CN104483376A - 一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。本筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术，对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，方法包括以下步骤：步骤1)建立环孢素A于免疫T细胞作用样品组群、步骤2)制备免疫T细胞二维电泳蛋白质样品、步骤3)双向凝胶电泳、步骤4)图像采集分析得出结果。本发明筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。

Description

一种筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法

技术领域

本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。

背景技术

环孢素A(cyclosprine，CsA)是由11个氨基酸组成的环状多肽，是土壤中一种真菌的活性代谢物。1978年英国首次将环孢素A应用于临床肾移植，此后环孢素A又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植，均取得令人满意的效果，明显提高病人的生存率。1984年环孢素A进入我国，形成了环孢素A加硫唑嘌呤加激素的三联免疫抑制方案，大大提高了移植存活率，同时也使移植术后急性排斥反应的发生率大幅下降。环孢素A作为一种强效免疫抑制剂，近年来人们对它的研究越来越多，发现它还可用来治疗自身免疫性疾病、血液病及寄生虫病等。目前，临床上针对个体病患，环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位一直无法确定，且常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低，难以在临床用药时提供具有药理意义和指导作用的检测结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种利用蛋白质组学技术对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。

为解决上述技术问题，本筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术，对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，其具体方法包括以下步骤：

步骤1)：将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的环孢素A，整体形成环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；

步骤2)：将步骤1)所述的环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5～8次；放入冰盐浴中静置30min；然后升温至10℃的条件下离心2h；离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70℃的保温箱中储存存储备用；

步骤3)：将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量10mol/L尿素、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L二硫苏糖醇0.5％的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min；平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；

步骤4)：将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与环孢素A作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得环孢素A作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质；

步骤5)：将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位。

本发明筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。

具体实施方式

本将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的环孢素A，整体形成环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；

步骤2)：将步骤1)所述的环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5～8次；放入冰盐浴中静置30min；然后升温至10℃的条件下离心2h；离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70℃的保温箱中储存存储备用；

步骤3)：将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量10mol/L尿素、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L二硫苏糖醇0.5％的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min；平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；

步骤4)：将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与环孢素A作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得环孢素A作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质；

步骤5)：将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位。

本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书描述的产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，其特征是：本方法利用蛋白质组学技术，对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，其具体方法包括以下步骤：

步骤1)：将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的环孢素A，整体形成环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；

步骤2)：将步骤1)所述的环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5～8次；放入冰盐浴中静置30min；然后升温至10℃的条件下离心2h；离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70℃的保温箱中储存存储备用；

步骤3)：将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量10mol/L尿素、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L二硫苏糖醇0.5％的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min；平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；

步骤4)：将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与环孢素A作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得环孢素A作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质；

步骤5)：将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位。