RU2331671C2 - СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala - Google Patents
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala Download PDFInfo
- Publication number
- RU2331671C2 RU2331671C2 RU2006119393/13A RU2006119393A RU2331671C2 RU 2331671 C2 RU2331671 C2 RU 2331671C2 RU 2006119393/13 A RU2006119393/13 A RU 2006119393/13A RU 2006119393 A RU2006119393 A RU 2006119393A RU 2331671 C2 RU2331671 C2 RU 2331671C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fga
- allele
- fibrinogen
- tcc
- agc
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в медицине при диагностике ряда заболеваний, связанных с метаболическим синдромом. Для определения Thr312Ala полиморфизма гена α-фибриногена (FGA) из исследуемого образца выделяют ДНК, которую затем подвергают амплификации методом полимеразной цепной реакции с использованием аллельспецифических праймеров. Для идентификации распространенного аллеля FGA Т используют обратный праймер 5'-ТСС-CAG-AGT-TCC-AGC-TTC-CAG-T-3'; для идентификации редкого аллеля FGA А применяют обратный праймер 5'-CCC-AGA-GTT-CCA-GCT-TCC-AGC-3'; прямым праймером в обоих случаях служит последовательность 5'-TGT-CGA-GGG-TCA-TGC-AGT-AGG-G-3'. Изобретение обеспечивает возможность проведения высокоточного, простого и дешевого анализа указанного полиморфизма фибриногена, пригодного для использования в клинико-диагностических лабораториях. 2 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине.
Фибриноген, гликопротеин плазмы, синтезируемый в печени, является главным компонентом системы гемостаза человека и животных. Молекула фибриногена человека состоит из шести полипептидных цепей: две Аα-цепи, две Вβ-цепи и две γ-цепи (Аα2Вβ2γ2). Три вида полипептидных цепей кодируются тремя отдельными генами, которые расположены на одной хромосоме 4q23-q32. Последовательность генов расшифрована, поэтому на практике геномную ДНК используют для определения мутаций и таким образом аминокислотных патологий в вариантах фибриногена. Так, наиболее изученная аномалия в молекуле фибриногена связана с Аα-цепью. В ее гене известен однонуклеотидный полиморфизм, обусловленный заменой А на G в 6534-й позиции кодирующей части, приводящей к замена треонина (Thr) на аланин (Ala) в 312-й позиции полипептида (обозначаемый как FGA T312A). Популяционная частота более редкого аллеля FGA А достаточно велика и составляет 35% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewcr.fcsi?db=nucleotide&val=14278704). Анализ генетической ассоциации показал, что у больных, несущих аллель FGA А нарушается образование стабильного фибринового сгустка, что повышает вероятность развития заболеваний, связанных со свертывающейся способностью крови. Имеются работы по корреляции этого аллеля с легочной эмболией (K.F.Standeven et al. Circulation, 2003, v.107, p.2326-2330), ишемической болезнью сердца (A.M.Carter et al. Circulation 1999, v.99, p.2423-2426) и сахарным диабетом (Е.J.Dunn, R.A.S.Ariens. Herz, 2004 v.29, p.470-479).
Известен способ идентификации аллелей гена FGA, основанный на двухэтапной процедуре - амплификации ДНК с последующим расщеплением амплифицированного фрагмента рестриктазой Rsa I (далее именуемый прототип) (A.M.Carter et al., Circulation 1999, v.99, p.2423-2426). Для идентификации Thr312Ala генотипов в прототипе использовали следующие олигонуклеотиды, которые в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяли получать продукт размером 190 п.н.: прямой, 5'-CCT-AGC-AGT-GCT-GGA-AGC-TG-3' и обратный, 5'-CTC-CCA-GGG-TTT-TGG-TTT-CCA-Т-3'. Данный фрагмент был амплифицирован при помощи стандартной процедуры ПЦР при температуре отжига праймеров 54°С. Состав реакционной смеси помимо стандартных компонент включал 25 пмоль/л каждого праймера, 2,0 ммоль/л хлорида магния. Полученный ПЦР-продукт инкубировали с 5 ед. рестриктазы Rsa I. При добавлении указанной рестриктазы к ПЦР-продукту в случае аллеля FGA Т происходит расщепление ДНК с образованием четырех фрагментов различной длины: 78, 48, 39 и 25 п.н. (Таблица). В случае редкого аллеля FGA А обнаруживается только три фрагмента: 117, 48 и 25 п.н. (Таблица ). Таким образом, в результате электрофоретического анализа в 2% агарозном геле от генотипов, гомозиготных по распространенному аллелю идентифицируется четыре полосы, от гомозигот по редкому аллелю - три полосы, а от гетсрозигот пять полос - 117, 78, 48, 39 и 25 п.н. (Таблица).
Примечание: «п.н.» - пар нуклеотидов.
К недостаткам метода следует отнести: высокую трудоемкость анализа и необходимость использования коммерческого препарата рестриктазы Rsa I, что составляет значимую часть стоимости выполнения данного анализа (www.biotst.net/search.php?criteria=Rsa&submit=%CF%EE%E8%FI1%EA).
Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение известного способа (уменьшение числа процедур) и ускорение выявления аллельных вариантов и генотипов FGA, без снижения точности.
Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с описанным выше методом (прототипом) является то, что в прототипе проводят стандартную амплификацию ДНК с использованием пары праймеров, фланкирующих интересующий фрагмент. В заявляемом способе использовали другой подход - аллельспецифическую амплификацию. При таком анализе амплификацию проводят в двух параллельных пробах: в одной - в качестве обратного праймера использовали олигонуклеотид с концевым нуклеотидом (Т), комплиментарным аденину (А) в 6534 позиции частого аллеля (FGA Т), а в другой - праймер с концевой дезоксицитидиловой кислотой (С) комплиментарной гуанину (G) в 6534 позиции редкого аллеля (FGA А). Благодаря этому, в заявляемом способе отсутствует этап обработки рестриктазой амплифицированного фрагмента ДНК.
Заявляемый способ расширяет область применения идентификации аллелей гена α-фибриногена (FGA) и позволит использовать этот метод в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений. Т.о., внедрение данной технологии будет способствовать повышению качества диагностики наследственных нарушений системы гомеостаза.
Заявляемый способ выполняли следующим образом.
Геномную ДНК выделяли из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом (Смит К., Клко С., Кантор Ч. В сб. Анализ генома. Под ред. К.Дейвиса, М.: Мир, 1990, с.58-94). Для идентификации распространенного аллеля FGA Т применяли обратный праймер 5'-ТСС-CAG-AGT-TCC-AGC-TTC-CAG-T-3' с треонином на 3'-конце. Для амплификации более редкого аллеля FGA А применяли обратный праймер 5'-CCC-AGA-GTT-CCA-GCT-TCC-AGC-3' с цитозином на 3'-конце. В качестве прямого праймера в обоих случаях служила последовательность 5'-TGT-CGA-GGG-TCA-TGC-AGT-AGG-G-3'.
Разработанный режим амплификации включал следующие стадии: начальную денатурацию при 95°С в течение 180 с, затем 30 циклов - с денатурацией в течение 20 с при 94°С; отжигом в течение 30 с при 58,5°С и синтезом в течение 35 с при 72°С. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.
Определение аллелей гена FGA проводили по наличию или отсутствию в геле фрагмента размером 475 п.н. В случае, если фрагмент выявлялся при амплификации ДНК с обеими парами праймеров, это свидетельствовало о присутствии обоих аллелей в генотипе индивида. Следовательно, носитель образца ДНК - гетерозигота. Амплификация фрагмента только с одной парой праймеров и отсутствие амплификата при использовании другой пары свидетельствовало о гомозиготном состоянии по соответствующему аллелю.
Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.
Геномную ДНК трех индивидуумов выделяли из крови с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Одновременную идентификацию аллелей в исследуемых образцах проводили при помощи прототипа и заявляемого способа.
В первом случае - в случае прототипа - смесь для амплификации объемом 50 мкл содержала 25 пмоль/л прямого и обратного праймера (ОАО "СибЭнзим", Новосибирск); 2,0 ммоль/л хлорида натрия; 1,25 ед Taq-полимеразы с 10-кратным буфером, приготовленным фирмой производителем (ОАО "СибЭнзим", Новосибирск); 0,2 ммоль/л смеси дезоксирибонуклеотидов (ОАО "СибЭнзим", Новосибирск) и 0,5 мкг тотальной ДНК. Амплификацию проводили на оборудовании РСТ-200 DNA-EngineTM MJ Research. Режим амплификации: начальная денатурация при 95°С в течение 180 с, затем 30 циклов - с денатурацией в течение 20 с при 94°С; отжигом в течение 30 с при 54°С и синтезом в течение 35 с при 72°С.После амплификации полученные ПЦР-продукты инкубировали с 5 ед. рестриктазы Rsa I.
Во втором случае состав реакционной смеси, также объемом 50 мкл, помимо стандартных компонент включал 0,1 мкмоль/л каждого праймера (ОАО "СибЭнзим", Новосибирск) 2,0 ммоль/л хлорид магния и 4 ммоль/л DMSO и 0,5 мкг тотальной ДНК. Режим амплификации был аналогичен прототипу с единственным отличием в температуре отжига праймеров, которая составила 58,5°С.
Все полученные продукты анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 10 мкл продукта. Электрофорез проводили в течение 60 мин при напряжении 100 В.
Электроферограмма, приведенная на Фиг.1, демонстрирует результаты идентификации аллелей гена фибриногена при помощи прототипа. При добавлении рестриктазы к ПЦР-продукта в образце 1 (Фиг.1 дорожка 1) образовалось четыре фрагмента разной длины. Это свидетельствует о том, что исследуемый генотип гомозиготен по аллелю FGA Т (генотип ТТ). Три фрагмента в образце 3 (Фиг.1 дорожка 3) соответствуют гомозиготе по аллелю FGA А (генотип АА), а пять (Фиг.1 дорожка 2) - гетерозиготе (генотип ТА).
Аналогичные результаты были получены при идентификации аллелей при помощи заявляемого способа. Электроферограмма приведена на Фиг.2. Образец 1 взят от индивидуума, гомозиготного по аллелю FGA Т (генотип ТТ). На это указывает наличие фрагмента ДНК размером 475 п.н. только на одной из пары дорожек в случае амплификации фрагмента ДНК FGA с парой праймеров, один из которых имеет 3'-концевой нуклеотид комплементарный аденину в позиции 6534 распространенного аллеля (FGA Т) (Фиг.2. дорожки 1 и 2). Образец 2 принадлежит индивидууму с гетерозиготым генотипом ТА (фрагмент размером 475 п.н. выявляется при амплификации с обоими парами праймеров - Фиг.2 дорожки 3 и 4 соответственно). Образец 3 получен от индивидуума, гомозиготного по аллелю FGA А (генотип АА). На это указывает наличие фрагмента только при амплификации с той парой праймеров, где обратный имеет 3'-концевой нуклеотид, комплементарный гуанину в позиции 6534 редкого аллеля (FGA А) (Фиг.2 дорожки 5 и 6).
С помощью предлагаемого способа обследованы 100 пациентов больных метаболическим синдромом и 50 практически здоровых лиц. Правильность определения генотипов заявляемым способом подтверждена независимо с помощью полимеразной цепной реакции и гидролиза продукта ПЦР рестриктазой Rsa I (СибЭнзим, Новосибирск) по способу, взятому в качестве прототипа (A.M.Carter et al., Circulation 1999, v.99, p.2423-2426).
Claims (1)
- Способ определения аллелей гена α-фибриногена (FGA) по полиморфному сайту Thr312Ala, включающий забор материала от пациента, амплификацию фрагмента гена FGA с использованием пары праймеров, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции с использованием двух пар праймеров, при этом для идентификации распространенного аллеля FGA Т используют обратный праймер 5'-TCC-CAG-AGT-TCC-AGC-TTC-CAG-T-3'; для идентификации редкого аллеля FGA А применяют обратный праймер 5'-CCC-AGA-GTT-CCA-GCT-TCC-AGC-3'; прямым праймером в обоих случаях служит последовательность 5'-TGT-CGA-GGG-TCA-TGC-AGT-AGG-G-3'.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006119393/13A RU2331671C2 (ru) | 2006-06-02 | 2006-06-02 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006119393/13A RU2331671C2 (ru) | 2006-06-02 | 2006-06-02 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006119393A RU2006119393A (ru) | 2007-12-27 |
RU2331671C2 true RU2331671C2 (ru) | 2008-08-20 |
Family
ID=39018299
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006119393/13A RU2331671C2 (ru) | 2006-06-02 | 2006-06-02 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2331671C2 (ru) |
-
2006
- 2006-06-02 RU RU2006119393/13A patent/RU2331671C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CARTER A.M. et al. Association of the alpha-fibrinogen Thr312Ala polymorphism with poststroke mortality in subjects with atrial fibrillation. Circulation. 1999, v.99, n.18, p.2423-2426. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2006119393A (ru) | 2007-12-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110541025B (zh) | 杜氏肌营养不良基因缺陷的检测方法、引物组合物及试剂盒 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
US20130023442A1 (en) | Single nucleotide polymorphism for predicting recurrence of hepatocellular carcinoma | |
ES2313416T3 (es) | Mejoras en generadores de heteroduplex inducidos. | |
CN115679003A (zh) | 用于预测药物疗效的组合物、系统及用途 | |
RU2331671C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА α-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ Thr312Ala | |
CN116004642A (zh) | 长qt综合征变异基因kcnh2及其应用 | |
US7541148B2 (en) | Method for detecting base mutation | |
KR102063486B1 (ko) | Rnf213 단일염기다형성과 한국인 모야모야병 발병 위험도의 연관성 | |
CN109371116B (zh) | 一种冠心病的筛查试剂盒 | |
US20070042364A1 (en) | Target genes for inflammatory bowel disease | |
JP4111481B2 (ja) | 心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチド | |
RU2322193C1 (ru) | Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов | |
CN116287193B (zh) | 一组用于评估阿达木单抗治疗银屑病效果的snp位点及其试剂盒和应用 | |
WO2002024905A1 (fr) | Procede permettant de determiner la mutation genetique | |
RU2600874C2 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для генотипирования полиморфных локусов днк, ассоциированных с риском развития спорадической формы болезни альцгеймера в российских популяциях | |
RU2151188C1 (ru) | Способ диагностики муковисцидоза | |
RU2180922C1 (ru) | Способ определения аллелей гена хемокинового рецептора ccr2 по полиморфному сайту v64i | |
CN112322727B (zh) | Cda基因snp位点的用途 | |
JP3682688B2 (ja) | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット | |
RU2144566C1 (ru) | Способ диагностики предрасположенности к гемохроматозу | |
RU2006101561A (ru) | Способы обнаружения болезни альцгеймера | |
ES2226533B1 (es) | Nuevas variantes alelicas en el gen del factor vii. | |
RU2283494C1 (ru) | Способ прогнозирования развития токсического гепатита при химиотерапии множественной миеломы | |
JP2003159074A (ja) | 癌関連遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110603 |