стадию смешивания клеточных линий.
19. Применение сочетания клеточных линий меланомы человека по п.1 для получения композиции для индуцирования противоопухолевого иммунного ответа у млекопитающего, имеющего меланому.
20. Применение сочетания клеточных линий меланомы человека по п.1 для получения композиции для лечения млекопитающего, имеющего меланому.
21. Применение сочетания клеточных линий меланомы человека по п.1 для получения композиции для адъювантного лечения млекопитающего, имеющего меланому.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ARP20070101520 | 2007-04-11 | ||
ARP070101520A AR060424A1 (es) | 2007-04-11 | 2007-04-11 | Lineas celulares , composiciones para el tratamiento de melanomas que las comprenden procedimientos para preparar las composiciones y metodos de tratamiento |
PCT/IB2008/051385 WO2008126039A2 (en) | 2007-04-11 | 2008-04-11 | Cell lines, compositions comprising them for the treatment of melanomas, procedures to prepare the compositions, and treatment methods |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009141593A RU2009141593A (ru) | 2011-05-20 |
RU2484134C2 true RU2484134C2 (ru) | 2013-06-10 |
Family
ID=39590605
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009141593/10A RU2484134C2 (ru) | 2007-04-11 | 2008-04-11 | Клеточные линии, содержащие их композиции для лечения меланом, способы получения композиций и способы лечения |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8501168B2 (ru) |
EP (1) | EP2146742B1 (ru) |
JP (1) | JP5762738B2 (ru) |
KR (1) | KR101502518B1 (ru) |
CN (1) | CN101861163B (ru) |
AR (1) | AR060424A1 (ru) |
AU (1) | AU2008238909B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0809767B1 (ru) |
CA (1) | CA2683629C (ru) |
CO (1) | CO6260100A2 (ru) |
DK (1) | DK2146742T3 (ru) |
ES (1) | ES2390130T3 (ru) |
MX (1) | MX2009010927A (ru) |
NZ (1) | NZ580533A (ru) |
RU (1) | RU2484134C2 (ru) |
WO (1) | WO2008126039A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200907240B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2755233C1 (ru) * | 2021-01-11 | 2021-09-14 | Сергей Анатольевич Яргунин | Способ лечения меланомы кожи IIb-IIc стадий |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6077735B2 (ja) * | 2011-06-08 | 2017-02-08 | 日本電子株式会社 | 電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法 |
SG11201401632WA (en) | 2011-10-20 | 2014-05-29 | California Stem Cell Inc | Antigen presenting cancer vaccine |
JP6077757B2 (ja) * | 2012-04-17 | 2017-02-08 | 日本電子株式会社 | 電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法 |
JP5921386B2 (ja) * | 2012-08-27 | 2016-05-24 | 日本電子株式会社 | 電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法 |
CN103146641B (zh) * | 2013-02-06 | 2015-03-25 | 云南中科灵长类生物医学重点实验室 | 多能干细胞的传代方法及其用途 |
CN104990781B (zh) * | 2015-06-29 | 2018-02-16 | 中国医学科学院皮肤病研究所 | 黑素细胞免疫组化苏木素—甲苯胺蓝双重复染法 |
TW202134430A (zh) | 2019-12-03 | 2021-09-16 | 美商紐沃進公司 | 腫瘤細胞疫苗 |
CN115074328A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-09-20 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种用于治疗黑素瘤的细胞株及其多效价全细胞疫苗与使用方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001028583A2 (en) * | 1999-10-18 | 2001-04-26 | St. Vincent's Hospital And Medical Center Of New York | Melanoma vaccine and methods of making and using same |
RU2004100550A (ru) * | 2004-01-05 | 2005-06-10 | Государственное учреждение научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН (RU) | Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга |
RU2283129C1 (ru) * | 2004-12-24 | 2006-09-10 | Сергей Викторович Луценко | Белковопептидный противоопухолевый композит, клеточный препарат, активированный этим композитом, и способ профилактики или лечения опухолей |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5882654A (en) * | 1989-11-03 | 1999-03-16 | Morton; Donald L. | Polyvalent melanoma vaccine |
AU705647B2 (en) * | 1996-07-10 | 1999-05-27 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
ATE283069T1 (de) * | 1996-08-16 | 2004-12-15 | Univ Johns Hopkins Med | Melanomzellinien, welche immundominante melanomantigene teilen und verfahren zu deren anwendung |
CA2321093A1 (en) * | 1998-02-20 | 1999-08-26 | The Rockefeller University | Apoptotic cell-mediated antigen presentation to dendritic cells |
EP2151245A1 (en) * | 1999-10-15 | 2010-02-10 | Baylor Research Institute | Use of allogeneic cell lines to load antigen-presenting cells to elicit or eliminate immune responses |
US7015205B1 (en) * | 1999-10-18 | 2006-03-21 | St. Vincent's Hospital And Medical Center Of New York | Melanoma vaccine and methods of making and using same |
WO2001048154A1 (fr) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Toyoshima, Kumao | Agent de maturation pour cellules dendritiques immatures |
ATE371017T1 (de) * | 2000-09-15 | 2007-09-15 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur auslösung spezifischer zytolytischer t-zellantworten |
US20030072737A1 (en) * | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
IL140796A0 (en) * | 2001-01-08 | 2002-02-10 | Hadasit Med Res Service | An autologous anti-cancer vaccine |
JP2004536787A (ja) * | 2001-03-09 | 2004-12-09 | ベイラー リサーチ インスティテュート | 血液免疫反応の誘導による悪性腫瘍治療方法 |
WO2003020884A2 (en) * | 2001-08-14 | 2003-03-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Method for rapid generation of mature dendritic cells |
EP1451305A4 (en) * | 2001-11-07 | 2005-10-05 | Mannkind Corp | EPITOPE SYNCHRONIZATION IN CELLS THAT HAVE ANTIGENS |
ES2354944T3 (es) * | 2002-12-06 | 2011-03-21 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Administración de células dendríticas maduradas parcialmente in vitro para el tratamiento de tumores. |
AU2004239288B2 (en) * | 2003-05-09 | 2010-01-28 | Centocor, Inc. | IL-23p40 specific immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
JP5021309B2 (ja) * | 2003-10-16 | 2012-09-05 | ステファン ジョン ラルフ | 免疫調節性組成物およびその使用方法 |
JP5848861B2 (ja) * | 2004-04-20 | 2016-01-27 | ジェンマブ エー/エスGenmab A/S | Cd20に対するヒトモノクローナル抗体 |
CA2565874C (en) * | 2004-05-10 | 2017-10-03 | Macrogenics, Inc. | Humanized fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof |
-
2007
- 2007-04-11 AR ARP070101520A patent/AR060424A1/es active IP Right Grant
-
2008
- 2008-04-11 BR BRPI0809767-4A patent/BRPI0809767B1/pt active IP Right Grant
- 2008-04-11 WO PCT/IB2008/051385 patent/WO2008126039A2/en active Application Filing
- 2008-04-11 MX MX2009010927A patent/MX2009010927A/es active IP Right Grant
- 2008-04-11 ES ES08737810T patent/ES2390130T3/es active Active
- 2008-04-11 DK DK08737810.5T patent/DK2146742T3/da active
- 2008-04-11 CA CA2683629A patent/CA2683629C/en active Active
- 2008-04-11 AU AU2008238909A patent/AU2008238909B2/en active Active
- 2008-04-11 NZ NZ580533A patent/NZ580533A/xx unknown
- 2008-04-11 RU RU2009141593/10A patent/RU2484134C2/ru active
- 2008-04-11 JP JP2010502629A patent/JP5762738B2/ja active Active
- 2008-04-11 EP EP08737810A patent/EP2146742B1/en active Active
- 2008-04-11 US US12/450,721 patent/US8501168B2/en active Active
- 2008-04-11 CN CN2008800182498A patent/CN101861163B/zh active Active
- 2008-04-11 KR KR1020097022846A patent/KR101502518B1/ko active IP Right Grant
-
2009
- 2009-10-16 ZA ZA200907240A patent/ZA200907240B/xx unknown
- 2009-10-28 CO CO09121156A patent/CO6260100A2/es active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001028583A2 (en) * | 1999-10-18 | 2001-04-26 | St. Vincent's Hospital And Medical Center Of New York | Melanoma vaccine and methods of making and using same |
RU2004100550A (ru) * | 2004-01-05 | 2005-06-10 | Государственное учреждение научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН (RU) | Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга |
RU2283129C1 (ru) * | 2004-12-24 | 2006-09-10 | Сергей Викторович Луценко | Белковопептидный противоопухолевый композит, клеточный препарат, активированный этим композитом, и способ профилактики или лечения опухолей |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
ALBERT M.L. et al., Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs, Nature, 1998, v.392, n.6671, p.86-89. * |
ALBERT M.L. et al., Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic Т lymphocytes, J. Exp. Med., 1998, v.188, n.7, p.1359-1368. * |
ALBERT M.L. et al., Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic Т lymphocytes, J. Exp. Med., 1998, v.188, n.7, p.1359-1368. ALBERT M.L. et al., Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs, Nature, 1998, v.392, n.6671, p.86-89. TOBIASOVA; Z. et al., In vitro assessment of dendritic cells pulsed with apoptotic tumor cells as a vaccine for ovarian cancer patients, Clin. Immunol., 2007, v.122, n.1, p.18-27. SHILYANSKY J. et al., Induction of cytolytic Т lymphocytes against pediatric solid tumors in vitro using autologous dendritic cells pulsed with necrotic primary tumor, J. Pediatr. Surg., 2007, v.42, n.1, p.54-61. ROHN T.A. et al., Melanoma cell necrosis facilitates transfer of specific sets of antigens onto MHC class II molecules of dendritic cells, Eur. J. Immunol., 2005, v.35, n.10, p.2826-2839. * |
GOLDSZMID R.S. et al., Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ Т cell immunity against В16 melanoma, J. Immunol., 2003, v.171, n.11, p.5940-5947. * |
LONGHI PAULA et al., Preclinical studies of a human vaccine based on dendritic cells loaded with apoptotic/necrotic melanoma cells, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 2004, v.45, p.292. * |
ROHN T.A. et al., Melanoma cell necrosis facilitates transfer of specific sets of antigens onto MHC class II molecules of dendritic cells, Eur. J. Immunol., 2005, v.35, n.10, p.2826-2839. * |
SHILYANSKY J. et al., Induction of cytolytic Т lymphocytes against pediatric solid tumors in vitro using autologous dendritic cells pulsed with necrotic primary tumor, J. Pediatr. Surg., 2007, v.42, n.1, p.54-61. * |
THUMANN P. et al., Antigen loading of dendritic cells with whole tumor cell preparations, J. Immunol. Methods, 2003, v.277, n.1-2, p.1-16. * |
THUMANN P. et al., Antigen loading of dendritic cells with whole tumor cell preparations, J. Immunol. Methods, 2003, v.277, n.1-2, p.1-16. LONGHI PAULA et al., Preclinical studies of a human vaccine based on dendritic cells loaded with apoptotic/necrotic melanoma cells, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 2004, v.45, p.292. GOLDSZMID R.S. et al., Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ Т cell immunity against В16 melanoma, J. Immunol., 2003, v.171, n.11, p.5940-5947. * |
TOBIASOVA; Z. et al., In vitro assessment of dendritic cells pulsed with apoptotic tumor cells as a vaccine for ovarian cancer patients, Clin. Immunol., 2007, v.122, n.1, p.18-27. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2755233C1 (ru) * | 2021-01-11 | 2021-09-14 | Сергей Анатольевич Яргунин | Способ лечения меланомы кожи IIb-IIc стадий |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101861163A (zh) | 2010-10-13 |
US8501168B2 (en) | 2013-08-06 |
MX2009010927A (es) | 2010-02-11 |
AR060424A1 (es) | 2008-06-18 |
AU2008238909B2 (en) | 2013-11-07 |
BRPI0809767A2 (pt) | 2014-09-23 |
US20100183683A1 (en) | 2010-07-22 |
JP2010523141A (ja) | 2010-07-15 |
KR20090129501A (ko) | 2009-12-16 |
ES2390130T3 (es) | 2012-11-06 |
BRPI0809767B1 (pt) | 2022-04-12 |
CO6260100A2 (es) | 2011-03-22 |
WO2008126039A2 (en) | 2008-10-23 |
ZA200907240B (en) | 2010-07-28 |
NZ580533A (en) | 2012-08-31 |
DK2146742T3 (da) | 2012-10-22 |
CN101861163B (zh) | 2013-06-12 |
KR101502518B1 (ko) | 2015-03-13 |
AU2008238909A1 (en) | 2008-10-23 |
EP2146742B1 (en) | 2012-07-11 |
CA2683629C (en) | 2016-06-21 |
WO2008126039A3 (en) | 2008-12-11 |
RU2009141593A (ru) | 2011-05-20 |
EP2146742A2 (en) | 2010-01-27 |
CA2683629A1 (en) | 2008-10-23 |
JP5762738B2 (ja) | 2015-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2484134C2 (ru) | Клеточные линии, содержащие их композиции для лечения меланом, способы получения композиций и способы лечения | |
Palucka et al. | Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells can induce objective clinical responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity | |
Wang et al. | Eliciting T cell immunity against poorly immunogenic tumors by immunization with dendritic cell-tumor fusion vaccines | |
Osada et al. | Dendritic cell-based immunotherapy | |
Hernando et al. | Vaccination with autologous tumour antigen-pulsed dendritic cells in advanced gynaecological malignancies: clinical and immunological evaluation of a phase I trial | |
Butterfield et al. | Adenovirus MART-1–engineered autologous dendritic cell vaccine for metastatic melanoma | |
Panelli et al. | Phase 1 study in patients with metastatic melanoma of immunization with dendritic cells presenting epitopes derived from the melanoma-associated antigens MART-1 and gp100 | |
RU2313365C2 (ru) | Фармацевтическая композиция для индукции иммунной реакции у человека | |
von Euw et al. | A phase I clinical study of vaccination of melanoma patients with dendritic cells loaded with allogeneic apoptotic/necrotic melanoma cells. Analysis of toxicity and immune response to the vaccine and of IL-10-1082 promoter genotype as predictor of disease progression | |
AU2003302504B2 (en) | Rapid one-step method for generation of antigen loaded dendritic cell vaccine from precursors | |
Ramanathan et al. | Development and clinical evaluation of dendritic cell vaccines for HPV related cervical cancer-a feasibility study | |
Wu et al. | Identification of EGFRvIII-derived CTL epitopes restricted by HLA A0201 for dendritic cell based immunotherapy of gliomas | |
Linette et al. | Immunization using autologous dendritic cells pulsed with the melanoma-associated antigen gp100-derived G280-9V peptide elicits CD8+ immunity | |
US20100303868A1 (en) | Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
US20150191695A1 (en) | Composition including gelsolin as effective ingredient for inducing differentiation into dendritic cell and method of inducing differentiation into dendritic cell | |
Lundqvist et al. | Recombinant adenovirus vector activates and protects human monocyte-derived dendritic cells from apoptosis | |
JP2006509830A (ja) | 癌予防用ハイブリッド細胞ワクチンの調製および投与 | |
Young et al. | Skewed differentiation of bone marrow CD34+ cells of tumor bearers from dendritic toward monocytic cells, and the redirection of differentiation toward dendritic cells by 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 | |
Paczesny et al. | Measuring melanoma-specific cytotoxic T lymphocytes elicited by dendritic cell vaccines with a tumor inhibition assay in vitro | |
BG107482A (bg) | Лекарствено средство за имунотерапия на злокачествени тумори | |
Vichchatorn et al. | Dendritic cells pulsed with total tumor RNA for activation NK-like T cells against glioblastoma multiforme | |
Hwang et al. | Generation of Potent Cytotoxic T Lymphocytes Against Castration‐Resistant Prostate Cancer Cells by Dendritic Cells Loaded With Dying Allogeneic Prostate Cancer Cells | |
Zhao et al. | RETRACTED: The Collective Effect of MIP-3α and FL Promotes Dendritic Cell Function Within the Immune Microenvironment of Murine Liver Cancer | |
Kim et al. | Cytotoxicities of Tumor-specific T Lymphocytes Primed by Glioma Apoptotic Body-or Glioma Cell Lysate-pulsed Dendritic Cells | |
주이신 | Functional enhancement of dendritic cells by biological response modifiers in tumor immunity |