RU2490638C1 - Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом - Google Patents
Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2490638C1 RU2490638C1 RU2012133016/15A RU2012133016A RU2490638C1 RU 2490638 C1 RU2490638 C1 RU 2490638C1 RU 2012133016/15 A RU2012133016/15 A RU 2012133016/15A RU 2012133016 A RU2012133016 A RU 2012133016A RU 2490638 C1 RU2490638 C1 RU 2490638C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- genotype
- hodgkin lymphomas
- lymphomas
- hodgkin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования формы неходжкинских лимфом, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации. Проводят генотипирование полиморфного локуса -248G>A гена Bcl-2 ассоциированного Х белка (BAX -248G>A). При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития В-клеточной формы неходжкинских лимфом, генотипа GA или аллеля A - высокую вероятность развития T-клеточной формы неходжкинских лимфом. Изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования формы неходжкинских лимфом при неопределенной гистологической картине заболевания. 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития В-клеточных и T-клеточных неходжкинских лимфом, ответа на проводимую химиотерапию при хроническом лимфолейкозе.
Неходжкинские лимфомы (НХЛ) - это группа злокачественных опухолей, развивающихся из лимфоидной ткани и различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и прогнозу. В России на долю НХЛ приходится 2,6% всех злокачественных новообразований. В последние годы заболеваемость НХЛ имеет неизменную тенденцию к росту. Несмотря на улучшение результатов терапии, связанное с применением высокодозной программной химиотерапии, смертность от НХЛ увеличивается приблизительно на 2% в год. Это определяет необходимость дальнейшего изучения механизмов злокачественной трансформации лимфоидных клеток и поиска новых диагностических показателей развития НХЛ.
Различают НХЛ про происхождению из B-клеточного звена и T-клеточного звена. К B-клеточным лимфомам относят: мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, фолликулярную лимфому 3 типа, диффузную B-крупноклеточную лимфому, первичную медиастинальную В-крупноклеточную лимфому, плазмоцитомы, B-лимфобластную лимфому, лимфому зоны мантии, лимфому Беркита. К T-клеточным лимфомам относят: грибовидный микоз, ангиоиммунобластную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому, переферические T-клеточные лимфомы, тонкокишечную T-клеточную лимфому. Ценность прогнозирования развития B-клеточных и T-клеточных лимфом заключается в раннем прогнозировании течения заболевания, раннем прогнозировании исхода и правильном выборе адекватной химиотерапии.
Известен способ ультразвукового прогнозирования лечения неходжкинских лимфом (Сидоренко Ю.С., Максимова Н.А., Айрапетов К.Г., Верховцева А.И.), основанный на ультразвуковом исследовании лимфоузлов [патент RU 2211665, 2003 г.] Недостатком данного способа является: поздняя диагностика, которая проходит уже в разгар заболевания и невозможность оценить клетки происхождения опухоли.
Также известен способ прогнозирования варианта течения неходжкинских лимфом (Левитан Н.В., Лосева М.И.), заключающийся в определении в периферической крови больного процентного содержания лимфоидных клеток с повышенным уровнем активности нуклеолярного аппарата и находящихся в стадии S/G2 клеточного цикла [патент RU 2082976, 1997 г.]. Недостатками данного способа является то, что данный способ достаточно трудоемок, занимает долгое время и для проведения данного исследования необходимы высокоподготовленные кадры. Также с помощью этого метода невозможны ранняя и превентивная диагностика и определение клеточного происхождения.
Прототипом изобретения является способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом (Воропаева Е.Н., Поспелова Т.Н., Ковынев И.Б., Воевода М.И., Скворцова Н.В., Лямкина А.С.), включающий определение генотипа 399-го кодона гена XRCC1 [патент RU 2373862, 2009 г.]. Недостатком данного метода является определение только агрессивной В-клеточной формы заболевания.
Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования формы НХЛ, получение дополнительного критерия при непонятной гистологической картине заболевания.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования формы неходжкинских лимфом, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации, согласно изобретению проводят генотипированием полиморфного локуса -248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (BAX -248G>A), и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития В-клеточной формы неходжскинских лимфом, генотипа GA или аллела A прогнозируют высокую вероятность развития T-клеточной формы неходжкинских лимфом..
Предлагаемый способ прогнозирования развития B-клеточных и T-клеточных НХЛ осуществляется следующим образом.
ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.
Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press; - 1984. - V.2. - P.31-34).
1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).
2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.
3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8,0, суспендируют.
4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.
Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.
1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7,8.
2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.
3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.
4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.
5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.
6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H2O, раствор хранят при - 20°C.
В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса -248G>A гена BAX F: 5'-5'-CATTAGAGCTGCGATTGGACCG-3', R: 5'-GCTCCCTCGGGAGGTTTGGT-3'. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0,1-1 мкг геномной ДНК, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8,8, 6,7 mM MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°C в течение 7 минут.
Нуклеотидную замену G→A в положении - 248 гена BAX выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Msp I, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).
Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса - 248 гена BAX типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 96 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель G и гомозиготный генотип GG, при наличии двух фрагментов размером 96 и 76 пн идентифицируется гетерозиготный генотип GA, при наличии фрагмента размером 76 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип АА. При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития B-клеточной формы неходжкинских лимфом, генотипа GA или аллели A - высокую вероятность развития T-клеточной формы неходжкинских лимфом.
Нами оценена эффективность терапии 120 больных НХЛ в возрасте от 17 до 88 лет (средний возраст 52,8±3,4 лет), которым проводилось лечение в гематологическом отделении РКБ им. Г.Г. Куватова, г.Уфа, в 2005-2011 годах. Клиническое и гистологическое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.
Проведен анализ ассоциаций между B-клеточной и T-клеточной формами НХЛ и генотипами полиморфного локуса - 248 гена BAX (таблица).
При проведении статистического анализа ассоциаций между исследованным полиморфным локусом и формой НХЛ была обнаружена ассоциация между полиморфным локусом -248 гена BAX и B-клеточными НХЛ. Так у больных с генотипом GG чаще встречалась B-клеточная форма НХЛ (χ2=9,15; p=0,003). Риск при наличии данного генотипа повышен практически в 4 раза (OR=3,75; 95% CI 1,65-8,54). У пациентов с генотипом GA и аллелем А напротив чаще встречалась T-клеточная форма НХЛ (χ2=4,29; р=0,039; χ2=11,46; p=0,002, соответственно).
Для иллюстрации приводим следующие клинические примеры.
Пример 1. Пациентка А-ва 1972 года рождения, г.Стерлитамак, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в октябре 2008 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GG, что позволило нам прогнозировать B-клеточное происхождение лимфомы. Прогноз подтвердился при гистологическом исследовании тканей опухоли (диффузная B-крупноклеточная лимфома).
Пример 2. Пациент Д-в 1982 года рождения, г.Ишимбай, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в ноябре 2009 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлен генотип GA, что позволило нам прогнозировать T-клеточное происхождение лимфомы. Прогноз подтвердился при гистологическом исследовании тканей опухоли (анапластическая крупноклеточная лимфома (ALK-)).
Пример 3. Пациентка Х-ва 1956 года рождения, г.Салават, Республика Башкортостан. Диагноз НХЛ установлен в январе 2011 года. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена и в реакционной смеси, содержащей примерно 0,1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hin1II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлено наличие аллеля А, что позволило нам прогнозировать Т-клеточное происхождение лимфомы. Прогноз подтвердился при гистологическом исследовании тканей опухоли (периферическая Т-клеточная лимфома).
Таблица | ||||||||
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса - 248 гена ВАХ в зависимости от формы НХЛ | ||||||||
В-клеточная форма (N=84) | Т-клеточная форма (N=36) | |||||||
Генотипы | Абс. | % | Абс. | % | χ2 | Р | OR | CI-95% |
GG | 63 | 75,00% | 16 | 44,44% | 9,15 | 0,003 | 3,75 | 1,65-8,54 |
GA | 16 | 19,05% | 14 | 38,89% | 4,29 | 0,039 | 0,37 | 0,16-0,88 |
АА | 5 | 5,95% | 6 | 16,67% | 2,31 | 0,129 | 0,32 | 0,09-1,12 |
G | 142 | 84,52% | 46 | 63,89% | 11,46 | 0,002 | 3,09 | 1,63-5,84 |
А | 26 | 15,48% | 26 | 36,11% | 11,46 | 0,002 | 0,32 | 0,17-0,61 |
Claims (1)
- Способ прогнозирования формы неходжкинских лимфом, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови с последующими ПЦР и рестрикцией продуктов амплификации, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса -248G>A гена Bcl-2 ассоциированного Х белка (BAX -248G>A), и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития B-клеточной формы неходжскинских лимфом, генотипа GA или аллеля A - высокую вероятность развития T-клеточной формы неходжскинских лимфом.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012133016/15A RU2490638C1 (ru) | 2012-08-01 | 2012-08-01 | Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012133016/15A RU2490638C1 (ru) | 2012-08-01 | 2012-08-01 | Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2490638C1 true RU2490638C1 (ru) | 2013-08-20 |
Family
ID=49162946
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012133016/15A RU2490638C1 (ru) | 2012-08-01 | 2012-08-01 | Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2490638C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MD1009Z (ru) * | 2015-03-02 | 2016-09-30 | Алёна НИКОРИЧ | Метод определения предрасположенности человека к развитию лимфомы нон-Ходжкин |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2082976C1 (ru) * | 1993-05-24 | 1997-06-27 | Новосибирский медицинский институт | Способ прогнозирования варианта течения неходжкинских лимфом |
RU2373862C1 (ru) * | 2008-04-07 | 2009-11-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) | Способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом |
-
2012
- 2012-08-01 RU RU2012133016/15A patent/RU2490638C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2082976C1 (ru) * | 1993-05-24 | 1997-06-27 | Новосибирский медицинский институт | Способ прогнозирования варианта течения неходжкинских лимфом |
RU2373862C1 (ru) * | 2008-04-07 | 2009-11-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО НГМУ Росздрава) | Способ определения предрасположенности человека к развитию агрессивных неходжкинских лимфом |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
STARCZYNSKI J. et al. Common polymorphism G(-248)A in the promoter region of the bax gene results in significantly shorter survival in patients with chronic lymphocytic Leukemia once treatment is initiated. J. Clin. Oncol. 2005 Mar. 1; 23(7):1514-1521 [Найдено 25.02.2013] [он-лайн], Найдено из Интернет: <URL: http://jco.ascopubs.org/content/23/7/1514.full.pdf+html>. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MD1009Z (ru) * | 2015-03-02 | 2016-09-30 | Алёна НИКОРИЧ | Метод определения предрасположенности человека к развитию лимфомы нон-Ходжкин |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rose-Zerilli et al. | ATM mutation rather than BIRC3 deletion and/or mutation predicts reduced survival in 11q-deleted chronic lymphocytic leukemia: data from the UK LRF CLL4 trial | |
JP5797288B2 (ja) | Vegf多型および抗脈管形成治療 | |
CN101679971A (zh) | 青光眼恶化风险的判定方法 | |
Jovčevska | Sequencing the next generation of glioblastomas | |
JP2019528705A (ja) | エンザスタウリンの活性を予測するための方法および組成物 | |
CN108715893B (zh) | 一组与放疗引起的放射性脑损伤相关的snp标志物及其应用 | |
JP2005532780A (ja) | 発癌リスク層別化のための遺伝的解析 | |
WO2020092672A2 (en) | A quantitative algorithm for endometriosis | |
US20150159225A1 (en) | Uveal melanoma prognosis | |
RU2490638C1 (ru) | Способ прогнозирования развития в-клеточных и т-клеточных неходжкинских лимфом | |
US20200000808A1 (en) | Systems and methods for treating cancer | |
RU2490641C1 (ru) | Способ прогнозирования течения неходжкинских лимфом | |
RU2481583C1 (ru) | Способ прогнозирования эффективности лечения хронического миелолейкоза | |
RU2495427C1 (ru) | Способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе | |
RU2490642C1 (ru) | Способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза | |
EP3599288B1 (en) | Diagnosis and treatment of psoriatic arthritis | |
EP2840147B1 (en) | Method for assessing endometrial cancer susceptibility | |
RU2282852C1 (ru) | Способ прогнозирования течения множественной миеломы | |
EA024246B1 (ru) | Способ прогнозирования эффективности лечения пациентов с неходжкинской лимфомой высокой степени злокачественности | |
RU2394242C1 (ru) | Способ прогнозирования первичной адентии | |
RU2496110C1 (ru) | Способ прогнозирования "тлеющей" формы хронического лимфолейкоза | |
Pepek et al. | Results of Polish Adult Leukemia Study Group (PALG) project assessing TP53 mutations with next-generation sequencing technology in relapsed and refractory chronic lymphocytic leukemia patients—an 18-month update | |
RU2582956C2 (ru) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ p.Q368X В ГЕНЕ МИОЦИЛИНА (MYOC), ВЫЗЫВАЮЩЕЙ РАЗВИТИЕ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ | |
RU2225612C2 (ru) | Способ прогнозирования течения множественной миеломы | |
RU2599502C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития рака яичников |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140802 |