RU2429294C2 - ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА - Google Patents
ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2429294C2 RU2429294C2 RU2009139151/10A RU2009139151A RU2429294C2 RU 2429294 C2 RU2429294 C2 RU 2429294C2 RU 2009139151/10 A RU2009139151/10 A RU 2009139151/10A RU 2009139151 A RU2009139151 A RU 2009139151A RU 2429294 C2 RU2429294 C2 RU 2429294C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- factor viii
- domain
- deletion
- cells
- f8bdd
- Prior art date
Links
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 17
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title abstract description 42
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title abstract description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 title abstract description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 13
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 13
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 13
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 10
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 8
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 4
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089996 B-domain-deleted factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 1
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 1
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010038291 endodeoxyribonuclease PvuI Proteins 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 108010025139 recombinant factor VIII SQ Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII, и может быть использовано в медицине. Конструируют экспрессионную плазмидную ДНК pOptivec/F8BDD, кодирующую рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII с делецией В-домена, которой трансформируют клетки линии DG-OV-F8BDD-18 для продуцирования. Изобретение обеспечивает высокий уровень секреции рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена в бессывороточную культуральную среду. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее, к методам получения фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена (BDD-rfVIII).
Структура гена фактора VIII (fVIII) и его связь с генетикой гемофилии были установлены в 1984-85 годах (Vehar G. A. and R. M. Lawn (1986). "The cloning of factor VIII and the genetics of hemophilia A". Hosp Pract (Off Ed), 21(5): 111-116). Ген фактора VIII локализован на большом плече Х-хромосомы, на участке длиной порядка 186 Кб, состоит из 26 экзонов размером от 69 п.о. до 3106 п.о. и интронов, достигающих до 32,4 Кб. Область, кодирующая фактор VIII, занимает до 1% длины Х-хромосомы.
Экспрессия гена фактора VIII преимущественно происходит в гепатоцитах (Zelechowska M.G., J.A. van Mourik, et al. (1985). "Ultrastructural localization of factor VIII procoagulant antigen in human liver hepatocytes". Nature, 317(6039): 729-730), где обнаруживается его мРНК, а также полипептид в эндоплазматическом ретикулуме. Кроме того, показано, что промоторная область фактора VIII содержит регуляторные последовательности, специфичные для гепатоцитов.
Исходный полипептид фактора VIII транслоцируется в люмен эндоплазматического ретикулума (ЭР), где происходит N-гликозилирование. В ЭР fVIII взаимодействует с рядом шаперонов, включая кальретикулин, кальнексин, BiP. Транспорт в аппарат Гольджи (АГ) до сих пор описан не полностью, есть данные, что в нем принимет участие взаимодействие с внутриклеточным мембранным лектином, ERGIC-53 (Endoplasmatic Reticule Golgi Intermediate Compartment). Внутри АГ происходит N- и O-гликозилирование, сульфатирование остатков тирозина, а также ограниченный протеолиз. Критическая аминокислота для процессинга в АГ - Arg 2307, ее замена на Glu или Leu ведет к значительному увеличению секреции зрелого белка (Gitschier J., W.I. Wood, et al. (1986). "Identification of a missense mutation in the factor VIII gene of a mild hemophiliac". Science, 232(4756): 1415-1416).
Зрелый природный fVIII представлен в плазме крови серией форм с массами, лежащими в пределах от 170 до 280 кДа. В норме он экспрессируется in vivo как одноцепочечный полипептид, длиной 2332 аминокислоты, включающий структурные домены А1(1-336)-А2(372-710)-В(741-1648)-А3(1896-2019)-С1(2020-2172)-С2(2173-2332), в физиологических концентрациях представленный мономерной формой. Физиологически активный в кровотоке фактор VIII представляет собой гетеродимер, состоящий из легкой цепи (домены А3-С1-С2; молекулярная масса (ММ) 80 кДа) и различных вариантов тяжелой цепи (домены А1-А2-В; ММ 90-200 кДа). Легкая и тяжелая цепи фактора VIII удерживаются за счет координирования иона меди и стабилизируются в кровотоке шапероном - фактором фон Виллебрандта (vWF), выделяющимся клетками эндотелия сосудов. Двуцепочечная форма образуется в результате протелитического расщепления предшественника (Lenting P. J., J. А. van Mourik, et al. (1998). "The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function". Blood, 92(11): 3983-3996), гетерогенность длины тяжелых цепей обусловлена ограниченным протеолизом (С)-конца В-домена.
В терапии гемофилии применяются: 1) препараты природного фактора VIII, 2) препараты рекомбинантного полноразмерного фактора VIII, 3) препараты на основе рекомбинантного фактора VIII с делецией В-домена (BDD-rfVIII). Препараты природного фактора VIII традиционно получают из фракции криопреципитата пулированной донорской плазмы. В целом количество извлекаемого из плазмы донорской крови фактора VIII физически ограничено объемом полученной плазмы с учетом потерь фактора при получении криопреципитата и очистке и не может быть увеличено никакими методами. Необходимо отметить, что около четверти больных гемофилией А развивают так называемую ингибиторную форму болезни, то есть в их организме начинают вырабатываться антитела к фактору VIII, вследствие чего таким больным необходимо вводить большее количество фактора. Частота возникновения ингибиторной формы гемофилии значительно увеличилась за последние 20 лет, что, возможно, связано с использованием очищенного фактора VIII. Тем не менее необходимость вирусной инактивации природного фактора VIII не позволяет продолжать использовать неочищенный слабоиммуногенный криопреципитат. Естественным выходом из сложившейся ситуации было создание рекомбинантных (генно-инженерных) вариантов фактора VIII. Фактор VIII представляет собой полипептид (>200 кДа), имеющий множество разнообразных посттрансляционных модификаций и in vivo циркулирующий только в комплексе с шапероном - фактором фон Виллебрандта. Вследствие этого промышленно пригодные способы получения полноразмерного рекомбинантного фактора VIII были основаны на его экспрессии в животных клетках при одновременной коэкспресии моноклональных антител, стабилизирующих продукт в культуральной среде, либо коэкспресии фактора фон Виллебрандта, либо введении в культуральную среду белков плазмы человека. Последний способ фактически приводит к тому, что рекомбинантный фактор VIII обладает большинством недостатков природного.
На протяжении последних 20 лет в мире активно проводят исследования влияния мутаций на активность, стабильность и иммуногенность препаратов фактора VIII, целью которых было получить экспрессирующийся с большей продуктивностью и более стабильный в среде аналог природного фактора, сохраняющий прогоагулянтную активность и не иммуногенный. В основном работы сосредоточены в области удаления участка кДНК, кодирующего В-домен (D. D. Pittman, E. M. Alderman, et al. (1993). "Biochemical, immunological, and in vivo functional characterization of В-domain-deleted factor VIII". Blood, 81(11): 2925-2935). Наилучшие результаты по получению линий продуцентов делеционных форм фактора VIII с определенной аминокислотной последовательностью были получены исследовательским подразделением компании Pharmacia (Lind P., K. Larsson, et al. (1995). "Novel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIII molecules. Construction and biochemical characterization". Eur J Biochem, 232(1): 19-27).
На настоящий момент существует лишь одна одобренная для клинического использования мутантная форма - делеционный мутант фактора VIII, вариант SQ.
Известен способ создания эукариотических продуцентов рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена в клетках млекопитающих (патент США US 4868112). Он состоит в конструировании плазмиды, содержащей целевой ген и ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), трансфекции данной плазмиды, в клетки млекопитающих линий COS-1, CHO (DUKX-B11), получении колоний стабильно трансфицированных клеток и их селекции в среде, содержащей метотрексат. При использовании данного способа уровень секреции целевого белка в культуральную среду составляет 2 ЕД/мл/сутки при плотности клеток 1 млн/мл. При этом культивацию производят в присутствии сыворотки крупного рогатого скота, содержащей фактор фон Виллебрандта, плотно связывающийся с фактором VIII.
Способов получения продуцентов для промышленного производства целевого белка без использования белковых препаратов природного происхождения не известно.
Для увеличения уровня секреции продуцентов BDD-rfVIII известны различные способы, основой которых является оптимизация доменной структуры и аминокислотного состава целевого белка. Так, в патентах США US 6376463, US 7122634 помимо делетирования В-домена применяют внесение точечных мутаций в домены А и создание слитных белков на основе генов фактора VIII свиньи и человека. Данный способ имеет ограниченную практическую пригодность, поскольку, как и при использовании природного свиного фактора VIII для больных ингибиторной формой гемофилии А, присутствует риск развития вторичной резистентности к фактору VIII из-за иммуногенности препарата (Parker Е. Т., Н. N. Craddock, et al. (2004). "Comparative immunogenicity of recombinant В domain-deleted porcine factor VIII and Hyate:C in hemophilia A mice presensitized to human factor VIII". J Thromb Haemost, 2(4): 605-611).
Известен также способ увеличения продуктивности систем экспрессии, основанный на введении в геном культивируемых клеток бицистронных генетических конструкций с последующей амплификацией гена целевого белка (патент США US 6114146). Клетки линий 293 и SK-HEP1 трансфецируют плазмидой pCMVF/EDHPro, содержащей ген DHFR и искусственный ген фактора VIII с делецией В-домена, соединенные участком, содержащим сайт внутреннего связывания рибосомы (IRES). При последующем культивировании в присутствии увеличивающихся концентраций метотрексата получают клеточные линии-продуценты, секретирующие BDD-rfVIII в культуральную среду с уровнем от 0,1 до 3 ЕД/млн клеток в сутки. Однако получение продуцентов по предлагаемой способу требует использования эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в составе культуральной среды, что приводит к образованию плотного комплекса фактора VIII и бычьего фактора фон Виллебрандта.
Наиболее близким по технической реализации аналогом изобретения является описанная в патенте США US 6358703 гетерологическая система экспрессии, полученная трансфекцией бицистронного плазмидного вектора pCIS25DTR в клетки линии HKB11. Использование данного продуцента в масштабе 15-литрового перфузионного биореактора позволяет достичь суммарной продуктивности 4 млн МЕ/сутки, вероятный уровень продуктивности при стандартных параметрах культивирования клеток должен находиться в диапазоне 10-30 МЕ/млн клеток в сутки. Недостатком известного технического решения является использование гибридной линии клеток, полученной слиянием клеток линии 293 S и раковых клеток лимфомы Беркитта, культивируемых в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в составе культуральной среды. Сыворотка также применяется при селекции мастер-клона конечной линии продуцента и только при получении банка рабочих продуцентов производится ее замена на препараты фракционированной плазмы человека. Кроме того, применимость использования раковых клеток человека для создания клеточных линий продуцентов имеет ряд ограничений по соображениям безопасности (Yallop С.А., Р.L. Norby, et al. (2003). "Characterisation ofG418-induced metabolic load in recombinant CHO and BHK cells: effect on the activity and expression of central metabolic enzymes". Cytotechnology, 42(2): 87-99); патентная заявка США US 2006/0099685 A1, п.0058).
Технической задачей изобретения является создание высокопродуктивной и свободной от использования продуктов животного происхождения линии клеток яичника китайского хомячка для получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена для биофармацевтического производства.
Поставленная задача решается за счет создания экспрессионной плазмидной ДНК pOptivec/F8BDD, включающей область ДНК, последовательность которой приведена в SEQ ID 2, и кодирующей полипептид, приведенный в SEQ ID 1, содержащий последовательность фактора свертываемости крови VIII с делегированным В-доменом;
а также за счет создания линии клеток яичника китайского хомячка DG-OV-F8BDD-18, в геноме которой содержится последовательность плазмидной ДНК pOptivec/F8BDD, - продуцента рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делегированным В-доменом.
Технический результат заключается в повышении выхода целевого белка в культуральную среду определенного химического состава, то есть не содержащую продуктов животного или растительного происхождения или гидролизаты таких продуктов, и проведении работ по созданию линии-продуцента без использования продуктов животного происхождения, что позволяет минимизировать риск присутствия в продукте патогенных вирусов и прионов.
Экспрессионная плазмидная ДНК pOptivec/F8BDD состоит из фрагмента ДНК, длиной 6359 п.о., содержащего последовательность кДНК гена человеческого фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена SQ, и фрагмента 4382 п.о. плазмиды pOptivec, содержащего
- регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию фактора VIII: конститутивный промотор вируса CMV, последовательность Козак (сайт связывания рибосом), и сигнал полиаденилирования вируса простого герпеса (HSV);
- последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) - и регуляторные элементы для экспрессии DHFR - последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках и сигнал полиаденилирования;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллин и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli.
Плазмида pOptivec/F8BDD содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции - FspI (8918); MfeI (4940); PsiI (1039); PvuI (9065); RleAI (2281); SapI (7686); SnaBI (9995); SphI (3663); SwaI (3650). Имеет молекулярную массу 6,64 мДа. Плазмиду вводят в клетки СНО DG-44 методом липосомальной трансфекции (Straus S.E., T. Wilson, et al. (1981). "Transfection of KB cells by liposomes containing adenovirus type 2 DNA". J Virol, 39(1): 290-294), получают пул стабильно трансфицированных клеток при помощи культивирования в среде химически определенного состава, не содержащей гипоксантина и тимидина. Амплификацию кассеты в геноме клеток проводят путем последовательных культивирований в присутствии возрастающих концентраций метотрексата от 25 нМ до 500 нМ. Получают пул клеток, устойчивых к высокой концентрации метотрексата, и используют для клонирования методом предельного разведения. Полученные клоны клеток-продуцентов анализируют методом иммуноферментного анализа и отбирают клоны, дающие максимальный уровень экспрессии целевого белка. Среди них выбирают клон DG-OV-F8BDD-18, при культивировании которого в суспензионной форме в бессывороточной среде уровень секреции В-домен делетированного фактора свертываемости крови VIII в норме составляет не менее 500 МЕ/л. Особенности созданной плазмиды приведены на чертеже.
На чертеже показана схематическая карта pOptivec/F8BDD.
Обозначения
Стрелками → обозначены области, кодирующие полипептид фактора свертывания крови VIII (включая и не включая область лидерного пептида).
Курсивом обозначены характеристические сайты рестрикции, в скобках указана позиция разрезания. NotI - рестриктазы, фланкирующие область вставки фрагмента кДНК фактора VIII в материнский вектор pOptivec.
Ampicillin (bla) resistance gene - ген устойчивости к ампициллину.
blа promoter - бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину.
CMV Promoter - конститутивный эукариотический промотор цитомегаловируса.
Kozak - сайт связывания рибосом - последовательность Козак.
Start ATG - первый кодон рамки считывания полипептида фактора VIII.
polyA - область, соответствующая поли-А тракту кДНК фактора VIII.
ECMV IRES - сайт связывания рибосом - последовательность IRES энцефаломиокардита, обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках.
DHFR - последовательность фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR).
ТК polyA signal - сигнал полиаденилирования.
pUC origin - область начала репликации (ориджин) плазмид семейства pUC.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК pOptivec/F8BDD, кодирующей белок человеческого фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена, для трансфекции линии клеток CHO-DG-44.
В качестве акцепторной плазмиды для клонирования делеционного варианта гена BDD-rfVIII используют экспрессионный вектор pOptivec, ранее полученный в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ ГНЦ РАМН на основе коммерчески доступной линеаризованной плазмидной ДНК pOptivec-TOPO при инкубации в деионизованной воде 30 минут с последующим лигированием ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва), проводившемся в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli штамма DH5α, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляют 5 мкл лигазной смеси, инкубируют на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревают до 42°C на 60 секунд и инкубируют на льду 5 минут. После чего добавляют 800 мкл питательного бульона SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 250 мМ KCl, 10 мМ MgCl2) и инкубируют при 37°C 60 минут. После инкубации переносят суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещают в термостат на 37°C 18 часов. Отдельные клоны трансформантов инокулируют в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивают 18 часов при 37°C и проводят выделение плазмидной ДНК с использованием набора реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по стандартному протоколу фирмы-производителя.
В качестве матрицы для получения вставки используют плазмиду pCMV6-XL4/NM_000132 (Origene, США), содержащую полную последовательность полноразмерной кДНК fVIII, совпадающую с теоретически определенной кДНК fVIII, опубликованной в базе данных GenBank. Методом ПЦР со специфических праймеров O1KpnIfor (5'GCTGGTACCTCACAGAGAATATACA3'), O1Hindrev (5' GGAGAAGCTTCTTGGTTCAATG3'), O2Hindfor (5'CCAAGCTTCTCCCAAAACCC ACCAGTCTTGAAAC3'), O2Blprev (5'CTGCCCATGCTGAGCAGATAC3'), содержащих сайты узнавания специфических эндонуклеаз, получают два ПЦР-продукта F1 и F2, фланкирующие делегируемый участок кодирующий В-домен, общая длина которых не превышает полутора тысяч пар оснований, то есть при условии проведения амплификации смесью высокоточных полимераз - вероятность мутации будет минимальной. ПЦР-продукты клонируют в Т-вектор и определяют первичную нуклеотидную последовательность по обеим цепям. Для секвенирования 350 нг плазмидной ДНК смешивают с праймером (3,2 pmol) и упаривают пробы при 65°C. Секвенирование проводится с помощью набора реактивов ABI PRISMR BigDye™ Terminator v. 3.1, с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Анализ хроматограмм проводят при помощи программы Chromas v 2.13 или пакета VNT Suite.
Фрагмент F3, соответствующий N-концевому участку тяжелой цепи fVIII, получают без использования ПЦР, путем препаративной рестрикции плазмиды pCMV6-XL4/NM_000132 эндонуклеазами рестрикции NotI и KpnI. Продукты рестрикции разделяют в 1% агарозном геле, буферный раствор ТВЕ, с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации, визуализируют при помощи УФ-облучения, вырезают из агарозного геля, помещают в пробирку объемом 1,5 мл и проводят экстракцию ДНК, используя набор реактивов "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) согласно протоколу фирмы-производителя.
Сборку трех фрагментов F1, F2, F3 ведут в плазмидном векторе pAL-TA (Евроген, РФ), что обеспечивает ряд методических преимуществ по сравнению со сборкой в векторе большего размера.
Отбор позитивных клонов E.coli проводят методом ПЦР с клонов с использованием праймера Odelf (5'GCCACAACTCAGACTTTCG3') и стандартных праймеров к последовательности вектора: M13for и M13rev. Амплификацию проводят при помощи прибора "Терцик" (ДНК-технология, РФ) по следующей схеме: инкубационную смесь из расчета 25 мкл на одну реакцию (2,5 мкл 10х буферного раствора для Taq-полимеразы; по 10 пМ прямого и обратного праймера; по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; воды до 24 мкл). Полученную смесь разносят по пробиркам по 22 мкл, в каждую пробирку помещают кусочек парафина. Бактериальные колонии переносят петлей в пробирки и одновременно делают штрихи на свежей, размеченной чашке Петри с твердой питательной средой (которую затем помещают в воздушный термостат на 37°C). Помещают пробирки в прибор, проводят денатурацию при 94°C 3 мин, добавляют в остававшуюся инкубационную смесь по 0,5 ЕД Taq-полимеразы и разносят по пробиркам на последней минуте первого цикла денатурации. Проводят 25 циклов ПЦР (денатурация: 94°C 30 с, отжиг праймера Х=2°C × n (А/Т) + 4°C × n (Г/Ц) -5°C 30 с, элонгация 72°C 30-90 с). Продукты полимеразной цепной реакции анализируют электрофорезом в 1% агарозном геле. Для отобранных позитивных клонов проводят выделение плазмиды и ее секвенирование. После подтверждения корректности сборки фрагментов дают выбранной плазмиде обозначение pAL-TA/F123.
Переносят фрагмент NotI-NotI из плазмиды pCMV6-XL4/NM_000132 в плазмиду pOptivec, линеаризованную NotI при помощи процедур, изложенных выше. После подтверждения идентичности последовательности гена фактора VIII в составе полученной плазмиды pOptivec/F8 методом полного секвенирования обеих цепей в области вставки, фрагмент BlpI-BlpI в pOptivec/F8 заменяют на фрагмент BlpI-BlpI из pAL-TA/F123.
Для этого полученный искусственный фрагмент гена В-домен делетированного фактора VIII лигируют с рестрицированным по сайту BlpI и дефосфорилированным вектором pOptivec/F8 и продуктом лигирования трансформируют клетки E.coli штамма ТОР10. Первичный анализ полученных клонов ведут при помощи метода ПЦР с колоний с использованием праймеров 8sq4f (5'TGTATTTGATGAGAACCGAAGC3') и 8sq5r (5'GCCACTCTGAGCCCTGTT3') или CMVfor (Invitrogen, США) и 8sq15r (5'GAGTTCTTTGTTTCTGAGTGCC3'). Последовательность полученных плазмидных конструкций pOptivec/F8BDD верифицируют методом секвенирования по обеим цепям кодирующей области на протяжении всего вставленного участка. Данные определения первичной нуклеотидной последовательности области плазмиды, кодирующей рекомбинантный фактор VIII человека с делетированным В-доменом, полученные с прибора для автоматического капиллярного электрофореза, анализируют в приложении ContigExpress программного пакета VectorNTI Suite (Invitrogen, США). С использованием стандартного алгоритма проводят тримминг 5'-концевых и/или 3'-концевых областей фрагментов. После этого проводят сборку контига с использованием стандартных настроек. Проводят понуклеотидное сравнение полученной консенсусной последовательности с теоретически предсказанной последовательностью BDD-rfVIII, проверяют отсутствие нуклеотидных замен. Помимо кодирующей области, по аналогичному алгоритму проводят также секвенирование областей рестриктных сайтов, по которым производят клонирование фрагмента кДНК, а также области промотора CMV и участка внутреннего связывания рибосомы (IRES) экспрессионного вектора pOptivec, проверяют отсутствие точечных мутаций.
Полученная экспрессионная плазмидная ДНК pOptivec/F8BDD кодирует фактор свертываемости VIII человека с делетированным В-доменом, имеет размер 10741 пара нуклеотидных оснований и содержит уникальные сайты рестрикции FspI (8918); MfeI (4940); PsiI (1039); PvuI (9065); RleAI (2281); SapI (7686); SnaBI (9995); SphI (3663); SwaI (3650). Данная конструкция предназначена для конститутивной трансфекции эукариотических клеток геном фактора свертываемости VIII человека с делетированым В-доменом с последующим отбором и амплификацией по сцепленному признаку DHFR+.
Сообщает клеткам-реципиентам следующие фенотипические признаки: при трансформации прокариот - устойчивость к ампициллину; при трансфекции клеток эукариот - ограниченная устойчивость к метотрексату, увеличивающаяся при селективном отборе, потеря ауксотрофности по гипоксантину и тимидину, экспрессия белка BDD-rfVIII в ростовую среду.
Созданную плазмидную ДНК используют для получения линии-продуцента.
Пример 2. Получение клональной линии эукариотических продуцентов рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена DG-OV-F8BDD-18, производного линии клеток яичника китайского хомячка DG-44
Экспрессионную плазмидную ДНК pOptivec/F8BDD, кодирующую рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII с делецией В-домена, сконструированную по методке, приведенной в Примере 1, амплифицируют в клетках бактерий в препаративных количествах. Для этого клетки штамма E.coli ТОР10, трансформированные верифицированной плазмидной ДНК, культивируют в 0,5 л жидкой среды LB в течение 14 часов. Выделение плазмидной ДНК проводят методом щелочного лизиса бактерий набором для препаративного выделения ДНК (EndoFree Plasmid MaxiKit, Qaigen) no методике производителя. Концентрация высокоочищенной плазмидной ДНК, не содержащей пирогенов, составляет при этом 190 мкг/мл. Для проведения конститутивной трансфекции эукариотических клеток выделенной плазмидной ДНК ее дополнительно переводят в линейную форму, рестрицировав количественно эндонуклеазой PvuI, что приводит к разрушению гена бета-лактамазы (устойчивости к ампициллину). Затем плазмидную ДНК очищают от рестриктазы, осаждая 70% этанолом. Выделенную плазмиду, предназначенную для транзиентной трансфекции, рестрикции не подвергают. Полученные формы плазмиды растворяют в фосфатно-солевом буфере и стерилизуют при помощи фильтра 0,22 мкм.
Клетки линии СНО DG-44 (Invitrogen, США) получают от производителя в криопробирках по 1 мл, содержащих замороженную суспензию клеток плотностью приблизительно 10 млн клеток на мл в среде CD DG-44 (Gibco, США) с 10% диметилсульфоксида (DMSO). Содержимое сосуда размораживают при 37°C и добавляют к 30 мл полной среды CD DG-44. Полная среда состоит из CD DG-44, 8 мМ L-глутамина и 1,8 мл/л сурфактанта Pluronic F-68 (BASF Inc., США) и содержит достаточные для роста DHFR-отрицательных клеток количества гипоксантина и тимидина. Клетки культивируют в колбах Эрленмеера на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа, при температуре 37°C. Подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток проводят в счетной камере Горяева, при окрашивании трипановым синим. Субкультивируют с частотой 1 раз в 24-48 часов по достижении концентрации живых клеток 1,2 млн кл./мл. Для этого удаляют кондиционированную среду центрифугированием в течение 5 минут на скорости 1200 об/мин, ресуспендируют клеточный осадок свежей средой и распределяют в новые колбы Эрленмеера с отношением субкультивирования 1:6.
За 48 часов до трансфекции клетки высевают по описанной методике в количестве 9 млн клеток на 1 колбу. Из этих клеток за 24 часа до трансфекции также высевают 9 млн клеток на 1 колбу. В день трансфекции доля живых клеток должна составлять не менее 95%. Клетки в день трансфекции, не центрифугируя, разводят до конечной концентрации 0,5 млн кл./мл в среде DG-44 в колбах Эрленмеера. Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК растворяют в фосфатно-солевом растворе и используют для получения трансфекционной смеси.
Трансфекцию полученной плазмиды pOptivec/F8BDD в клетки линии СНО DG-44 проводят при помощи липосомного реагента FreeStyle MAX (Invitrogen) в бессывороточной среде OptiPro SFM (Invitrogen). Клетки в день трансфекции, не центрифугируя, разводят до конечной концентрации 0,5 млн кл./мл в среде DG-44 в колбах Эрленмеера. Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК растворяют в PBS буфере и используют для получения трансфекционной смеси, содержащей 18 мкг плазмидной ДНК, 15 мкл трансфекционного агента.
Плазмидная ДНК, используемая для трансфекции, представляет собой смешанные в соотношении 20:1 по массе плазмиды pOptivec/F8BDD, линеаризованную эндонуклеазой рестрикции PvuI, и сверхспирализованную контрольную плазмиду pEGFP (Clontech, США). Трансфекционную смесь осторожно перемешивают и инкубируют от 10 до 20 минут, а затем осторожно добавляют во вращающуюся колбу, содержащую клетки СНО DG-44, в указанном выше количестве. Экспрессируемый в трансфицированных клетках флуоресцентный белок используется для оценки эффективности трансфекции. Для этого через 12 часов после трансфекции в пробе клеток определяют долю флуоресцирующих при анализе с помощью пары оптических фильтров EGFP. Полученное соотношение характеризует интенсивность транзиентной экспрессии в трансфицированных клетках.
Для отбора стабильных трансформантов с включением в хромосомную последовательность плазмидной ДНК pOptivec/F8BDD трансфицированные клетки СНО DG-44 пересаживают в среду CD OptiCHO (Invitrogen), не содержащую гипоксантин и тимидин, и культивируют по следующей методике.
Проводят подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток в счетной камере Горяева при окрашивании трипановым синим. Затем удаляют старую среду центрифугированием в течение 5 минут на скорости 1200 об/мин, ресуспендируют клеточный осадок свежей средой CD OptiCHO (Invitrogen), с добавлением L-глутамина в конечной концентрации 8 мМ, и распределяют в новые колбы Эрленмеера по 9×106 клеток на колбу. Клетки культивируют в колбах Эрленмеера на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа, при температуре 37°C. Субкультивируют с частотой 1 раз в 2 дня в течение 10-14 дней до достижения доли живых клеток более 90%. По достижении доли живых клеток 90% и более замораживают промежуточный клеточный банк с образцами, содержащими по 107 клеток в 1 мл среды CD OptiCHO с добавлением 10% DMSO. Полученный по приведенной методике пул трансфицированных клеток в форме суспензионной культуры обогащают путем культивации в ростовой среде, не содержащей гипоксантина и тимидина, в течение 14 дней.
Для амплификации целевого гена BDD-rfVIII проводят селекционное культивирование в присутствии нарастающих доз метотрексата путем последовательных пассажей в ростовой среде, дополнительно содержащей 50, 100, 250, 500 нМ метотрексата. Для этого образцы из промежуточного банка размораживают по описанному выше протоколу, с теми изменениями, что в качестве культивационной среды используется CD OptiCHO (Invitrogen), с добавлением L-глутамина в конечной концентрации 8 мМ. Затем в культивационную среду добавляют метотрексат в диапазоне концентраций от 50 нМ до 500 нМ с удвоением рабочей концентрации метотрексата на каждом шаге амплификации. Переход к следующему шагу амплификации осуществляют каждые 14-21 день по достижении доли живых клеток более 90%.
Обогащенную культуру трансфицированных клеток используют для создания первичного криобанка и для получения клонов трансфицированных клеток.
На каждом шаге амплификации уровень экспрессии целевого белка в культуре клеток определяют иммуноферментным анализом. Клетки продуценты последнего шага амплификации клонируются методом предельных разведений, в расчете конечной концентрации 2 клетки на лунку в условиях адгерентной культивации.
Получают 22 жизнеспособных клона клеток, секретирующих В-домен делегированный фактор свертываемости крови VIII человека в ростовую среду. Среди них отбирают 4 клона, дающих наибольшую концентрацию рекомбинантного белка в пересчете на число клеток в лунке.
Отобранные клоны культивируют в течение четырех последовательных пассажей и подвергают криопрезервации для создания мастер-банка клеток-продуцентов. Затем эти клоны реадаптируют к суспензионному культивированию еще в течение трех пассажей для получения кондиционированной ростовой среды, содержащей целевой белок. Для отобранных клонов проводят анализ контаминации микоплазмой, проверяют, что ни один из клонов не содержит ДНК микоплазмы.
Измерение концентрации рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена в кондиционированной ростовой среде, проведенное при помощи ИФА, показало, что продуктивность гетерологической системы экспрессии, созданной на основе наилучшего клона, составляет около 0,5 ЕД/млн клеток/сутки. Продуктивность системы была приблизительно постоянна в течение трех последовательных пассажей, что указывает на стабильность всех или большинства геномных копий ДНК BDD-rfVIII. Выбранный клон (код DG-OV-F8BDD-18) последовательно культивируют в 3, 15, 100 и 200 мл ростовой среды CD OptiCHO до достижения клеточной плотности 3 млн/мл. Культивирование в объеме ростовой среды дополнительно проводят в течение 3 дней, ежедневно добавляя глютамин до 4 мМ и глюкозу до 3 мМ.
Кондиционированную ростовую среду отделяют от клеточной массы, концентрируют, обессоливают и замораживают. Содержание целевого рекомбинантного белка определяют при помощи ИФА. Было показано, что концентрация целевого белка составляет не менее 500 ЕД/л/сутки при концентрации клеток в с суспензии 1 млн/мл. При проведении всех работ не используются материалы животного происхождения, что позволяет избежать контаминации создаваемой линии клеток вирусами животных, включая не охарактеризованные на настоящий момент, и прионами. Созданная линия клеток получена на основе широко распространенной в биофармацевтической промышленности линии СНО DG-44 и обеспечивает максимально возможную вирусную и прионную безопасность продукта.
Claims (2)
1. Плазмидная ДНК pOptivec/F8BDD, имеющая молекулярную массу 6,64 мДа и уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции - FspI (8918); MfeI (4940); PsiI (1039); PvuI (9065); RleAI (2281); SapI (7686); SnaBI (9995); SphI (3663); SwaI (3650); состоящая из фрагмента ДНК с SEQ ID NO:2 длиной 6359 п.о., содержащего последовательность кДНК гена человеческого фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO:1, и фрагмента 4382 п.о. плазмиды pOptivec, содержащего:
- регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию гена фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена: конститутивный промотор вируса CMV, последовательность Козак (сайт связывания рибосом) и сигнал полиаденилирования вируса простого герпеса (HSV);
- последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) и регуляторные элементы для экспрессии DHFR - последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках и сигнал полиаденилирования;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллин и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli;
- регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию гена фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена: конститутивный промотор вируса CMV, последовательность Козак (сайт связывания рибосом) и сигнал полиаденилирования вируса простого герпеса (HSV);
- последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) и регуляторные элементы для экспрессии DHFR - последовательность IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках и сигнал полиаденилирования;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллин и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli;
2. Линия клеток яичника китайского хомячка DG-OV-F8BDD-18 - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делегированным В-доменом, обладающая продуктивностью 0,5 ЕД/млн клеток/сутки, полученная путем липосомальной трансфекции клеток яичника китайского хомячка линии СНО DG-44 плазмидой по п.1 и последующего селективного культивирования в присутствии возрастающих концентраций метотрексата от 25 до 500 нМ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009139151/10A RU2429294C2 (ru) | 2009-10-23 | 2009-10-23 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009139151/10A RU2429294C2 (ru) | 2009-10-23 | 2009-10-23 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009139151A RU2009139151A (ru) | 2011-04-27 |
| RU2429294C2 true RU2429294C2 (ru) | 2011-09-20 |
Family
ID=44731333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009139151/10A RU2429294C2 (ru) | 2009-10-23 | 2009-10-23 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2429294C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2561466C2 (ru) * | 2013-05-22 | 2015-08-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2500818C1 (ru) * | 2012-07-19 | 2013-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII |
-
2009
- 2009-10-23 RU RU2009139151/10A patent/RU2429294C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КОВНИР С.В. и др. Оптимизация экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII в стабильной линии животных клеток-продуцентов. - Цитология, 2008, т.50, №9, с.808. ВОРОБЬЕВ И.И. и др. Методы получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII. Тезисы конференции GNZ-2008, материалы найдены в Интернет 08.07.2010 по адресу: http://www.lmbt.ru/#publications Инструкция к набору pOptiVEC TOPO ТА Cloning Kit от 27.11.2006, с.1-27. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2561466C2 (ru) * | 2013-05-22 | 2015-08-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009139151A (ru) | 2011-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7817312B2 (ja) | 改変された幹細胞メモリーｔ細胞、その作製方法およびその使用方法 | |
| AU2022200903B2 (en) | Engineered Cascade components and Cascade complexes | |
| JP5162635B2 (ja) | 高レベルエキスプレッサー第ｖｉｉｉ因子ポリペプチドをコードする核酸配列およびアミノ酸配列および使用方法 | |
| JP2025028917A (ja) | 核酸構築物及び使用方法 | |
| JP2019058173A (ja) | ヒト細胞系における組換えヒトタンパク質の無血清安定トランスフェクションおよび製造 | |
| SK286945B6 (sk) | Expresný systém faktora VIII | |
| EP2976422B1 (en) | Co-expression of factor viii and von willebrand factor | |
| US11390652B2 (en) | Transcriptional regulatory fusion polypeptide | |
| JP2005518783A5 (ru) | ||
| AU2002337901A1 (en) | Nucleic acid and amino acid sequences encoding high-level expressor factor VIII polypeptides and methods of use | |
| KR20130086035A (ko) | 장기 지속형 약물 제형 | |
| CN115427558A (zh) | 用于高效且特异性基因组编辑的位点-特异性重组酶的融合物 | |
| Herlitschka et al. | High expression of a B-domain deleted factor VIII gene in a human hepatic cell line | |
| RU2561466C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора | |
| JP4804356B2 (ja) | 第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体の高発現レベルのための改変されたｃＤＮＡ | |
| CN114703142A (zh) | 一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途 | |
| RU2469093C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА | |
| JP4372684B2 (ja) | 標的核酸への変異の導入方法 | |
| CN113981027A (zh) | 制备治疗性蛋白质的方法 | |
| CN118638763B (zh) | 具有提高的稳定性的Cas9蛋白、试剂盒及提高Cas9蛋白稳定性的方法 | |
| JP2022518200A (ja) | 非抗生物質選択マーカーとしてのβ－ガラクトシダーゼαペプチド及びその使用 | |
| RU2827658C2 (ru) | Сконструированные компоненты cascade и комплексы cascade | |
| HK40068105A (en) | Methods of manufacturing therapeutic proteins | |
| RU2500818C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII | |
| Kenny | Towards a mouse model for haemophilia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161024 |