CN104990781B - 黑素细胞免疫组化苏木素—甲苯胺蓝双重复染法 - Google Patents

黑素细胞免疫组化苏木素—甲苯胺蓝双重复染法 Download PDF

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黑素细胞免疫组化的苏木素—甲苯胺蓝双重复染的方法：⑴.切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：⑵.阻断灭活内源性过氧化物酶：⑶.抗原修复；⑷.血清封闭；⑸.滴加一抗；⑹.滴加二抗；⑺.DAB显色；⑻.苏木素复染，盐酸酒精分化；⑼.甲苯胺蓝工作液复染，冰醋酸分化；⑽.脱水透明后封片。本发明的阳性颗粒复染后仍为棕黄色，组织内原有黑素颗粒变为墨绿色，区别明显，易于与棕色颗粒区分，且不影响苏木素的显色，背景细胞细胞核清晰可见，免疫组化阳性棕黄色颗粒、墨绿色黑素颗粒、蓝色胞核三者色差明显，便于直观区分。甲苯胺蓝染液配制起来简单方便。

Description

黑素细胞免疫组化苏木素—甲苯胺蓝双重复染法
技术领域
本发明涉及一种检测技术，具体涉及一种黑素细胞及其增生性病变免疫组化的苏木素—甲苯胺蓝双重复染的方法。
背景技术
皮肤病病理研究或临床研究中，人类黑素细胞及其增生性病变尤其是恶性黑素瘤的研究是很活跃的领域之一。而研究自带黑素颗粒的黑素细胞必须使用针对黑素组织的免疫组化染色技术。临床常规非黑素组织免疫组化染色技术（ABC法）实验步骤如下：
⑴.切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净。
⑵. 阻断灭活内源性过氧化物酶：
3%H2O2 37℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑶. 抗原修复（常规操作）；
⑷. 血清封闭：山羊血清37℃孵育10min，倾去勿洗；
⑸. 滴加一抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；
⑹. PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑺. 滴加二抗，室温避光孵育20min；
⑻. PBS缓冲液冲洗5min×3次；
⑼. 配置DAB显色液（取蒸馏水1ml，依次滴加DAB试剂盒中的A、B、C各1滴，混匀），将显色液滴至切片上，常规显色；
⑽. 蒸馏水漂洗5min×3次；
. 苏木素复染1min，1%盐酸乙醇分化，自来水清洗，温水反蓝；
. 脱水透明后封片。
上述常规苏木素单独复染染色后免疫组化反应阳性的棕黄色颗粒与细胞内原有黑素颗粒颜色相近，不易区分，给阅片带来了一定困难。因此，为了区分免疫组化反应阳性的棕黄色颗粒与原有黑素颗粒，已有文献报道黑素细胞免疫组化Giemsa复染法供选择，具体实验步骤如下：
⑴.切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净。
⑵. 阻断灭活内源性过氧化物酶：
3%H2O2 37℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑶. 抗原修复（常规操作）；
⑷. 血清封闭：山羊血清37℃孵育10min，倾去勿洗；
⑸. 滴加一抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；
⑹. PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑺. 滴加二抗，室温避光孵育20min；
⑻. PBS缓冲液冲洗5min×3次；
⑼. 配置DAB显色液（取蒸馏水1ml，依次滴加DAB试剂盒中的A、B、C各1滴，混匀），将显色液滴至切片上，常规显色；
⑽. 蒸馏水漂洗5min×3次；
. Giemsa工作液复染20-30min，1：500冰醋酸分化至显微镜下黑素颗粒呈现墨绿色（约需2min），自来水清洗。
染液配制：0.75 g Giemsa溶于50 ml甘油中，加热至50～60 ℃，每隔1 h摇荡1次，7～8次，再加甲醇混合后静置一夜，即得到Giemsa原液；将Giemsa原液用0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH6.8，不含NaCL）按1︰20稀释配成，现用现配。
. 脱水透明后封片。
以上传统Giemsa复染法的现有技术，复染者背景为淡锈红色，与DAB染色阳性的棕色颗粒色差偏小，有重叠效应，且背景细胞无细胞核。
发明内容
为了克服传统技术的上述不足，本发明的目的是提供一种黑素细胞免疫组化的苏木素-甲苯胺蓝复染方法，黑色素颗粒染色效果同Giemsa复染者，保留了Giemsa复染不影响DAB棕黄色阳性结果的同时又改变了原有黑色素颜色的直观优点，其背景为蓝色，与苏木素复染背景颜色一致，易于与棕色颗粒区分，且不影响苏木素的显色，背景细胞细胞核清晰可见，免疫组化阳性棕黄色颗粒、墨绿色黑素颗粒、蓝色胞核三者色差明显，便于直观区分。甲苯胺蓝原液较Giemsa原液配制起来步骤更为简单方便。
完成上述发明任务的技术方案是，一种黑素细胞免疫组化的苏木素—甲苯胺蓝双重复染的方法，其特征在于，步骤如下：
⑴. 切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净。
⑵. 阻断灭活内源性过氧化物酶：
3%H2O2 37℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑶. 抗原修复（常规操作）；
⑷. 血清封闭：山羊血清37℃孵育10min，倾去勿洗；
⑸. 滴加一抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；
⑹. PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑺. 滴加二抗，室温避光孵育20min；
⑻. PBS缓冲液冲洗5min×3次；
⑼. 配置DAB显色液（取蒸馏水1ml，依次滴加DAB试剂盒中的A、B、C各1滴，混匀），将显色液滴至切片上，常规显色；
⑽. 蒸馏水漂洗5min×3次；
. 苏木素复染1min，1%盐酸乙醇分化，自来水清洗，温水反蓝；
⑿. 甲苯胺蓝工作液复染20-30min，1：500冰醋酸分化至显微镜下黑素颗粒呈现墨绿色（约需2min），自来水清洗；
染液配制：将1g甲苯胺蓝溶于100ml蒸馏水中，即得到甲苯胺蓝原液；甲苯将甲苯胺蓝原液用PBS缓冲液按1:20稀释配成，现用现配；
⒀. 脱水透明后封片。
换言之，本发明实验方法的步骤⑴-步骤⑽与现有技术相同；步骤-步骤⒀为苏木素与甲苯胺蓝工作液双重复染。本发明了保留黑素细胞原有黑素颗粒的同时显现免疫组化阳性的棕色颗粒，并区别明显，
更优化、更详细地说，本发明的各步骤操作如下：
⑴. 切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净。
⑵. 阻断灭活内源性过氧化物酶：
3%H2O2 37℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑶. 抗原修复（常规操作）；
⑷. 血清封闭：山羊血清37℃孵育10min，倾去勿洗；
⑸. 滴加一抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；
⑹. PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑺. 滴加二抗，室温避光孵育20min；
⑻. PBS缓冲液冲洗5min×3次；
⑼. 配置DAB显色液（取蒸馏水1ml，依次滴加DAB试剂盒中的A、B、C各1滴，混匀），将显色液滴至切片上，常规显色；
⑽. 蒸馏水漂洗5min×3次；
. 苏木素复染1min，1%盐酸乙醇分化，自来水清洗，温水反蓝；
⑿. 甲苯胺蓝工作液复染20-30min，1：500冰醋酸分化至显微镜下黑素颗粒呈现墨绿色（约需2min），自来水清洗；
染液配制：将1g甲苯胺蓝溶于100ml蒸馏水中，即得到甲苯胺蓝原液；甲苯将甲苯胺蓝原液用PBS缓冲液按1:20稀释配成，现用现配；
⒀. 脱水透明后封片。
本发明能够克服传统技术的不足，并具有以下优点：免疫组化反应的阳性颗粒经创新的苏木素—甲苯胺蓝双重复染法复染后仍为棕黄色，组织内原有黑素颗粒变为墨绿色，区别明显。苏木素—甲苯胺蓝双重复染者黑色素颗粒染色效果同Giemsa复染者，保留了Giemsa复染不影响DAB棕黄色阳性结果的同时又改变了原有黑色素颜色的直观优点，其背景为蓝色，与苏木素复染背景颜色一致，易于与棕色颗粒区分，且不影响苏木素的显色，背景细胞细胞核清晰可见，免疫组化阳性棕黄色颗粒、墨绿色黑素颗粒、蓝色胞核三者色差明显，便于直观区分。甲苯胺蓝原液较Giemsa原液配制起来步骤更为简单方便。
附图说明
图1为本发明双重复染后的效果图：苏木素—甲苯胺蓝双重复染在蓝色背景基础上阳性棕黄色颗粒及染成墨绿色的黑素颗粒，可见蓝色细胞核（×100倍）；图中，1为免疫组化阳性棕黄色颗粒；2为染成墨绿色的黑素颗粒；3为细胞核；
图2为Giemsa单独复染的效果图：见淡锈红色背景基础上阳性棕黄色颗粒及染成墨绿色的黑素颗粒，细胞核未着色（×100倍）；图中，1为免疫组化阳性棕黄色颗粒；2为染成墨绿色的黑素颗粒；
图3为常规苏木素单独复染，免疫组化阳性棕色颗粒与原有黑素颗粒颜色相近，不易区分（×100倍）。图中，1为免疫组化阳性棕黄色颗粒；3为细胞核。
具体实施方式
实施例1，黑素组织免疫组化的苏木素—甲苯胺蓝双重复染的方法，步骤如下：
⑴. 切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净。
⑵. 阻断灭活内源性过氧化物酶：
3%H2O2 37℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑶. 抗原修复（常规操作）；
⑷. 血清封闭：山羊血清37℃孵育10min，倾去勿洗；
⑸. 滴加一抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；
⑹. PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑺. 滴加二抗，室温避光孵育20min；
⑻. PBS缓冲液冲洗5min×3次；
⑼. 配置DAB显色液（取蒸馏水1ml，依次滴加DAB试剂盒中的A、B、C各1滴，混匀），将显色液滴至切片上，常规显色；
⑽. 蒸馏水漂洗5min×3次；
. 苏木素复染1min，1%盐酸乙醇分化，自来水清洗，温水反蓝；
⑿. 甲苯胺蓝工作液复染20-30min，1：500冰醋酸分化至显微镜下黑素颗粒呈现墨绿色（约需2min），自来水清洗；
染液配制：将1g甲苯胺蓝溶于100ml蒸馏水中，即得到甲苯胺蓝原液；甲苯将甲苯胺蓝原液用PBS缓冲液按1:20稀释配成，现用现配；
⒀. 脱水透明后封片。

Claims (1)

1.一种黑素细胞免疫组化的苏木素—甲苯胺蓝双重复染的方法，其特征在于，步骤如下：
⑴. 切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净；
⑵. 阻断灭活内源性过氧化物酶：
3%H2O237℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑶. 抗原修复；
⑷. 血清封闭：山羊血清37℃孵育10min，倾去勿洗；
⑸. 滴加一抗，PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；
⑹. PBS缓冲液清洗5min×3次；
⑺. 滴加二抗，室温避光孵育20min；
⑻. PBS缓冲液冲洗5min×3次；
⑼. 配置DAB显色液，将显色液滴至切片上，常规显色；所述显色液的配置操作是：取蒸馏水1ml，依次滴加DAB试剂盒中的A、B、C各1滴，混匀；
⑽. 蒸馏水漂洗5min×3次；
. 苏木素复染1min，1%盐酸乙醇分化，自来水清洗，温水反蓝；
⑿. 甲苯胺蓝工作液复染20-30min，1：500冰醋酸分化至显微镜下黑素颗粒呈现墨绿色，需2min，自来水清洗；
染液配制：将1g甲苯胺蓝溶于100ml蒸馏水中，即得到甲苯胺蓝原液；甲苯胺蓝工作液是将甲苯胺蓝原液用PBS缓冲液按1:20稀释配成，现用现配；
⒀. 脱水透明后封片；
步骤⑴切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水的具体操作是：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30min，无水乙醇、95%、90%、85%梯度酒精各3 min，自来水洗净；
步骤⑵阻断灭活内源性过氧化物酶的具体操作是：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS缓冲液清洗5min×3次。
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