RU2490641C1 - Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом - Google Patents
Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2490641C1 RU2490641C1 RU2012133014/15A RU2012133014A RU2490641C1 RU 2490641 C1 RU2490641 C1 RU 2490641C1 RU 2012133014/15 A RU2012133014/15 A RU 2012133014/15A RU 2012133014 A RU2012133014 A RU 2012133014A RU 2490641 C1 RU2490641 C1 RU 2490641C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genotype
- hodgkin lymphomas
- lymphomas
- prediction
- hodgkin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации. Проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2. При выявлении у больного генотипа ТТ прогнозируют индолентную форму неходжкинских лимфом, генотипа TG прогнозируют агрессивную форму неходжкинских лимфом, генотипа GG прогнозируют высокоагрессивную форму неходжкинских лимфом. Изобретение обеспечивает получение дополнительного критерия при оценке и прогнозе течения неходжкинских лимфом. 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно, к гематологии, может быть использовано для прогнозирования индолентной, агрессивной и высокоагрессивной формы неходжкинских лимфом.
Неходжкинские лимфомы - это злокачественные опухоли с быстрым ростом заболеваемости во всем мире. За последние 20 лет заболеваемость увеличилась более чем на 50% в развитых странах, то есть темп прироста заболеваемости НХЛ превышает таковой при лимфоме Ходжкина. В России НХЛ составляют 2,55% от всех злокачественных опухолей; в 2002 г. выявлено 5532 новых случая. Стандартизованный показатель заболеваемости среди мужчин составил 8,2, а среди женщин - 7,2 на 100000.
Основными моментами, определяющими клинические черты заболевания и прогноз, являются стадия дифференцировки клеток, из которых состоит опухоль, и характер роста внутри вовлеченного лимфоузла (фолликулярный или диффузный). Достижения иммунологии, цитогенетики и молекулярной биологии позволяют выделять специфические субтипы лимфом, различающиеся клиническим течением, ответом на терапию и прогнозом.
К индолентной форме НХЛ относят лимфомы: мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфомы селезенки, нодальные и экстранодальные лимфомы, фолликулярные лимфомы 1-2 тип, грибовидный микоз, ангиоиммунобластную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому (ALK+). К агрессивным относят: фолликулярную лимфому 3 типа, диффузную В-крупноклеточную лимфому, первичную медиастинальную В-крупноклеточную лимфому, плазмоцитомы, анапластическую крупноклеточную лимфому (ALK-). К высокоагрессивным форме относят:
В-лимфобластную лимфому, лимфому зоны мантии, лимфому Беркита, переферические Т-клеточные лимфомы, тонкокишечную Т-клеточную лимфому. Ценность прогнозирования форм НХЛ заключается в раннем прогнозировании течения заболевания, раннем прогнозировании исхода и правильном выборе адекватной химиотерапии.
Известен способ ультразвукового прогнозирования лечения неходжкинских лимфом (Сидоренко Ю.С., Максимова Н.А., Айрапетов К.Г., Верховцева А.И.), основанный на ультразвуковом исследовании лимфоузлов [патент RU 2211665,
2003 г.]. Недостатком данного способа является: поздняя диагностика, которая проходит уже в разгар заболевания и невозможность оценить клетки происхождения опухоли.
Также известен способ прогнозирования варианта течения неходжкинских лимфом (Левитан Н.В., Лосева М.И.), заключающийся в определении в периферической крови больного процентного содержания лимфоидных клеток с повышенным уровнем активности нуклеолярного аппарата и находящихся в стадии S/G2 клеточного цикла [патент RU 2082976, 1997 г.]. Недостатками данного способа является то, что данный способ достаточно трудоемок, занимает долгое время, и для проведения данного исследования необходимы высокоподготовленные кадры. Также с помощью этого метода невозможна ранняя и превинтивная диагностика.
Прототипом данного изобретения является способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом (Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Ковынев И.Б., Воевода М.И., Скворцова Н.В., Лямкина А.С.), основанный на определении генотипа 399-го кодона гена XRCC1 [патент RU 2373862, 2009 г.]. Недостатками данного метода является определение только агрессивной формы заболевания, не определяют индолентную и высокоагрессивную форму.
Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования формы НХЛ, получение дополнительного критерия при оценке и прогнозе НХЛ.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования течения неходжкинских лимфом, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 и при выявлении у больного генотипа ТТ прогнозируют индолентную форму неходжкинских лимфом, генотипа TG прогнозируют агрессивную форму неходжкинских лимфом, генотипа GG прогнозируют высокоагрессивную форму неходжкинских лимфом.
Предлагаемый способ прогнозирования течения НХЛ осуществляется следующим образом.
ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.
Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).
1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисHCl (pH 7,6).
2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.
3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.
4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.
Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.
1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до pH 7.8.
2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.
3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.
4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.
5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.
6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H2O; раствор хранят при -20°C.
В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 F: 5'-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3', 5'-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl2, 16,6 тМ (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 940C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 940C - 45 секунд, 550C - 45 секунд, 720C - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 720C в течение 7 минут.
Нуклеотидную замену T→G в положении 309 гена MDM2 выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Msp А II, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).
Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят в при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 157 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель Т и гомозиготный генотип ТТ, при наличии двух фрагментов размером 157 и 109 пн идентифицируется гетерозиготный генотип TG, при наличии фрагмента размером 109 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип GG. При генотипировании полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 генетическим маркерами индолентной формы НХЛ были генотип ТТ, агрессивной формы генотип TG, высокоагрессивной формы генотип GG.
Нами проанализированно течение и исходы заболевания у 115 больных НХЛ в возрасте от 17 до 88 лет (средний возраст 52,5±3,1 лет), которым проводилось лечение в гематологическом отделении РКБ им. Г.Г. Куватова г.Уфа в 2005-2011 годах. Клиническое и гистологическое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.
Проведен анализ ассоциаций между индолентной, агрессивной и всокоагрессивной формами НХЛ и генотипами полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 (таблица).
При проведении статистического анализа ассоциаций между исследованным полиморфным локусом и формой НХЛ была обнаружена ассоциация между полиморфным локусом 309T>G гена MDM2 и различными формами НХЛ. Так в группе больных с индолентной формой НХЛ чаще встречался генотип ТТ (χ2=11,26; p=0,01). В группе больных агрессивной формой заболевания статистически значимо чаще встречался гетерозиготный генотип TG (χ2=3,92; p=0,05), а в группе с высокоагрессивной формой НХЛ чаще встречался генотип GG (χ2=25,50; p=0,01). Таким образом маркером индолентной формы НХЛ являлся генотип ТТ (OR=4,65), агрессивной формы генотип TG (OR=2,43), высокоагрессивной формы генотип GG (OR=13,67).
Для иллюстрации приведем клинические примеры:
Пример 1. Пациентка Б-ва 1974 года рождения, г.Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в июне 2010 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Msp А II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип ТТ, что позволило прогнозировать индолентную форму. Что подтвердилось при наблюдении за пациентом: пациент ответил на монотерапию алкилирующими препаратами, ухудшения не наблюдалось.
Пример 2. Пациентка Р-ва 1978 года рождения, г.Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в августе 2007 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больной было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Msp А II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип TG, что позволило прогнозировать агрессивную форму. Что подтвердилось при наблюдении за пациентом: пациент не отвечал на монотерапию, ответ наблюдался при проведении полихимиотерапии.
Пример 3. Пациент П-в 1981 года рождения, г.Стерлитамак, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в сентябре 2009 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Msp AII провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GG, что позволило нам прогнозировать высокоагрессивную форму. Что подтвердилось при наблюдении за пациентом: пациент не отвечал на все виды лечения. Выживаемость 3 месяца.
Таблица | |||||||||
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 в зависимости от формы НХЛ | |||||||||
Геноти пы |
Индолентная форма (N=58) | Агрессивная форма (N=36) | Высокоагрессивная форма (N=21) | ||||||
Абс. (%) | χ2 (Р) | OR | Абс. (%) | χ2 (p) | OR | Абс. (%) | χ2 (Р) | OR | |
TT | 27 (46,55%) | 11,26 (0,01) | 4,65 | 7 (19,44%) | 2,67 (0,10) | 0,42 | 2 (9,52%) | 4,50 (0,03) | 0,19 |
TG | 26 (44,83%) | 0,01 (0,93) | 0,90 | 22 (61,11%) | 3,92 (0,05) | 2,43 | 5 (23,81%) | 4,09 (0,04) | 0,30 |
GG | 5 (8,62%) | 11,52 (0,01) | 0,16 | 7 (19,44%) | 0,09 (0,76) | 0,76 | 14 (66,67%) | 25,50 (0,01) | 13,67 |
T | 80 (68,97%) | 18,98 (0,01) | 3,41 | 36 (50,00%) | 0,56 (0,45) | 0,78 | 9 (21,43%) | 20,85 (0,01) | 0,17 |
G | 36 (31,03%) | 18,98 (0,01) | 0,29 | 36 (50,00%) | 0,56 (0,45) | 1,29 | 33 (78,57%) | 20,85 (0,01) | 5,91 |
Claims (1)
- Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса 309T>G гена MDM2 и при выявлении у больного генотипа ТТ прогнозируют индолентную форму неходжкинских лимфом, генотипа TG - агрессивную форму неходжкинских лимфом, генотипа GG - высокоагрессивную форму неходжкинских лимфом.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012133014/15A RU2490641C1 (ru) | 2012-08-01 | 2012-08-01 | Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012133014/15A RU2490641C1 (ru) | 2012-08-01 | 2012-08-01 | Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2490641C1 true RU2490641C1 (ru) | 2013-08-20 |
Family
ID=49162949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012133014/15A RU2490641C1 (ru) | 2012-08-01 | 2012-08-01 | Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2490641C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MD1009Z (ru) * | 2015-03-02 | 2016-09-30 | Алёна НИКОРИЧ | Метод определения предрасположенности человека к развитию лимфомы нон-Ходжкин |
RU2772187C1 (ru) * | 2021-09-17 | 2022-05-18 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования течения первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2373862C1 (ru) * | 2008-04-07 | 2009-11-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) | Способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом |
-
2012
- 2012-08-01 RU RU2012133014/15A patent/RU2490641C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2373862C1 (ru) * | 2008-04-07 | 2009-11-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) | Способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BITTENBRING J. et al. MDM2 gene SNP309 T/G and p53 gene SNP72 G/C do not influence diffuse large B-cell non-Hodgkin lymphoma onset or survival in central European Caucasians. BMC Cancer. 2008 Apr. 23; 8: 116 [Найдено 27.02.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: <URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2375899/pdf/1471-2407-8-116.pdf>. * |
ГЕРШАНОВИЧ М.Л. Основные принципы лечения неходжкинских лимфом. Практическая Онкология. 2004; 5(3): 185-193 [Найдено 27.02.2013] [он-лайн]. Найдено из Интернет: <URL: http://www.rosoncoweb.ru/library/journals/practical_oncology/arh019/04.pdf>. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MD1009Z (ru) * | 2015-03-02 | 2016-09-30 | Алёна НИКОРИЧ | Метод определения предрасположенности человека к развитию лимфомы нон-Ходжкин |
RU2772187C1 (ru) * | 2021-09-17 | 2022-05-18 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования течения первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108138209B (zh) | 通过原位扩增制备细胞游离核酸分子的方法 | |
CN101679971A (zh) | 青光眼恶化风险的判定方法 | |
WO2018170659A1 (en) | Methods and compositions for preparing sequencing libraries | |
WO2017112738A1 (en) | Methods for measuring microsatellite instability | |
Modarres et al. | Assessment of DPY19L2 deletion in familial and non-familial individuals with globozoospermia and DPY19L2 genotyping | |
CN108715893B (zh) | 一组与放疗引起的放射性脑损伤相关的snp标志物及其应用 | |
Sridhar et al. | Molecular genetic testing methodologies in hematopoietic diseases: current and future methods | |
RU2490641C1 (ru) | Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом | |
RU2490638C1 (ru) | Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом | |
RU2495427C1 (ru) | Способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе | |
CN104774841B (zh) | 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症scn1a基因新突变 | |
RU2490642C1 (ru) | Способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза | |
JP2019515035A (ja) | Krasバリアントがん患者の免疫ベースの処置 | |
RU2282852C1 (ru) | Способ прогнозирования течения множественной миеломы | |
WO2016106701A1 (zh) | 检测非小细胞肺癌的qRT-PCR引物、探针、芯片、试剂盒、应用和方法 | |
US7763422B2 (en) | Method for assessing cancerous state | |
CN105886497A (zh) | 多态性短串联重复基因座等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用 | |
RU2225612C2 (ru) | Способ прогнозирования течения множественной миеломы | |
RU2394242C1 (ru) | Способ прогнозирования первичной адентии | |
JP2019024455A (ja) | 結核菌遺伝系統特異的に結核症発症のリスクを判定する方法 | |
JP6516128B2 (ja) | 抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法及び判定用キット | |
CN109609616B (zh) | Hla-a*02:01和hla-c*01:02在丹参酮所致药疹中的用途 | |
RU2496110C1 (ru) | Способ прогнозирования "тлеющей" формы хронического лимфолейкоза | |
KR20120031734A (ko) | 급성 골수성 백혈병 환자의 시타라빈 민감성을 예측하기 위한 키트 및 방법 | |
Pepek et al. | Results of Polish Adult Leukemia Study Group (PALG) project assessing TP53 mutations with next-generation sequencing technology in relapsed and refractory chronic lymphocytic leukemia patients—an 18-month update |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140802 |