RU2343486C2 - Способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов и среда для его осуществления - Google Patents

Abstract

Изобретение касается детектирования специфичности активированных лимфоцитов у реципиентов или пациентов после трансплантации органов или после инфицирования патогенным микроорганизмом, или вакцинации. Способ предусматривает стадии: а) разбавления антигена или антигенов, способных активировать лимфоциты в организме, с использованием среды, дополнительно содержащей нейтрализующие антитела против цитокинов, индуцирующих клеточную пролиферацию, и/или цитокины, способные индуцировать апоптоз мононуклеарных клеток, б) приготовления суспензии мононуклеарных клеток с активированными лимфоцитами, в) инкубации смеси антигена и суспензии (стадии а) и б)), г) определения наличия антиген-специфических активированных лимфоцитов. Использование изобретения позволяет заблаговременно диагностировать отторжение при трансплантации органа, предоставляет руководство для рационального введения лекарственных препаратов в клинических условиях, а также предоставляет точный и быстрый способ детектирования инфекционных заболеваний, лечения на ранней стадии заболевания, тем самым уменьшая скорость инфицирования. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем относится к способу детектирования специфичности активированных лимфоцитов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детектирования специфичности активированных лимфоцитов in vivo после трансплантации, вирусной/бактериальной инфекции или вакцинации.

Уровень техники

Иммунность или иммунитет представляет собой ответ на биологическое узнавание чужеродных антигенов (патогенов) и их элиминацию. Большинство антигенов не являются аутогенными, а происходят из экзогенных источников (чужеродные антигены). После внедрения в организм чужеродные антигены распознаются и оперативно удаляются при помощи ряда иммунных ответов, инициированных иммунной системой организма.

Во время трансплантации антигенные различия между донором и реципиентом, например, различия между антигеном главного комплекса гистосовметимости (МНС) и антигеном минорного комплекса гистосовметимости (mH-антиген), могут индуцировать у реципиента продуцирование специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на антигены, которые присутствуют в органе/ткани донора и отличаются от соответствующих антигенов реципиента. Лимфоциты, продуцируемые таким образом, затем будут атаковать трансплантированный орган, приводя к реакции отторжения. Специфические активированные лимфоциты, нацеленные на различные патогены, также могут продуцироваться, если организм стимулирован/инфицирован патогенными микроорганизмами, такими как вирус кори, респираторный синцитиальный вирус, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирусы гепатита Е и F, вирусы ветряной оспы и опоясывающего герпеса, вирус простого герпеса, цитомегаловирус, Вирус Эпштейна-Барр, коронавирус, ротавирус, вирус коксаки, ECHO-вирус, вирус Эбола, вирус желтой лихорадки, аденовирус, вирус лесного энцефалита, вирус краснухи, вирус эпидемического энцефалита В, антирабический вирус, SARS-вирус, вирус гриппа (включая человеческий и птичий), вирус эпидемического паротита, вирус геморрагической лихорадки, ВИЧ, вирус полимиелита, риккетсия, эпидемический энцефалитный диплококк, Bacillus typhi или Bacillus paratyphosus, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus diphtheriae, Bordetella pertussis, Bacillus anthracis, Bacterium burgeri, Yersinia pestis, Lepra bacillus, атипичная микобактерия, Leptospire, Treponema pallidum, Spirochaeta recurrentis, Clamudia, Cyptozoite, Leishmania, Toxoplasma, Schistosome, Paragonimiasis, Chinese liver fluke, Fasciolopsis, Filaria и т.п. В одном и том же организме может существовать множество различных специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на различные антигены, например, у пациента, у которого произошло отторжение и который был инфицирован вирусом герпеса после трансплантации сердца, его организм будет генерировать как специфические активированные лимфоциты против МНС, так и специфические активированные лимфоциты против вируса герпеса.

Трансплантация является последней надеждой при выборе лечения на последней стадии заболевания многих органов. После трансплантации различия в МНС и mH-антигенах между донором и реципиентом всегда приводят к отторжению, которое остается основной причиной смертности в течение 3, 5 и 10 лет после трансплантации органов, таких как сердце, печень, почка и трансплантации костного мозга, а также клеточной трансплантации, и отторжение начинается с активации лимфоцитов. Наличие у реципиента лимфоцитов, специфически активированных против донора, обычно означает, что организм начал или начинает атаку на орган донора. Следовательно, для того, чтобы добиться нормального функционирования трансплантированного органа у реципиента, следует своевременно предпринимать соответствующие меры, например, увеличение дозы используемого иммуносупрессивного агента или замену на другой тип иммуносупрессивного агента, тем самым улучшая качество жизни и удлиняя время жизни реципиента.

Биопсия, которая представляет собой инвазивный способ и не может повторяться ежедневно, в настоящее время является “золотым стандартом” для диагноза отторжения во всем мире. Однако этот способ не был широко принят врачами и пациентами, поскольку он является болезненным, опасным и дорогим. Более того, из-за того, что очаги опасности находятся в определенных частях органа, а образец биопсии может быть взят только из некоторой части органа, доля неверно поставленного диагноза может быть высокой. К тому же, целью биопсии является выявление патологических изменений, например, обнаружение патологических изменений, действительно указывающих на орган, который уже поврежден. Следовательно, для улучшения качества жизни органа реципиента и удлинения срока жизни трансплантированного органа необходимы неинвазивный диагностический способ, который был бы быстр, прост и имел бы высокую чувствительность к реакции отторжения. Отторжение начинается в виде активации лимфоцитов, следовательно, активированные лимфоциты должны присутствовать еще до патологических изменений. Таким образом, настоящее изобретение разработано для диагностирования реакции отторжения путем детектирования специфических лимфоцитов, активированных МНС- или mH-антигеном в периферической крови. В результате способом, предоставленным в настоящем изобретении, можно диагностировать реакцию отторжения задолго до того, как в трансплантированном органе произойдут патологические изменения. Более того, в способе устранены недостатки, присущие анализу с применением биопсии, и он обеспечивает быстрый, точный и ясный диагностический результат в отношении реакции отторжения. Способ также может быть использован для улучшения качества жизни пациентов и увеличения срока жизни имплантата.

Многие патогенные микроорганизмы, такие как вирус кори, вирус ветряной оспы, вирус эпидемического энцефалита В, Mycobacterium tuberculosis и т.д., до проявления заболеваний имеют латентный период, во время которого симптомы обычно являются нетипичными, например, в виде повышенной температуры и т.д. Однако диагноз заболеваний, вызванных этими патогенами, обычно зависит от диагноза, основанного на типичных симптомах (специфичных симптомах), проявление которых в таких заболеваниях всегда задерживается из-за латентного периода. В результате процент постановки неверных диагнозов может быть высоким.

Настоящее изобретение также может быть использовано для диагностики инфекции патогенными микроорганизмами. Обеспечен точный и быстрый способ детектирования заболеваний во время латентного периода и на ранней стадии. Следовательно, было бы существенным реализовать задачи своевременного детектирования, своевременного введения карантина, своевременного лечения и уменьшения скорости распространения инфекции.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к способу детектирования специфичности активированных лимфоцитов, включающему в себя следующие этапы:

1) разбавление образца антигена средой, причем антиген может активировать лимфоциты в организме, и при этом среда содержит, дополнительно к стандартным ингредиентам для культивирования клеток, нейтрализующие антитела против цитокинов, которые индуцируют клеточную пролиферацию, и/или цитокины, которые индуцируют апоптоз мононуклеарных клеток или ингибируют клеточную активность или ингибируют клеточную пролиферацию;

2) приготовление суспензии мононуклеарных клеток в среде, причем суспензия содержит активированные лимфоциты;

3) инкубацию смеси антигена и указанной суспензии мононуклеарных клеток, содержащей активированные лимфоциты, на планшете для клеточных культур;

4) определение наличия антиген-специфических активированных лимфоцитов путем сравнения различий в детектируемых сигналах между тестовыми лунками и контрольными лунками.

В одном из аспектов настоящий способ может быть использован для детектирования специфичности активированных лимфоцитов, продуцированных организмом, который был стимулирован каким-либо антигеном.

В другом аспекте антиген, используемый в настоящем изобретении, может быть аллогенным антигеном, гетероантигеном или антигеном патогенных микроорганизмов различного типа. Образцы аллогенных антигенов и гетероантигенов могут представлять собой единичные антигены или могут быть смешанными антигенами от одного или нескольких индивидуумов. Антигены могут быть представлены в виде конкретного антигена, находящегося на клеточных мембранах клеток человека или животного, или на клеточных мембранах или клеточных стенках плесневых грибов или бактерий, или на оболочках или капсидах вирусов. Антиген(антигены) также могут быть представлены в виде растворимых антигенов, растворенных в растворах.

В одном из аспектов аллогенные антигены могут представлять собой непосредственный или опосредованный продукт аллелей, который может быть распознан как антиген другим членом того же биологического вида. Продукты аллелей включают в себя не только полипептиды, но также и специфические полисахариды и липиды, синтезированные ферментами, кодируемыми этими аллелями. Аллогенные антигены, используемые в настоящем изобретении, представляют собой антигены гистосовместимости, включающие главный антиген гистосовместимости (МНС) (также известный как “HLA” у человека, “SLA” у свиньи, “MAMU” у макаки, “PYCY” у желтого павиана, Н₂-антиген у мышей, RT₁-антиген у крыс) и минорный антиген гистосовместимости (Hm-антиген).

Гетероантигены, как используются в настоящем описании, относятся к веществам (например, полипептидам, специфическим полисахаридам, липидам и т.д.), которые существуют только в одном из двух биологических видов. Они могут быть опознаны другими видами и, следовательно, могут индуцировать иммунный ответ. Например, если орган свиньи собираются трансплантировать человеку, обезьяне, павиану или шимпанзе и т.д., то вещества (как описано выше), присутствующие у свиньи, но не присутствующие в организме человека, обезьяны, павиана или шимпанзе и т.д., называются гетероантигенами.

В одном из аспектов антиген патогенного микроорганизма представляет собой специфический антиген бактерии или вируса. В качестве альтернативы, антиген патогенного микроорганизма представляет собой смесь антигенов бактерий и/или вирусов (каждая бактерия или вирус может экспрессировать антигены многих типов). Он может быть предоставлен в виде композиции, приготовленной путем обработки бактериальных или вирусных частиц неионным очищающим средством и липидным растворителем или 10% формальдегидом. Антигены бактерий и вирусов также могут быть экспрессированы на клеточных мембранах клеток человека/животного. Антигены также могут быть предоставлены в виде растворимого антигена, растворенного в растворах.

В настоящем описании “целевой антиген(антигены)” относится к антигенам, которые используются при анализе, и специфические, активированные ими лимфоциты уже могут присутствовать у субъектов, которые могут быть идентифицированы при помощи этого анализа.

В настоящем описании “нерелевантный антиген(антигены)” относится к антигенам, которые при анализе используются в качестве контроля, и специфические, активированные ими лимфоциты не должны присутствовать у субъектов. Нерелевантные антигены могут различаться, в зависимости от целей анализа. Нерелевантные антигены могут быть дополнительно добавлены при анализе, или они могут быть добавлены в тот же измерительный планшет в качестве контрольных антигенов.

Антиген(антигены), используемые в настоящем изобретении, может быть конкретным антигеном, таким как антиген(антигены) ВИЧ, переносимый клетками, бактериями или вирусами; или вирусный антиген или бактериальный антиген, переносимый определенной клеткой, бактериями или вирусами. В качестве альтернативы, антигены могут быть растворимыми антигенами, такими как молекулы аллогенных антигенов или молекулы гетероантигенов, или некоторые специфические белковые молекулы определенного вируса или бактерии.

Антиген(антигены), используемый в настоящем изобретении, может относиться к одному типу аллогенных или гетерогенных молекул, а также может представлять собой смесь, содержащую несколько или все HLA-антигены и mH-антигены человека. Антиген(антигены) также может представлять собой один тип специфического антигена вируса или бактерии. Антиген(антигены), кроме того, может представлять собой смешанные антигены множества различных вирусов или бактерий. Использование одного антигена или использование смешанных антигенов может иметь результатом разную точность. Например, если при анализе используется смешанный аллогенный антиген, положительный результат может означать только наличие лимфоцитов, активированных аллогенными антигенами, т.е. иммунная система организма инициировала реакцию отторжения против донорского органа, но точно не известно, какая молекула антигена действительно индуцировала реакцию отторжения. Однако при использовании измерительного планшета, разделяющего различные HLA- и mH-антигены в отдельных камерах/лунках, положительный результат может точно указать на активированные лимфоциты, которые действительно активированы одним или несколькими аллогенными антигенами. Аналогично для диагноза вирусного или бактериального инфекционного заболевания, если при анализе используются смешанные антигены респираторно-синцитиального вируса, короновируса, аденовируса, вируса гриппа и вируса парагриппа, вируса кори, вируса ветряной оспы, вируса свинки, вируса герпеса и т.д., то положительный результат может означать только то, что субъект инфицирован одним из вышеуказанных патогенов, но при этом невозможно указать, какой из них является причиной. Напротив, если в качестве антигена при анализе используется один специфический белок определенного вируса или по существу один тип специфического белка определенного вируса, то, исходя из результатов анализа, можно установить, какой именно вирус является патогеном.

Антиген(антигены) в настоящем изобретении может быть получен следующим способом:

1. Были выбраны специфические реципиенты (HLA-антигены разных реципиентов обычно отличаются) с тем, чтобы получить все человеческие HLA-I-антигены, HLA-II-антигены и mH-антигены, присутствующие на мембранах В-клеток периферической крови. У разных индивидов естественным образом образуются различные комбинации, что позволяет сделать выбор, определяемый только необходимостью. У каждого субъекта брали по 0,5 мл периферической крови и помещали ее в культуральный флакон, содержащий подходящее количество среды для клеточных культур, например, среды 1640 (компании GIBCO), DMEM (компании GIBCO) или Eagle (компании GIBCO), среды, содержащей 10% телячьей сыворотки или фетальной телячьей сыворотки (компании GIBCO). Одновременно добавляли подходящее количество супернатанта культивируемой клеточной линии В958 (коммерчески доступной от компании АТСС), которая может секретировать вирус Эпштейна-Барр в среду для клеточных культур во время инкубации. Количество супернатанта должно содержать достаточное количество вирусов Эпштейна-Барр, чтобы трансформировать все В-клетки в 0,5 мл крови (обычно 5-10 мл супернатанта суспензии клеточной культуры В958, которую инкубировали в течение 3 дней, и исходная концентрация клеток составляла 500000 клеток В958 на мл). Затем флакон с клеточной культурой помещали в СО₂-инкубатор при 37°С на 15 дней (во время которых каждые 5 дней добавляли по 5-10 мл среды), до тех пор, пока в суспензии не появлялись агрегированные опухолевые клетки. После появления агрегированных опухолевых клеток среду можно заменить, и клетки можно культивировать таким же способом, как клетки других обычных клеточных культур, за исключением того, что все инструменты, которые контактируют непосредственно или опосредованно с клеточной линией В958, должны быть очень тщательно стерилизованы для удаления вируса Эпштейна-Барр (хотя вирус Эпштейна-Барр существует повсеместно, даже в носоглоточной полости здорового человека, процедура стерилизации все же необходима). Обработанную таким образом периферическую кровь субъектов можно было использовать для получения из нее различных линий В-клеток. После клонирования, размножения и заморозки были получены линии В-клеток, которые могли стабильно экспрессировать определенные типы HLA-антигенов и/или mH-антиген.

2. Клеточные линии, содержащие человеческие антигены HLA и mH, также можно получить способами генной инженерии: были выбраны человеческие клеточные линии, которые не экспрессируют человеческие антигены HLA и/или mH, такие как U937 (коммерчески доступная от компании АТСС) и К562 (коммерчески доступная от компании АТСС) и использованы в качестве векторов антигенов. Для получения мРНК белых кровяных клеток из периферической крови субъектов использовали обычные методы молекулярной биологии. Обычные методы генной инженерии, такие как ПЦР обратной транскрипции, сплайсинг и т.д. могут быть использованы для создания векторов экспрессии, которые могут экспрессировать различные виды HLA-антигена. Эти векторы затем трансфецировали в U937, К562 или другие клетки, которые изначально не экспрессировали HLA- и mH-антигены, для создания клеточных линий, каждая из которых может экспрессировать конкретный тип HLA-антигена, т.е. все человеческие HLA-антигены. Векторы экспрессии могут быть отобраны из различных ретровирусов. Векторы экспрессии также могут быть получены способом, описанным в Immunogenetics (25:1-6, 1987) и т.д. Эти способы также могут быть использованы для экспрессии антигенов. Для каждого HLA-антигена, соответственно, могут быть созданы отдельные клеточные линии таким образом, что каждая клеточная линия может экспрессировать один HLA-антиген. При создании более 100 клеточных линий охватываются все человеческие HLA-антигены. После клонирования, размножения и заморозки, соответственно, могут быть получены клеточные линии, которые стабильно экспрессируют определенные человеческие HLA- и mH-антигены.

3. Клеточные линии, содержащие человеческие HLA- и mH-антигены, также могут быть получены согласно следующему способу:

3.1 В качестве опухолевых клеточных линий были выбраны и использовались человеческие клеточные линии, для которых известно, что они либо экспрессируют, либо не экспрессируют человеческий HLA- и/или mH-антиген, такие как Raji (коммерчески доступная от компании АТСС), U937 (коммерчески доступная от компании АТСС), К562 (коммерчески доступная от компании АТСС) и опухолевая клеточная линия SP2/0 мышиного асцита. Отбирали В-клетки, содержащие известный HLA-антиген(антигены) в периферической крови (Abe и др. J Immunol Methods, 90: 111-123) (Principles and techniques of culture in vitro) (Xue Qingshan, Science Publishing House, 2001, издание 1), (SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY) (изданная Barbara B. Mishell and Stanley M. Shiigi W.H. Freeman and Company, San Francisco, 1980) и 〈Concise Immunology Techniques〉 (Zhu Zhengmei and Liu Hui, Science Publishing House, July 2002, издание 1), затем добавляли бактериальный липополисахарид (LPS) (SIGMA) до его конечной концентрации 2-25 мкг/мл. Смесь из фактора роста В-клеток (BCGF) (созданную самими авторами, см. 3.2), античеловеческих IgM (компании Sigma), митогена лаконоса (PWM) (компании Sigma) (конечная концентрация составила 1-25 мкг/мл) и протеина А стафилококка (компании Sigma) (конечная концентрация 1/1000-1/10000) инкубировали в течение 2-3 недель. Затем клетки Raji, U937 или К562 сливали с человеческими мононуклеарными клетками с известным антигеном, которые были стимулированы смесью из фактора роста В-клеток (BCGF), античеловеческого IgM, протеина А стафилококка, бактериального липополисахарида и митогена лаконоса (PWM) в течение 2-3 недель, для получения иммортализованной клеточной линии, которая может экспрессировать определенный вид(виды) HLA-антигена при помощи технологии, описанной в "Techniques of Monoclonal Antibody" (Science and Technlolgy, Publishing House in Shaanxi Province, под редакцией Xu Zhikai, China, January, 1992, издание 1). Таким образом, были созданы клеточные линии, которые могут экспрессировать различные комбинации HLA-антигенов. Тем самым было создано множество различных клеточных линий, содержащих почти все человеческие HLA-антигены.

3.2 Создание линии В-клеток: см. "Principles and techniques of culture in vitro" (Xue Qingshan, Science Publishing House, 2001, edition 1).

1) Получение лимфоцитов: у пациента отбирали периферическую кровь с известными HLA-антигенами, добавляли гепарин (компании Sigma) для антикоагуляции, выделяли мононуклеарные клетки, используя раствор для отделения лимфоцитов (компании Sigma), готовили суспензию (концентрация: 1×10⁶ клеток/мл) в среде RPMI-1640 (компании Gibco), содержащей 10% FCS, инкубировали клетки во флаконе для клеточной культуры в течение 4-8 часов, встряхивали флаконы для получения суспендированных клеток, центрифугировали суспензию в течение 10 мин при 1000 об/мин, и собирали преципитаты, которые представляли собой очищенные лимфоциты.

2) Получение супернатанта культивированных BCGF: получали суспензию лимфоцитов (концентрация: 2×10⁶ клеток/мл) в среде RPMI-1640 (компании Gibco), содержащей 1% FCS (компании Gibco), в суспензию добавляли РНА до конечной концентрации 2 пкг/мл, помещали суспензию в культуральный флакон, инкубировали флакон в инкубаторе при влажности насыщения и 5% СО₂ при 37°С в течение 3-4 дней, собирали культуру в центрифужную пробирку, центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин при 4°С, собирали супернатант и хранили его при -20°С. Супернатант представлял собой необработанные BCGF.

3) Получали суспензию лимфоцитов (концентрация 1×10⁶ клеток/мл) в среде RPMI-1640 (компании GIBCO), содержащей 10% FCS, в суспензию добавляли фрагмент античеловеческого IgM F(ab)₂ (компании Sigma) до конечной концентрации 20 мкг/мл, в суспензию добавляли необработанные BCGF до конечной концентрации 10% и в суспензию добавляли бактериальный липополисахарид (LPS) (SIGMA) до конечной концентрации 2-25 мкг/мл.

4) В каждую лунку 24-луночного планшета добавляли по 1 мл клеточной суспензии. Клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С. Половину объема культуральной среды обновляли каждые 3-4 дня, т.е. из лунок удаляли по 0,5 мл суспензии и затем добавляли новую культуральную среду, содержащую фрагмент античеловеческого IgM F(ab)₂ (компании Sigma) (20 мкг/мл), необработанные BCGF (10%) и бактериальный липополисахарид (LPS) (SIGMA) (конечная концентрация 2-25 мкг/мл). Спустя 3-5 недель, когда клоны становились больше, клетки переносили в культуральные флаконы и продолжали культивировать. Затем создавали линию В-клеток с известными HLA-антигенами.

5) Таким образом, были созданы клеточные линии, которые могут экспрессировать различные комбинации HLA-антигенов. Было создано множество клеточных линий, содержащих практически все человеческие HLA-антигены.

4. Клеточные линии, содержащие человеческий HLA-антиген и mH-антиген, также могут быть получены при помощи следующего способа: в качестве субъектов были выбраны люди, у которых не было одинаковых HLA-антигенов или у которых совпадало с другими лишь незначительное количество типов HLA-антигенов. У этих людей отбирали периферическую кровь; из нее создавали линии В-клеток согласно способу 1; эти клеточные линии использовали в качестве векторов, и для экспрессии тех HLA-антигенов и mH-антигенов, которые не могли быть экспрессированы этими клеточными линиями, использовали способы генной инженерии (как описано в способе 2). По существу, можно использовать меньшее количество клеточных линий для экспрессии большего количества антигенов, тем самым экспрессируя все человеческие HLA-антигены и mH-антигены при помощи минимального количества клеточных линий. Согласно этой стратегии необходимо было создать только несколько клеточных линий, чтобы экспрессировать все 18 DR-антигенов, обнаруженных на клеточной поверхности до настоящего времени, если в качестве векторов антигенов использовать клеточную линию Raji (коммерчески доступную от компании АТСС) или клеточную линию Daudi (коммерчески доступную от компании АТСС), которые могут экспрессировать больше HLA-II-антигенов.

5. Культиваровали и размножали клетки или клеточные линии (экспрессирующие все человеческие HLA-антигены), полученные при помощи описанных выше способов или при помощи других способов, таких как получение клеток или клеточных линий непосредственно из селезенки/периферической крови человека или животных. Затем клетки смешивали и разрушали, используя стерилизованную дистиллированную воду и инкубируя при 37°С в течение 0,5-2 часов. Когда клетки были разрушены полностью, для преципитации клеточных мембран в течение 20 минут использовали высокоскоростную центрифугу (3000-20000 g) с охлаждением. Супернатант удаляли, а преципитат (клеточные мембраны) лиофилизировали и хранили для дальнейшего использования. При использовании преципитат разбавляли средой для клеточных культур до разной концентрации в зависимости от задачи для получения единичного HLA-антигена или смеси конкретных HLA-антигенов. Фактически конкретный HLA-антиген переносится на липидном тельце.

6. HLA-антигены, используемые в настоящем изобретении, также могут быть растворимыми антигенами. Растворимые антигены могут быть получены следующим способом: вектор, сконструированный по способу 2, может экспрессировать HLA-антигены в человеческих клетках, прокариотических клетках или других эукариотических клетках (таких как дрожжи). Полученные таким образом HLA-антигены, не важно, каким способом, могут быть использованы непосредственно как антигены после фиксации в 10% формальдегиде и промывки. В качестве альтернативы, HLA-антигены могут быть получены при помощи обычной аффинной хроматографии (например, аффинная колонка, приготовленная с анти-В2-микроглобулиновыми антителами (Forth Military Medical University) или анти-HLA-антителами типа I или типа II (Forth Military Medical University)) или другими способами очистки белка. Очищенный HLA-антиген, полученный таким образом, может быть использован в дальнейших исследованиях.

7. Приготовление специфического антигена патогенного микроорганизма: приготовление различных патогенов, таких как вирус кори, вирус ветряной оспы и Mycobacterium tuberculosis, можно найти в публикациях «Principles and Techniques of Culture in vitro» (Xue Qingshan, Science Publishing House, 2001, edition 1); «Diagnosis and Experimental Virology» (Zhengzhou University Publishing House, 2002, edition 1, edited by Yang Zhanqiu, Liu Jianjun, Xiao hong. Ding Xiaohua); «Experimental Virology in Medical Use» (Du Ping. Chinese PLA Medical Publishing House, 1985, edition 1); «Modern Phthisiology» (Chinese PLA Medical Publishing House, 2000, edition 1, edited by Zhang Dunrong) и т.п. Патогенные микроорганизмы культивировали in vivo или in vitro согласно их росту и репродуктивным характеристикам и очищали, используя соответствующий способ. Очищенные или практически очищенные патогены могут быть использованы как антигены после дополнительной обработки облучением ⁶⁰Со и инактивации 0,4-40 г/л формальдегидом, глутаральдегидом, неионным детергентом или липидным растворителем (таким как диэтиловый эфир, хлороформ). Специфические антигены патогенных микроорганизмов также могут быть специфическими антигенами микроорганизмов, экспрессированными с использованием способов генной инженерии. Эти антигены могут быть экспрессированы в клетках человека или животных, прокариотических клетках или эукариотических клетках. Эти клетки могут быть использованы непосредственно как антигены. В качестве альтернативы, эти клетки могут быть использованы как антигены после очистки путем обычной аффинной хроматографии или при помощи других технологий очистки белков.

8. Антигены, используемые в настоящем изобретении, также могут быть гетероантигенами в случае гетерогенной трансплантации, такими как антиген свиньи-донора (включая все виды трансгенных свиней и инбредные линии) или антиген мыши, антиген крысы, антиген морской свинки и т.п. Для экспрессии вышеупомянутых антигенов, которые могут быть использованы в качестве предназначенных для тестирования антигенов во время гетерогенной трансплантации, могут быть созданы различные клеточные линии

9. Антигены согласно изобретению могут быть созданы в лаборатории или могут быть приобретены на коммерческой основе у компаний. Коммерчески доступными являются, например, антигены вируса кори, вируса эпидемического энцефалита В, вирусов полимиелита, дифтерийной палочки.

В настоящем изобретении может быть использован широкий спектр антигенов, включая все “чужеродные” субстанции, которые могут специфически активировать лимфоциты организма. По существу, антигены могут быть использованы для детектирования наличия специфических лимфоцитов, активированных такими антигенами.

Для детектирования наличия специфических лимфоцитов, активированных антигенами, могут быть использованы все антигены, полученные вышеупомянутыми или другими способами (включая использование единичных или смешанных антигенов, нерастворимых антигенов или растворимых антигенов, аллогеных антигенов или гетероантигенов, человеческого HLA-антигена или антигенов мыши, крысы, свиньи и т.п., антигенов патогенных микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы, а также всех видов антигенов вакцин для человека), при условии, что они могут специфически активировать лимфоциты в организме.

Полученные антигены, которые могут быть экспрессированы в клетках человека или животных, клеточных стенках бактерий или оболочках/капсидах вирусов, необходимо инактивировать обработкой митомицином или 0,1-10% формальдегидом или неионным детергентом, а также липидным растворителем (таким как ацетон, диметилбензол, хлороформ и т.п.) перед возможным использованием в качестве образца тестируемого антигена. При некоторых обстоятельствах антигены могут быть непосредственно использованы в качестве образца тестируемого антигена без дополнительной обработки. Белковые антигены (растворимые антигены), очищенные аффинной хроматографией или другими способами очистки белков, и целевые антигены, абсорбированные на липосоме, могут быть непосредственно использованы в качестве тестируемых антигенов.

Антигены, полученные в стерильных условиях, могут быть использованы по отдельности или в различных комбинациях (согласно различным целям). Антигены инкубировали с мононуклеарными клетками периферической крови субъектов, полученными способами с использованием обычной среды для отделения лимфоцитов для приготовления мононуклеарных клеток. Среда, используемая для разбавления мононуклеарных клеток, дополнительно к телячьей сыворотке или фетальной телячьей сыворотке, необходимой для обычного культивирования клеток (также может быть использована коммерчески доступная среда без сыворотки), содержала антитела, нейтрализующие активность цитокинов и/или цитокины-ингибиторы клеточной пролиферации, и иммуносупрессивный агент и/или противораковые лекарственные препараты. Иммуносупрессивные агенты и/или противораковые лекарственные препараты включают програф (FK506), циклоспорины, например, циклоспорин А, циклоспорин С, циклофосфамид, азатиоприн, рапамицин, RS-61443 (микофенолят мофетил, ММ, молекулярная формула: C₂₄H₁₁NCLO₇) (который представляет собой производное эфира микофенольной кислоты, МРА, молекулярная формула C₁₇H₁₁O₆), BQR (6-фтор-2-3-метил-1-4-хинолиновая кислота), дезоксиспергуалин, иммуносупресант, секретируемый человеческой клеточной линией JM острой Т-лимфоцитарной лейкемии, гормон коры надпочечников (например, медрат, преднизон, гидрокортизон, дексаметазон и др.), ингибитор топоизомеразы (например, камптотецин (САМ), этопозид (VP-16), алкилирующий агент (например, цисплатин, кариолизин, алкеран, хлорамбуцил, кармустин и т.п.)), антиметаболит (метотрексат, цитозин-арабинозид, ингибитор тимидилатсинтетазы, ди-N-тетрагидрофолиевая кислота и т.п.), производные ретиноевых кислот - витамина А (например, полностью транс-ретиноевая кислота, пальмитат ксантопсин, аммониевая соль 4-N-гидроксибензол-ретиноевой кислоты) и другие лекарственные препараты, которые потенциально способны индуцировать иммуносупрессивную функцию или индуцировать апоптоз опухолевых клеток. Функцией вышеупомянутых антигенов является подавление активации специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на антигены, или индуцирование активного апоптоза специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на антигены; функцией антитела, нейтрализующего активность цитокинов, и/или цитокинов-ингибиторов клеточной пролиферации является индукция пассивного апоптоза активированных лимфоцитов; функция вышеупомянутых иммуносупрессивных лекарственных препаратов заключается в том, чтобы сделать результаты теста более стабильными, точными, чувствительными и легко сравнимые с контролем.

Дозирование или концентрации иммуносупрессивных агентов и противораковых лекарственных препаратов в культуральной среде могут быть различными. Концентрации или дозирование могут быть подобраны по желанию. В общем случае концентрация примерно в 1000 раз больше наименьшей концентрации лекарственного препарата (минимальное значение) в крови, приведенной в руководстве по применению (предел дозирования составляет приблизительно 0,001 нг - 100 мкг/мл), например, пределы дозирования FK506 составляют 0,001 нг - 10 мкг/мл (предпочтительно 0,001 нг - 100 мкг/мл); циклоспорина А составляют 0,001 нг - 10 мкг/мл (предпочтительно 0,001 нг -1 мкг/мл). Оптимальная концентрация представляет собой самую низкую концентрацию лекарственного препарата, при которой можно достичь наилучшей повторяемости результата тестирования. Иммуносупрессивные агенты и противораковые лекарственные препараты могут применяться по отдельности или в сочетании в зависимости от цели.

Нейтрализующие антитела против цитокинов, стимулирующих клеточную пролиферацию, включают в себя антитела против интерлейкинов 1, 2, 4, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, интерферонов (-α, β, ω, γ), колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), фактора стволовых клеток (SCF), тромбопоэтина (ТРО), фактора роста нервов (NGF) и все другие нейтрализующие антитела против цитокинов, вызывающих активацию или пролиферацию мононуклеарных клеток; цитокины, которые могут индуцировать апоптоз или ингибировать активацию или пролиферацию мононуклеарных клеток (например, лимфоцитов или моноцитов), включают в себя IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, трансформирующий фактор роста β (TGF-β), интерферон-γ, фактор некроза опухоли (TNF), CTLA4 и другие цитокины или слитые белки-цитокины, например, CTLA4.Ig (слитый белок антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-клетками (CTLA4), и Fc-фрагмент человеческого иммуноглобулина G (IG)) и т.п.

Нейтрализующее антитело в настоящем описании относится к антителам, обладающим эффектом ингибирования биологической активности цитокинов. Нейтрализующие антитела могут ингибировать биологическую активность цитокинов, которые в противном случае могут активировать или стимулировать клеточную пролиферацию, тем самым ингибируя биологические функции цитокинов.

Функцией нейтрализующих антител и цитокинов-ингибиторов является облегчение эффекта специфического ингибирования специфического антигена на специфических активированных лимфоцитах, т.е. комбинированного эффекта специфического антигена, нейтрализующих антител и цитокинов-ингибиторов, может ингибировать активность антиген-специфических активированных лимфоцитов и мононуклеарных клеток. Поскольку другой цитокин функционирует по-другому, а единицы активности или титр цитокинов или нейтрализующих антител против цитокинов, производимых различными компаниями, могут различаться, то концентрации нейтрализующих антител в культуральной среде могут сильно различаться, в пределах 1 мкг - 10 мг/мл. Подходящая концентрация должна представлять собой такую концентрацию, при которой можно получить воспроизводимые результаты тестирования с высокой чувствительностью. Концентрации цитокинов-ингибиторов вычисляют в виде их единиц активности с конечной концентрацией в пределах 0,01-1000 ед.активности/мл (обычно 0,1-50 ед.активности/мл). Оптимальной концентрацией должна быть концентрация, при которой можно получить наилучшую чувствительность и точность результатов тестирования.

Существует много видов иммуносупруссивных агентов, антител, нейтрализующих активность цитокинов, и цитокинов, которые могут ингибировать активность лимфоцитов или моноцитов. Механизмы их функционирования сложны. Один или несколько факторов могут быть выбраны и использованы по отдельности или в сочетании при тестировании для достижения чувствительного, точного и воспроизводимого результата.

Целевые антигены, нецелевые антигены контроля и мононуклеарные клетки субъектов, изолированные при помощи среды для отделения лимфоцитов (полученной способами, описанными в примерах 1, 2 и 3), разбавляли средой, содержащей подходящие концентрации иммуносупрессивного агента и противораковых лекарственных препаратов, нейтрализующие антитела против цитокинов и/или цитокины-ингибиторы до подходящих концентраций.

При использовании клеток, несущих целевые антигены в качестве антигенов, таких как антигены, полученные способами 1, 2, 3 и 4, концентрация клеток составляет приблизительно 0,001-10×10⁶/мл, предпочтительно примерно 1-2×10⁶/мл; и концентрация мононуклеарных клеток субъекта составляет приблизительно 0,1-5×10⁶/мл, предпочтительно примерно 1-3×10⁶/мл. Если антигены представляют собой растворимые и очищенные антигены, то концентрация специфических целевых антигенов (не включая неспецифический белок) составляет приблизительно 0,1 мкг/мл-10 мг/мл. Рабочая концентрация антигенов, полученная способом 5, примерно составляет количество мембранных антигенов на 0,1-100×10⁶ клетках на мл рабочего раствора. Антигены, полученные способами 6 или 7, обычно рассматриваются в качестве целевых антигенов с концентрацией рабочего раствора 0,1-10 мг/мл.

Целевые антигены с подходящей концентрацией и нецелевой антиген отрицательного контроля были, соответственно, инкубированы вместе с образцом мононуклеарных клеток, предназначенных для тестирования, в лунках планшета для клеточных культур. 100 мкл антигенов и 100 мкл клеток, предназначенных для тестирования, добавляли в каждую лунку и затем инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С. В среде для клеточных культур, предоставляемой настоящим изобретением, активность активированных лимфоцитов наглядно ингибировалась, если активированные лимфоциты в образце, предназначенном для тестирования, встречались со специфическими антигенами. После 3-72 часов инкубации, обычно после 20 часов инкубации проводили тестирование клеточной активности в тестовых лунках, контрольных лунках с нецелевым антигеном и лунках, содержащих только мононуклеарные клетки (без антигена). Наличие активированных лимфоцитов, специфических для известных антигенов, могут быть определены при помощи изменения активности в каждой лунке. Существует два способа для тестирования клеточной активности: прямой способ и опосредованный способ. В первом способе добавляют определенное вещество непосредственно в лунки и клеточную активность оценивают при помощи способности клеток очищать (способность предотвращать проникновение в клетку веществ, таких как тетрабромфлуоресцин, трипановый синий и эозин) или трансформировать (способность преобразовывать растворимый МТТ в кристаллы формазана) вещество, причем указанная способность может быть использована в качестве детектируемого сигнала; во втором способе выбирают способ подходящего детектирования, и детектируемый сигнал согласно принципам реакции настоящего изобретения. Например, если изменение клеточной активности вызвано клеточным апоптозом, то различные способы оценки клеточного апоптоза могут быть использованы в качестве детектируемых сигналов для определения изменения клеточной активности в виде количества апоптозных клеток (см. "Molecular Medicine of Apoptosis" (под редакцией Hu Ye Ling Zhiqiang, Shan Xiaoyun, August, 2002, Military Medical Science Publishing House)).

Детектируемые сигналы в настоящем изобретении означают получение при помощи определенных средств или путем добавки определенного вещества(веществ) результата реакции тестируемых мононуклеарных клеток в тестовой лунке, видимого невооруженным глазом или наблюдаемого при помощи устройств наблюдения, т.е. визуализация (демонстрация) степени результирующих изменений тестируемых мононуклеарных клеток.

Детектируемые сигналы в настоящем изобретении в основном включают в себя

1. МТТ-колориметрию: МТТ добавляют в каждую лунку. Изменения (увеличение или уменьшение) клеточной активности могут быть обнаружены путем наблюдения в различных группах количества кристаллов формазана, образованных клеткой из растворимого МТТ.

2. Способ окрашивания клеток: См. "Molecular Medicine of Apoptosis" (под редакцией Hu Ye, Ling Zhiqiang, Shan Xiaoyun, август, 2002, Military Medical Science Publishing House). Согласно принципам реакции, приведенным в указанной книге, клетки окрашивают красителем гематоксилин-эозином, красителем метиловый зеленый пиронин, красителем Гимза, красителем по Райту. Затем клетки наблюдают под микроскопом. В каждой группе вычисляют процент клеточного апоптоза согласно характерным изменениям, происходящим в апоптозных клетках.

3. Способ окрашивания флуоресцентным антигеном: См. "Molecular Medicine of Apoptosis" (под редакцией Hu Ye, Ling Zhiqiang, Shan Xiaoyun, август, 2002, Military Medical Science Publishing House). Согласно принципам реакции, приведенным в этой книге, в различных группах клетки маркируют/окрашивают акридином оранжевым, пропидиумом йодида, этидием бромида, родамином 123, флуоресцеин изотиоцинатом (антитело-маркер). Затем в каждой группе наблюдают клетки под флуоресцентным микроскопом для определения апоптозных клеток согласно характерным изменениям, происходящим в апоптозных клетках.

4. Иммуносорбентный анализ со связанным ферментом: См. "Molecular Medicine of Apoptosis" (под редакцией Hu Ye, Ling Zhiqiang, Shan Xiaoyun, август, 2002, Military Medical Science Publishing House). Согласно принципам реакции, приведенным в этой книге, используя антигистонные антитела и анти-ДНК антитела и используя иммуноанализ со связанным ферментом для клеточного апоптоза, вычисляют количество апоптозных клеток детектированием количества поврежденных однонитевых и двухнитевых ДНК, вызванное клеточным апоптозом.

Связь между анализом МТТ и анализом клеточного апоптоза заключается в следующем. Способ МТТ использует способность живых клеток превращать растворимый МТТ в бледно-голубые кристаллы формазана (мертвые клетки не обладают такой способностью). Чем больше живых клеток, тем больше активность и тем больше количество бледно-голубых кристаллов формазана, образованных из МТТ. Цель анализа клеточного апоптоза, напротив, заключается в детектировании апоптозных клеток, т.е. количества мертвых клеток. В каждом эксперименте фиксируют количество живых клеток, предназначенных для тестирования. В результате большее количество мертвых клеток указывает на наличие меньшего количества живых клеток. Таким образом, количество бледно-голубых кристаллов формазана, образованных из растворимого МТТ, становится меньше, и наоборот.

Хотя могут быть использованы различные способы для преобразования результатов тестирования настоящего изобретения в детектируемые сигналы различного вида, после сравнения с ними был сделан вывод, что МТТ-колориметрия является наиболее подходящим и чувствительным подходом к отображению результатов тестирования. После культивирования клеток в каждую лунку добавляли по 10-20 мкл МТТ (5 мг/мл). Затем клетки инкубировали при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 5-6 ч, обычно 1-2 ч. Использовали инвертированный микроскоп для обнаружения бледно-голубых кристаллов формазана, образованных из желтого раствора МТТ. В качестве альтернативы, после культивирования клеток из каждой лунки можно удалить супернатант и затем в каждую лунку добавить по 100-150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Культуральную планшету осторожно встряхивали в течение 5 мин для полного растворения бледно-голубых кристаллов формазана. В разных лунках измеряли величину абсорбции при помощи спектрометра с микротитр-планшетом при длине волны максимальной абсорбции 490-590 нм. Обычно длина волны составляла 550 нм. Сравнивали различия между тестовой лункой и лункой с отрицательным контролем для детектирования наличия антиген-специфических активированных лимфоцитов для известных целевых антигенов. Лунки с отрицательным контролем в настоящем изобретении также включают лунки, содержащие только клетки, предназначенные для тестирования (без добавления какого-либо антигена).

Креативность настоящего изобретения заключается в том, что оно предоставляет новый способ, который использует известные антигены, для детектирования специфических активированных лимфоцитов или использует известные специфические активированные лимфоциты для детектирования специфических антигенов. Приготовление различных антигенов и подходы для получения антигенов не относятся к содержанию настоящего изобретения. Антигены, полученные с использованием любого подхода или в любом виде, могут использоваться в эксперименте настоящего изобретения и могут дать соответствующие результаты. Использование различных антигенов означает только то, что специфичности активированных лимфоцитов, предназначенных для тестирования, являются различными. Использование различных антигенов не оказывает влияния на выполнение эксперимента, результат эксперимента, а также на определение положительного и отрицательного результатов. В настоящем изобретении может быть использовано множество антигенов, но в данном описании будут представлены только некоторые примеры для иллюстрации выполнения эксперимента, цели и значения изобретения. Способ, предоставленный настоящим описанием, называется анализом специфичности активированных лимфоцитов (ALSA). Контрольный эксперимент согласно изобретению представляет собой культуру смешанных лимфоцитов (MLC) (Science 143, 813-814, 1964; Blood 23(1): 108-116, 1964).

Настоящее изобретение вместе с другими его задачами и преимуществами будет лучше понято из нижеследующего описания, рассматриваемого совместно с прилагаемыми чертежами.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 Снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC, непосредственно наблюдаемые под инвертированным микроскопом (10×4), в которых реактивные (иммунокомпетентные) клетки получены от нормального пациента, который никогда не подвергался трансплантации органа; эксперимент представляет собой отрицательный контрольный эксперимент (в реактивных (иммунокомпетентных) клетках отсутствуют какие-либо лимфоциты активированные, какими-либо HLA-антигенами). Два снимка слева представляют собой результаты тестирования ALSA экспериментальной группы (Фиг.1В) и контрольной группы (Фиг.1С); два снимка справа представляют собой результаты тестирования MLC экспериментальной группы (Фиг.1А) и контрольной группы (Фиг.1D).

Фиг.2 Снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC, непосредственно наблюдаемые под инвертированным микроскопом (10×10), в которых иммунокомпетентные клетки получены от пациентов с трансплантацией сердца, у которых при помощи биопсии было установлено, что отторжение аллотрансплантанта не произошло. Два снимка слева представляют собой результаты тестирования ALSA экспериментальной группы (Фиг.2В) и контрольной группы (Фиг.2С); два снимка справа представляют собой результаты тестирования MLC экспериментальной группы (Фиг.2А) и контрольной группы (Фиг.2D).

Фиг.3 Снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC, непосредственно наблюдаемые под инвертированным микроскопом (10×4), в которых иммунокомпетентные клетки получены от пациентов с трансплантацией сердца, у которых при помощи биопсии было установлено наличие отторжения первой степени. Два снимка слева представляют собой результаты тестирования ALSA экспериментальной группы (Фиг.3В) и контрольной группы (Фиг.3С); два снимка справа представляют собой результаты тестирования MLC экспериментальной группы (Фиг.3А) и контрольной группы (Фиг.3D).

Фиг.4 Снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC, непосредственно наблюдаемые под инвертированным микроскопом (10×10), в которых иммунокомпетентные клетки получены от пациентов, у которых при помощи биопсии было установлено наличие отторжения третьей степени. Два снимка слева представляют собой результаты тестирования ALSA экспериментальной группы (Фиг.4В) и контрольной группы (Фиг.4С); два снимка справа представляют собой результаты тестирования MLC экспериментальной группы (Фиг.4А) и контрольной группы (Фиг.4D).

Примеры

Нижеследующие примеры предоставлены только с иллюстративной целью. Они никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Описание способа согласно изобретению

Активированные лимфоциты были получены при помощи однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов (MLC): примированные (иммунокомпетентные) лимфоциты и лимфоциты-стимуляторы были получены из периферической крови неродственных здоровых добровольцев, соответственно. Лимфоциты получали при помощи выделения их из периферической крови с использованием коммерческого раствора для отделения клеток. Клетки-стимулираторы (HLA-антигены, экспрессированные на их клеточных мембранах, использовались для стимуляции активации (усиления клеточной активности) или апоптоза (уменьшения клеточной активности) реактивных (иммунокомпетентных) клеток) обрабатывали 25 мкг/мл митомицина, после чего промывали нормальным физиологическим раствором. Затем часть из них использовали для культивировании клеток первичной однонаправленной MLC (получение активированных лимфоцитов), а другие хранили в замороженном состоянии (-70°С) обычным способом для дальнейшего использования (для повторной стимуляции активированных лимфоцитов из первичной MLC).

После 4 дней обычного культивирования первичной однонаправленной MLC клетки собрали и использовали в качестве активированных лимфоцитов. Эти лимфоциты после однократной промывки средой 1640 без сыворотки повторно использовали в настоящем изобретении в качестве иммунокомпетентных клеток, а также в контрольном исследовании. В настоящем изобретении и в контрольном исследовании: клетки, которые хранили в замороженном состоянии и которые использовались в реакции первичной однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов, использовали в качестве клеток-стимуляторов. Суспензию примированных лимфоцитов и клеток-стимуляторов готовили в культуральной среде 1640 c 10% FCS (2×10⁶ клеток/мл). Концентрация очищенных моноклональных антител (N-mAb) 5C9, нейтрализующих IL-2, составляла 8 мг/мл (коммерчески доступные от Department of Immunology. Forth Military Medical University. China). Как эксперимент, так и контрольный эксперимент имели обрабатываемую и контрольную группы. Контрольный эксперимент, по существу, заключался в проведении повторной MLC: тест ALSA, по существу, заключался в добавлении 15 мкл N-mAb в тестовую систему повторно проводимой MLC.

ALSA тестовая группа:

группа В, тестовая группа: 100 мкл иммунокомпетентных клеток + 100 мкл клеток-стимуляторов + 15 мкл N-mAb;

группа С, контрольная группа: 100 мкл клеток-стимуляторов + 100 мкл культуральной среды 1640 c 10% FCS + 15 мкл N-mAb.

MLC тестовая группа:

группа А, тестовая группа: 100 мкл иммунокомпетентных клеток + 100 мкл клеток-стимуляторов;

группа D, контрольная группа: 100 мкл клеток-стимуляторов + 100 мкл культуральной среды 1640 с 10% FCS.

Планшеты для культивирования клеток представляли собой 96-луночные планшеты с U-образным профилем, каждая группа включала в себя по три параллельные лунки. По 100 мкл иммунокомпетентных клеток засевали в каждую лунку. В две тестовые группы дополнительно добавляли по 100 мкл клеток-стимуляторов. Напротив, в две контрольные группы вместо клеток-стимуляторов добавляли по 100 мкл культуральной среды 1640 с 10% FCS. В тесте ALSA в каждую лунку в двух группах добавляли по 15 мкл N-mAb. Клетки культивировали при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 20-24 часов, затем в каждую лунку добавляли по 10 мкл раствора МТТ и держали в инкубаторе еще один час. Результаты просматривали под инвертированным микроскопом. В качестве альтернативы, из каждой лунки удаляли культуральную среду и в каждую лунку добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида для растворения во всех лунках бледно-голубых кристаллов. В каждой лунке величину абсорбции измеряли микропланшетным ридером при 550 нм.

Таблица 1 Результаты тестов трех ALSA и MLC экспериментов с тремя парами клеток-стимуляторов и иммунокомпетентных клеток от 6 различных индивидуумов. Клетки культивировали в течение 20 часов (МТТ-хромометрия)
Экспери- мент	ALSA			MLC
	Группа В Тест-группа	Группа С Контрольная группа	Процент ингибирования (%)	Группа А Тест-группа	Группа D Контрольная группа	Процент ингибирования (%)
1	0,339	0,433	-22	0,744	0,667	+12
2	0,261	0,470	-44	0,640	0,540	+19
3	0,240	0,588	-41	0,706	0,732	-4

Примечание: каждое значение в тестовой группе и контрольной группе представляет собой среднее значение для группы из трех параллельных проб в лунках; процент ингибирования указывает на степень ингибирования клетками-стимуляторами (HLA-антиген) специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на HLA-антиген; в тесте ALSA в каждую лунку добавляли метилпреднизолон и FK506 до конечной концентрации 5 мкг/мл и 0,125 мг/мл соответственно. В тесте MLC иммуносупрессивный агент не использовался. Здесь и далее в настоящем описании «процент ингибирования»=(среднее значение для трех параллелей в тестовой группе при А550 нм/среднее значение для трех параллелей в контрольной группе при А550 нм)×100%, причем “-” означает ингибирование, “+” означает усиление.

Как в тесте ALSA, так и в тесте MLC в тестовых группах к одному и тому же количеству иммунокомпетентных клеток добавляли клетки-стимуляторы. Согласно современной иммунологической теории в тесте MLC активность клеток в тестовых группах должна заметно увеличиться. По меньшей мере способность преобразования МТТ клеток в тестовой группе не должна быть ниже таковой в контрольной группе, которая содержит только иммунокомпетентные клетки. Однако результат в Таблице 1 показывает, что результат теста MLC может либо увеличиваться, либо уменьшаться, но не оставаться стабильным. В современной иммунологии повсеместно отвергается использование MLC для детектирования специфических активированных лимфоцитов (т.е. вторичный MLC). Другими словами, способ MLC не является подходящим для детектирования специфичности активированных лимфоцитов. Однако в тесте ALSA клеточная активность в тестовой группе намного слабее, чем клеточная активность в контрольной группе, что является полной противоположностью результату, который должен быть в тесте MLC. Положительный результат показывает эффект ингибирования, т.е. если лимфоциты, которые могут быть активированы тестируемыми антигенами, присутствуют среди иммунокомпетентных клеток, то активность лимфоцитов в тестовой группе ингибируется. В результате активность в тестовой группе слабее, чем активность в контрольной группе. Как показано результатами того же тестирования клеток от различных индивидуумов, способ является надежным. Таким образом, хотя тест ALSA, который проводится путем добавления в MLC тестовую систему моноклональных антител, нейтрализующих IL-2, имеет отношение к тесту MLC, тест ALSA является действительно новым способом, который полностью отличается от теста MLC, что подтверждается тем, что ингредиенты тестовой системы, результаты и статистическая значимость отличаются от таковых для теста MLC. Целью использования иммуносупрессивных агентов в основном является улучшение чувствительности, стабильности и повторяемости результатов тестирования. Если отторжение аллотрансплантанта является относительно сильным, то эффекты ингибирования могут быть хорошими даже без добавления иммуносупрессивного агента (См. таблицу 4 в примере 2).

Пример 2. Использование способа согласно изобретению для диагностики отторжения трансплантата

1. Приготовление клеток-стимуляторов (используемых в качестве клеток, содержащих HLA-антигены, предназначенные для тестирования): Во время трансплантации сердца, брали образец селезенки донора и растирали на сетке калибра 200. Полученные в результате клетки дважды промывали культуральной средой 1640 (GIBCO Company) без сыворотки при 1500 об/мин. Супернатант удаляли и готовили преципитат путем добавления культуральной среды 1640 (GIBCO Company) без сыворотки в суспензию клеток до концентрации 1×10⁸ клеток/мл. Для получения мононуклеарных клеток использовали обычную среду для отделения человеческих лимфоцитов (GIBCO Company). Клетки центрифугировали в течение 20 мин при 2000 об/мин в горизонтальной центрифуге. Затем клетки на границе между раствором для отделения клеток и средой 1640 удаляли и помещали в другую обеззараженную центрифужную пробирку. Клетки дважды промывали средой 1640 без сыворотки при 1500 и 1000 об/мин соответственно. Затем супернатант удаляли (если присутствовали красные кровяные клетки, клетки следовало суспендировать в 0,83% раствора NH₄Cl при 37-40°С, затем поместить в водяную баню при 37-40°С на 10 мин и, наконец, дважды промыть средой 1640 без сыворотки при 1000 об/мин) и готовили суспензию клеток, добавляя в преципитат среду 1640 без сыворотки, содержащую 25 мкг/мл митомицина (компания Sigma) до концентрации 1×10⁷ клеток/мл. Клетки помещали в водяную баню при 37°С на 40 мин, затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли и осажденные клетки промывали три раза средой 1640 без сыворотки при 1000 об/мин. Преципитат доводили до получения клеточной суспензии с концентраций 2×10⁷ клеток/мл при помощи раствора, хранящегося в замороженном виде (приготовленного согласно "Practical Monoclonal Antibody Technology" под редакцией Hu Zhikai, Shaan Xi Science and Technology Publishing House, 1992, edition 1). Клеточную суспензию распределяли по пробиркам для хранения в замороженном состоянии и хранили при -70°С в рефрижераторе или жидком азоте для дальнейшего использования.

2. Очищенные моноклональные антитела, нейтрализующие IL-2 (производства Department of Immunology, Fourth Military Medical University), готовили, используя среду 1640 без сыворотки или раствор PSB до 6 мг/мл. Для фильтрования бактерий использовали одноразовые иглы-фильтры. Раствор хранили при -20°С для дальнейшего использования. В качестве рабочего раствора готовили 5 мг/мл тетразолия (МТТ, компании Sigma) при помощи нормального физиологического раствора. Для фильтрования бактерий из рабочего раствора использовали одноразовые иглы-фильтры. Отфильтрованный раствор делили на две пробирки и хранили при -20°С для дальнейшего использования.

3. Приготовление иммунокомпетентных клеток (могут содержать монуклеарные клетки активированных лимфоцитов, предназначенных для тестирования): спустя 6 месяцев после трансплантации сердца (обычно регулярное тестирование можно проводить через 5 дней после трансплантации сердца или когда есть подозрение на то, что произошло отторжение). 5-20 мл венозной крови получали от реципиентов, у которых при помощи биопсии было установлено, что отторжение не произошло, и от реципиентов, у которых при помощи биопсии было установлено наличие отторжения первой или третьей степени. Кроме того, 10 мл периферической крови получили от нормальных индивидуумов, которые никогда не подвергались трансплантации. Мононуклеарные клетки приготовили способами, описанными выше, и использовали в качестве иммунокомпетентных клеток, которые могли содержать антиген-специфические активированные лимфоциты донора; мононуклеарные клетки от нормальных индивидуумов использовали в качестве иммунокомпетентных клеток, т.е. отрицательного контроля, который не содержал антиген-специфические активированные лимфоциты донора (клетки-стимуляторы, используемые в эксперименте, могут быть клетками донора от любого пациента с трансплантацией); клетки дважды промывали путем центрифугирования в среде 1640 без сыворотки и преципитат готовили в виде клеточной суспензии с концентрацией 2×10⁶ клеток/мл в среде 1640, содержащей 0,125 нг FK506 (торговая марка Prograf, производства Ireland Fujisawa Limited Company) и 5 мкг метилпреднизолона (производства Belgium Pharmacia & Upjohn Company) на мл с 20% FCS (компании GIBCO). Замороженные клетки селезенки донора размораживали во время приготовления иммунокомпетентных клеток. Клетки промывали средой 1640 без сыворотки при 1000 об/мин. Преципитат готовили в виде клеточной суспензии с концентрацией 2×10⁶ клеток/мл в среде 1640 с 20% FCS и иммунносупрессивными агентами и в дальнейшем использовали в качестве клеток-стимуляторов (содержащих HLA-антигены донора).

4. Клетки донора (клетки-стимуляторы), клетки реципиента (иммунокомпетентные клетки) и IL-2 N-mAb засевали в 96-луночный планшет с U-образным профилем, количество которых в каждой группе было следующим: группа А: 100 мкл иммунокомпетентных клеток + 100 мкл клеток-стимуляторов; группа В: 100 мкл иммунокомпетентных клеток + 100 мкл клеток-стимуляторов + 15 мкл IL-2 N-mAb; группа С: 100 мкл иммунокомпетентных клеток + 100 мкл клеток-стимуляторов + 15 мкл IL-2 N-mAb + 100 мкл среды 1640, используемой для разбавления клеток; группа D: 100 мкл иммунокомпетентных клеток + 100 мкл среды 1640, используемой для разбавления клеток. Каждая группа включала по три лунки. Группа В и группа С, которые содержали IL-2 N-mAb, представляли собой тестовую группу и контрольную группу в тесте ALSA, соответственно. Группа А и группа D, которые не содержали IL-2 N-mAb, представляли собой тестовую группу и контрольную группу в тесте MLC, соответственно. Клетки-стимуляторы в отрицательном контрольном эксперименте могут быть клетками донора от любого пациента с трансплантированным сердцем, и иммунокомпетентные клетки могут быть получены из мононуклеарных клеток периферической крови нормальных индивидуумов, которые никогда не подвергались трансплантации сердца. После завершения вышеперечисленных процедур планшету для культивирования клеток инкубировали при 37°С в СО₂-инкубаторе.

5. Результат колориметрии с солью тетразолия (МТТ): после культивирования в течение 20 часов в каждую лунку добавляли 10 мкл МТТ и держали в инкубаторе в течение еще одного часа. Результат наблюдали под инвертированным микроскопом для детектирования количества бледно-голубых кристаллов формазана, образованных из желтого растворенного МТТ в каждой лунке. В качестве альтернативы, в тесте могла быть использована колориметрия с солью тетразолия (МТТ): среду для клеточных культур удаляли из каждой лунки; затем в каждую лунку добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и осторожно встряхивали в течение 5 мин для полного растворения в лунках бледно-голубых кристаллов формазана. В каждой лунке измеряли величину абсорбции при 550 нм со счетчиком микроплаты.

А. Результаты прямого наблюдения под инвертированным микроскопом показаны на Фиг. 1, 2, 3 и 4 (маркеры А, В, С и D на разных фигурах соответствуют названиям групп на фигурах, например, А означает группу А).

На Фиг.1 представлены снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC при непосредственном наблюдении под инвертированным микроскопом (10×4), причем реактивные (иммунокомпетентные) клетки получены от нормального человека, который никогда не подвергался трансплантации органов. Как можно видеть на снимках между результатами ALSA тестовой/экспериментальной группы (Фиг.1В) и контрольной группы (Фиг.1С), значимое различие отсутствует. Также отсутствует значимое различие между результатами ALSA тестовых групп (Фиг.1А) и контрольной группы (Фиг.1D). Все эти результаты указывают на отсутствие активированных лимфоцитов, соответствующих HLA-антигенам, переносимыми клетками-стимуляторами. Однако клеточная активность контрольной группы в тесте ALSA намного слабее, чем клеточная активность контрольной группы в тесте MLC, что указывает на то, что IL-2 N-mAb оказывает ингибиторное влияние на клеточную активность.

На Фиг.2 представлены снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC при непосредственном наблюдении под инвертированным микроскопом (10×10), причем иммунокомпетентные клетки получены от пациентов с трансплантацией сердца, биопсия которых не подтвердила отторжения аллотрансплантанта. Результаты тестовой группы в тесте ALSA не являются значительно более слабыми, чем результаты контрольной группы, что указывает на отсутствие активированных лимфоцитов, соответствующих HLA-антигенам, переносимым клетками-стимуляторами (клетками донора) в иммунокомпетентные клетки, т.е. на отсутствие иммунной реакции (реципиент не атакует клетки донора). Этот результат соответствует результату биопсии.

На Фиг.3 представлены снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC при непосредственном наблюдении под инвертированным микроскопом (10×4), причем иммунокомпетентные клетки получены от пациентов с трансплантацией сердца, у которых при помощи биопсии было установлено отторжение первой степени аллотрансплантанта. На двух снимках слева представлены результаты тестирования ALSA экспериментальной группы (Фиг.3В) и контрольной группы (Фиг.3С); на двух снимках справа представлены результаты тестирования MLC экспериментальной группы (Фиг.3A) и контрольной группы (Фиг.3D). Результаты тестовой группы в тесте ALSA являются значительно более слабыми, чем результаты контрольной группы, что указывает на наличие активированных лимфоцитов, соответствующих HLA-антигенам, переносимым клетками-стимуляторами (клетками донора) в реактивные клетки (иммунокомпетентные клетки), т.е. на наличие иммунной реакции (реципиент атакует клетки донора). Этот результат соответствует результату биопсии. Однако между результатами MLC тестовой группы и контрольной группы отсутствует значимое различие, что указывает на то, что тест MLC не является подходящим для диагностики отторжения при трансплантации органа.

На Фиг.4 представлены снимки, показывающие результаты теста ALSA и теста MLC при непосредственном наблюдении под инвертированным микроскопом (10×10), причем иммунокомпетентные клетки получены от пациентов с трансплантацией сердца, у которых при помощи биопсии было установлено отторжение третьей степени аллотрансплантанта. На двух снимках слева представлены результаты тестирования ALSA экспериментальной группы (Фиг.4В) и контрольной группы (Фиг.4С); на двух снимках справа представлены результаты тестирования MLC экспериментальной группы (Фиг.4A) и контрольной группы (Фиг.4D). Как можно видеть на снимках, клеточная активность тестовой группы в тесте ALSA полностью ингибируется (Фиг.4В). Напротив, клеточная активность контрольной группы является все еще относительно сильной, что указывает на наличие активированных лимфоцитов, соответствующих HLA-антигенам, переносимыми клетками-стимуляторами (клетками донора) в реактивные клетки (клетки реципиента), т.е. на наличие иммунной реакции (реципиент атакует клетки донора). Сравнение с контрольной группой показало, что клеточная активность в тестовой группе в тесте MLC является намного слабее (Фиг.4А). Это может указывать на наличие в реактивных клетках большего количества активированных лимфоцитов, соответствующих антигенам донора, поскольку такая ситуация редко имеет место при отторжении первой степени.

Как можно отметить из вышеуказанных результатов, в случае отторжения клеточная активность в тестовой группе в тесте ALSA намного слабее, чем клеточная активность в контрольной группе (Фиг.3В, 3С, 4В и 4С). Фиг.3В и 4В не показывают образования кристаллов формазана, что указывает на наличие в мононуклеарных клетках реципиента лимфоцитов, активированных HLA-антигенами, экспрессируемыми клетками донора, т.е. реципиент инициировал иммунную реакцию против HLA-антигенов донора. Результат биопсии подтвердил, что у пациентов произошло отторжение ранней и третьей степени. Однако результаты тестовой группы и контрольной группы в тесте MLC иногда различались (Фиг.4А и 4D), а иногда не различались (Фиг.3А и 3D), указывая на то, что тест MLC не является подходящим для детектирования наличия активированных лимфоцитов и диагностики отторжения при трансплантации органа.

В случае отсутствия отторжения клеточная активность в тестовой группе и контрольной группе теста ALSA может быть слабее, чем клеточная активность в тесте MLC (Фиг.1В и 1С). Однако между клеточной активностью в тестовой группе и контрольной группе в тесте ALSA значимое различие отсутствует (Фиг.1В, 1С, 2В и 2С).

Колориметрия: Помимо прямого наблюдения под инвертированным микроскопом результат теста ALSA также может быть представлен при помощи колориметрии. Из каждой лунки удаляли среду для клеточных культур; затем в каждую лунку добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и осторожно встряхивали в течение 5 мин для полного растворения в лунках кристаллов формазана. В каждой лунке величину абсорбции измеряли микропланшетным ридером при 550 нм.

Отбирали венозную кровь реципиента, у которого было установлено наличие отторжения первой степени, для получения лимфоцитов, предназначенных для тестирования. Повторяли процедуры в п.1-4 с различными концентрациями клеток-стимуляторов. Результаты колориметрии представлены в таблице 2.

Таблица 2 Реакционные клетки получали из периферической крови реципиентов, которые были подвергнуты трансплантации сердца и у которых при помощи биопсии было установлено наличие отторжения первой степени; в качестве клеток-стимуляторов использовали клетки селезенки донора, которые хранили в замороженном виде; и в тестах ALSA и MLC наблюдали влияние, связанное с различной концентрацией клеток-стимуляторов
Концентрация клеток-стимуляторов (/мл)	ALSA			MLC
	Группа В Тест-группа	Группа С Контрольная группа	Процент ингибирования (%)	Группа А Тест-группа	Группа D Контрольная группа	Процент ингибирования (%)
106	0,135	0,223	-39	0,389	0,304	+28
105	0,266	0,276	-4	0,296	0,309	-4
104	0,221	0,266	-17	0,426	0,385	+11
103	0,266	0,29	-8	0,450	0,361	+25
102	0,273	0,383	-29	0,517	0,418	+24
101	0,355	0,275	+29	0,456	0,400	+14
100	0,315	0,249	+27	0,396	0,361	+10

Примечание: см. примечание к таблице 1.

В таблице 2 показано, что результаты тестовой группы в тесте ALSA являются значительно более слабыми, чем результаты контрольной группы, что указывает на наличие лимфоцитов, активированных HLA-антигенами донора в реактивных клетках, т.е. реципиент инициировал иммунную реакцию против органов донора. Этот результат соответствует результату биопсии. Концентрации клеток-стимуляторов в тесте ALSA могли находиться в пределах 10⁶-10²/мл, т.е. для тестирования наличия активированных лимфоцитов, соответствующих антигенам, может быть использована любая концентрация в этих пределах. Концентрация ниже 10²/мл не могла обеспечить детектирование наличия активированных лимфоцитов, соответствующих антигенам, следовательно, она не может быть использована в диагностике отторжения. Другими словами, при анализе активированных лимфоцитов, для получения точного результата концентрация антигенов, предназначенных для тестирования, должна достигать определенного порога, ниже которого может иметь место ложный отрицательный результат (см. таблицу 2: несовпадение результата биопсии с результатами теста при использовании клеток-стимуляторов при концентрации 10¹/мл и 10⁰/мл соответственно). Из таблицы 2 видно, что эффект ингибирования становится выше при использовании концентрации клеток-стимуляторов 10⁶ клеток/мл и 10² клеток/мл, при этом результаты составляют -39% и -29% соответственно. Это дополнительно подтверждает заключение, сделанное в работе (Annu. Rev. Immunol. 1999, 17:221-53) о том, что слишком большое количество или слишком малое количество антигенов может свидетельствовать об индуцировании процесса активного апоптоза специфических активированных лимфоцитов.

Отбирали венозную кровь у реципиента, у которого было установлено наличие отторжения первой степени, для получения лимфоцитов, предназначенных для тестирования. Процедуры в п.1-4 повторяли с различными концентрациями клеток-стимуляторов. Результаты колориметрии представлены в таблице 3.

Таблица 3 Реакционные клетки получали из периферической крови реципиентов, которые были подвергнуты трансплантации сердца и у которых при помощи биопсии было установлено наличие отторжения первой степени; в качестве клеток-стимуляторов использовали клетки селезенки донора, которые хранили в замороженном виде; и в тестах ALSA и MLC производили наблюдение в динамике в различные моменты времени культивирования клеток
Время культивирования клеток (ч)	ALSA			MLC
	Группа В Тест-группа	Группа С Контрольная группа	Процент ингибирования (%)	Группа А Тест-группа	Группа D Контроль-ная группа	Процент ингибирования (%)
1	0,137	0,124	+10	0,310	0,192	+61
2	0,071	0,09	-21	0,153	0,109	+40
3	0,113	0,114	-1	0,240	0,160	+50
4	0,039	0,062	-37	0,150	0,162	-7
5	0,058	0,156	-63	0,270	0,232	+16
6	0,029	0,082	-65	0,400	0,181	+121
7	0,039	0,151	-74	0,259	0,269	-4
9	0,032	0,033	-3	0,225	0,207	+9
11	0,027	0,054	-50	0,169	0,248	-32
13	0,042	0,068	-38	0,230	0,350	-34
15	0,11	0,164	-33	0,265	0,200	+32
17	0,073	0,09	-19	0,133	0,183	-27
20	0,09	0,137	-34	0,162	0,203	-20

Примечание: см. примечание к таблице 1.

Результаты наблюдения в динамике показали, что клеточная активность в тесте ALSA является значительно более слабой, чем клеточная активность в контрольной группе после 2 часов культивирования, что указывает на наличие лимфоцитов, активированных HLA-антигенами донора в реактивных клетках (в настоящем изобретении несколько раз подчеркивалось, что если клеточная активность в тестовой группе в тесте ALSA является значительно более слабой, чем клеточная активность в контрольной группе, это указывает на наличие специфических лимфоцитов, активированных HLA-антигенами донора, переносимыми клетками-стимуляторами в реактивные клетки), т.е. реципиент инициировал иммунную реакцию против органов донора. Этот результат соответствует результату биопсии. Наивысший эффект ингибирования наблюдался после 7 часов культивирования клеток, с процентом ингибирования, составляющим 74%. Данный результат также указывает, что тест ALSA, при использовании в клинике, может давать стабильные результаты только спустя два часа. Более того, результаты соответствуют результатам биопсии. Напротив, результаты теста MLC, представленные в таблице 3, не являются стабильными, иногда являясь завышенными, иногда заниженными, дополнительно подтверждая, что MLC не следует использовать при диагностике активированных лимфоцитов.

Процедуры в п.1-4 повторяли для тестируемых индивидуумов с различными степенями отторжения; результаты колориметрии представлены в таблице 4. Для группы, обозначенных “*”, не использовался иммуносупрессивный агент в тестах ALSA и MLC, и результаты наблюдали спустя 72 часа культивирования клеток после добавления МТТ.

Таблица 4 Сравнение между ALSA и биопсией при различных степенях отторжения
Степень согласно биопсии	ALSA			MLC
	Группа В Тест-группа	Группа С Контрольная группа	Процент ингибирования (%)	Группа А Тест-группа	Группа D Контрольная группа	Процент ингибирования (%)
Степень 3	0,02*	0,098*	-80	0,118*	0,122*	-3
Степень 1 (ранняя)	0,09	0,137	-34	0,162	0,203	-20
Степень 1	0,135	0,223	-39	0,389	0,304	+28
0	0,263	0,287	-8	0,374	0,328	+14

Из результатов, представленных в таблице 4, видно, что результаты теста ALSA хорошо соответствуют результатам биопсии в клинических условиях. Также может существовать связь между степенями отторжения согласно биопсии и результатами ALSA (процент ингибирования), т.е. чем сильнее отторжение, тем выше процент ингибирования.

Пятнадцать пациентов с трансплантацией сердца находились под наблюдением и более 100 раз были протестированы настоящим способом. Контрольная биопсия проводилась 56 раз. Положительные результаты наблюдали в тесте 29 раз, из которых 18 случаев при помощи биопсии были идентифицированы как бессимптомно протекающее отторжение. Среди этих 18 случаев 4 случая представляли собой третью степень отторжения, 5 представляли собой вторую степень отторжения, девять случаев представляли собой первую степень отторжения. Хотя результаты биопсии в остальных 11 положительных случаях указывали на отклонения, степень отклонения не позволяла поставить диагноз отторжения первой степени. Для 27 случаев, для которых настоящим способом были получены отрицательные результаты, биопсия также показала отрицательные результаты.

Таблица 5 Сравнение соответствия между тестом ALSA и клиническим тестом-биопсией
Способ тестирования		Биопсия
Тест ALSA		Положительная	Отрицательная
	Положительный	18	11
	Отрицательный	0	27

Соответствие, специфичность и чувствительность результатов двух тестов равны 80,3%, 71% и 100% соответственно.

Из таблиц 1, 2, 3 и 4 и Фиг.1, 2, 3 и 4 можно увидеть, что результаты, полученные в тесте ALSA, являются объективными, точными и однозначными. Кроме того, тест ALSA является простым, быстрым и легко стандартизуемым.

Как указывалось выше, отторжение начинается в виде активации лимфоцитов, следовательно, активированные лимфоциты должны присутствовать до начала патологических изменений. В настоящем изобретении делается особый акцент на наличие антиген-специфических активированных лимфоцитов в периферической крови пациентов. Следовательно, отторжение может быть диагностировано при помощи ALSA до начала патологических изменений, обнаруживаемых при помощи биопсий. Это может объяснить наличие в тесте “ложноположительных” случаев. Основываясь на результатах биопсии, 11 ложно-положительных случаев не соответствовали диагностическому стандарту отторжения первой степени, но это не означает, что пациенты являются совершенно нормальными, наоборот, это может быть вызвано неадекватностью результатов самой биопсии. Другими словами, относительно низкая специфичность настоящего способа является следствием его высокой чувствительности.

Каждый пациент с трансплантацией сердца находился под непрерывным наблюдением, и результаты сравнивали с патологическими результатами, полученными при помощи биопсии.

Истинно положительный (ТР): результат теста ALSA является положительным, и результат биопсии указывает на наличие отторжения (≥1 степени).

Истинно отрицательный (TN): результат теста ALSA является отрицательным, и результат биопсии указывает на отсутствие отторжения.

Ложноположительный (FP): результат теста ALSA является положительным, но результат биопсии указывает на отсутствие отторжения.

Ложноотрицательный (FN): результат теста ALSA является отрицательным, но результат биопсии указывает на наличие отторжения(≥1 степени).

Соответствие = (ТР+TN)/(ТР+TN+FP+FN)

Специфичность = TN/(TN+FP)

Чувствительность = ТР/(ТР+FN)

Согласно процедурам, описанным выше, и согласно более чем 100 результатам тестов ALSA и MLC, а также оценкам результатов биопсии можно сделать вывод о том, что настоящее изобретение соответствует диагностическим стандартам, используемым при обнаружении отторжения.

1. Прямое наблюдение под инвертированным микроскопом

Случай отторжения	Клеточная активность в группах А (MLC тестовая группа) и В (ALSA тестовая группа) была значительно слабее, чем клеточная активность в группах С (ALSA контрольная группа) и D (MLC контрольная группа). Клеточная активность могла быть полностью подавлена, главным образом в группе В. Степень ослабления клеточной активности в группе А может иметь отношение к степени отторжения. Более высокая степень отторжения соответствует более низкой клеточной активности. При низкой степени отторжения клеточная активность в группе А не была значительно более низкой, чем клеточная активность в группах С и D. При наличии отторжения клеточная активность в группе В была значительно более низкой, чем клеточная активность в группах С, А и D.
Отсутствие отторжения	Между группами значительное различие в клеточной активности отсутствовало. Напротив, клеточная активность в группах В и С была относительно слабой. Иногда в группе С клеточная активность была даже слабее.
Отсутствие отторжения, пациент перенес вирусное или бактериальное воздействие в момент эксперимента или незадолго до эксперимента	Клеточная активность во всех группах была относительно высокой. Между группами значимое различие в клеточной активности отсутствовало. Напротив, клеточная активность в группах В и С была относительно ослабленной.
Наличие отторжения, пациент перенес вирусное или бактериальное воздействие в момент эксперимента или незадолго до эксперимента	Клеточная активность в группе А могла быть ослабленной. Клеточная активность в группе В была значительно слабее, чем клеточная активность в группах С, А и D. Клеточная активность в группе D была очень сильной, или клеточная активность была очень сильной в группах А, С и D.

2. Измерение величины абсорбции в каждой лунке микропланшетным ридером

После 20 часов культивирования клеток в каждую лунку добавляли по 10 мкл МТТ. Через 0,5-1,5 часа из каждой лунки удаляли среду для клеточных культур, затем в каждую лунку добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и осторожно встряхивали в течение 5 минут для полного растворения в лунках кристаллов формазана. В каждой лунке величину абсорбции измеряли микропланшетным ридером при 550 нм. Лунку, не содержащую клетки, но содержащую 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), использовали в качестве лунки, определяющей нулевую величину. Используя процент ингибирования в качестве стандарта, в качестве положительного результата было определено ингибирование, превышающее 10%, а в качестве возможного положительного результата был определен процент ингибирования между 1 и 10%.

Пример 3. Диагностика пациентов, инфицированных вирусом японского энцефалита В

Получение антигена-стимулятора, специфичного для вируса японского энцефалита В: очищенный вирус японского энцефалита В получали, как описано в Journal of Medical Colleges of PLA 1986, 1(4):356-362 и Journal of Fourth Military Medical University 1984 5, (4):251-254. Вирус фиксировали в течение ночи (примерно 12 часов) в 40 г/л формальдегида при 4°С и затем центрифугировали и четыре раза промывали нормальным физиологическим раствором. Содержание белка измеряли ультрафиолетовым спектрофотометром. Полученные антигены разделяли на две пробирки, лиофилизировали и хранили в холодильнике при -70°С.

Получение очищенных IL-2 N-mAb и тетразолия (МТТ) описано в примере 2.

Получение мононуклеарных клеток, предназначенных для тестирования: 5-10 мкл венозной крови отбирали у инфицированных вирусом японского энцефалита В пациентов с точно поставленным диагнозом во время фазы заболевания с повышенной температурой. Мононуклеарные клетки получали, используя способ, описанный в примере 2. Клетки дважды промывали средой 1640 без сыворотки и преципитат готовили в виде клеточной суспензии с концентрацией 2×10⁶ клеток/мл в среде 1640 (0,125 нг FK506 и 5 мкг метилпреднизолона на мл) с 20% FCS. Брали замороженный вирус японского энцелифата В и для дальнейшего использования готовили в виде суспензии вирусного белка с концентрацией 3 мг/мл в среде 1640 (0,125 нг FK506 и 5 мкг метилпреднизолона на мл) с 20% FCS.

Мононуклеарные клетки, вирусную суспензию и IL-2 N-mAb засевали 96-луночную планшету с U-образным профилем, количество которых в каждой группе было следующим: тестовая группа: 100 мкл клеток от тестируемых пациентов + 100 мкл вирусной суспензии + 35 мкл IL-2 N-mAb; контрольная группа: 100 мкл клеток от тестируемых пациентов + 35 мкл IL-2 N-mAb+ 100 мкл среды 1640, используемой для разбавления клеток. Каждая группа включала три лунки. После завершения вышеуказанных процедур планшету для культивирования клеток инкубировали при 37°С в СО₂ инкубаторе.

МТТ хромогенный способ: после 7 часов культивирования клеток в каждую лунку добавляли по 5 мкл МТТ и держали в инкубаторе в течение еще одного часа. Из каждой лунки удаляли среду для клеточных культур, затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и осторожно встряхивали в течение 5 минут для полного растворения в лунках кристаллов формазана. В каждой лунке величину абсорбции измеряли микропланшетным ридером. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 Результаты тестирования пациентов с точно установленным диагнозом инфицирования вирусом японского энцефалита В, находящихся в фазе заболевания с повышенной температурой, способом ALSA
Случай	Тест ALSA
	Тестовая группа	Контрольная группа	Процент ингибирования (%)
1	0,167	0,469	-64
2	0,254	0,482	-47

Примечание: каждая величина в тестовой группе и контрольной группе представляет собой среднее значений в трех лунках; процент ингибирования переставляет степень ингибирования антигена вируса японского энцефалита В в специфических активированных лимфоцитах; в тесте ALSA в каждую лунку добавляли метилпреднизолон и FK506 до конечной концентрации 5 мкг/мл и 0,125 нг/мл соответственно.

Из таблицы 6 видно, что в мононуклеарных клетках эффект ингибирования антигена вируса японского энцефалита В достигает 64% и 47% соответственно, указывая на наличие большого количества активированных лимфоцитов, соответствующих антигену вируса японского энцефалита В в реактивных клетках, т.е. на то, что пациенты были недавно инфицированы или вакцинированы вирусом вируса японского энцефалита В.

Claims (23)

1. Способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов в организме, предусматривающий следующие стадии:
а) разбавление антигена или антигенов, способных активировать лимфоциты в организме, средой, содержащей дополнительно к стандартным ингредиентам, используемым для клеточных культур, нейтрализующие антитела против цитокинов, которые могут индуцировать клеточную пролиферацию, и/или цитокины, способные индуцировать апоптоз мононуклеарных клеток или ингибировать активацию клеток или клеточную пролиферацию;
б) приготовление суспензии мононуклеарных клеток, содержащей активированные лимфоциты, предназначенные для тестирования в среде;
в) инкубацию смеси антигена и суспензии, содержащей активированные лимфоциты, полученных на стадиях а) и б), в лунках планшета для клеточных культур; и
г) определение наличия антигенспецифических активированных лимфоцитов путем сравнения различий в детектируемых сигналах, исходящих от тестовых лунок и контрольных лунок планшета.

2. Способ по п.1, в котором антиген или антигены выбраны из группы человеческих антигенов гистосовместимости, аллогенных антигенов, гетероантигенов, вирусных антигенов или бактериальных антигенов.

3. Способ по п.2, в котором антиген или антигены представляют собой корпускулярный или растворимый антиген, а человеческие антигены гистосовместимости представляют собой один из антигенов HLA типа I или типа II или их смесь.

4. Способ по п.1, в котором среда дополнительно содержит иммуносупрессивные агенты и/или противоопухолевые лекарственные препараты, причем количество используемых иммуносупрессивных агентов и/или противоопухолевых лекарственных препаратов составляет 0,001 нг - 100 мкг/мл в среде, при этом количество используемых нейтрализующих антител против цитокинов составляет 1 мкг - 10 мг/мл среды, и количество используемых цитокинов, которые индуцируют апоптоз мононуклеарных клеток, или ингибируют активацию клеток, или ингибируют клеточную пролиферацию, составляет 0,01-1000 единиц активности/мл среды.

5. Способ по п.1, в котором детектируемые сигналы представляют собой сигналы, которые могут отражать изменения клеточной активности в лунках.

6. Способ по п.4, в котором иммуносупрессивные агенты выбраны из прографа FK506, циклоспоринов, циклофосфамида, азатиоприна, рапамицина, RS-61443, BQR, иммуносупрессанта, секретируемого человеческой клеточной линией JM острой Т-лимфоцитарной лейкемии, дезоксиспергуалина и гормона коры надпочечников, и в котором противоопухолевые лекарственные препараты выбраны из ингибитора топоизомеразы, алкилирующего агента, антиметаболита, производных ретиноевых кислот - витамина А и других лекарственных препаратов, которые потенциально способны индуцировать иммуносупрессивную функцию или индуцировать апоптоз опухолевых клеток.

7. Способ по п.6, в котором иммуносупрессивные агенты и противоопухолевые лекарственные препараты используют по отдельности или в сочетании.

8. Способ по п.6, в котором гормон коры надпочечников выбран из медрата, преднизона, гидрокортизона или дексаметазона.

9. Способ по п.6, в котором циклоспорины выбраны из циклоспорина А или циклоспорина С.

10. Способ по п.4, в котором цитокины, которые могут стимулировать клеточную пролиферацию, выбраны из интерлейкина 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, α-интерферона, β-интерферона, ω-интерферона, γ-интерферона, колониестимулирующего фактора гранулоцитов, колониестимулирующего фактора макрофагов, колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов, фактора стволовых клеток или тромбопоэтина.

11. Способ по п.4, в котором цитокины, которые могут ингибировать активацию мононуклеарных клеток и клеточную пролиферацию, выбраны из IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 или трансформирующего фактора роста β.

12. Среда для детектирования специфичности активированных лимфоцитов, содержащая дополнительно к стандартным ингредиентам, используемым для клеточных культур, иммуносупрессивные агенты и/или противоопухолевые лекарственные препараты, нейтрализующие антитела против цитокинов, которые могут индуцировать клеточную пролиферацию, и/или цитокины, способные ингибировать активацию клеток или клеточную пролиферацию.

13. Среда по п.12, в которой количество используемых иммуносупрессивных агентов составляет 0,001 нг - 100 мкг/мл среды.

14. Среда по п.12, в которой количество используемых нейтрализующих антител против цитокинов, которые могут индуцировать клеточную пролиферацию, составляет 1 мкг - 10 мг/мл среды.

15. Среда по п.12, в которой количество используемых цитокинов, которые ингибируют активацию мононуклеарных клеток или клеточную пролиферацию, составляет 0,01-1000 единиц активности/мл среды.

16. Среда по п.14, в которой нейтрализующие антитела против цитокинов используют по отдельности или в сочетании.

17. Среда по п.14 или 15, в которой нейтрализующие цитокины антитела и цитокины, которые ингибируют активацию мононуклеарных клеток или клеточную пролиферацию, используются по отдельности или в сочетании.

18. Среда по п.13, в которой иммуносупрессивные агенты выбраны из прографа FK506, циклоспоринов, циклофосфамида, азатиоприна, рапамицина, RS-61443, BQR, дезоксиспергуалина и гормона коры надпочечников и в которой противоопухолевые лекарственные препараты выбраны из ингибитора топоизомеразы, алкилирующего агента, антиметаболита, производных ретиноевых кислот - витамина А и других лекарственных препаратов, которые потенциально способны индуцировать иммуносупрессивную функцию или индуцировать апоптоз опухолевых клеток.

19. Среда по п.18, в которой иммуносупрессивные агенты и противоопухолевые лекарственные препараты используются по отдельности или в сочетании.

20. Среда по п.18, в которой гормон коры надпочечников выбран из медрата, преднизона, гидрокортизона или дексаметазона.

21. Среда по п.18, в которой циклоспорины выбраны из циклоспорина А или циклоспорина С.

22. Среда по п.14, в которой цитокины, которые могут стимулировать клеточную пролиферацию, выбраны из интерлейкина 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, α-интерферона, β-интерферона, ω-интерферона, γ-интерферона, колониестимулирующего фактора гранулоцитов, колониестимулирующего фактора макрофагов, колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов, фактора стволовых клеток или тромбопоэтина.

23. Среда по п.15, в которой цитокины, которые могут ингибировать активацию мононуклеарных клеток и клеточную пролиферацию, выбраны из IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, трансформирующего фактора роста β или фактора некроза опухоли.

Images