RU2380413C1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 6G2 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БЕЛКУ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к белку теплового шока 70 (БТШ 70). Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c бычьим БТШ 70 в течение 78 суток. На третьи сутки проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 Ag/8-653 (10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 4000 (Merk, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы. Гибридома 6G2 депонирована в коллекции микроорганизмов ГНТТ ПМБ под номером Н-2. МКА, продуцируемые гибридомой по изобретению, более выраженно выявляют как экспрессию БТШ 70 на поверхности клеток, так и изменение уровня внутриклеточного БТШ 70 при воздействии стрессовых факторов (теплового шока). 4 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к белку теплового шока 70 (БТШ 70).

Белки теплового шока играют важную роль для обеспечения гомеостаза организма на всех стадиях его развития и в экстремальных для него условиях, таких, как воздействие стресса отравляющих и наркотических веществ, радиации, сублетальной температуры и других.

В настоящее время достаточно подробно изучены основные функции внутриклеточных БТШ, связанные с участием этих молекул в процессах синтеза, фолдинга, транспорта, репорации внутриклеточных протеинов (шаперонные функции) [1] и важной ролью БТШ в системе защиты клеток от повреждающих воздействий (протективные функции) [2]. Зарегистрирована поверхностная локализация БТШ у ряда линий опухолевых клеток, у вирус - инфецированных лимфоцитов, у активированных макрофагов и Т-лимфоцитов [3], а также обнаружено существование свободного БТШ в межклеточном пространстве [4]. На основе иммуноадъювантных свойств БТШ интенсивно ведутся исследования по разработке вакцин для иммунотерапии злокачественных опухолей [5, 6].

Одним из важных подходов определения БТШ 70 в биологических организмах является использование МКА, продуцируемых гибридомами.

Известно, любая белковая структура несет на своей поверхности определенное количество эпитопов, в том числе и структурных. Как правило, чем выше молекулярный вес белка, тем больше эпитопов. Они имеют разную иммуногенность и определяют уникальность той или иной белковой молекулы в осуществлении ее функциональных свойств. Поэтому, чем больше панель гибридом, антитела каждой из них работают только с одним из эпитопов белка, тем больше инструментов для исследования этих свойств. Следовательно, получение новых гибридом всегда актуально. Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, используются как важный инструмент для выявления основных структурно-функциональных свойств белков, в том числе и БТШ 70.

За рубежом некоторые фирмы, например, Sigma, Cayman chemical, Biocompare (США), StressGen (Канада), HyTest (Финляндия) продают моноклональные антитела к БТШ 70 [7].

Известен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BRM 22 (фирма Sigma, США), продуцирующий МКА к БТШ 70. Коммерческие МКА, продуцируемые гибридомой BRM 22, не выявляют при непрямом иммунофлуоресцентном анализе (например, клетки лимфомы EL-4) различные пулы живых клеток, что ограничивает их использование для определения БТШ 70 при воздействии стрессовых факторов на субпопуляции живых клеток [8].

Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к БТШ 70 и пригодные для определения БТШ 70 при воздействии стрессовых факторов.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 6G2 - продуцент моноклональных антител к БТШ 70.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ МПБ) коллекционный номер - H2.

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c N-концевым фрагментом БТШ 70 в течение 78 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 Ag/8-653 (10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 4000 (Меrk, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.

Характеристика гибридомы 6G2.

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы 6G2 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда DMEM или RPMI - 1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 10⁵ на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 10⁶ на одну мышь при первичном введении и 10⁵ на одну мышь при вторичном введении из иммуноасцитной жидкости. За 14 суток до введения клеток гибридомы, мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл 2, 6, 10, 14-тетраметиленпентадекана (пристана). Иммуноасцитическая жидкость образуется на 14-20 сутки в объеме 3-5 мл. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).

Характеристика полезного продукта. Гибридома 6G2 продуцирует специфичные моноклональные антитела к БТШ 70, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:1000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:100000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяют с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок А или G сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 2-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения).

Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микроплазмы не определяли.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°С и затем опускают в жидкий азот.

Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°С. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 65-75%.

Свойства полезного продукта. Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgGl подклассу иммуноглобулинов мыши. МКА специфичны к БТШ 70 быка и человека (с другими видами животных и микроорганизмами не проверялись).

Пример 1. Получение гибридомы.

Иммунизацация

Мышей линии BALB/c иммунизируют препаратом N-концевого фрагмента БТШ 70 быка по схеме:

- подкожное введение мышам 100 мкг N-концевого фрагмента БТШ 70 в несколько точек в полном адъюванте Фрейнда;

- через 28 суток повторное введение мышам 100 мкг N-концевого фрагмента БТШ 70 в несколько точек в неполном адъюванте Фрейнда;

- через 28 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг N-концевого фрагмента БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 14 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг N-концевого фрагмента БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 7 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг N-концевого фрагмента БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 7 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг N-концевого фрагмента БТШ 70 в физиологическом растворе.

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после инъекции N-концевого фрагмента БТШ 70 согласно Animal protocol №P 02-19, стр.7. Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.

Гибридизация

Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 10⁸ спленоцитов мыши с 10⁷ клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000 (Merk, Германия) в течение 1 минуты.

Селекция

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде DMEM "Sigma" с 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Скрининг гибридных клонов

Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 нг N-концевого фрагмента БТШ 70 и БТШ 70, приготовленного на 0,01 М карбонатном буфере pН 9,6 в объеме 100 мкл, и затем выдерживают при температуре 6°С в течение 16 ч. Лунки планшета отмывают забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Тв). Вносят в лунки по 100 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°С в течение 45 мин. Три раза отмывают ЗФР-Тв и вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл. Панель инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ЗФР-Тв и добавляют в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 40 минут, затем 5 раз отмывают лунки раствором ЗФР-Тв. Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания продукта хромогена - ортофениплендиамина (4 мкл 30% Н₂O₂ и 4 мг ортофенилендиамина на 100 мл 0,1 М натрий цитратного буфера pН 5,0). Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 8N серной кислоты. Планшеты сканируют на планшетном ридере Пикон (Россия), измеряя поглощение при 492 нм.

Клонирование

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 10⁴ клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.

Культивирование

Культивирование клонов гибридомы ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Криоконсервация

Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.

Проверка специфичности МКА.

Пример 2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ.

Для проведения твердофазного ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят N-концевой фрагмент БТШ 70 и БТШ 70 в разведениях от 100 нг до 1 нг, приготовленных на 0,01 М карбонатном буфере (pН 9,6) в объеме 100 мкл и выдерживают при температуре 6°С в течение 16 часов. Последующие стадии анализа проводят аналогично стадиям, описанным для скрининга гибридных клонов.

Моноклональные антитела вносят в лунки в концентрации 100 нг/мл.

Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.

В непрямом твердофазном ИФА моноклональные антитела гибридомы 6G2 специфически взаимодействуют с БТШ 70 и определяют до 3 нг белка в анализируемом образце (фиг.1).

Пример 3. Иммуноблот.

Для проверки специфичности МКА гибридомы 6G2 к БТШ 70 проводят СДС-электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 2 часов при 220 В, 20 мА. Белки из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-P) в течение 1 час при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в 20 мМ трис-буфер, pН 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран и разведения белков использовали 20 мМ трис-буфер, pН 7,4, содержащий 150 мМ NaCl и 0,5% твин 20. Блокированные и промытые мембраны разрезают на полосы и инкубируют каждую полосу отдельно в растворах МКА гибридомы 6G2 и МКА BRM 22 концентрациях 1 мкг/мл в течение 1 часа при температуре 37°С. Далее, после промывки буфером, полоски обрабатывают раствором антимышиных антител конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают буфером и окрашивают диаминобензидином с использованием 0,5 мг/мл 3.3'-диаминобензидина с 0,1 мг/мл NiCl₂, 0,1 мг/мл СoСl₂, 0.03% Н₂O₂ в ЗФР pН 7,2. Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 6G2, взаимодействуют с БТШ 70 в иммуноблоте и выявляют те же белковые полосы, что и коммерческие МКА BRM 22 (фиг.2).

Пример 4. Дот-блот.

Дот-блот проводят на нитроцеллюлозной мембране (Hybond-P). Посадочная доза для БТШ 70 и его фрагментов составляет 50 нг в точку диаметром 2 мм. Нитроцеллюлозную мембрану блокируют в 1% растворе БСА в ЗФР в течение 1 часа при комнатной температуре, погружают в раствор МКА гибридомы 6G2 в концентрации 1 мкг/мл в ЗФР-Тв, инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С и промывают ЗФР-Тв. Затем мембраны помещают в раствор пероксидазного конъюгата (Sigma) в ЗФР-Тв в рабочем разведении на 1 час при температуре 37°С и промывают ЗФР-Тв. В качестве субстрата для пероксидазы хрена используют раствор диаминобензидина (0,5 мг/мл 3.3'-диаминобензидина с 0,1 мг/мл NiCl₂, 0,1 мг/мл СоСl₂, 0.03% Н₂О₂) в ЗФР pН 7,2. Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Отрицательный контроль - мембраны, обработанные сывороткой интактной мыши в разведении 1/1000. Положительный контроль - мембраны, обработанные сывороткой иммунной мыши в разведении 1/1000.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 6G2, специфически взаимодействуют в дот-блоте с цельным БТШ 70 и его N-концевым фрагментом (aal-437) и не взаимодействуют с его С-концевым фрагментом (аа386-641) (фиг.3).

Пример 5. Цитометрическое тестирование МКА.

Измерение уровня экспрессии поверхностных БТШ 70 производят методом проточной цитометрии после непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток с использованием тестируемых моноклональных антител к БТШ 70 (2Е4, BRM 22 - «первые» антитела, титр 1:500) и «вторых» антител - конъюгат антител против Fab фрагментов мышиных IgG с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) ("Sigma", США) в рабочем разведении. Для этого клетки после центрифугирования при 200g в течение 10 минут переводят в ЗФР, содержащий 0,1% NaN₃ и 0,5% BSA, и инкубируют в течение 30 мин при температуре 4°С c первыми антителами. Затем клетки дважды отмывают ЗФР с использованием центрифугирования при 200g в течение 10 мин и инкубируют в течение 30 мин при 4°С со вторыми антителами. После инкубации клетки опять дважды отмывают в ЗФР центрифугированием в том же режиме. Окрашенные образцы анализируют на проточном цитофлуориметре (EPICS XL, "Coulter Corporation", США). В каждом образце проводят измерение уровня флуоресценции не менее 10000 клеток.

На фиг.4 представлены результаты сравнительного цитометрического тестирования полученных моноклональных антител гибридомы 6G2 и коммерческих антител BRM 22 в модели их взаимодействия с БТШ 70, присутствующим на поверхности клеток лимфомы EL-4. В качестве контролей используют типичное распределение клеток EL-4 по параметрам переднего (FS) и бокового (SS) светорассеяния, выявляющее пулы живых и апоптозных клеток (фиг.4, А); контроль аутофлуоресценции (фиг.4, Б) и контроль окрашивания вторыми, ФИТЦ-меченными антителами (фиг.4, В).

Коммерческие МКА BRM 22 связываются преимущественно с пулом апоптозных клеток и лишь незначительно взаимодействовуют с поверхностью живых клеток (фиг.4, Г). Моноклональные антитела 6G2 окрашивают пулы апоптозных и живых клеток. Однако у живых клеток они обнаруживают три субпопуляции, характеризующиеся различным уровнем экспрессии поверхностных БТШ70 (фиг.4, Д).

Пример 6. Определение БТШ 70 при воздействии теплового шока.

Суспензию живых клеток лимфомы EL-4 инкубировали в течение 10 мин при температуре 43°С c последующим непрямым иммунофлуоресцентным окрашиванием внутриклеточных БТШ 70 с использованием МКА BRM 22 и МКА гибридомы 6G2. В качестве контроля используют клетки EL-4 без воздействия теплового шока.

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток EL-4 для оценки внутриклеточного содержания БТШ 70 осуществляют по описанному в примере 5 протоколу. Однако перед окрашиванием проводят префиксацию клеток и перфорирование их плазматических мембран для обеспечения проникновения антител во внутриклеточное пространство. Для фиксации к клеткам добавляют 2% раствор параформальдегида в ЗФР и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре и дважды отмывают ЗФР. Для перфорирования плазматических мембран клетки обрабатывают 0,5% раствором Triton-X100 в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого клетки дважды отмывают ЗФР, переводят в раствор ЗФР и проводят процедуру непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Полученные образцы анализируют на проточном цитофлуориметре (EPICS XL, "Coulter Corporation", США). В каждом образце проводят измерение уровня флуоресценции не менее 10000 клеток.

В таблице представлены результаты, полученные при использовании различных антител для проточно-цитометрического анализа изменения содержания БТШ 70 в клетках EL-4, подвергнутых тепловому шоку.

Таблица Результаты проточно-цитометрического анализа изменения содержания БТШ 70 в клетках EL-4, подвергнутых тепловому шоку, с помощью МКА
МКА	Относительный уровень флуоресценции клеток EL-4
	Контроль	Тепловой шок	% изменения
BRM 22	48,5	73,2	+50,9%
6G2	51,6	92,8	+79,8%

Из таблицы видно, что МКА гибридомы 6G2 дают более высокий уровень флуоресценции по сравнению с МКА BRM 22 как в контрольных клетках, так и в клетках, подвергнутых тепловому шоку. Кроме того, зарегистрированные протестированными МКА эффекты гипертермии различаются по величине. Тепловой шок приводит не только к усилению синтеза БТШ 70, но и к существенным изменениям его состояния и конформации. В частности, такое воздействие может вызывать образование прочных комплексов БТШ 70 с другими внутриклеточными протеинами и их агрегацию, что отражается на детектируемом МКА уровне БТШ 70. Моноклональные антитела гибридомы 6G2 выявляют более высокий процент увеличения синтеза БТШ 70 в клетке, чем МКА BRM 22, что позволяет получить более полную картину количественного изменения синтеза этого белка в ответ на воздействие теплового шока.

Преимущество гибридомы 6G2 по сравнению с гибридомой BRM 22 заключается в том, что ее МКА более выраженно выявляют как экспрессию БТШ 70 на поверхности клеток, так и изменение уровня внутриклеточного БТШ 70 при воздействии теплового шока (стрессовый фактор). Кроме того, использование ее МКА открывает перспективу анализа субпопуляций живых клеток с различным уровнем экспрессии поверхностных БТШ 70.

Моноклональные антитела гибридомы 6G2 специфичны к БТШ 70.

Эти свойства гибридомы 6G2, а также взаимодействие ее МКА с целым БТШ 70 и с его N-концевым фрагментом свидетельствует о возможности использования МКА как компонента тест-систем для определения БТШ 70.

Список литературы

1. Craig Е.А., Weissman J.S., Horwich A.L. Heat shock proteins and molecular chaperones: mediators of protein conformation and turnover in the cell // Cell - 1994. - Vol.78. - P.365-372.

2. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins // Annu. Rev. Genet. - 1993. - Vol.27. - P.437-496.

3. Multhoff G. and Hightower L.E. Cell surface expression of heat shock proteins and the immune response. // Cell Stress & Chaperones - 1996. - Vol.1. - P.167-176.

4. Hightower L.E., Guidon P.T. Selective release from cultured mammalian cells of heat-shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins. //J. Cell. Physiol. - 1989. - Vol.138, - P.257-266.

5. Udono H. and Srivatstava P.K. Heat shok protein 70-associated peptides elicit specific cancer immunity // J. Exp.Med. - 1993. - Vol.178. - P.1391-1396.

6. Li Y., Yang G., Repasky E., Wang X.-Y. Generation of anti-tumor immunity using mammalian heat shok protein 70 DNA vaccines for cancer immunotherapy // Vaccine - 2006. - Vol.24. - P.5360-5370.

7. /www.caymanchem.com, www.biocompare.com, www.stressgen.ru, www.abcam.com. /

8. Sapozhnikov A.M., Ponomarev E.D., Tarasenko T.N. and Telford G.W. Spontaneous apoptosis and expression of cell surface heat shock proteins in cultured EL-4 lymphoma cells // Cell proliferation - 1999. - Vol.32. - P.363-378.

Claims (1)

1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 6G2 - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку теплового шока 70, депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНТТ ПМБ), коллекционный номер Н-2.

Images