JP2007512816A - 活性化リンパ球の特異性の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、臓器移植後、又は生体がウィルス、細菌に感染したり、ワクチンを接種されたりした後で、生体内の活性化リンパ球の特異性を検出する方法に関する。
免疫(immune)又は免疫性(immunity)とは、生体が抗原性異物を認識し除去する生理的反応である。免疫を引き起こす抗原物質は、大部分生体自身の物質ではなく外因性の物質であり、それらが生体に入ると、生体の免疫システムに迅速に認識され、且つ一連の免疫応答過程により消滅させられ、生体を元のバランス状態に戻す。
本発明は、生体活性化リンパ球の特異性を検出する方法であって、以下のステップを含む:
1)細胞培養に必要とされる通常の成分の外、細胞増殖に対する刺激活性を有するサイトカインの中和抗体及び/又は単核細胞に対するアポトーシス誘導作用、活性化抑制作用、又は増殖抑制作用を有するサイトカインを含有する培地で生体のリンパ球を活性化させる検出用抗原を希釈する;
2)前記培地を用いて被検の活性化リンパ球を含む単核細胞懸濁液を調製する;
3)前記検出用抗原と被検の活性化リンパ球を含む単核細胞とを細胞培養板に加えて、一緒に培養する;
4)試験ウェルと陰性対照ウェルの検出可能な信号の差異を比較することによって、検体中に抗原特異性の活性化リンパ球が存在するかどうかを確認する。
1.器官適合性を有する適当数のレシピエントを選定し、それらの末梢血のB細胞膜上のHLA抗原のコンビネーションにヒトの全てのHLA−クラスIとクラスII及びmH抗原を含有させると、各人のこれらHLA抗原のコンビネーションが自然と形成されるので、必要に応じていくつかのコンビネーションを選択して用いればよい。然る後に、彼らから末梢血0.5mlを採取し、適量の細胞培地(例えば、ウシ新生児又はウシ胎児の血清(GIBCO社)を10%含む1640培地(GIBCO社)又はDMEM(GIBCO社)又はEagle(GIBCO社)培地)を含む細胞培養瓶に入れ、同時に各培養瓶に適量のB958細胞株(ATCCから商業的に入手可能)の細胞培養上澄み液(該細胞株が培養過程においてEBウィルスを生成し培養液中へ放出する)を入れる。その量は、その中に含まれるEBウィルスが充分にレシピエントの0.5ml末梢血中の全部のB細胞を形質転換できる量を適量(一般的に、B958細胞(50万個/ml)の培養三日後の上澄み液が約5〜10mlあればよい)とする。その後、細胞培養瓶を37℃下で、CO2インキュベーター内に置き、5日おきに培養液5〜10mlを加えつつ15日程度培養する。その培養時間の長短は培養瓶中に塊状に浮遊成長する腫瘍細胞が観察できることを基準として決定される。塊状に浮遊成長する腫瘍細胞が出現した後、一般細胞を培養すべく液を取り替え、通常の細胞培養を同様に行う。EBウィルスを消滅させるために、これらの細胞及びB958細胞と接触した全ての物品と培養上澄み液に煮沸消毒を行うことを要求するにすぎない。EBウィルスは非常に広く分布しており、正常者の鼻咽喉等の部位にさえEBウィルスが存在しているにもかかわらず、前記消毒は依然として必要な予防措置である。レシピエントの末梢血に上述の処理を行って、各自のB細胞株が調製される。これらの細胞に対してクローン化、増殖、通常の細胞としての凍結保存を経て種を保存すると、いくつかのHLA抗原及び/又はmH抗原をそれぞれ安定して発現する細胞系を確立できる。
抗原担体として、ヒトHLA及び/又はmH抗原を発現しないヒト細胞株、例えばU937(ATCC社から商業的に入手可能)、K562(ATCC社から商業的に入手可能)等を選択し、分子生物学の通常の技術に従って、上述の選定されたレシピエントそれぞれの末梢血の白血球中mRNAを抽出し、逆転写PCR増幅、スプライシング、連結等の通常の遺伝子工学技術で、それぞれ各種のHLA抗原を発現できる発現ベクターを構築してから、前記発現ベクターをU937又はK562又は他のヒトHLAとmH抗原を発現しない細胞にトランスフェクションして発現させ、各種HLA抗原をそれぞれ発現できる細胞株を確立する、即ち、ヒトHLA抗原の全てをそれぞれ発現させる。その発現ベクターは、各種の逆転写ウィルスベクターから選択される一種を使用してもよく、文献(Immunogenetics 25:1−6,1987)等を参照して、文献に記載の方法でベクターを選択して抗原を発現させる。HLA抗原ごとにそれぞれ発現細胞株を確立し、細胞株ごとに一種のHLA抗原だけを発現させ、100程度の細胞株を確立することによって、これらに全てのヒトHLA抗原を含有させ、前記のHLA抗原を発現する細胞株に対して、クローン化、細胞増殖、通常の凍結保存を行って種を保存する。即ち、某かのヒトHLA抗原又はmH抗原をそれぞれ安定して発現する細胞系を確立できる。
3.1 腫瘍細胞株として既知の、ヒトHLA又は/及びmH抗原を発現し又は発現しないヒト細胞株、例えばRaji(ATCC社から商業的に入手可能)、U937(ATCC社から商業的に入手可能)、K562(ATCC社から商業的に入手可能)、又はマウスの腹水腫瘍細胞系SP2/0等を選択し、某かの既知HLA抗原を含むヒト末梢血B細胞を選択し(文献(Abe等、J Immunol Methods、90:111−123)、『体外培養の原理と技術』(薛慶善編集、科学出版社発行、2001年初版)、『SELECTED METHODS IN CELLUAR IMMUNOLOGY』(Edited by BarbaraB. Mishell and StanleyM. Shiigi W. H. Freemanand Company, San Francisco,1980)、及び『簡明免疫学技術』(朱正美、劉輝編集、科学出版社発行、2002年7月初版)を参照)、若干の細菌リポ多糖類(LPS)(SIGMA)(培養液中の最終濃度:2〜25μg/ml)を添加し、B細胞成長因子(BCGF)(自分で調整、3.2を参照)、抗ヒトIgM(SIGMA社)、アメリカヤマゴボウ(PWM)(SIGMA社)(培養液中の最終濃度:1〜25μg/ml)、及びブドウ球菌A蛋白質(SIGMA社)(培養液中の最終濃度:1/1000〜1/10000)を用いて2〜3週間共培養した後、『モノクローナル抗体技術』(徐志凱編集、陝西科学出版社発行、1992年1月初版)を参照し、Raji、U937又はK562細胞を、前記選択し、B細胞成長因子(BCGF)、抗ヒトIgM、ブドウ球菌A蛋白質、細菌リポ多糖類、アメリカヤマゴボウ(PWM)で2〜3週間刺激された、既知HLA抗原を含むヒト単核細胞と共に融合させて、不死化したいくつかのHLA抗原を安定して発現する細胞株を得る。この方法により、各種のコンビネーションが異なるHLA抗原を発現する細胞株を得る。これにより、各種の細胞株を確立でき、前記細胞株に殆ど全てのヒトHLA抗原を含有させる。
1)リンパ球の調製:既知のHLA抗原を有する患者の末梢血を採取し、ヘパリン(Sigma社)で抗凝集させ、リンパ球分離液(Sigma社)を用いてその単核細胞を分離し、10%FCSのRPMI 1640培養液(GIBCO社)で密度1〜106個/mlの細胞懸濁液とし、細胞培養瓶に入れ4〜8時間培養し、細胞培養瓶を揺り動かし細胞を浮遊させ、遠心管に注いで1000r/minで10分間遠心分離し、沈降物を精製されたリンパ球とする。
2)BCGFを含む培養上澄み液の調製:1%FCS(GIBCO社)を含むRPMI 1640細胞培養液を用い、リンパ球の密度が2×106個細胞/mlの懸濁液となるように配合した。最終濃度が2pg/mlになるまでPHA(SIGMA社の製品)を添加し、培養瓶に入れた。飽和湿度、37℃、5%CO2のインキュベーター中で3〜4日培養する。培養物を集めて遠心管に入れ、4℃、1500r/minで10min間遠心分離する。上澄み液を採集し、粗製BCGFとした。−20℃で保存する。
3)10%FCSを含むRPMI 1640培養液を用いて、リンパ球の密度が1×106個/mlの懸濁液となるように配合した。最終濃度が20μg/mlになるまで抗ヒトIgM F(ab)2フラグメント(Sigma社)を添加し、最終濃度が10%になるまで粗製BCGFを添加し、培養液中に最終濃度が2〜25μg/mlになるまで細菌リポ多糖類(LPS)(SIGMA社製品)を添加する。
4)24ウェル板に細胞懸濁液(1ml/各ウェル)を加え、37℃下、CO2インキュベーター中で培養する。3〜4日おきに一回、半量の液を取り替える、即ち、まず各ウェルから培養上澄み液0.5mlを吸取し捨て、次に20μg/ml抗ヒトIgM F(ab)2フラグメント、10%の粗製BCGF、及び培養液における最終濃度が2〜25μg/mlである細菌リポ多糖類(LPS)を含有する新鮮な培養液を添加する。約3〜5週間培養した。成長クローンが比較的大きい場合には、細胞を培養瓶に移送し培養する。即ち、確立されたものは、既知のHLA抗原を含むB細胞株である。
5)この方法でそれぞれ異なるHLA抗原を発現するB細胞株を調製できる。しかも、前記細胞株には殆ど全てのヒトHLA抗原が含まれている。
集団から、若干の、他の人間と同じHLA抗原を持っていない個体又は十数個のHLA抗原に関して他の人間と同じHLA抗原が少ない個体を選択してそれらの末梢血を採取し、方法1に記載の方法に従って前記個体のB細胞株を確立し、次いで、前記細胞株を担体として、遺伝子工学の方法(例えば、方法2に記載の方法)によって、前記細胞株に存在しない若干のHLA又はmH抗原を該細胞株に発現させる。これによれば、用いる細胞株が少なくても、出来るだけ多くのHLA抗原を持たせることができる。結果的に、出来るだけ少ない細胞株で全てのヒトHLA抗原とmH抗原を発現させることを実現できる。また、このような考え方によれば、かなり多くHLAクラスII抗原を発現するRaji細胞株(ATCC社から商業的に入手可能)又はDandi細胞株(ATCC社から商業的に入手可能)を抗原ベクターとして選択し、数個の細胞株を確立するだけで、これまでに発見されているヒトの全18個のDR抗原を細胞の表面に含有させることができる。
方法2で構築されたHLA抗原発現ベクターは、培養したヒト細胞に発現されてよく、原核細胞又は他の真核細胞(例えば、酵母菌)に発現されてもよい。発現したHLA抗原(方法を問わない)は、10%ホルムアルデヒドでの固定、洗浄を経て、直接、抗原として使用される。また、通常の親和性クロマトグラフィ(例えば、抗B2マイクログロブリン抗体(第四軍医大学免疫教室提供)、抗HLA一次抗原又は二次抗原抗体にて調製された親和性クロマトグラフィカラム(第四軍医大学免疫教室提供)を調製)、又は他の蛋白質精製技術により精製し、HLA抗原分子精製品を得、次の試験に用いた。
各種病原体、例えば麻疹ウィルス、水痘ウィルス、結核桿菌等の調製については、『体外培養の原理と技術』(薛慶善編集、科学出版社発行、2001年初版)、『診断と実験ウィルス学』(鄭州大学出版社発行、2002年初版、楊占秋、劉建軍、肖紅、丁暁華編集)、『医用実験ウィルス学』(杜平編集、人民軍芸出版社発行、1985年初版)、『現代結核病学』(人民軍医出版社発行、2000年初版、張敦熔編集)等の資料を参照できる。各種病原性微生物のそれぞれ異なる成長増殖特性に応じて、動物の体内(in vivo)又は体外(in vitro)で培養し、それぞれの異なる方法に従って、精製することにより、前記病原体の精製品又は相対的精製品を得た。前記の相対的精製品としての病原体を、60CO照射、0.1〜10%ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、非イオン性洗浄剤又は脂溶剤(例えばエーテル、クロロホルム)による処理にて不活性化し、抗原として使用した。また、各種の病原性微生物の特異性抗原は、遺伝子工学によって発現させた前記病原性微生物の特異性抗原であってもよい。前記抗原は、ヒト又は動物細胞に発現されてもよいし、原核又は真核細胞に発現されてもよい。前記細胞を、直接、抗原として使用してよく、また親和性クロマトグラフィ又は他の蛋白質精製技術により前記病原微生物の特異性抗原を精製した後使用してもよい。
1、MTT比色法:各ウェルにMTTを添加し、各群の細胞にて可溶性MTTから転化されてなるホルマザン類(formazane)結晶の量を観測し、これにより、各群の細胞の活性の変化(増加又は減衰)を把握する。
MTT方法と細胞アポトーシス検出方法の間には以下のような相互対応関係がある。即ち、MTT方法においては、生細胞が可溶性MTTを青紫色のホルマザン類(formazane)結晶物質に転化する原理(死細胞はこのような能力を有しない)を利用して各群細胞における生細胞の活性を検出する。生細胞が多いほど、細胞の活性が強く、可溶性MTTから転化した青紫色のホルマザン類(formazane)結晶物質の量が多い;細胞アポトーシス検出方法においては、各群細胞のアポトーシス状況、即ち死細胞の量を検出している;試験において、各群に投入される被検生細胞は一定であり、各群におけるアポトーシスが発生した細胞数が多いと、その中の生細胞が少なく、可溶性MTTから転化される青紫色のホルマザン類(formazane)結晶物質の量が少なくなり、逆の場合には、可溶性MTTから転化される青紫色のホルマザン類結晶物質の量が多くなる。
以下に、本発明の目的、意義を詳細に説明するために実施例を挙げるが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではないということが理解させるべきである。
一方向混合リンパ球(MLC)培養方法による活性化リンパ球の調製:
反応細胞と刺激細胞は、それぞれ、関係のない健康な試験志願者の末梢血に由来し、前記志願者のリンパ球は、市販のリンパ球分離液でそれらの末梢血を分離して得たものである。刺激細胞(その細胞膜上に発現したHLA抗原を刺激抗原として、反応細胞の活性化(細胞活性を増強する)又はアポトーシス(細胞活性を減衰する)を刺激する)は、マイトマイシン25μg/mlで処理し、生理食塩水で洗浄した後、その一部を初回一方向混合リンパ球培養に用いて、活性化リンパ球を調製した;残りの一部は、通常の細胞凍結保存方法で−70℃未満の温度下で凍結保存し、初回混合リンパ球培養における活性化リンパ球に再刺激を行うことに用いた。
Bグループ、試験群:反応細胞100μl+刺激細胞100μl+15μl N−mAb;
Cグループ、対照群:反応細胞100μl+10%FCS 1640培養液100μl+15μl N−mAb;
MLC試験のグループ:
Aグループ、試験群:反応細胞100μl+刺激細胞100μl;
Dグループ、対照群:反応細胞100μl+10%FCS 1640培養液100μl;
1)刺激細胞(検出用HLA抗原の細胞として)の調製:
心臓移植時に、無菌操作でドナーの脾臓を採取し、200メッシュの研磨網で供与者の脾臓細胞を磨砕し、それを無血清1640培養液(GIBCO社)にて二回洗浄(1500rpm)し、上澄み液を捨て、沈降物を無血清1640培養液で約1×108個細胞/mlの細胞懸濁液とし、通常のヒトリンパ球分離液(GIBCO社)で単核細胞を分離し、それを遠心機(2000rpm)で20分間遠心分離し、分離液と1640培養液界面上にある細胞層細胞を吸取して他の無菌遠心管に移入し、無血清1640培養液にて二回遠心・洗浄(それぞれ1500rpm、1000rpm)し、上澄み液を捨て(赤血球があれば、37〜40℃の0.83%NH4Cl溶液で懸濁させ、37〜40℃の水浴で10分間処理し、その後、無血清1640培養液で二回遠心・洗浄(1000rpm)する)、沈降物をマイトマイシン(Sigma社)25μg/mlを含む無血清1640培養液で約1×107個細胞/mlの細胞懸濁液とし、37℃の水浴で40分間作用させ、1000rpmで10分間遠心分離し、上澄み液を捨て、沈降した細胞を無血清1640培養液で三回遠心・洗浄(1000rpm)し、沈降物を細胞凍結保存液(『実用モノクローナル抗体技術』(徐志凱編集、陝西科学出版社発行、1992年初版)における処方に従って製造した)で約2×107個細胞/mlの細胞懸濁液とし、凍結保存管内に分注し、−70℃の冷蔵庫又は液体窒素で凍結保存して将来の使用に備えた。
心臓移植6ヶ月後(一般的に、心臓移植5日後に定期的検査を開始する。また拒絶反応があると疑われた時にも行われてよい)に、生検で拒絶反応が発生していないと確認されたレシピエントと、生検で一級及び三級拒絶反応が発生したと確認されたレシピエントの静脈血5〜20mlをそれぞれ採取した。これとは別に、心臓移植を行わなかった正常者の末梢血10mlを採取した。上述の方法に従って、それらの単核細胞をそれぞれ分離し、ドナー抗原特異性活性化リンパ球を含むであろう反応細胞とし、移植を受けていない正常者に由来する単核細胞を特異性活性化リンパ球を含まない反応細胞であるとして陰性対照試験(その試験の刺激細胞は前記のいずれかの移植患者からのドナー細胞である)を行った;無血清1640培養液で二回遠心・洗浄し、沈降物を20%牛胎児血清(GIBCO社)を含む1640培養液(その中に、1ml当たり0.125ngのFK506(商品名 プログラフ、アイルランド藤沢薬品社製、Fujisawa Ireland Limited)、及び5μgのメチルプレドニゾロン(ベルギーファルマシア・アップジョン社製、Pharmacia & Upjohn)を含む)で約2×106個細胞/mlの細胞懸濁液とし、使用まで置いた。反応細胞を製造すると同時に、凍結保存しておいたドナーの脾臓細胞を蘇生させ、それを無血清1640培養液で一回遠心・洗浄(1000rpm)し、沈降物を、前記の20%牛胎児血清と免疫抑制剤を含む1640培養液にて約2×106個細胞/mlの細胞懸濁液とし、これを刺激細胞(供与者HLA抗原を含む)として、使用まで置いた。
Aグループ:反応細胞100μl+刺激細胞100μl;
Bグループ:反応細胞100μl+刺激細胞100μl +IL−2中和モノクローナル抗体15μl;
Cグループ:反応細胞100μl +IL−2中和モノクローナル抗体15μl +細胞希釈用1640培養液100μl;
Dグループ:反応細胞100μl+細胞希釈用1640培養液100μl。
前記細胞を20h培養した後に各ウェルにMTT 10μlを添加し、引き続き1h培養した後、倒立顕微鏡で直接各ウェルの黄色い可溶性MTTから転化した青紫色のホルマザン類(formazane)結晶物質の量を観察した。
ALSA試験の結果は、倒立顕微鏡での直接観察の外、比色法によっても示すことができる。まず各ウェルの培養液を除去し、各ウェルにジメチルスルホキシド(DMSO)150μlを添加し、5分間軽く振とうし、ホルマザン類結晶物質を充分に溶解してから、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を測定した(リファレンス波長:550nm)。
真陽性(TP):本方法にて陽性で、生検ではI級以上の拒絶反応が発生していた。
真陰性(TN):本方法にて陰性で、生検でも拒絶反応が発生していなかった。
偽陽性(FP):本方法にて陽性で、生検では拒絶反応が発生していなかった。
偽陰性(FN):本方法にて陰性で、生検ではI級以上の拒絶反応が発生していた。
一致性=(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)
特異性=(TN)/(TN+FP)
敏感性=(TP)/(TP+FN)
2時間細胞培養した後、MTTを添加(10μl/各ウェル)し、引き続き0.5〜1.5時間培養した後、各ウェルの培養液を吸引して捨て、各ウェルにジメチルスルホキシド(DMSO)150μlを添加し、5分間軽く振とうし、ホルマザン類結晶物質を充分に溶解させてから、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度(リファレンス波長:550nm)を測定する。150μlのジメチルスルホキシド(DMSO)のみを添加した無細胞ウェルを零点調整ウェルとする。抑制率で判定する:
−10%より大きい場合:陽性
−1〜−10%の場合:擬陽性。
B型脳炎ウィルス特異性刺激抗原の調製:
文献(第四軍医大学学報、1984年Vol.5, No.4, 251〜254;Journal of Medical Colleges of PLA 1986,1(4):356-362)を参照して、精製したB型脳炎ウィルスを調製し、10%ホルムアルデヒドを添加して固定し、4℃でオーバーナイト(約12時間)し、4回にて、遠心・濃縮し、生理食塩水で洗浄し、紫外線分光光度計でタンパク質の含有量を測定し、凍結保存管に分注して凍結乾燥し、−70℃の冷蔵庫中に凍結保存して使用まで置いた。
確診された高熱期のB型脳炎患者の静脈血を5〜10ml採取し、実施例2の方法に従って、単核細胞を分離し、無血清1640培養液で2回洗浄し、沈降物を20%牛胎児血清を含む1640培養液(その中に、1ml当たり0.125ngのFK506、及び5μgのメチルプレドニゾロンを含む)で、約2×106個細胞/mlの細胞懸濁液とし、使用まで置いた。被検単核細胞を調製すると同時に、凍結保存しておいたB型脳炎ウィルスを取り出し、20%牛胎児血清(GIBCO社)を含む1640培養液(その中に、1ml当たり0.125ngのFK506、及び5μgのメチルプレドニゾロンを含む)で、ウィルスタンパク質濃度が約3mg/mlであるウィルス懸濁液を調製し、使用まで置いた。
試験群:患者被検細胞100μl+ウィルス懸濁液100μl+ IL- 2中和モノクローナル抗体35μl;
対照群:患者被検細胞100μl+ IL- 2中和モノクローナル抗体35μl+細胞希釈用1640培養液100μl。
Claims (23)
- 生体活性化リンパ球の特異性の検出方法であって、以下のステップを有することを特徴とする方法:
1)培地で検出用抗原を希釈し、前記抗原が生体のリンパ球を活性化させ、前記培地が、通常の細胞培養に必要する成分を含有するほかに、細胞増殖に対する刺激活性を有するサイトカインの中和抗体及び/又は単核細胞に対するアポトーシス誘導作用、又は活性化抑制作用、又は増殖抑制作用を有するサイトカインを添加する;
2)前記培地で被検の活性化リンパ球を含む単核細胞試料を調製する;
3)前記検出用抗原と、被検の活性化リンパ球を含む単核細胞試料を細胞培養板に加えて、一緒に培養する;
4)試験ウェルと陰性対照ウェルの検出可能な信号の差異を比較することによって、試料に前記抗原特異性の活性化リンパ球が存在するかどうか確認する。 - 前記抗原がヒト主要組織適合性抗原、同種異系抗原,異種抗原、ウィルス抗原、又は細菌抗原から選択したものである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗原が顆粒抗原又は可溶性抗原であり、前記ヒト主要組織適合性抗原がHLAクラスI抗原又はクラスII抗原の中の一種であり、又は多種のHLAクラスI抗原とクラスII抗原の混合物である、請求項2に記載の方法。
- 前記培地に免疫抑制剤及び/又は制癌剤が更に添加されており、前記の培地の量を基準として、前記免疫抑制剤及び/又は制癌剤の用量が約0.001ng〜100μg/ml、前記の細胞増殖に対する刺激活性を有するサイトカインの中和抗体の用量が約1μg〜10mg/ml、前記の単核細胞に対するアポトーシス誘導作用、活性化抑制作用、又は増殖抑制作用を有するサイトカインの用量が約0.01-100個活性単位/mlである、請求項1に記載の方法。
- 前記の検出可能な信号が各ウェルの細胞活性の変化を反映できる信号である、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫抑制剤が、プログラフ、シクロスポリン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ラパマイシン、RS−61443、BQR、ヒト急性Tリンパ球白血病細胞株JMが分泌した免疫抑制因子、デオキシスペルグアリン、又は副腎皮質ホルモンから選択したものであり、前記制癌剤が、トポイソメラーゼ、アルキル化剤、代謝拮抗薬、レチノイン酸類化合物−ビタミンA誘導体、又は潜在的に免疫抑制誘導作用又は腫瘍細胞アポトーシス誘導作用を有する薬物から選択したものである、請求項4に記載の方法。
- 前記免疫抑制剤と制癌剤を単独に使用した、又は併用した、請求項6に記載の方法。
- 前記副腎皮質ホルモンがメチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、又はデキサメタゾンから選択したものである、請求項6に記載の方法。
- 前記シクロスポリンがシクロスポリンA又はシクロスポリンCから選択したものである、請求項6に記載の方法。
- 前記の細胞増殖を刺激する活性を有するサイトカインが、インターロイキン1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23,α−インターフェロン,β−インターフェロン,ω−インターフェロン,γ−インターフェロン,顆粒球コロニー形成刺激因子, マクロファージコロニー形成刺激因子, 顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子, 幹細胞因子、又は血小板産生因子から選択したものである、請求項4に記載の方法。
- 前記の、単核細胞に対する活性化抑制作用、及び増殖抑制作用を有するサイトカインが、インターロイキン2, 4、10、15、又は形質転換増殖因子βから選択したものである、請求項4に記載の方法。
- 通常の細胞培養に必要する成分を含有するほかに、免疫抑制剤及び/又は制癌剤と、細胞増殖に対する刺激活性を有するサイトカインの中和抗体及び/又は単核細胞に対する活性化抑制作用及び増殖抑制作用を有するサイトカインを添加した、活性化リンパ球の特異性を検出するための培地。
- 前記免疫抑制剤の用量が、前記培地の量を基準として約0.001ng〜100μg/mlである、請求項12に記載の培地。
- 前記の細胞増殖に対する刺激活性を有するサイトカインの中和抗体の用量が、前記培地の量を基準として約1μg〜10mg/mlである、請求項12に記載の培地。
- 前記の単核細胞に対する活性化抑制作用及び増殖抑制作用を有するサイトカインの用量が、前記培地の量を基準として約0.01-100個活性単位/mlである、請求項12に記載の培地。
- 前記サイトカイン中和抗体を単独に使用した、又は併用した、請求項12に記載の培地。
- 前記サイトカイン中和抗体と単核細胞に対する活性化抑制作用及び増殖抑制作用を有するサイトカインを、単独に使用した、又は併用した、請求項14又は15に記載の培地。
- 前記免疫抑制剤が、プログラフ、シクロスポリン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ラパマイシン、RS−61443、BQR、デオキシスペルグアリン、又は副腎皮質ホルモンから選択したものであり、前記制癌剤が、トポイソメラーゼ、アルキル化剤、代謝拮抗薬、レチノイン酸類化合物−ビタミンA誘導体、又は潜在的に免疫抑制誘導作用又は腫瘍細胞アポトーシス誘導作用を有する薬物から選択したものである、請求項13に記載の培地。
- 前記免疫抑制剤と制癌剤を単独に使用した、又は併用した、請求項18に記載の培地。
- 前記副腎皮質ホルモンがメチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、又はデキサメタゾンから選択したものである、請求項18に記載の培地。
- 前記シクロスポリンがシクロスポリンA又はシクロスポリンCから選択したものである、請求項18に記載の培地。
- 前記の細胞増殖を刺激する活性を有するサイトカインが、インターロイキン1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23,α−インターフェロン,β−インターフェロン,ω−インターフェロン,γ−インターフェロン,顆粒球コロニー形成刺激因子, マクロファージコロニー形成刺激因子, 顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子, 幹細胞因子、又は血小板産生因子から選択したものである、請求項14に記載の培地。
- 前記の、単核細胞に対する活性化抑制作用、及び増殖抑制作用を有するサイトカインが、インターロイキン2, 4、10、15、形質転換増殖因子β、又は腫瘍壊死因子から選択したものである、請求項15に記載の培地。
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