RU2352134C1

RU2352134C1 - Способ получения гидролизата из молок лососевых рыб

Info

Publication number: RU2352134C1
Application number: RU2008103108/13A
Authority: RU
Inventors: Людмила Дмитриевна Тимченко (RU); Людмила Дмитриевна Тимченко; Инна Николаевна Ткаченко (RU); Инна Николаевна Ткаченко; Игорь Владимирович Ржепаковский (RU); Игорь Владимирович Ржепаковский; Валерий Николаевич Вакулин (RU); Валерий Николаевич Вакулин
Priority date: 2008-01-28
Filing date: 2008-01-28
Publication date: 2009-04-20

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения гидролизата. Способ включает приготовление белоксодержащей массы, смешивание ее с водой, нагревание при рН 7,6-8,0, добавление хлороформа и фильтрование. В качестве белоксодержащей массы используют молоки лососевых рыб. Смешивание с водой проводят в соотношении 1:2. После нагревания бульон охлаждают до 48-50°С, подщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,2 по фенолфталеину, смешивают с биомассой и добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) и 2% хлороформа. Затем помещают в термокамеру при температуре 35-37°С, выдерживают в течение 4-5 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 12-15 минут в течение 4-5 минут, а в последующие дни через каждые 2 часа в течение 4-5 минут, затем на шестые сутки добавляют пепсин, перемешивают и выдерживают в термокамере в течение 9-10 дней при температуре 35-37°С, регулярно помешивая и измеряя уровень аминного азота. После окончания переваривания добавляют раствор 1 н. HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 9-10 минут. Полученный гидролизат нейтрализуют 20% раствором NaOH до рН 7,0, добавляют 2% хлороформа с последующим хранением при температуре 2-8°С. Изобретение позволяет снизить себестоимость и повысит качество гидролизата. 2 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения гидролизата из молок лососевых рыб, и может быть использовано как биологически активная составная часть пищевых добавок и питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Уровень техники

Известен способ получения гидролизата следующего состава, г/л: говяжье или конское мясо очищают от жира и сухожилий, нарезают кусочками или полосками в толщину пальца. Кладут в кипящую воду из расчета 2 л воды на 1 кг мяса; кипятят в течение 5 минут. Мясо вылавливают и пропускают через мясорубку. Смешивают фарш с жидкостью и остужают до 45°С, после чего смесь помещают в бутыль с плотной резиновой пробкой, куда добавляют 5-10 г панкреатина или 40-80 г поджелудочной железы (в зависимости от того, какую степень расщепления хотят получить) (см. Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. / Ю.А.Козлов, 1950. - С.51).

Недостатком данного гидролизата является высокая себестоимость.

Известна питательная среда для культивирования клеток эукариотов, включающая сыворотку крови крупного рогатого скота и раствора Хенкса, при этом она дополнительно содержит протеолитический гидролизат отходов рыболовных промыслов, полученный путем протеолитического гидролиза отходов тушек промысловых рыб, измельченных совместно с кишечником в щелочной среде, при следующем соотношении компонентов, об.:

Протеолитический гидролизат
отходов рыбных промыслов	0,15-0,20
Сыворотка крови крупного рогатого скота	5-10
Раствор Хенкса	Остальное

Известен способ получения основы питательной среды протеолитического гидролизата для культивирования клеток эукариотов, предусматривающий протеолитический гидролиз отходов рыболовных промыслов в щелочной среде, температурную инактивацию, фильтрование и высушивание, при этом в качестве отходов рыболовных промыслов используют отходы тушек промысловых рыб, которые измельчают совместно с кишечником, затем смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1 1, гидролиз ведут при температуре 40-42°С до массовой доли аминного азота 5,5-6,5% и массовой доли свободных аминокислот 50-60% температурную инактивацию проводят в изоэлектрической точке (см. пат. RU №2103360, МПК C12N 5/00, A23J 3/30, опубл. 27.01.1998 г.).

Недостатком данного способа и питательной среды является сложность технологии получения гидролизата, высокая себестоимость конечного продукта - основы питательной среды.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб, включающий приготовление белоксодержащей массы, гидролиз путем подщелачивания и нагрева с одновременным перемешиванием, подкисление полученной биомассы, при этом белоксодержащую массу готовят из внутренностей рыб или путем смешивания внутренностей рыб и тушек рыб, а гидролиз массы проводят непосредственно или смешивая ее с водой при температуре 50-55°С в течение 3-6 ч, при этом подщелачивают белоксодержащую массу гидроокисью кальция до рН 8,5-8,8, а подкисляют полученную биомассу до рН 3,2-3,5 ортофосфорной кислотой и проводят декантацию жира.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб смешивают внутренности рыб и тушки рыб в соотношении 1:2.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб после декантации жира из полученной смеси отделяют нерастворимый осадок, при этом если гидролиз массы проводят непосредственно, то перед отделением массу предварительно перемешивают с равным объемом очищенной воды.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб после отделения нерастворимого осадка проводят осветление раствора путем подщелачивания его до значений рН 7,2-7,5 гидроокисью кальция, нагрева до температуры 80-90°С в течение 15-30 мин.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб осветленный раствор концентрируют.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб осветленный раствор после концентрирования подвергают высушиванию.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб перед высушиванием в раствор добавляют пищевые волокна, а затем высушенную массу измельчают.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб после концентрации раствора или после его высушивания производят дополнительную очистку продукта путем хроматографии.

В способе получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб хроматографию проводят при рН 4,1-4,5, фильтруя продукт через хроматографический носитель при комнатной температуре (см. пат. RU №2262859, МПК A23J 1/04, A23L 3/30, A23K 1/10, опубл. 27.02.2005 г.).

Недостатком данного способа является сложность получения гидролизата, высокая себестоимость.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения гидролизата из молок лососевых рыб, обладающего упрощением технологии получения, снижением себестоимости и повышением качества гидролизата.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к упрощению технологии получения гидролизата, снижению себестоимости и повышению качества.

Технический результат достигается с помощью способа получения гидролизата из молок лососевых рыб, включающего приготовление белоксодержащей массы, смешивание ее с водой, нагревание при рН 7,6-8,0 добавление хлороформа, фильтрование, при этом в качестве белоксодержащей массы используют молоки лососевых рыб, смешивание с водой проводят в соотношении 1:2, а после нагревания бульон охлаждают до 48-50°С, подщелачивают Na₂СО₃ до рН 8,2 по фенолфталеину, смешивают с биомассой и добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) и 2% хлороформа, затем емкость помещают в термокамеру при температуре 35-37°С, выдерживают в течение 4-5 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 12-15 минут в течение 4-5 минут, а в последующие дни через каждые 2 часа в течение 4-5 минут, затем на шестые сутки добавляют пепсин, перемешивают и выдерживают в термокамере в течение 9-10 дней при температуре 35-37°С, регулярно помешивая и измеряя уровень аминного азота, причем после окончания переваривания добавляют раствор 1 н. HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 9-10 минут, затем полученный гидролизат нейтрализуют 20% раствором NaOH до рН 7,0, добавляют 2% хлороформа с последующим хранением при температуре 2-8°С.

Сущность способа получения гидролизата из молок лососевых рыб.

Приготовление гидролизата из молок лососевых рыб заключается в следующем. Молоки лосевых рыб в количестве 0,5 кг режут на кусочки размером 2×3 см, заливают 1,0 л водопроводной воды, при помешивании нагревают до закипания, варят в течение 10 мин. Сваренные молоки встряхивают дуршлагом, остывшие молоки измельчают на мясорубке. Бульон охлаждают до 48-50°С, подщелачивают Na₂СО₃ до рН 8,2 по фенолфталеину. Фарш молок лососевых рыб помещают в емкость, заливают готовым остывшим бульоном, добавляют 0,15 кг поджелудочной железы КРС, затем к общему объему содержимого емкости вливают 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом. Емкость помещают в термокамеру при температуре 35-37°С, выдерживают в течение 4-5 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 12-15 минут по 4-5 минут, а в последующие дни через каждые два часа по 4-5 минут, затем, на 6 сутки добавляют 0,1 кг пепсина, тщательно перемешивают и оставляют в термокамере на 9-10 дней при температуре 35-37°С, помешивая через каждые 2 часа, ежедневно измеряют уровень аминного азота. Через 10 дней получается желеобразная жидкость, которая плохо фильтруется.

В конце переваривания жидкость загустевает, напоминая по консистенции желе. При отсутствии такого загустевания перевар не пригоден. По окончании переваривания, на 11 сутки, добавляют 400 мл 1 н. раствора HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 9-10 мин, затем фильтруют через ткань Белтинга и 4 слоя фильтровальной бумаги. Измеряют аминный азот. Полученный гидролизат нейтрализуют 20% раствором NAOH до рН 7,0. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С. Используют по мере необходимости.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа получения гидролизата из молок лососевых рыб.

Пример 1. Приготовление гидролизата из молок лососевых рыб заключается в следующем. 0,5 кг молок лососевых рыб заливают 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения и проваривают в течение 10 минут, затем смесь охлаждают до 45°С, молоки измельчают, бульон подщелачивают Na₂СО₃ до рН 7,8-8,2. Ингредиенты помещают в емкость, например стеклянный баллон, добавляют 0,08 кг поджелудочной железы КРС, 2% хлороформа и помещают в термокамеру при температуре 30°С. Выдерживают 10-12 суток, встряхивая 3-4 раза в день. Каждый день измеряют аминный азот, который должен каждый день увеличиваться. По мере прекращения нарастания аминного азота гидролизат считается готовым. Его фильтруют, нейтрализуют до рН 7,0 и хранят при температуре от 2 до 8°С.

Недостаток полученного гидролизата - густая консистенция перевара, что затрудняет фильтрацию. При таком гидролизе происходит неполное расщепление белков до аминокислот, что снижает биологическую ценность.

Пример 2. Приготовление гидролизата из молок лососевых рыб проводят аналогично примеру 1, но при этом 0,5 кг молок лососевых рыб заливают 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения и проваривают в течение 10 минут. Затем смесь охлаждают до 45°С, молоки измельчают, бульон подщелачивают Na₂CO₃ до рН 7,8-8,2. Ингредиенты помещают в стеклянный баллон, добавляют 0,1 кг поджелудочной железы КРС, 2% хлороформа и помещают в термокамеру при температуре 30°С. Выдерживают 10-12 суток, встряхивая 3-4 раза в день. Каждый день измеряют аминный азот, который должен каждый день увеличиваться. По мере прекращения нарастания аминного азота гидролизат считается готовым. Его фильтруют и хранят при температуре от 2 до 8°С.

Полученная основа имеет осадок, плохо фильтруется. При таком гидролизе происходит неполное расщепление белков до аминокислот, что снижает биологическую ценность.

Пример 3. Приготовление гидролизата из молок лососевых рыб проводят аналогично примеру 1, но при этом 0,5 кг молок лососевых рыб заливают 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения и проваривают в течение 10 минут. Затем смесь охлаждают до 45°С, молоки измельчают, бульон подщелачивают Na₂CO₃ до рН 7,8-8,2. Ингредиенты помещают в стеклянный баллон, добавляют 0,15 кг поджелудочной железы КРС, 2% хлороформа и помещают в термокамеру при температуре 30°С. Выдерживают 5 суток, встряхивая 3-4 раза в день. Затем добавляют 0,05 кг пепсина и оставляют еще на 10 суток при температуре 30°С. Выдерживают 10-12 суток, встряхивая 3-4 раза в день. Каждый день измеряют аминный азот. По мере прекращения нарастания аминного азота гидролизат считается готовым. Его фильтруют и хранят при температуре от 2 до 8°С.

Полученная основа имеет осадок и плохо фильтруется.

Пример 4. Приготовление гидролизата из молок лосевых рыб заключается в следующем: молоки в количестве 0,5 кг режут на кусочки размером 2×3 см, заливают 1,0 л водопроводной воды, при помешивании нагревают до закипания, варят в течение 10 мин. Сваренные молоки встряхивают дуршлагом, остывшие молоки измельчают на мясорубке. Бульон охлаждают до 50°С, подщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,2 по фенолфталеину. Фарш молок лососевых рыб помещают в трехлитровый стеклянный баллон, заливают готовым остывшим бульоном, добавляют 0,15 кг поджелудочной железы КРС. К общему объему содержимого баллона вливают 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом. Баллон помещают в термокамеру при температуре 35°С. Выдерживают в течение 4 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 12 минут по 4 минуты, а в последующие дни через каждые два часа по 4 минуты. Затем, на 6 сутки добавляют 0,1 кг пепсина, тщательно перемешивают и оставляют в термокамере на 9 дней при температуре 35°С, помешивая через каждые 2 часа, при этом ежедневно измеряют уровень аминного азота. Через 10 дней получается желеобразная жидкость, которая плохо фильтруется. В конце переваривания жидкость загустевает, напоминая по консистенции желе. При отсутствии такого загустевания перевар не пригоден. По окончании переваривания, на 10 сутки, добавляют 400 мл 1 н. раствора HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 9 мин, затем фильтруют через ткань Белтинга и 4 слоя фильтровальной бумаги. Измеряют аминный азот. Полученный гидролизат нейтрализуют 20% раствором NAOH до рН 7,0. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С.

Полученный гидролизат хорошо фильтруется, белки максимально расщепляются до аминокислот, гидролизат обладает высокой биологической активностью.

Пример 5. Приготовление гидролизата из молок лосевых рыб заключается в следующем: молоки в количестве 0,5 кг режут на кусочки размером 2×3 см, заливают 1,0 л водопроводной воды, при помешивании нагревают до закипания, варят в течение 10 мин. Сваренные молоки встряхивают дуршлагом, остывшие молоки измельчают на мясорубке. Бульон охлаждают до 50°С, подщелачивают Na₂СО₃ до рН 8,2 по фенолфталеину. Фарш молок лососевых рыб помещают в трехлитровый стеклянный баллон, заливают готовым остывшим бульоном, добавляют 0,15 кг поджелудочной железы КРС. К общему объему содержимого баллона вливают 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом. Баллон помещают в термокамеру при температуре 37°С. Выдерживают в течение 5 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые два часа по 5 минут. Затем, на 6 сутки добавляют 0,1 кг пепсина, тщательно перемешивают и оставляют в термокамере на 10 дней при температуре 37°С, помешивая через каждые 2 часа. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. Через 10 дней получается желеобразная жидкость, которая плохо фильтруется. В конце переваривания жидкость загустевает, напоминая по консистенции желе. При отсутствии такого загустевания перевар не пригоден. По окончании переваривания, на 11 сутки, добавляют 400 мл 1 н. раствора HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 10 мин, затем фильтруют через ткань Белтинга и 4 слоя фильтровальной бумаги. Измеряют аминный азот. Полученный гидролизат нейтрализуют 20% раствором NAOH до рН 7,0. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С.

Полученный гидролизат хорошо фильтруется, белки максимально расщепляются до аминокислот, обладает высокой биологической активностью.

Пример 6. Приготовление гидролизата из молок лосевых рыб заключается в следующем: молоки в количестве 0,5 кг режут на кусочки размером 2×3 см, заливают 1,0 л водопроводной воды, при помешивании нагревают до закипания, варят в течение 10 мин. Сваренные молоки встряхивают дуршлагом, остывшие молоки измельчают на мясорубке. Бульон охлаждают до 50°С, подщелачивают Na₂СО₃ до рН 8,2 по фенолфталеину. Фарш молок лососевых рыб помещают в трехлитровый стеклянный баллон, заливают готовым остывшим бульоном, добавляют 0,15 кг поджелудочной железы КРС. К общему объему содержимого баллона вливают 2% хлороформа, запробковывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом. Баллон помещают в термокамеру при температуре 37°С. Выдерживают в течение 5 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые два часа по 5 минут. Затем, на 6 сутки добавляют 0,15 кг пепсина, тщательно перемешивают и оставляют в термокамере на 10 дней при температуре 37°С, помешивая через каждые 2 часа. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. Через 10 дней получается желеобразная жидкость, которая плохо фильтруется. В конце переваривания жидкость загустевает, напоминая по консистенции желе. При отсутствии такого загустевания перевар не пригоден. По окончании переваривания, на 11 сутки, добавляют 400 мл 1 н. раствора HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 10 мин, затем фильтруют через ткань Белтинга и 4 слоя фильтровальной бумаги. Измеряют аминный азот. Полученный гидролизат нейтрализуют 20% раствором NAOH до рН 7,0. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°С.

При такой рецептуре и способе получения гидролизат по примеру №6 по биологической ценности не уступает гидролизату, приготовленному согласно способу по примерам 4 и 5. Недостаток последнего гидролизата в использовании большего количества фермента-пепсина, что при пересчете на экономическую эффективность увеличивает денежные затраты.

Таким образом, наиболее оптимальным и соответствующим требованиям, предъявляемым к гидролизатам, является способ получения гидролизата по примерам 4, 5. Гидролизат имеет светло-коньячный цвет, хорошо фильтруется и обладает высокой биологической активностью.

Пример 7. Для подтверждения биологической активности гидролизата из молок лососевых рыб приготовленного, согласно примерам 4, 5, проводят исследование его химического состава и испытывают на активность способом К.Бакирджиева (Калашник, И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии. / И.А.Калашник. - 2-е изд., перераб. и доп. - Киев: Урожай. - 1990. - 160 с.), а также проводят исследование гидролизата в качестве основы микробиологических питательных сред для наращивания бактериальной массы. Для этого мясной гидролизат в агаре Хоттингера заменили на гидролизат из молок лососевых рыб по примерам 4, 5.

Было проведено химическое исследование полученного гидролизата на наличие аминокислот, углеводов, а так же микро- и макроэлементов.

На основании проведенных исследований получены следующие результаты, приведенные в табл.1.

Таблица 1. Некоторые химические компоненты гидролизата из молок лососевых рыб, приготовленного по примерам 4, 5.
Химические компоненты/качественные показатели	Количественные показатели
1. Аминокислоты:	г/л:
треонин	51,1±0,2
пролин	41,2±0,1
метионин	23,3±0,8
лейцин	38,0±1,0
аргинин солянокислый	43,0±0,5
2. Углеводы:	-
глюкоза	количество не рассчитывали
следы лактозы	количество не рассчитывали
гликоген	количество не рассчитывали
3. Микро- и макроэлементы	мг/л:
цинк	5,3
медь	0,4
железо	1,8
натрий	52,3
калий	213
магний	18,0
кальций	2,9

Определение активности гидролизата способом К.Бакирджиева.

Берут 2 флакона гидролизата. В первую пробирку помещают 500 мг дрожжей, 19,5 мл глюкозы и 0,5 мл 0,9% раствор натрия хлорида (контроль). Во вторую и третью пробирки - 500 мг дрожжей, 19,5 мл глюкозы, 0,5 мл гидролизата по предлагаемому способу. Пробирки плотно укупориваются резиновыми пробками с вставленными в них изогнутыми стеклянными трубками, через которые выходит жидкость, вытесняемая углекислым газом, вырабатываемым дрожжами в процессе их жизнедеятельности. Объем вытесняемой жидкости в пробирках определяют каждые 24 часа.

Разница в объеме вытесняемой жидкости между контрольной пробиркой и тестовыми составила 30%. Это указывает на высокую биологическую активность гидролизата по предлагаемому способу.

При исследовании гидролизата в качестве основы микробиологических питательных сред для наращивания бактериальной массы испытывают культуры тест-штаммов: Y.pestis EV; Р.aeruginosa 27/99; S.marcescens-1; lactobacterii-сп; E.coli CA-18. Рост микроорганизмов на питательной среде, содержащей в качестве питательной основы гидролизат из молок лососевых рыб, превосходит рост микроорганизмов на агаре Хоттингера. На новой питательной среде наблюдается сплошной рост с образованием интенсивного красного пигмента для S.marcescens-1 и сплошной рост с образованием интенсивного сине-зеленого пигмента для Р.aeruginosa 27/99, а также увеличение количества выросших колоний для E.coli CA-18, Y.pestis EV, Lactobacterii-сп. Данные представлены в табл.2.

Таблица 2. Культуральные свойства тест-штаммов микроорганизмов
№ примера	Ростовые качества сред по отношению к различным штамма микроорганизмов
№ примера	S.marcescens-1	Р.aeruginosa 27/99	E.coli CA-18	Y.pestis EV	Lactobacterii-сп
агар Хоттингера с гидролизатом из молок лососевых рыб по примеру 4	Сплошной рост с образованием интенсивного красного пигмента	Сплошной рост с образованием интенсивного сине-зеленого пигмента	50 колоний	60 колоний	28 колоний
Контроль - агар Хоттингера с мясным гидролизатом	Рост с образованием красного пигмента	Рост с образованием сине-зеленого пигмента	42 колонии	55 колоний	23 колонии

Таким образом, разработанный способ получения гидролизата из молок лососевых рыб с минимальными затратами позволяет сохранить широкий набор биологических компонентов, что дает право использовать его в различных областях промышленности.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

Гидролизат молок превосходит традиционные виды гидролизатов (в частности, мясной и кильки) по следующим параметрам:

- включает большое количество высоко активных низкомолекулярных азотистых соединений;

- содержит разнообразные макро- и микроэлементы: Zn, Cu, Fe, Na, К, Mg, Са;

- содержит углеводы;

- является экологически чистым, отсутствуют антибиотики и др. вредные примеси;

- имеет более низкую себестоимость.

Claims

Способ получения гидролизата из молок лососевых рыб, включающий приготовление белоксодержащей массы, смешивание ее с водой, нагревание при рН 7,6-8,0, добавление хлороформа, фильтрование, отличающийся тем, что в качестве белоксодержащей массы используют молоки лососевых рыб, смешивание с водой проводят в соотношении 1:2, а после нагревания бульон охлаждают до 48-50°С, подщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,2 по фенолфталеину, смешивают с биомассой и добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) и 2% хлороформа, затем емкость помещают в термокамеру при температуре 35-37°С, выдерживают в течение 4-5 суток, встряхивая в течение первых суток через каждые 12-15 мин в течение 4-5 мин, а в последующие дни через каждые 2 ч в течение 4-5 мин, затем на шестые сутки добавляют пепсин, перемешивают и выдерживают в термокамере в течение 9-10 дней при температуре 35-37°С, регулярно помешивая и измеряя уровень аминного азота, причем после окончания переваривания добавляют раствор 1Н HCl до рН 4,1 и кипятят в течение 9-10 мин, затем полученный гидролизат нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до рН 7,0, добавляют 2% хлороформа с последующим хранением при температуре 2-8°С.