RU2296328C1 - Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления - Google Patents
Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2296328C1 RU2296328C1 RU2005130476/15A RU2005130476A RU2296328C1 RU 2296328 C1 RU2296328 C1 RU 2296328C1 RU 2005130476/15 A RU2005130476/15 A RU 2005130476/15A RU 2005130476 A RU2005130476 A RU 2005130476A RU 2296328 C1 RU2296328 C1 RU 2296328C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chain reaction
- polymerase chain
- temperature
- carried out
- dna
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, молекулярно-биологическим исследованиям в области диагностики онкологических заболеваний. Заявленный способ и универсальный диагностический набор (ДН) предназначены для проведения медико-генетического анализа сразу нескольких мутаций (полиморфизмов) разных генов, в том числе генов, ассоциированных с некоторыми частыми мультифакториальными заболеваниями. Вследствие использования стандартных компонент смеси и стандартных олигопраймеров, оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) скорость анализа сокращается до 2-3 дней. Изобретение обеспечивает упрощение, удешевление анализа и делает его пригодным для проведения молекулярных исследований как в специализированных центрах, так и в лабораториях широкого спектра. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.
Description
Изобретение имеет отношение к медицине, молекулярно-биологическим исследованиям предрасположенности в области диагностики онкологических заболеваний.
Одним из наиболее перспективных и успешно развивающихся направлений мировой науки являются молекулярно-биологические технологии - основа для проведения опосредованного медико-генетического анализа. Данные технологии представляют собой широкий спектр методов, предназначенных для исследования и анализа генома организмов (от бактерии до человека), выявления и идентификации вариаций в структуре исследуемого участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) вплоть до расшифровки и установления первичной последовательности его оснований. Основой молекулярно-биологических методов диагностики являются различной степени сложности технологические манипуляции с нуклеиновыми кислотами, предварительно выделенными из клеток и тканей организма.
Расшифровка генома человека, идентификация тысяч новых генов и их полиморфизмов послужили концептуальной и методической основой молекулярной медицины, характерные особенности которой - профилактическая направленность и индивидуальный подход к человеку. Последний заключается, прежде всего, в выборе специфических молекулярных маркеров, необходимых для анализа аллельных вариантов набора генов (генной сети), вовлеченных в ту или иную патологию. В практической реализации такого подхода большое значение имеет совершенствование и упрощение методов анализа биологического материала. С этой целью создаются специальные диагностические наборы, опирающиеся на современные технологии и направленные на максимальное упрощение и автоматизацию молекулярных исследований без потери качества и точности анализа (http://www.clinlab.ru/win/LIBRARY/JOURNLAB/lab4/j4ct1.htm).
Стандартный способ диагностики предрасположенности к онкозаболеваниям включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), ферментативного гидролиза эндонуклеазами, электрофорез. Температурный режим ПЦР состоит из следующих этапов: начальное плавление, ряд последовательных циклов из плавления, отжига и синтеза, а также финального синтеза. Используются следующие реагенты: 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 6.7 мМ MgCl2; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 170 мкг БСА, смесь четырех dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза 0,2 ед./мкл (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, p.5.3-5.31, 6.36-6.45, 9.14-9.23, 14.14-14.19).
Недостатком этого способа является то, что с помощью его можно анализировать только одну мутацию или полиморфизм. Он не позволяет осуществить одновременный анализ сразу нескольких генов, что приводит к замедлению процесса диагностики, увеличению трудозатрат и усложнению рабочего протокола.
В основу изобретения положена задача создания универсального диагностического набора (ДН) для проведения медико-генетического анализа сразу нескольких мутаций (полиморфизмов) разных генов, в том числе генов, ассоциированных с некоторыми частыми мультифакториальными заболеваниями. Вследствие использования стандартных компонент смеси и стандартных олигопраймеров, оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) скорость анализа сокращается до 2-3 дней, поэтому применение способа определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностического набора приводит к упрощению, удешевлению анализа и делает его пригодным для проведения молекулярных исследований как в специализированных центрах, так и в лабораториях широкого спектра.
Решение этих технических задач обеспечивается описанной ниже модификацией общепринятого способа диагностики мультифакториальных заболеваний. После выделения ДНК проводят одну мультиплексную и одну стандартную полимеразную цепную реакцию с использованием 3 пар праймеров для мультиплексной ПЦР. Далее проводится гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindll (для мультиплексной ПЦР) и BstFNI (для стандартной ПЦР) и электрофорез продуктов гидролиза в 6% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля (в качестве маркера используют бромфенол).
В диагностическом наборе, включающем компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 6.7 мМ MgCl2; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 0,2 ед./мкл, все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) смешаны в одном объеме, все компоненты для проведения стандартной полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) и энзиматической рестрикции смешаны в других объемах, а в набор дополнительно включены ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и олигопраймеры.
Наличие смеси компонент, дополнительное введение ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, воды ампулированной и олигопраймеров в диагностический набор позволяет значительно ускорить процесс анализа, удешевить процедуру диагностики, сделать ее более доступной независимо от условий проведения.
Предложенные условия проведения анализа позволяют с помощью диагностического набора быстро, дешево и точно осуществить диагностику предрасположенности к онкологическим заболеваниям.
Состав набора можно представить в виде следующей схемы, которая показана на чертеже. В состав набора входит 1 - упаковочная коробка для набора; 2 - комплект №1 для проведения ПЦР и энзиматической реакции (смесь для мультиплексной ПЦР, термостабильная ДНК полимераза, буфер для эндонуклеазы рестрикции, эндонуклеаза рестрикции Hindll и контроль для ПЦР и энзиматической реакции); 3 - комплект №2 для проведения ПЦР и энзиматической реакции (смесь для стандартной ПЦР, термостабильная ДНК полимераза, буфер для эндонуклеазы рестрикции, эндонуклеаза рестрикции BstFNI и контроль для ПЦР и энзиматической реакции); 4 - вода ампулированная.
В заявляемом изобретении предлагается новый модифицированный вариант идентификации аллелей генов, ассоциированных с онкозаболеваниями, путем использования набора олигопраймеров и температурного режима, позволяющих проводить мультиплексную полимеразную цепную реакцию и стандартную полимеразную реакцию для определения сразу 2-х полиморфизмов одного гена, причем модифицированную таким образом, что появляется возможность проводить анализ гаплотипов по данному гену (ген р53).
Варианты генов и последовательности олигопраймеров приведены в таблице 1.
Способ состоит из 8 этапов и осуществляется следующим образом.
Этап I. Выделение ДНК по стандартному протоколу.
Этап II. Проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием 3 пар праймеров с помощью диагностического набора. При этом начальное плавление проводят в течение 4-7 минут при температуре 95°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий плавление при 94-96°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, отжиг при температуре от 60 до 62°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, синтез при температуре 72°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, финальный синтез в течение 3-5 минут при температуре 72°С (Таблица 2). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Perkin Elmer» (USA).
Этап III. Проведение стандартной полимеразной цепной реакции с помощью диагностического набора. При этом начальное плавление проводят в течение 4-7 минут при температуре 94°С, далее проводят цикл от 30 до 35 раз, включающий плавление при 94-96°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, отжиг при температуре от 53 до 56°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, синтез при температуре 72°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, финальный синтез в течение 5-7 минут при температуре 72°С (Таблица 2). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Perkin Elmer» (USA).
Этап IV. Проверка специфичности амплификации и количества амплификата (после окончания ПЦР) методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартному протоколу.
Этап V. Гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции Hindll (для мультиплексной ПЦР) и BstFNI (для стандартной ПЦР) по стандартному протоколу.
Таблица 2. | ||||
Условия проведения ПЦР. | ||||
Начальное плавление | Плавление | Отжиг | Синтез | Финальный синтез |
Стандартная ПЦР | ||||
30-35 циклов | ||||
94°С 4-7 мин | 94-96°С 40 с - 1 мин | 53-56°С 40 с - 1 мин | 72°С 40 с - 1 мин | 72°С 5-7 мин |
Мультиплексная ПЦР | ||||
28-32 цикла | ||||
95°С 4-7 мин | 94-96°С 40 с - 1 мин | 60-62°С 40 с - 1 мин | 72°С 40 с - 1 мин | 72°С 3-5 мин |
Этап VI. Разделение продуктов гидролиза в 7,5% полиакриламидном геле, приготовленном на трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 20 см. Для получения 30% раствора акриламида смешивали 29 г акриламида с 1 г N,N-метилен-бис-акриламида и растворяли смесь в 100 мл дистиллированной воды, 10-кратный раствор ТБЕ готовили, растворяя 54 г триса, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) в 0,5 л дистиллированной воды. Для приготовления 40 мл 7,5% полиакриламидного геля смешивали 10 мл 30% акриламида, 4 мл 10-кратного ТБЕ, 26 мл дистиллированной воды, 400 мкл 10% раствора персульфата аммония и 50 мкл тетраметилэтилендиамина. Перед заливкой раствор тщательно перемешивали. Пробы (образцы) наносили в гель в полном полученном после рестрикции объеме для каждого продукта гидролиза в отдельную лунку. Электрофорез проводили в 1-кратном ТБЕ при напряжении электрического поля 100 В, пока образцы не входили в гель и не проходили около 1 см от лунок. После этого напряжение увеличивали до 180-200 В. Останавливали электрофоретическое разделение после выхода бромфенола из геля.
Этап VII. Окрашивание геля водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просмотр в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе и фотографирование на системе видео-гель-документации.
Этап VIII. Анализ полученных результатов по заданному протоколу.
Использование данного подхода и диагностического набора начато в НИИ Цитологии РАН. Данный способ позволил существенно ускорить и удешевить тестирование заявленных генов более чем в 3 раза.
Предлагаемое изобретение может найти применение в диагностике различных онкологических заболеваний, таких как рак легких, рак груди, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, рак желудка и некоторых других, связанных с исследованием ДНК.
Claims (2)
1. Способ определения наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, включающий выделение ДНК; проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из начального плавления, ряда циклов из плавления, отжига и синтеза и финального синтеза; проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindi I и BstFNI, а также электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием 3 пар праймеров при следующих условиях:
начальное плавление проводят в течение 4-7 мин при температуре 95°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий плавление при 94-96°С в течение от 40 с до 1 мин, отжиг при температуре от 60 до 62°С в течение от 40 с до 1 мин, синтез при температуре 72°С в течение от 40 с до 1 мин, финальный синтез в течение 3-5 мин при температуре 72°С;
затем проводят модифицированную полимеразную цепную реакцию при следующих условиях:
начальное плавление проводят в течение 4-7 мин при температуре 94°С, далее проводят цикл от 30 до 35 раз, включающий плавление при 94-96°C в течение от 40 с до 1 мин, отжиг при температуре от 53 до 56°С в течение от 40 с до 1 мин, синтез при температуре 72°С в течение от 40 с до 1 мин, финальный синтез в течение 5-7 мин при температуре 72°С, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5%-ном полиакриламидном геле до выхода маркера из геля.
2. Диагностический набор для определения наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, включающий компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1,0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 0,2 ед./мкл, отличающийся тем, что все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) смешаны в одном объеме, все компоненты для проведения модифицированной полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) и энзиматической рестрикции смешаны в других объемах, а в набор дополнительно включены ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и следующие олигопраймеры:
F:5'-CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTTGG-3'
R:5'-CGTAGCTGCCCTGGTAGGTTT-3'
F:5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3'
R:5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3'
F:5'-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3'
R:5'-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3'
F:5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTCT-3'
R:5'-GAAAGACCTCCCAGCGGTCA-3'
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2005130476/15A RU2296328C1 (ru) | 2005-09-21 | 2005-09-21 | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2005130476/15A RU2296328C1 (ru) | 2005-09-21 | 2005-09-21 | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2296328C1 true RU2296328C1 (ru) | 2007-03-27 |
Family
ID=37999250
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2005130476/15A RU2296328C1 (ru) | 2005-09-21 | 2005-09-21 | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2296328C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2475184C2 (ru) * | 2010-06-25 | 2013-02-20 | Марина Юрьевна Якушева | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям |
RU2529797C2 (ru) * | 2007-09-18 | 2014-09-27 | Кэнсер Рисёч Текнолоджи Лтд | Раковый маркер и терапевтическая мишень |
RU2576780C2 (ru) * | 2014-04-25 | 2016-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Ген-технология" | Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины |
-
2005
- 2005-09-21 RU RU2005130476/15A patent/RU2296328C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Sambrook J et al. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, p.5.3-5.31, 6.36-6.45, 9.14-9.23, 14.14-14.19. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2529797C2 (ru) * | 2007-09-18 | 2014-09-27 | Кэнсер Рисёч Текнолоджи Лтд | Раковый маркер и терапевтическая мишень |
RU2475184C2 (ru) * | 2010-06-25 | 2013-02-20 | Марина Юрьевна Якушева | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям |
RU2576780C2 (ru) * | 2014-04-25 | 2016-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Ген-технология" | Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2850073T3 (es) | Cebadores universales de ARN ribosómico 16S y su uso en análisis y diagnóstico microbiológico | |
CN104975081B (zh) | 检测pkd1基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 | |
JP2802125B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
RU2003126575A (ru) | Высокочувствительный метод обнаружения структур метилирования цитозина | |
EP1192007A1 (de) | Microchip-matrix-vorrichtung zur vervielfaltigung und characterisierung von nukleinsauren | |
US20140248622A1 (en) | Telomere Length Measurement in Formalin-Fixed, Paraffin Embedded (FFPE) Samples by Quantitative PCR | |
RU2296328C1 (ru) | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления | |
CN108642208A (zh) | 一种樟属及其近缘属植物通用ssr分子标记及其开发方法和应用 | |
RU2304775C2 (ru) | Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и диагностический набор для его осуществления | |
RU2332464C1 (ru) | Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба | |
KR20070100531A (ko) | 쌍이온 화합물을 이용한 핵산 혼성화 특이성을 증가시키는방법 | |
KR102219895B1 (ko) | 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
KR101595016B1 (ko) | 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법 | |
RU2413774C1 (ru) | Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля | |
CN107630095B (zh) | 与绵羊羊毛弯曲数性状相关的分子标记及其特异性引物对和应用 | |
RU2528742C2 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы | |
RU2490642C1 (ru) | Способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза | |
RU2800084C2 (ru) | Способ получения молекулярных STR-маркеров Х-хромосомы для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства для работы с образцами малых количеств ДНК и набор олигонуклеотидов для его осуществления | |
Jakipov et al. | Genetic identification of the causative agent of brucellosis. | |
Kaoud Hussein | Advanced technology for the diagnosis of fish diseases | |
US20050048524A1 (en) | Molecular biological identification techniques for microorganisms | |
RU2490641C1 (ru) | Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом | |
RU2282852C1 (ru) | Способ прогнозирования течения множественной миеломы | |
KR101997134B1 (ko) | Str 마커를 포함하는 pcr용 프리믹스 조성물 및 이를 이용한 과학수사 교육용 유전자 분석 키트 | |
CN109457019A (zh) | Kcnh2基因scd相关snp检测试剂盒及检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090922 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20110520 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120922 |