RU2437935C2 - Способ производства мультиферментного препарата - Google Patents
Способ производства мультиферментного препарата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2437935C2 RU2437935C2 RU2009133995/10A RU2009133995A RU2437935C2 RU 2437935 C2 RU2437935 C2 RU 2437935C2 RU 2009133995/10 A RU2009133995/10 A RU 2009133995/10A RU 2009133995 A RU2009133995 A RU 2009133995A RU 2437935 C2 RU2437935 C2 RU 2437935C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yeast
- temperature
- distilled water
- hours
- precipitate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 30
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 abstract 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 abstract 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 37
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 33
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 32
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 5
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical class C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 206010001605 Alcohol poisoning Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical class [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению мультиферментных препаратов, и может быть использовано на предприятиях пищевой промышленности в качестве получения препаратов, направленных на снижение токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма. Способ предусматривает культивирование дрожжей в биореакторе на мелассной среде с добавлением молочной сыворотки в количестве 50% от общего объема питательной среды. Клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости центрифугированием и подвергают трансформации на шаровой мельнице при температуре 25±2°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,3 ч. Трансформированные клетки дрожжей экстрагируют 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С с последующим центрифугированием с получением супернатанта. Полученный супернатант подвергают двукратной обработке охлажденным раствором ацетона с получением осадка. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 3 ч при температурем +4±2°С и центрифугируют с получением супернатанта. Полученный супернатант подвергают микрофильтрации на мембранах с размерами пор 0,22 мкм и удаляют балластные белки с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой. Изобретение позволяет получить этанол-окисляющий мультиферментный препарат с высокой степенью чистоты и высокой каталитической активностью и повысить выход биомассы дрожжей.
Description
Изобретение относится к области получения мультиферментных препаратов, в частности получению этанол-окисляющего мультиферментного препарата, и может быть использовано на предприятиях биотехнологической промышленности в качестве получения препаратов, направленных на снижение токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма.
Известен способ получения ферментного препарата алгкогольдегидрогеназы, культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащие источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение фермента (Metra, R.J. Pyridine Nucleotide-Linked Oxidation of methanol in methanol-assimilating yeasts.- Bacteriology. - 1975. - V.3. - P.1165-1167). Однако данный способ не позволяет получить из дрожжей ферментный препарат, специфичный к алкоголю и ацетальдегиду высокой каталитической активности. Кроме того, он не может быть использован в пищевой промышленности, в связи с тем, что не отвечает требованиям по микробиологической чистоте ГосФармакопеи.
Известен также другой способ получения ферментного препарата из дрожжей, предусматривающий культивирование дрожжей в проточных условиях, где в качестве источника углерода используют этиловый спирт, после чего дрожжи подвергают растиранию на стеклянных бусах и центрифугированию с последующей очисткой хроматографическим методом на ДЕАЭ-целлюлозе (авторское свидетельство SU 763464, 15.09.1980). Это техническое решение является наиболее близким к заявленному по совокупности существенных признаков (прототип). Недостатками является то, что данный способ позволяет выделить из дрожжей один фермент с низкой каталитической активностью к субстрату, кроме того, полученный препарат загрязнен микрофлорой и балластными белками.
Технической задачей изобретения является выделение алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы с высокой каталитической активностью в одном препарате, повышение их каталитической активности, предназначенной для применения в биотехнологической промышленности.
Технический результат достигается за счет культивирования дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae в биореакторе на питательной среде, состоящей из мелассы и молочной сыворотки (соотношение 1:1) при температуре процесса 30±2°С, продолжительностью 18 ч, при скорости аэрации воздуха 30±0,2 л/ч и скорости перемешивания 500±5 об/мин. При меньшем содержании молочной сыворотки наблюдается увеличения выхода биомассы дрожжей и снижается каталитическая активность ферментного комплекса состоящего из АДГ и АЛДГ. При массовой доле молочной сыворотки в питательной среде более 50% не наблюдается увеличение выхода биомассы дрожжей и целевого продукта. По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 15±1 мин при 15000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса составляет для АДГ 20±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,3±0,02 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей сыворотку.
Для более полного извлечения дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 80 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.
Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последущим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 15000 об/мин в течение 40 мин и проводят ультрафильтрацию супернатантана при температуре 25±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.
Очистку фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 25,4 и 4,3% соответственно.
Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого ферментный комплекс, состоящего из АДГ и АЛДГ, наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 90,3%.
С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящего из АДГ и АЛДГ и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. С этой целью ферментный комплекс, содержащий АДГ и АЛДГ, коферменты НАД и НАДН добавляют в 9% водный раствор агарозы и оставляют при температуре 2±2°С на 1 час, после застывания продукта его подвергают гомогенизации.
В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 1290 Е/мг белка и АЛДГ 39,0 Е/мг белка.
Пример 1. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют на питательной среде, содержащей 50% мелассы и 50% молочной сыворотки в периодическом ферментере с рабочим объемом 5,0 л. Для предотвращения спенивания в среду добавляют силиконовое масло в количестве 0,01%. Аэрацию воздуха ведут со скоростью 30±0,2 л/ч, скорость перемешивания питательной среды и биомассы составляет 500±5 об/мин. Процесс культивирования ведут при температуре 30±2°С в течение 18 ч.
По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 20±1 мин при 12000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса составляет для АДГ 20±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,2±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.
Для более полного извлечения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 80 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.
Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 25°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.
Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 15 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 18,2 и 3,2% соответственно.
Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого этанол-окисляющую систему наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.
Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 90,5%.
С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.
В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 1290 Е/мг белка и АЛДГ 39,0 Е/мг белка.
Пример 2. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют согласно примеру 1. По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 30±1 мин при 10000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет для АДГ 16±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,15±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.
Для более полного извлечения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 100 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.
Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 12000 об/мин в течение 60 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 26±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,40 мкм при температуре плюс 19±2°С давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.
Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 20,7 и 3,8% соответственно.
Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки этанол-окисляющей системы составляет 83,5%.
С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.
В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 780,0 Е/мг белка и АЛДГ 28,0 Е/мг белка.
Пример 3. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют согласно примеру 1. При этом каталитическая активность ферментного комплекса для АДГ 18,0±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,2±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.
Дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 60 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.
Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 12000 об/мин в течение 60 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 24±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.
Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 15 см3/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 18,2 и 3,2% соответственно.
Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого этанол-окисляющую систему наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 83,5%.
С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.
В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 830,0 Е/мг белка и АЛДГ 25,0 Е/мг белка.
Предлагаемый способ позволяет получить этанол-окисляющий мультиферментный препарат с высокой степенью чистоты и высокой каталитической активностью по алкогольдегидрогеназе (в 4,0 раза выше чем в прототипе) и альдегиддегидрогеназе. Также разработанная технология позволяет повысить выход биомассы дрожжей и использовать этанол-окисляющий мультиферментный препарат в пищевой промышленности.
Claims (1)
- Способ производства мультиферментного препарата, предусматривающий культивирование дрожжей в биореакторе на мелассной среде с добавлением молочной сыворотки в количестве 50% от общего объема питательной среды, отделение клеток дрожжей центрифугированием, трансформацию дрожжей на шаровой мельнице при температуре 25±2°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч, экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С с последующим центрифугированием с получением супернатанта, двукратную обработку полученного супернатанта охлажденным раствором ацетона с получением осадка, растворение осадка в дистиллированной воде, диализ против дистиллированной воды в течение 3 ч при температуре плюс 4±2°С, центрифугирование с получением супернатанта с последующей микрофильтрацией на мембранах с размерами пор 0,22 мкм и удалением балластных белков с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009133995/10A RU2437935C2 (ru) | 2009-09-10 | 2009-09-10 | Способ производства мультиферментного препарата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009133995/10A RU2437935C2 (ru) | 2009-09-10 | 2009-09-10 | Способ производства мультиферментного препарата |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009133995A RU2009133995A (ru) | 2011-03-20 |
| RU2437935C2 true RU2437935C2 (ru) | 2011-12-27 |
Family
ID=44053389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009133995/10A RU2437935C2 (ru) | 2009-09-10 | 2009-09-10 | Способ производства мультиферментного препарата |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2437935C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU174588A1 (ru) * | И. Я. Веселов, А. И. Веселое , Д. Я. Типограф | Способ получения ферментного препарата из микроорганизмов | ||
| SU763464A1 (ru) * | 1978-06-07 | 1980-09-15 | Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.М.В.Ломоносова | Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы |
-
2009
- 2009-09-10 RU RU2009133995/10A patent/RU2437935C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU174588A1 (ru) * | И. Я. Веселов, А. И. Веселое , Д. Я. Типограф | Способ получения ферментного препарата из микроорганизмов | ||
| SU763464A1 (ru) * | 1978-06-07 | 1980-09-15 | Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.М.В.Ломоносова | Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КОЧЕТОВ Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М., 1971, Высшая. школа, с.127-134. * |
| См. Интернет http://medi.ru/pbmc/8810301.htm, 2001. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009133995A (ru) | 2011-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5455244B2 (ja) | 遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造方法 | |
| CN103320362B (zh) | 一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN103695341B (zh) | 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法 | |
| CN101235394B (zh) | 一种分离提取富马酸的方法 | |
| KR102186997B1 (ko) | 단백질 정제의 신규한 방법 | |
| CN105754892A (zh) | 一种微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法 | |
| CN104017853A (zh) | 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN105886573B (zh) | 一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 | |
| CN104404016B (zh) | 一种生产柚苷酶的方法 | |
| RU2437935C2 (ru) | Способ производства мультиферментного препарата | |
| CN104531573B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105087427B (zh) | 产琼胶酶的需钠弧菌及其应用 | |
| CN102604917A (zh) | 一种高纯度纳豆激酶的制备方法 | |
| CN103923853B (zh) | 一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法 | |
| CN102433289A (zh) | 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法 | |
| CN103305495B (zh) | 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 | |
| RU2085212C1 (ru) | Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск | |
| CN104774794A (zh) | 一株产d-甘露糖异构酶的菌株及用其生产d-甘露糖的方法 | |
| CN1082605A (zh) | 一种产生超氧化物歧化酶的芽孢杆菌及其生产方法 | |
| JPS6279777A (ja) | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 | |
| CN101215590A (zh) | 一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法 | |
| CN105200102B (zh) | 从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法 | |
| CN108315375B (zh) | 一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法 | |
| CN104357339A (zh) | 一株产木糖醇的菌株及其产木糖醇的方法 | |
| CN109628527B (zh) | 一种梯度pH法制备胸苷的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110911 |