RU2330045C9

RU2330045C9 - Способ получения бициклических пептидных соединений

Info

Publication number: RU2330045C9
Application number: RU2005117345/04A
Authority: RU
Inventors: Альдо САЛИМБЕНИ (IT); Альдо САЛИМБЕНИ; Давиде ПОМА (IT); Давиде ПОМА; Дамиано ТУРОЦЦИ (IT); Дамиано ТУРОЦЦИ; Стефано МАНЦИНИ (IT); Стефано Манцини; Карло Альберто МАДЖДЖИ (IT); Карло Альберто Маджджи
Original assignee: Менарини Ричерке С.П.А.
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2008-11-20
Also published as: ATE440105T1; CA2508696A1; RU2005117345A; EP1576000A2; KR101081256B1; EP1576000B1; AU2003289958A1; KR20050089966A; CN1720260A; BR0317029A; ITFI20020239A1; US7999068B2; PL377635A1; US20090163695A1; CN1318445C; WO2004052923A2; AU2003289958A8; CA2508696C; JP4593284B2; DE60328915D1

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения бициклических пептидных соединений формулы (I-A) через получение промежуточного продукта формулы (I) в жидкой фазе. Предложенный способ позволяет получать бициклические пептидные соединения с высоким выходом и высокой чистотой. 2 н. и 21 з.п. ф-лы.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу получения бициклических пептидных соединений формулы (I), указанной ниже, применимых в качестве промежуточных продуктов при получении фармакологически активных соединений, в частности при получении бициклических гликопептидов формулы (I-А), указанной ниже, которые обладает антагонистической активностью против рецептора NK₂тахикинина.

Уровень техники

Соединения формулы (I-А), в частности [N-4-(2-ацетиламино-2-дезокси-β-D-глюкопиранозил)-L-аспарагинил-L-α-аспартил-L-триптофил-L-фенилаланил-L-2,3-диаминопропионил-L-лейцил]-С-4,2-N-3,5-лактам-С-1,6-N-2,1-лактам (соединение формулы (I-A), указанной ниже, в которой R₁=R₂=R₃=H, известное под торговым названием «непадутант»), являются соединениями, которые имеют сильную антагонистическую активность против рецептора NK₂ тахикинина и, следовательно, могут быть использованы для получения фармацевтических соединений для лечения заболеваний, и применимы при лечении и профилактике заболеваний, в которых тахикинины принимают участие в качестве нейромодуляторов.

Это соединение и некоторые из его промежуточных продуктов описаны в Европейском патенте №815126В1, особенно в примере 4. В указанном документе описаны на страницах 4 и 5 уже известные в литературе способы синтеза в растворе или твердой фазе линейных пептидов последовательным сочетанием подходящим образом защищенных аминокислот и их последующей конечной циклизацией для получения соединений общей формулы (I).

Эти способы описаны в очень общем виде, хотя более подробные детали предложены для получения соединений в примерах 1 и 2. В этих примерах используемым синтезом было сочетание Fmoc-аминокислот в твердой фазе до получения линейного пептида, который после отщепления от смолы циклизуют, очищают ВЭЖХ и снова циклизуют. Важно отметить, что по данному пути синтеза гликозидную боковую цепь вводят на стадии синтеза в твердой фазе линейного пептида на смоле, когда боковую цепь подходящим образом защищают аспарагином.

Сущность изобретения

Заявителем теперь неожиданно обнаружен новый и более эффективный способ получения бициклических пептидных соединений формулы (I), указанной ниже, применимых в качестве промежуточных продуктов для получения соединений с фармакологической активностью. Новый способ получения проводят полностью в растворе, а не в твердой фазе, что позволяет получить продукты с высокой чистотой и высокими выходами.

Следовательно, предметом изобретения является способ получения бициклических пептидных соединений формулы (I) (SEQ. ID. 1)

включающий в себя следующие стадии:

1) удаление защитной группы у линейного пентапептида формулы (II) (SEQ. ID. 2) в присутствии растворителя с получением соединения формулы (III)

где A₁ и A₂ представляют собой две защитные группы атома азота, отличающиеся друг от друга, и R₅ и R₆, отличающиеся друг от друга, выбраны из бензилокси- и низших алкилоксигрупп, в которых алкильная часть представляет собой неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу;

2) внутримолекулярную циклизацию соединения формулы (III), полученного на стадии 1), в присутствии растворителя и подходящего агента сочетания с получением соединения формулы (IV) (SEQ. ID. 3)

где R₅ имеет указанные выше значения;

3) удаление защитной группы у соединения (IV), полученного на стадии 2), в присутствии растворителя с получением соединения формулы (V)

где R₅ имеет указанные выше значения;

4) сочетание соединения формулы (V), полученного на стадии 3), и защищенной аминокислоты формулы (VIa) в присутствии растворителя с получением соединений формулы (VII) (SEQ. ID. 4)

где A₃ представляет собой защитную группу атома азота, R₇ выбран из бензилокси- и низших алкилоксигрупп, в которых алкильная часть представляет собой неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу; R₈ представляет собой остаточную группу, образованную процедурой активации на карбоксильной группе;

5) удаление защитной группы у соединения формулы (VII), полученного на стадии 4), в присутствии растворителя с получением соединения формулы (VIII)

где R₇ имеет указанные выше значения;

6) внутримолекулярную циклизацию, в присутствии растворителя и подходящего агента сочетания, соединения формулы (VIII), полученного на стадии 5), с получением бициклического соединения формулы (IX)

где R₇ имеет указанные выше значения;

7) удаление защитной группы у бициклического соединения формулы (IX), полученного на стадии 6), в присутствии растворителя с получением соединения формулы (I)

где R₇ имеет указанные выше значения.

Соединение формулы (III) представлено SEQ. ID. 2, где соединения формулы (I) могут быть использованы, например, для получения бициклических гликопептидных соединений формулы (I-А), указанной ниже, которые обладают сильной антагонистической активностью для рецептора NK₂ тахикинина; заявителем обнаружен новый способ получения, при помощи которого гликозидную боковую цепь вводят в соединения формулы (I) взаимодействием, проводимом в растворе, и очистка конечного продукта ВЭЖХ не является обязательной, так что получение этих соединений в больших масштабах может быть достигнуто при определенно более низких затратах, чем затраты современного способа получения.

Следующим предметом настоящего изобретения является способ получения бициклических гликопептидных соединений формулы (1-А) (SEQ. ID. 5)

где R₁, R₂ и R₃, одинаковые или отличные друг от друга, могут быть водородом или защитной группой атома кислорода,

включающий в себя следующие стадии:

1А) активацию бициклических пептидных соединений формулы (I) подходящим агентом сочетания с получением производного формулы (II-A)

в которой R выбран из группы, состоящей из бензотриазола, возможно замещенного галогеном, азабензотриазола и сукцинимидила;

2А) взаимодействие соединения формулы (II-А), полученного на стадии 1А), в присутствии растворителя с гликозидным производным формулы (III-A)

где R, R₁, R₂ и R₃ имеют значения, указанные выше.

Следующим предметом изобретения является способ получения соединения формулы (I-A), начинающийся из соединений формулы (II) и формулы (III) и проходящий через образование соединения формулы (I), как описано в двух вышеуказанных способах.

Способы изобретения, проводимые полностью при помощи реакций в растворе, а не в твердой фазе, обнаруживают неожиданно высокие выходы и не требуют использования способов очистки ВЭЖХ, что, таким образом, позволяет значительно уменьшить затраты при получении и достичь получения продуктов в большом масштабе.

Подробное описание изобретения

Защитные группы азота, используемые в настоящих способах, могут быть выбраны из любых защитных групп, которые могут быть использованы для синтеза пептидов, таких как защитные группы, указанные в М.Bodansky, "Peptide Chemistry", Springer Verlag, 1988, или в J.Jones. "The Chemical Synthesis of Peptides", Clarendon Press. Oxford, 1994. В соответствии с данным изобретением защитные группы азота предпочтительно выбраны из группы, состоящей из бензилоксикарбонила и алкоксикарбонила, в котором алкильная часть представляет собой неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу; более предпочтительно они выбраны из трет-бутоксикарбонила (Boc) и бензилоксикарбонила (Z).

R₈ представляет собой остаточную группу, образованную процедурой активации, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из бензилоксикарбонила, алкоксикарбонила, содержащего в алкильной части неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу, сукцинимидила, бензотриазола, возможно замещенного галогеном, и азабензотриазола.

Линейные пептиды формулы (II) могут быть получены одной из следующих стратегий.

а) Постадийная стратегия: по этой стратегии аминокислоты, необходимые для получения пептида формулы (II), последовательно сочетают, исходя из производного аминокислоты Dpr формулы (X), защищенной у атома азота и полученной отдельно или генерированной in situ

где A₁ и A₂, отличные друг от друга, представляют собой защитные группы атома азота, как определено выше;

R₉ представляет собой остаточную группу, образованную процедурой активации, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из бензилоксикарбонила, алкоксикарбонила, содержащего в алкильной части неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу, и сукцинимидила;

производное формулы (X), указанной выше, подвергают взаимодействию с эфиром Leu (XI) в присутствии растворителя

где R₅ имеет значения, указанные выше,

таким образом получая дипептид A₄-Drp(A₂)-Leu-R₅, который затем освобождают от защитной группы подходящим способом, зависящим от защитной группы на атоме азота, которая должна быть удалена, и совместимым с защитной группой, которая должна сохраняться.

Затем таким образом освобожденный от защитной группы дипептид сочетают с активированным эфиром аминокислоты Phe и так далее последовательно со звеньями Trp и Asp до получения соединения формулы (II).

b) Стратегия 2+2+1: данная стратегия состоит в сочетании дипептида с одной удаленной защитной группой H-Dpr(A₂)-Leu-R₅, полученным, как описано выше по стратегии а), с активированным производным дипептида, имеющего нижеследующую формулу (XII)

A₅-Trp-Phe-ОН

(XII)

где A₂ и A₅, отличающиеся друг от друга, представляют собой защитные группы атомов азота, как описано выше;

полученным отдельно или генерированным in situ сочетанием активированного эфира Trp, защищенного у атома азота, и полученного отдельно или генерированного in situ, с эфиром Phe, и последующим гидролизом эфирной группы.

Образовавшийся тетрапептид A₅-Trp-Phe-Dpr(A₂)-Leu-R₅ подходящим образом освобождают от защитной группы, присоединенной к атому азота Trp, и сочетают с соединением формулы (VIb)

в которой A₁, R₆ и R₈ имеет указанные выше значения.

с) Стратегия 3+2: в соответствии с данной стратегией трипептид A₁-Asp(R₆)-Trp-Phe-OH, полученный удалением защитной группы атома азота у соединений формулы (XII), указанных выше, и последующим сочетанием с соединением формулы (VIb), указанным выше, затем сочетают с дипептидом с одной удаленной защитной группой H-Dpr-(A₂)-Leu-R₅, полученным, как описано в соответствии с процедурой стратегии а).

Используемый в настоящем изобретении термин «низшие алкоксильные группы» относится к тем алкоксильным группам, у которых алкильная часть содержит неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу, предпочтительно выбранным из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, изопропила и трет-бутила. Это должно относится также к алкилоксикарбонильным группам изобретения, у которых алкильная часть содержит неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, изопропила и трет-бутила.

Агент сочетания может быть выбран из любого из агентов сочетания, обычно используемых в синтезе пептидов, так чтобы получить активированное производное аминокислоты, такое как производные аминокислот, указанные, например, в М. Bodansky, "Peptide Chemistry", Springer Verlag, 1988, или в J. Jones, "The Chemical Synthesis of Peptides", Clarendon Press, Oxford, 1994.

Активированные производные, если они не являются коммерчески доступными, могут быть получены отдельно или in situ взаимодействием аминокислоты или пептида и одного или нескольких из многочисленных известных агентов сочетания, таких как изобутилхлорформиат (IBCF), карбодиимид, выбранный из дициклогексилкарбодиимида (DCC) и гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC·HCI), возможно в комбинации с гидроксипроизводным, выбранным из 1-гидроксибензотриазола (HOBt), 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HOAt), 6-хлор-1-гидроксибензотриазола (Cl-HOBt) и гидроксисукцинимида (HOSu); фосфониевой солью, солью N-оксида гуанидина или урониевой солью, такой как гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)три(диметиламино)фосфония (ВОР), гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинфосфония (РуВОР), гексафторфосфат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-бензотриазолия (HBTU), гексафторфосфат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия (HCTU), тетрафторборат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-бензотриазолия (TBTU), гексафторфосфат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазол[4,5-b]пиридиния (HATU), тетрафторборат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1H-бензотриазолия (TCTU), тетрафторборат O-[(этоксикарбонил)цианометиленамино]-N,N,N',N'-тетраметилурония (TOTU), тетрафторборат O-(бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2,3-дикарбоксимидо)-N,N,N',N'-тетраметилурония (TNTU) или тетрафторборат O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (TSTU).

Когда указанное производное генерируют in situ, реакцию сочетания проводят сразу после добавления другого реагента, который в случае внутримолекулярных циклизаций явно соответствует свободной концевой аминогруппе, присутствующей в самой молекуле.

Реакцию сочетания обычно проводят в присутствии третичного амина, такого как N-метилморфолин (NMM), триэтиламин (TEA) или диизопропилэтиламин (DIPEA), в органическом растворителе, выбранном из растворителей, обычно используемых для синтеза пептидов. Предпочтительными растворителями для реакции сочетания являются этилацетат (AcOEt), диметилформамид (ДМФ) и N-метилпирролидон (NMP).

Реакции сочетания могут быть проведены при температуре, которая не должна вызывать деградации или сделать реакцию слишком медленной, причем температура предпочтительно находится между -20 и +50°C.

Удаления защитных групп в способах изобретения достигают подходящими способами для групп, которые нужно удалить, и совместимыми с группами, которые остаются; данные реакции удаления защитных групп обычно проводят способами каталитического гидрирования или обработками кислотами или основаниями.

Для гидрирований катализатор может быть выбран из тех рядов катализаторов, которые являются доступными и подходящими для этой цели, предпочтительным является 5% или 10% палладием. Растворитель для реакций удаления защитной группы каталитическим гидрированием может быть выбран из растворителей, которые растворяют соединения в реакции, в том числе кетоны, такие как ацетон, растворителей, которые отравляют катализатор, и растворителей, которые не взаимодействуют с самими компонентами реакции. Предпочтительными растворителями для реакции являются ДМФ, NMP, органические кислоты, такие как уксусная кислота и п-толуолсульфоновая кислота (PTSA), и спирты, такие как метанол, этанол и изопропанол, или их смеси. Температура реакции гидрирования находится между -20 и +50°C.

Для удаления защитных групп обработкой кислотой предпочтительно используют минеральные кислоты, такие как хлористоводородная кислота, или органические кислоты, такие как трифторуксусная кислота или муравьиная кислота, которые могут быть использованы отдельно или в смеси с другими растворителями. Температура составляет от -20 до +50°C.

Для удаления защитных групп обработкой основанием предпочтительно используют гидроксиды щелочных металлов и щелочноземельных металлов в присутствии растворителя, такого как вода, диоксан, ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол или их смеси; температура находится между -20 и +50°C.

Термин «защитная группа атома кислорода, используемый в настоящем изобретении, относится к защитной группе, выбранной из групп, обычно используемых для защиты групп -ОН и хорошо известных любому специалисту в данной области, выбранной, например, из группы, состоящей COR₄, где R₄ представляет собой неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, фенил, возможно замещенный атомом галогена, бензил или бензоил; предпочтительной защитной группой атома кислорода является ацетил.

В соответствии с изобретением гликопептидные соединения формулы (I-А) могут быть получены взаимодействием гликозидного производного формулы (III-A) с активированным производным пептида формулы (II-A), полученным реакцией активации или генерированным in situ соединением формулы (I). Следовательно, в способе получения бициклических гликопептидных соединений формулы (I-A) гликозидную группу вводят не в линейный пептид, а в бициклическое пептидное соединение.

Если соединения формулы (III-A) подвергают реакции, когда R₁, R₂ и R₃ не являются водородом, полученные соединения формулы (I-A) могут быть превращены в соответствующие соединения, в которой R₁=R₂=R₃=H, посредством каталитического гидрирования или обработкой кислотой или основанием в соответствии с природой защитных групп R₁, R₂ и R₃.

Гликозидные соединения формулы (III-A), предпочтительно используемые в способе изобретения, выбраны из группы, состоящей из 2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-глюкопиранозиламина и 2-ацетамидо-3,4,6-три-O-ацетил-2-дезокси-β-D-глюкопиранозиламина, которые являются известными в литературе и могут быть получены, например, как описано соответственно в I. Shin. et al., Tetrahedron Letters, 42 (2001), 1325-1328, и D. Macmillan et al., Organic Letters, Vol.4, №9, 2002.

Нижеследующие примеры и схемы синтеза приведены для обеспечения неограничивающей иллюстрации изобретения.

В схеме 1 указан путь синтеза, который, начинаясь из соединений формулы (II), приводит к соединениям формулы (I-A), тогда как на схемах 2-4 показаны три разные стратегии получения соединений формулы (II).

Защитными группами, приведенными в качестве примеров, являются трет-бутоксикарбонил (ВОС) и бензилоксикарбонил (Z) для концевых аминогрупп и группа метилового эфира и трет-бутилового эфира для концевых карбоксильных групп.

Номера, указанные рядом с каждым соединением в нижеследующих схемах, соответствуют номерам, приписываемым соединениям в примерах.

Идентификацию и оценку чистоты для полученных соединений устанавливали элементным анализом, ВЭЖХ, ¹H-ЯМР, ИК- и масс-спектральным анализом.

ПРИМЕР 1

Получение Z-Asp(OH)-Trp-Phe-DDr(H)-Leu-OMe (SEQ. ID. 1)

72 ммоль/л раствора Z-Asp(O-трет-Bu)-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe, полученного, как описано в примере 15, в 95% муравьиной кислоте нагревают до 40°C в вакууме в течение 4 дней.

Реакционную смесь упаривают при пониженном давлении и остаток снова растворяют в смеси 8:2 CH₃CN-H₂O.

Суспензию охлаждают до 15-20°C и рН регулируют до 6 добавлением 20% водного раствора NMM.

Ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении и образовавшуюся суспензию фильтруют.

Беловатое твердое вещество промывают H₂O и сушат в вакууме при 30-40°C, получая продукт с выходом, равным 96,4%.

¹H-ЯМР, диметилсульфоксид-d₆ (ДМСО-d₆) δ:

0,86 (2д; 6Н); 1,47-1,75 (м; 3H); 2,32-2,68 (м; 2Н); 2,79-3,55 (м; 6Н); 3,63 (с; 3H); 4,25-4,65 (м; 5Н); 4,99 (AB-Syst.; 2Н); 6,91-7,43 (м; 14Н); 7,48-7,60 (2д; 2Н); 7,82 (ушир.; 2Н), 8,03-8,43 (4д; 4Н); 10,83 (с; 1Н); 12,35 (ушир.; 1Н).

ПРИМЕР 2

Получение Z-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-Ome (SEQ. ID. 2)

2,2 эквивалента NMM добавляют к 24 ммоль/л раствора Z-Asp(OH)-Trp-Phe-Dpr(NH₂)-Leu-Ome в ДМФ и спустя 5-10 минут добавляют 1,2 эквивалента PyBOP.

После 2-3 часов перемешивания при комнатной температуре раствор упаривают при пониженном давлении до получения жидкого остатка, который добавляют по каплям в 0,5 М водный раствор NaHCO₃.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают смесью 4:6 ДМФ - Н₂О, затем Н₂O до достижения нейтрального значения рН и сушат в вакууме при 30-50°C, получая при этом продукт с выходом, равным 84,2%.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,83 (2д; 6Н); 1,34-1,69 (м; 3H); 2,31-2,92 (м; 4Н); 3,03-3,91 (м; 4Н); 3,61 (с; 3H); 4,17-4,63 (м; 5Н); 5,01 (AB-Syst.; 2Н); 6,84-7,48 (м; 16Н); 7,60 (д; 1Н); 7,87 (д; 2Н); 8,01 (т; 1Н); 8,27 (д; 1Н); 10,81 (с; 1Н).

ПРИМЕР 3

Получение Z-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH (SEQ. ID. 3)

Мутный раствор, содержащий 77 ммоль/л Z-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-Ome в смеси 8:2 диоксан - H₂O, нагревают до 35°C и выдерживают при рН 12,0-12,5 медленным и непрерывным добавлением 1,5 н. NaOH.

В конце реакции рН мутного раствора устанавливают до 9 добавлением 6 н. HCl, осветляют фильтрованием на слое для соадъювантного фильтрования и подкисляют до рН 3 снова добавлением 6 н. HCl.

Раствор концентрируют при пониженном давлении до получения фильтруемого раствора.

Полученное фильтрованием беловатое твердое вещество промывают смесью 1:1 диоксан - H₂O, затем Н₂О и сушат в вакууме при 30-40°C, получая при этом продукт с выходом, равным 97,7%.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,84 (2д; 6Н); 1,42-1,76 (м; 3H); 2,29-3,48 (м; 7Н); 3,85 (м; 1Н); 4,10-4,65 (м; 5Н); 5,00 (AB-Syst.; 2Н); 6,86-7,47 (м; 16Н); 7,55-8,36 (4д+м; 5Н); 10,80 (д; 1Н); 12,65 (ушир.; 1Н).

ПРИМЕР 4

Получение Z-Asp(O-трет-Bu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH (SEQ. ID. 4)

66 ммоль/л раствора Z-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH в ДМФ гидрируют при комнатной температуре в присутствии 1 эквивалента NMM и каталитических количеств 10% Pd/C при 50% влаги.

После реакции в течение 6 часов суспензию фильтруют для удаления катализатора и фильтрат разбавляют ДМФ с получением 53 ммоль/л раствора Z-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH, к которому добавляют 4 эквивалента NMM и 1,05 эквивалента Z-Asp(O-трет-Bu)Osu.

После перемешивания в течение 5 часов при комнатной температуре смесь упаривают при пониженном давлении до получения остатка, который прикапывают в 0,5 н. H₂SO₄. Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают смесью 1:1 ДМФ - H₂O, затем Н₂О и сушат в вакууме при 30-40°C, получая при этом продукт с выходом, равным 93,7%.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,84 (2д; 6Н); 1,35 (с; 9Н); 1,40-1,70 (м; 3H); 2,20-3,94 (м; 10Н); 4,10-4,81 (м; 6Н); 4,92-5,12 (AB-Syst; 2Н); 6,74-7,57 (м; 17Н); 7,71-8,35 (4д+1 т; 5Н); 10,70 (с; 1Н); 12,70 (ушир.; 1Н).

ПРИМЕР 5

Получение цикло[Asp(O-трет-Bu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] (SEQ. ID. 5)

47 ммоль/л раствора Z-Asp(O-трет-Bu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH в ДМФ гидрируют при комнатной температуре в присутствии 1 эквивалента DIPEA и каталитических количеств 10% Pd/C при 50% влаги.

После реакции в течение приблизительно 2 часов суспензию фильтруют для удаления катализатора и разбавляют ДМФ до получения 19 ммоль/л раствора H-Asp(O-трет-Bu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH, к которому добавляют 1,4 эквивалента DIPEA и 1,2 эквивалента HATU.

После перемешивания в течение 30-60 минут при комнатной температуре раствор упаривают при пониженном давлении до получения остатка, который добавляют по каплям в 0,5 М водный раствор NaHCO₃.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают большим количеством H₂O до нейтрального рН, сушат в вакууме при 30-50°C, получая при этом продукт с выходом, равным 94,1%.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,88 (2д; 6Н); 1,38 (с; 9Н); 1,31-1,72 (м; 3H); 2,33-2,99 (м; 6Н); 3,20-3,63 (м; 3H); 3,87-4,62 (м; 7Н); 6,75-7,50 (м; 13Н); 8,04 (ушир.; 1Н); 8,56 (д; 1Н); 8,76 (д; 1Н); 9,18 (ушир.; 1Н); 10,84 (с; 1Н).

ПРИМЕР 6

Получение цикло[Asp(ОН)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] (SEQ. ID. 6)

83 ммоль/л раствора цикло[Asp(O-трет-Bu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] в 90% муравьиной кислоте нагревают при 40°C в вакууме в течение 2 часов. Реакционную смесь упаривают при пониженном давлении до получения густого остатка, который снова растворяют в H₂O.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают H₂O, сушат в вакууме при 30-40°C и, наконец, очищают при помощи колонки сефадекса® LH-20, элюируя метанолом.

Получают 314 г белого твердого вещества (титр 95,2%, выход 82,0%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,88 (2д; 6Н); 1,31-1,77 (м; 3H); 2,32-3,73 (м; 9Н); 3,80-4,65 (м; 7Н); 6,82-7,51 (м; 13Н); 7,94-9,19 (2д; 2 ушир.; 4Н); 10,85 (с; 1Н); 12,20 (с, 1Н).

ПРИМЕР 7

Получение цикло[Asp-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] (SEQ. ID. 7)

3 эквивалента NMM, 1,2 эквивалента HATU и 2-ацетамидо-3,4,6-три-O-ацетил-2-дезокси-β-D-глюкопиранозиламина добавляют к 0,24 моль/л раствора цикло[Asp(OH)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] в ДМФ с интервалами 10 минут.

После перемешивания в течение 1 часа при 0-4°C реакционную смесь упаривают при пониженном давлении до получения жидкого остатка, который добавляют по каплям в 1% водный раствор NaHCO₃.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают H₂O, сушат в вакууме при 30-40°C и очищают кристаллизацией из смеси EtOH - H₂O.

Получают 117 г белого твердого вещества (титр 96,0%, выход 87,0%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

10,80 (д; 1Н); 8,90 (ушир.; 1Н), 8,72 (д; 1Н); 8,47 (д; 1Н); 8,46 (д; 1Н); 8,08 (ушир.; 1Н); 7,84 (д; 1Н); 7,43 (дд; 1н); 7,33 (дд; 1Н); 7,24 (ушир.; 1Н); 7,23 (м; 2Н); 7,16 (м; 3H); 7,14 (д; 1Н); 7,06 (дт; 1Н); 7,00 (д; 1Н); 6,98 (дт; 1Н); 6,90 (т; 1Н); 5,18 (дд; 1Н); 5,12 (дд; 1Н); 4,82 (дд; 1Н); 4,18 (дд; 1Н); 3,96 (дд; 1Н); 3,85 (ддд; 1Н); 3,80 (ддд; 1Н); 4,53 (м, 1Н); 4,47 (м; 1Н); 4,43 (м; 1Н); 4,39 (м; 1Н); 4,16 (м; 1Н); 4,08 (м; 1Н); 3,58 (м; 1Н); 3,30 (м; 1Н); 2,98 (м; 1Н); 2,88 (м; 1Н); 2,86 (м; 1Н); 2,70 (м; 1Н); 2,65 (м; 1Н); 2,60 (м; 1Н); 2,19 (м; 1Н); 2,00 (с; 3H); 1,96 (с; 3H); 1,90 (с; 3H); 1,73 (с; 3H); 1,65 (м; 1Н); 1,52 (м; 1Н); 1,37 (м; 1Н); 0,92 (д; 3H); 0,85 (д; 3H).

ПРИМЕР 8

Получение цикло[Asp-Asp-Trp-Pbe-Dpr-Leu] (непадутант) (SEQ. ID. 8)

Способ а)

2 эквивалента NMM и 1,3 эквивалента TBTU и 2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-глюкопиранозиламина добавляют с интервалами 10 минут к 83 ммоль/л раствора в ДМФ цикло[Asp(ОН)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] (получен, как описано в примере 6).

После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре реакционную смесь упаривают при пониженном давлении до получения густого маслянистого остатка, который снова растворяют в смеси 2:8 ацетонитрил-трет-бутоксиметан (ТВМЕ). Образовавшуюся суспензию энергично перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре и затем фильтруют.

Полученное твердое вещество промывают ТВМЕ, сушат в вакууме при 25-30°C и, наконец, очищают препаративной ВЭЖХ с использованием в качестве элюента смесей, состоящих из ацетонитрила и воды.

Получают 151 г белого твердого вещества (титр 93,0%, выход 89,3%).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,85 (д; 3H); 0,92 (д; 3H); 1,36 (м; 1Н); 1,51 (м; 1Н); 1,65 (м; 1Н); 1,76 (с; 3H); 2,16 (дд; 1Н); 2,57 (дд; 1Н); 2,63 (дд, 1Н); 2,67 (дд; 1Н); 2,83 (дд; 1Н); 2,88 (дд; 1Н); 2,93 (м; 1Н); 3,04-3,09 (м; 2Н); 3,27-3,32 (м; 2Н); 3,42 (м; 1Н); 3,50 (ддд+ушир.; 2Н); 3,65 (дд; 1Н); 3,96 (ушир.; 1Н); 4,09 (м; 1Н); 4,12 (м; 1Н); 4,35 (м; 1Н); 4,43 (м; 1Н); 4,50 (м; 1Н); 4,53 (м+т; 2Н); 4,81 (дд; 1Н); 4,94 (д; 1Н); 4,98 (д; 1Н); 6,91 (ушир.; 1Н); 6,98 (т+ушир.; 2Н); 7,06 (т; 1Н); 7,14-7,17 (м; 4Н); 7,24 (т; 2Н); 7,27 (ушир.; 1Н); 7,33 (д; 1Н); 7,42 (д; 1Н); 7,77 (д; 1Н); 8,05 (ушир.; 1Н); 8,10 (д; 1Н); 8,51 (д; 1Н); 8,77 (д; 1Н); 9,00 (ушир.; 1Н); 10,84 (д; 1Н).

Способ b)

0,04 эквивалента 0,1 н. NaOMe в МеОН добавляют к 0,89 моль/л раствора в МеОН цикло[Asp-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu], полученного, как описано в примере 7.

После перемешивания в течение 3 часов при комнатной температуре рН регулируют до 6,5-7 и добавляют амберлист® 15. После удаления смолы раствор концентрируют при пониженном давлении до получения остатка, который разбавляет ТВМЕ.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное белое твердое вещество промывают ТВМЕ, сушат в вакууме при 35-40°C, получая при этом продукт с выходом, равным 94,8%.

ПРИМЕР 9

Получение Z-Dpr(BOC)-Leu-ОМе

Способ а)

1,2 эквивалента NMM добавляют к 0,66 моль/л раствора Z-Dpr(BOC)-OH в ДМФ. Раствор охлаждают до -25°C и 1 эквивалент IBCF добавляют по каплям при поддержании температуры ниже -20°C.

Спустя приблизительно 10 минут по каплям добавляют 0,78 моль/л предварительно охлажденного раствора, содержащего 1 эквивалент H-Leu-OMe·HCL и NMM в ДМФ, всегда поддерживая температуру ниже -15°C.

После перемешивания в течение одного часа реакционную смесь добавляют по каплям в 0,5 М водный раствор NaHCO₃.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают последовательно H₂O, 0,05 М H₂SO₄ и Н₂О до достижения нейтрального значения рН, сушат в вакууме при 30-50°C, получая при этом продукт с выходом, равным 89,0%. Точка плавления 122-125°C.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,85 (2д; 6Н); 1,37 (с; 9Н); 1,40-1,71 (м; 3H); 3,01-3,36 (м; 2Н); 3,61 (с; 3H); 4,06-4,37 (м; 2Н); 5,03 (с; 2Н); 7,35 (с; 5Н); 6,66 (т; 1Н); 7,20 (д; 1Н); 8,29 (д; 1Н).

Способ b)

1 эквивалент DCC добавляют к 0,35 моль/л раствора Z-Dpr(BOC)-OH в ДМФ, содержащего 1 эквивалент HOSu и охлажденного до 0-5°C. Смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 1 часа. DCC удаляют фильтрованием и к прозрачному раствору добавляют 1,2 эквивалента H-Leu-ОМе·HCl и 2,6 эквивалента NMM. После перемешивания в течение 2-3 часов при комнатной температуре смесь разбавляют 0,5 н. NaHCO₃, затем охлаждают до -5°C.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество последовательно промывают 0,5 н. NaHCO₃, смесью 2:1 H₂O - ДМФ и водой, затем сушат в вакууме при 30-40°C, получая при этом продукт с выходом, равным 93%.

ПРИМЕР 10

Получение H-Dpr(BOC)-Leu-OMe

0,14 моль/л раствора Z-Dpr(BOC)-Leu-OMe в МеОН, содержащего 1 эквивалент PTSA, гидрируют при комнатной температуре в присутствии каталитических количеств 10% Pd/C, 50% влаги.

После реакции в течение приблизительно 2 часов суспензию фильтруют для удаления катализатора и фильтрат разбавляют ДМФ.

МеОН и Н₂O полностью выпаривают при пониженном давлении и остаточный раствор в ДМФ, содержащий дипептид, используют для последующего сочетания.

ПРИМЕР 11

Получение Z-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe

Указанное соединение получают из дипептида H-Dpr(BOC)-Leu-OMe из примера 10 по способу, описанному в примере 9, с использованием Z-Phe-OH.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,86 (2д; 6Н); 1,38 (с; 9Н); 1,40-1,74 (м; 3H); 2,73-3,02 (м; 2Н); 3,10-3,41 (м; 2Н); 3,62 (с; 3H); 4,17-4,46 (м; 3H); 4,94 (AB-Syst.; 2Н); 7,18-7,39 (м; 10Н); 6,52 (т; 1Н); 7,52(д; 1Н); 8,13(д; 1Н); 8,25(д; 1Н).

ПРИМЕР 12

Получение H-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe

Данное соединение получают из защищенного производного из примера 11 по способу примера 10 с использованием ДМФ в качестве растворителя.

ПРИМЕР 13

Получение Z-Trp-Phe-Dpr(Boc)-Leu-OMe (SEQ. ID. 9)

Данное соединение получают с использованием способа в примере 9 из трипептида примера 12 и с использованием Z-Trp-OH или сочетанием двух пептидов Z-Trp-Phe-OH и H-Dpr(BOC)-Leu-OMe, полученных, как описано в примерах 17 и 10 соответственно.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,86 (2д; 6Н); 1,37 (с; 9Н); 1,40-1,76 (м; 3H); 2,73-3,41 (м; 6Н); 3,62 (с; 3H); 4,16-4,67 (м; 4Н); 4,93 (AB-Syst.; 2Н); 6,89-7,65 (м; 16Н); 6,55 (т; 1Н); 8,07 (д; 1Н); 8,11 (д; 1Н); 8,29 (д; 1Н); 10,79 (с; 1Н).

ПРИМЕР 14

Получение H-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe (SEQ. ID. 10)

Данное соединение получают из защищенного производного примера 13 по способу примера 10 с использованием NMP в качестве растворителя.

ПРИМЕР 15

Получение Z-Asp(O-трет-Bu)-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe (SEQ. ID. 11)

Способ а)

1 объем CH₃CN, 1,5 эквивалента DIPEA и 1,15 эквивалента 7-Asp(O-трет-Bu)-OSu добавляют к 0,16 моль/л раствора H-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe в NMP, полученного реакцией гидрирования. После перемешивания в течение 3-4 часов при комнатной температуре реакционную смесь охлаждают до 5°C и разбавляют H₂O. Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают смесью 3:7 CH₃CN - H₂O и H₂O и затем сушат в вакууме при 30-50°C, получая при этом продукт с выходом, равным 90%.

Способ b)

1 эквивалент DIPEA, 1,1 эквивалента TBTU и через 5 минут 1 эквивалент 0,25 моль/л раствора H-Dpr(BOC)-Leu-OMe в ДМФ, полученного реакцией гидрирования (пример 10), добавляют к 0,22 моль/л раствора Z-Asp-(O-трет-Bu)-Trp-Phe-OH в ДМФ, охлажденному до -5°C, при поддержании температуры ниже -5°C.

После перемешивания в течение приблизительно 2 часов реакционную смесь разбавляют 0,5 М водным раствором NaHCO₃.

Образовавшуюся суспензию фильтруют и полученное твердое вещество промывают последовательно H₂O, смесью 3:4 ДМФ - 0,5 М NaHCO₃, Н₂О и затем сушат в вакууме при 30-40°C, получая при этом продукт с выходом 84,4%. Точка плавления 215-218°C.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

0,86 (2д; 6Н); 1,34 (с; 9Н); 1,37 (с; 9Н); 1,40-1,72 (м; 3H); 2,23-2,67 (м; 2Н); 2,71-3,39 (м; 6Н); 3,62 (с; 3H); 4,23-4,58 (м; 5Н); 5,01 (AB-Syst.; 2Н); 6,89-7,58 (м; 16Н); 6,50 (т; 1Н); 7,87-8,29 (4д; 4Н); 10,78 (с; 1Н).

ПРИМЕР 16

Получение Z-Trp-Phe-OMe

Соединение получают по способу примера 9 сочетанием двух аминокислот Z-Trp-OH и H-Phe-OMe

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ:

2,88-2,98 (м; 2Н); 3,11 (дд; 1Н); 3,32 (дд; 1Н); 3,62 (с; 3H); 4,40-4,58 (м; 1Н); 4,16-4,30 (м; 1Н); 5,11 (с; 2Н); 5,45 (д; 1Н); 6,11 (д; 1Н); 6,72-6,85 (м; 2Н); 6,92-7,46 (м; 12Н); 7,67 (д; 1Н); 8,03 (с; 1Н).

ПРИМЕР 17

Получение Z-Trp-Phe-OH

Данное соединение получают из метилового эфира примера 16 по способу, описанному в примере 3.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

2,70-3,15 (м; 4Н); 4,20-4,36 (м; 1Н); 4,38-4,55 (м; 1Н); 4,92 (с; 2Н); 6,85-7,42 (м; 15Н); 7,63 (д; 1Н); 8,26 (д; 1Н), 10,81 (с; 1Н); 12,30 (ушир.; 1Н).

ПРИМЕР 18

Получение H-Trp-Phe-OH

Данное соединение получают из защищенного производного примера 17 по способу примера 10 с использованием уксусной кислоты в качестве растворителя.

ПРИМЕР 19

Получение Z-Asp(O-трет-Bu)-Trp-Phe-OH

Соединение получают по способу примера 15 (способ а) из дипептида примера 18.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆) δ:

1,35 (с; 3H); 2,21-2,67 (м; 2Н); 2,71-3,18 (м; 4Н); 4,22-4,58 (м; 3H); 5,00 (AB-Syst; 2Н); 6,87-7,43 (м; 14Н); 7,55 (м; 2Н); 7,94 (д; 1Н), 8,17 (д; 1Н); 10,80 (с; 1Н); 12,25 (ушир.; 1Н).

Claims

1. Способ получения бициклических пептидных соединений формулы (I-A) в жидкой фазе

посредством промежуточного продукта формулы (I)

включающий в себя следующие стадии:

1) удаление защитной группы у линейного пентапептида формулы (II) в присутствии растворителя с получением соединения формулы (III)

где A₁ и А₂ представляют собой две защитные группы атомов азота, отличные друг от друга, и R₅ и R₆, отличные друг от друга, выбраны из бензилокси- и низших алкилоксигрупп, в которых алкильная часть содержит неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу;

2) внутримолекулярную циклизацию соединения формулы (III), полученного на стадии 1), в присутствии растворителя и подходящего агента сочетания с получением соединения формулы (IV)

где R₅ имеет указанные выше значения;

где R₅ имеет указанные выше значения;

4) сочетание соединения формулы (V), полученного на стадии 3), и защищенной аминокислоты формулы (VIa) в присутствии растворителя с получением соединений формулы (VII)

где А₃ представляет собой защитную группу атома азота; R₇ выбран из бензилокси- и низших алкилоксигрупп, в которых алкильная часть содержит неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу; R₈ представляет собой остаточную группу, образованную процедурой активации на карбоксильной группе;

где R₇ имеет указанные выше значения;

где R₇ имеет указанные выше значения;

где R₇ имеет указанные выше значения;

8) активация бициклических пептидных соединений формулы (I) с подходящим агентом сочетания с получением производного соединения формулы (II-A)

где R представляет собой группу, выбранную из бензотриазола, возможно замещенного галогеном, азабензотриазола и сукцинимидила;

9) взаимодействие соединения формулы (II-A), полученного на стадии 8), в присутствии растворителя с гликозидным производным формулы (III-A) с получением соединения формулы (I-A)

где R, R₁, R₂ и R₃ имеют указанные выше значения.

2. Способ по п.1, в котором линейные пептиды формулы (II) получают стратегией последовательного сочетания подходящих аминокислот, исходя из производного аминокислоты Dpr формулы (X), защищенного на атоме азота и полученного отдельно или генерированного in situ

где А₂ и А₄, отличные друг от друга, представляют собой защитные группы атомов азота;

в соответствии со следующими стадиями:

взаимодействие производного формулы (X), приведенной выше, в присутствии растворителя с эфиром Leu формулы (XI)

где R₅ имеет значения, указанные в п.1, с получением дипептида A₄-Dpr(A₂)-Leu-R₅,

удаление защитной группы у дипептида A₄-Dpr(A₂)-Leu-R₅ с получением дипептида с одной удаленной защитной группой H-Dpr(A₂)-Leu-R₅;

сочетание дипептида с одной удаленной защитной группой Н-Dpr(А₂)-Leu-R₅ с активированным эфиром последующей аминокислоты Phe и затем последовательно с Trp и Asp до получения соединений формулы (II).

3. Способ по п.1, в котором линейные пептиды формулы (II) получают при помощи стратегии синтеза, включающей в себя следующие стадии:

сочетание дипептида с одной удаленной защитной группой H-Dpr(A₂)-Leu-R₅, полученного, как описано в п.2, с активированным производным дипептида нижеследующей формулы (XII)

A₅-Trp-Phe-OH,

(XII)

где А₂ и А₅, отличные друг от друга, представляют собой защитные группы атомов азота, полученных отдельно или генерированных in situ сочетанием активированного эфира Trp, защищенного у атома азота и полученного отдельно или генерированного in situ, с эфиром Phe, и последующим гидролизом эфирной группы с получением тетрапептида A₅-Trp-Phe-Dpr(A₂)-Leu-R₅;

подходящее удаление защитной группы, присоединенной к атому азота у Trp, у тетрапептида A₅-Trp-Phe-Dpr(A₂)-Leu-R₅;

сочетание тетрапептида с удаленной защитной группой с соединением формулы (VIb)

в которой A₁, R₆ и R₈ имеют значения, указанные в п.1.

4. Способ по п.1, в котором линейные пептиды формулы (II) получают стратегией синтеза типа 3+2, который включают в себя сочетание трипептида A₁-Asp(R₆)-Trp-Phe-OH, полученного удалением защитной группы у атома азота из указанных выше соединений формулы (XII), последующим сочетанием с соединением указанной выше формулы (VIb) и затем дальнейшим сочетанием с дипептидом с одной удаленной защитной группой H-Dpr-(A₂)-Leu-R₅, полученным, как описано в п.2.

5. Способ по п.1, в котором указанные защитные группы атомов азота выбраны из группы, состоящей из бензилоксикарбонила и алкоксикарбонилов, у которых алкильная часть содержит неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу.

6. Способ по п.5, в котором указанные защитные группы атомов азота выбраны из трет-бутоксикарбонила и бензилоксикарбонила.

7. Способ по п.1, в котором указанная группа R₈ выбрана из группы, состоящей из бензилоксикарбонила, алкилоксикарбонила, содержащего неразветвленную или разветвленную С1-С4-группу в алкильной части, сукцинимидила, бензотриазола, возможно замещенного галогеном, и азабензотриазола.

8. Способ по пп.1-7, в котором указанная неразветвленная или разветвленная С1-С4-группа выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, изопропила и трет-бутила.

9. Способ по п.1, в котором соединения формулы (I-A), где R₁, R₂ и R₃ не являются водородом, превращают в соответствующие соединения формулы (I-А), где R₁=R₂=R₃=H, реакцией удаления защитных групп в присутствии растворителя.

10. Способ по п.9, в котором указанные защитные группы атомов кислорода выбраны из группы, состоящей из -COR₄, где R₄ представляет собой неразветвленную или разветвленную С1-С4-алкильную группу, фенил, возможно замещенный атомом галогена, бензил или бензоил.

11. Способ по п.10, в котором указанная С1-С4-алкильная группа выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, изопропила и трет-бутила.

12. Способ по п.11, в котором указанная С1-С4-алкильная группа представляет собой метил.

13. Способ по п.1, в котором указанные гликозидные производные формулы (III-A) выбраны из группы, состоящей из 2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-глюкопиранозиламина и 2-ацетамидо-3,4,6-три-O-ацетил-2-дезокси-β-D-глюкопиранозиламина.

14. Способ по п.1, в котором указанный агент сочетания, используемый на стадии 8, выбран из группы, состоящей из изобутилхлорформиата, карбодиимида, возможно в комбинации с гидроксипроизводным, фосфониевыми солями, солями N-оксида гуанидина и урониевыми солями.

15. Способ по п.14, в котором указанные карбодиимиды выбраны из группы, состоящей из дициклогексилкарбодиимида и гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида; указанное гидроксипроизводное выбрано из 1-гидроксибензотриазола, 6-хлор-1-гидроксибензотриазола, гидроксисукцинимида и 1-гидрокси-7-азабензотриазола; указанные фосфониевые соли, соли N-оксида гуанидина и урониевые соли выбраны из гексафторфосфата (бензотриазол-1-илокси)три(диметиламино)фосфония, гексафторфосфата (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинфосфония, гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-бензотриазолия, гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия, тетрафторбората 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-бензотриазолия, гексафторфосфата 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазол[4,5-b]пиридиния, тетрафторборат 3-оксида 1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлор-1Н-бензотриазолия, тетрафторбората O-[(этоксикарбонил)цианометиленамино]-N,N,N',N'-тетраметилурония, тетрафторбората O-(бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2,3-дикарбоксимидо)-N,N,N',N'-тетраметилурония и тетрафторбората О-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония.

16. Способ по п.1, в котором указанные реакции сочетания на стадии 8 проводят в присутствии третичного амина в органическом растворителе при температуре между -20 и +50°С.

17. Способ по п.16, в котором указанный третичный амин выбран из группы, состоящей из N-метилморфолина, триэтиламина и диизопропилэтиламина, и указанный органический растворитель выбран из группы, состоящей из этилацетата, диметилформамида и N-метилпирролидона.

18. Способ по п.1 или 10, в которых указанные реакции удаления защитных групп проводят посредством гидрирования в присутствии катализатора в растворителе, выбранном из растворителей, которые растворяют компоненты реакции без реакции с ними, исключая кетоны, и растворителей, которые отравляют катализатор, при температуре между -20 и +50°С.

19. Способ по п.18, в котором указанный катализатор выбран из 5 и 10% палладия и указанный растворитель выбран из диметилформамида, N-метилпирролидона, уксусной кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, метанола, этанола, изопропанола и их смесей.

20. Способ по п.1 или 10, в которых указанные реакции удаления защитных групп проводят при помощи кислотной обработки чистыми кислотами или кислотами, смешанными с другими растворителями, при температуре между -20 и +50°С.

21. Способ по п.20, в котором указанные кислоты выбраны из хлористоводородной кислоты, трифторуксусной кислоты и муравьиной кислоты.

22. Способ по п.1 или 10, в которых указанные реакции удаления защитных групп проводят при помощи обработки соединением-основанием в присутствии растворителя при температуре между -20 и +50°С.

23. Способ по п.22, в котором указанное соединение-основание выбрано из гидроксидов щелочных металлов или щелочноземельных металлов и указанный растворитель выбран из группы, состоящей из воды, диоксана, ацетонитрила, метанола, этанола, изопропанола и их смесей.