RU2599502C1 - Способ прогнозирования риска развития рака яичников - Google Patents

Способ прогнозирования риска развития рака яичников Download PDF

Info

Publication number
RU2599502C1
RU2599502C1 RU2015120884/15A RU2015120884A RU2599502C1 RU 2599502 C1 RU2599502 C1 RU 2599502C1 RU 2015120884/15 A RU2015120884/15 A RU 2015120884/15A RU 2015120884 A RU2015120884 A RU 2015120884A RU 2599502 C1 RU2599502 C1 RU 2599502C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chek2
brca1
ovarian cancer
mutation
mutations
Prior art date
Application number
RU2015120884/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Дарья Симоновна Прокофьева
Марина Алексеевна Бермишева
Альфия Хаматьяновна Нургалиева
Эльза Камилевна Хуснутдинова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет" filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет"
Priority to RU2015120884/15A priority Critical patent/RU2599502C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2599502C1 publication Critical patent/RU2599502C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/125—Electrophoretic separation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и онкогинекологии, и предназначено для прогнозирования риска развития рака яичников. Осуществляют выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и комплексную детекцию мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2) у одного пациента. Обнаружение одной из указанных мутаций свидетельствует о повышенном риске развития рака яичников. Изобретение обеспечивает упрощение способа определения мутаций c.5266dupC, c.181T>G (BRCA1), del5395 и p.R145W (CHEK2) и сокращение времени исследования до 1 дня. 4 ил., 5 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинской генетике и онкогинекологии, может быть использовано для прогнозирования риска развития рака яичников.
Рак яичников (РЯ) - злокачественное новообразование яичников. РЯ является ведущей причиной смертности от гинекологических раков у женщин, поскольку часто заболевание диагностируется на поздних стадиях развития (III или IV). Сложность диагностирования связана с бессимптомным течением болезни на ранних стадиях, а также тем, что РЯ является сложным гетерогенным заболеванием с несколькими гистологическими формами. В России ежегодно регистрируют более 12000 случаев патологии около половины, из которых заканчиваются смертельным исходом. В последнее десятилетие отмечается тенденция роста заболеваемости женщин в возрасте до 30 лет.
Известен способ прогнозирования риска возникновения РЯ, заключающийся в том, что пациенту проводят анализ экспрессии гена TUSC3 в биологическом образце (предпочтительно образец ткани) с последующим сравнением экспрессии данного маркера в образцах от здоровых доноров. При низком уровне экспрессии гена TUSC3 у обследуемого индивида прогнозируют риск развития заболевания по определенной формуле (Patent Application Publication №US 2009/0298068 A1, 2009). Недостатками этого метода являются его трудоемкость и необходимость дорогостоящих реактивов. Кроме того в данном способе не учитываются популяционные особенности регионов.
Известен способ прогнозирования риска развития РЯ, заключающийся в выявлении генетических вариантов в гене BRCA2 для определения предрасположенности к BRCA2-ассоциированным злокачественным новообразованиям, в частности к РМЖ и РЯ. Кроме того, описываемый способ позволяет прогнозировать течение заболеваний и определять ответ и эффективность лечения у пациентов (United States Patent №US 8,476,020 B1, 2013). Однако, данный способ не учитывает молекулярно-генетические особенности популяций. Так, например, для населения Волго-Уральского региона не характерно носительство мутаций в данном гене.
В целом, главным недостатком известных способов прогнозирования риска развития РЯ является то, что они не учитывают существенные различия в спектре и частоте мутаций между разными популяциями и регионами.
Наиболее близким аналогом является диссертационное исследование Прокофьевой Д.С.(Прокофьева Д.С.Изучение генетических факторов риска развития рака яичников. 2013, с. 190). В данной работе выявлены информативные маркеры риска развития РЯ (мутации c.5266dupC, c.181T>G в гене BRCA1 и del5395, p.R145W в гене CHEK2). Основными недостатками аналога являются трудоемкость и длительность анализа вследствие применения метода фенольно-хлороформной экстракции ДНК (занимающего 2 дня), а также детекции мутации c.5266dupC в гене BRCA1 с использованием метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (занимающего также 2 дня).
Техническая задача - разработка способа прогнозирования риска развития рака яичников с помощью комплексной детекции мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2) в течение 1 дня, что позволит достигнуть высокой точности прогноза риска развития РЯ и проводить у носителей мутаций профилактику онкологических заболеваний.
Технический результат изобретения - упрощение способа определения мутаций c.5266dupC, c.181T>G (BRCA1), del5395 и p.R145W (CHEK2).
Указанный технический результат достигается тем, что способ прогнозирования риска развития рака яичников включает в себя выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови наборами реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови, такими как GeneJET™ Mini, и комплексную детекцию мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2) у одного пациента. При этом скрининг мутаций c.5266dupC в гене BRCA1 и p.R145W в гене CHEK2 проводят с помощью анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM), поиск мутации c.181T>G в гене BRCA1 выполняют с помощью аллель-специфичной ПЦР с последующим разделением в 2% агарозном геле и анализом при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Выявление мутации del5395 осуществляют по средствам мультиплексной ПЦР, с последующим разделением ПЦР-продуктов в 2% агарозном геле и анализом при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Ранее мутацию p.R145W (CHEK2) выявляли только у больных раком молочной железы, нами впервые было идентифицировано данное изменение у пациентов с раком яичников, проживающих в Республике Башкортостан.
Способ осуществляется следующим образом.
ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. Непосредственный этап выделения ДНК проводят с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови, согласно протоколу производителя. Полученную ДНК используют в качестве матрицы при проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа.
Детекцию мутации c.5266dupC в гене BRCA1 проводят с помощью HRM анализа. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров представлены в работе Bogdanova N. (Bogdanova N. Genetic determinants of breast cancer susceptibility in the Byelorussian population. Dissertation dr. rer. nat. - 2008. - Vol. 193. - P. 1-193). Используются следующие последовательности олигонуклеотидов: (F) 5′-gggaatccaaattacacagc-3′, (R) 5′-ccaaagcgagcaagagaatctc-3′. Состав реакционной смеси для ПЦР общим объемом 17 µl включает в себя: 2 µl геномной ДНК (70 нг), 1.88 µl dNTPs, 4 µl MgCl2, 3,4 µl Q-solution, 1 µl смеси праймеров, 2.12 µl однократного буфера для Top-Tag полимеразы, 0.1 µl Top-Tag полимеразы, 0,8 µl EvaGreen и 1.7 µl воды высокой степени очистки. Режим амплификации: предварительная денатурация 7 минут при 95°С, затем 40 циклов со следующими параметрами - 95°С - 15 секунд, 60°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. Плавление ПЦР-продукта проводят в диапазоне температур 55-95°С. Используют канал SYBR Green I, данные о кривых плавления анализируют в температурных пределах от 65°С до 95°С со скоростью линейного изменения 0,5°С в секунду.
На рисунке 1 представлен анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью: а) нормированный график кривых HRM анализа образцов с мутацией c.5266dupC (1) и без мутации (2); б) кривые плавления образцов с мутацией c.5266dupC (3) и в норме (4).
Скрининг мутации c.181T>G в гене BRCA1 проводят с помощью аллель-специфичной ПЦР. Специфичные последовательности нуклеотидных праймеров представлены в работе Bogdanova N. (Bogdanova N. Genetic determinants of breast cancer susceptibility in the Byelorussian population. Dissertation dr. rer. nat. - 2008. - Vol. 193. - P. 1-193). Используются следующие последовательности олигонуклеотидов: (F) 5′-ccagaagaaagggccttcactgg-3′, (R) 5′-cctgtataaggcagatgtcc-3′ (аллель специфичные для мутации c.181T>G); (F) 5′-ctcttaagggcagttgtgag-3′ и (R) 5′-ttcctactgtggttgcttcc-3′ (для амплификации внутреннего контроля). Состав реакционной смеси для ПЦР объемом 20 µl включает в себя: 2 µl геномной ДНК (70 нг), 1.5 µl dNTPs, 1.5 µl MgCl2, 2 µl каждого праймера, 2 µl однократного буфера для полимеразы с горячим стартом, 0.08 µl HotStar полимеразы и 4.92 µl воды высокой степени очистки. Режим амплификации: предварительная денатурация 15 минуты при 95°С, затем 35 циклов со следующими параметрами - 94°С - 1 минута, 62°С - 1 минута, 72°С - 1 минута. После 35-го цикла проводят инкубацию при 72°С в течение 5 минут. Полученные ПЦР-продукты подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле. Перед нанесением на гель пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см2.
Детекцию результатов проводят путем визуализации в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. В результате ПЦР реакции амплифицируется продукт размером 221 п.н. В качестве внутреннего контроля синтезируют фрагмент гена MDC1 размером 353 п.н.
На рисунке 2 представлено электрофоретическое разделение продуктов амплификации: 1, 2 - образцы без мутации c.181T>G; 3, 4 - образцы с мутаций c.181T>G; М - маркер молекулярного веса 1 Kb.
Поиск мутации del5395 в гене CHEK2 проводится с помощью аллель-специфичной дуплексной ПЦР. Последовательности двух пар специфичных праймеров, фланкирующих протяженную делецию из 5395 нуклеотидов, охватывающую 9 и 10 экзоны гена, представлены в работе Cybulski С.с соавт. (Cybulski С.et al. A deletion in CHEK2 of 5,395 bp predisposes to breast cancer in Poland. Breast cancer research and treatment. - 2007. - T. 102. - №. 1. -С.119-122). Используются следующие последовательности праймеров: (F) 5′-tgtaatgagctgagattgtgc-3′ и (R) 5′-cagaaatgagacaggaagtt-3′, фланкирующие точку разрыва в интроне 8; (F) 5′ctctgttgtgtacaagtgac-3′ и (R) 5′gtctcaaacttggctgcg-3′, фланкирующие точку разрыва в интроне 10. Состав реакционной смеси для ПЦР объемом 20 µl включает в себя: 2 µl геномной ДНК (70 нг), 1.5 µl dNTPs, 1.5 µl MgCl2, 2 µl каждого праймера, 2 µl однократного буфера для полимеразы с горячим стартом, 0.08 µl HotStar полимеразы и 4.92 µl воды высокой степени очистки. Режим амплификации: предварительная денатурация 10 минуты при 95°С, затем 9 циклов со следующими параметрами - 94°С - 25 секунд, 68°С - 25 секунд (понижение температуры на 1,4°С в каждом цикле (68°С первый цикл 55°С - 9-й цикл)), 72°С - 35 секунд. Затем 31 цикл со следующими параметрами - 94°С - 25 секунд, 55°С - 30 секунд, 72°С - 35 секунд. Полученные ПЦР-продукты подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле. Перед нанесением на гель пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см2. Детекцию результатов проводят путем визуализации в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. В образцах, не содержащих мутации del5395, амплифицируются фрагменты размером 379 п.н. и 522 п.н. В случае наличия мутации амплифицируется дополнительный фрагмент размером 450 п.н.
На рисунке 3 представлено электрофоретическое разделение продуктов амплификации: 1 - образец с мутацией del5395; 2, 3 - образцы без мутации del5395.
Скрининг мутации p.R145W (с.433С>Т) в гене CHEK2 проводят с помощью анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих область с возможным содержанием мутации с. 433С>Т и их оптимальные концентрации в реакционной смеси подобраны с помощью пакета биологических программ DNASTAR (Primer select 5.05 1993-2002). Используются следующие последовательности олигонуклеотидов: (F) 5′-ttgctttgatgaaccactgc-3′, (R) 5′-tgtttcagactttgaatagcagaga-3′. Состав реакционной смеси для ПЦР общим объемом 17 µl включает в себя: 2 µl геномной ДНК (70 нг), 1.88 µl dNTPs, 4 µl MgCl2, 3.4 µl Q-solution, 1 µl смеси праймеров, 2.12 µl однократного буфера для Top-Tag полимеразы, 0.1 µl Top-Tag полимеразы, 0.8 µl EvaGreen и 1.7 µl воды высокой степени очистки. Режим амплификации: предварительная денатурация 7 минуты при 95°С, затем 40 циклов со следующими параметрами - 95°С - 15 секунд, 57°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. Плавление ПЦР-продукта проводят в диапазоне температур 55-95°С. Используют канал SYBR Green I, данные о кривых плавления анализируют в температурных пределах от 70°С до 85°С со скоростью линейного изменения 0,5°С в секунду.
На рисунке 4 представлен анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью: а) нормированный график кривых HRM образцов с мутацией с. 433С>Т (1) и без мутации (2); б) кривые плавления образцов с мутацией с. 433С>Т (3) в норме (4).
Проводили анализ данных клинико-генетических исследований 187 женщин с установленным диагнозом «рак яичников» в возрасте от 17 года до 76 лет из Республики Башкортостан. По этническому происхождению обследуемая группа была неоднородна: русские -108 (58%), татары - 53 (28%), украинцы - 13 (7%), башкиры - 7 (4%) и чуваши - 6 (3%). Этническая принадлежность обследуемых определялась до третьего поколения путем личного опроса каждого человека. Материал собран в отделении гинекологии Клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан, (г. Уфа) и онкологического отделения Городской клинической больницы №1 (n=85) (г. Стерлитамак). Забор крови осуществлялся на базе вышеуказанных лечебных учреждений после осмотра исследуемых групп.
Контрольную группу составили 339 женщина без онкологических заболеваний на момент забора крови из Республики Башкортостан. По этническому составу контрольная группа соответствовала группе больных РЯ: русские - 49%, татары - 35%, башкиры - 9%, чуваши - 6% и украинцы - 1%. Средний возраст женщин из контрольной группы составил 41 год (18-69 лет).
Проведенный поиск мутации c.5266dupC в гене BRCA1 среди больных раком яичников и здоровых доноров позволил выявить 6,4% (12/187) пациенток и 0,6% (2/339) здоровых женщин с данным нарушением. Подобное распределение свидетельствует о широком распространении дупликации c.5266dupC в Республики Башкортостан и высоком риске развития рака яичников у носительниц данного изменения (OR: 11.6; 95% CI 2.6-52.2; р=0.0003).
Все позитивные случаи были подтверждены с помощью прямого секвенирования. Наличие мутации del5395 в гене CHEK2 подтверждали с помощью long-rang ПЦР.
Мутация c.181T>G была обнаружена у 1,6% (3/187) больных раком яичников. Для носительниц мутации c.181T>G отмечается более ранний возраст начала заболевания. В контрольной группе данного нарушения не идентифицировано.
Мутации del5395 и p.R145W в гене CHEK2 выявлены с частотой 1% (2/187). Среди здоровых доноров носителей не обнаружено.
В целом, у больных раком яичников из Республики Башкортостан с высокой частотой встречается мутация в гене c.5266dupC BRCA1. Также для пациенток характерны мутации c.181T>G в гене BRCA1, del5395 и p.R145W гене CHEK2. Полученные высокие значения частот изученных мутаций среди больных раком яичников свидетельствуют о важности определения этих нарушений в результате ДНК-диагностики с целью прогнозирования риска развития рака яичников.
Примеры прогнозирования риска рака яичников.
Пример 1. Пациентка Е.А., 1951 г.р., русского этнического происхождения. Имела случаи заболевания раком яичников в семье. Клинический диагноз - рак яичников.
Для выявления предрасположенности к развитию РЯ у пациентки был произведен забор крови объемом 5 мл с последующим выделением ДНК из периферических лимфоцитов с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови. Комплексный скрининг мутаций проводили следующим образом: мутации c.5266dupC (BRCA1) и p.R145W (CHEK2) детектировали с помощью HRM анализа; мутацию c.181T>G (BRCA1) - аллель-специфичной ПЦР; мутацию del5395 (CHEK2) - аллель-специфичной дуплексной ПЦР. В результате у пациентки выявлена мутация c.5266dupC в гене BRCA1.
Пример 2. Пациентка М.Г., 1932 г.р., русского этнического происхождения. Клинический диагноз - рак яичников.
Для выявления предрасположенности к развитию РЯ у пациентки был произведен забор крови объемом 5 мл с последующим выделением ДНК из периферических лимфоцитов с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови. Комплексный скрининг мутаций проводили следующим образом: мутации c.5266dupC (BRCA1) и p.R145W (CHEK2) детектировали с помощью HRM анализа; мутацию c.181T>G (BRCA1) - аллель-специфичной ПЦР; мутацию del5395 (CHEK2) - аллель-специфичной дуплексной ПЦР. В результате у пациентки выявлена мутация del5395 в гене CHEK2.
Пример 3. Пациентка P.P., 1951 г. р., татарского этнического происхождения. Имела случай заболевания раком молочной железы в семье. Клинический диагноз - рак яичников.
Для выявления предрасположенности к развитию РЯ у пациентки был произведен забор крови объемом 5 мл с последующим выделением ДНК из периферических лимфоцитов с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови. Комплексный скрининг мутаций проводили следующим образом: мутации c.5266dupC (BRCA1) и p.R145W (CHEK2) детектировали с помощью HRM анализа; мутацию c.181T>G (BRCA1) - аллель-специфичной ПЦР; мутацию del5395 (CHEK2) - аллель-специфичной дуплексной ПЦР. В результате у пациентки выявлена мутация с.181Т>G в гене BRCA1.
Пример 4. Пациентка М.В., 1946 г. р., русского этнического происхождения. Клинический диагноз - рак яичников.
Для выявления предрасположенности к развитию РЯ у пациентки был произведен забор крови объемом 5 мл с последующим выделением ДНК из периферических лимфоцитов с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови. Комплексный скрининг мутаций проводили следующим образом: мутации c.5266dupC (BRCA1) и p.R145W (CHEK2) детектировали с помощью HRM анализа; мутацию c.181T>G (BRCA1) - аллель-специфичной ПЦР; мутацию del5395 (CHEK2) - аллель-специфичной дуплексной ПЦР. В результате у пациентки выявлена мутация p.R145W в гене CHEK2.
Пример 5. Женщина из контрольной группы Г.А., 1967 г. р. русского этнического происхождения.
С целью выявления предрасположенности к развитию РЯ у здорового донора был произведен забор крови объемом 5 мл с последующим выделением ДНК из периферических лимфоцитов с помощью наборов реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови. Комплексный скрининг мутаций проводили следующим образом: мутации c.5266dupC (BRCA1) и p.R145W (CHEK2) детектировали с помощью HRM анализа; мутацию c.181T>G (BRCA1) - аллель-специфичной ПЦР; мутацию del5395 (CHEK2) - аллель-специфичной дуплексной ПЦР. В результате у обследованной женщины не выявлены не одна из исследуемых мутаций.
Обследование женщин, больных РЯ, и женщин из контрольной группы подтвердило высокую точность прогноза РЯ с применением предложенного способа, включающего в себя совместную детекцию четырех мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2). Использование данного способа выявления мутаций в генах, ассоциированных с повышенным риском развития рака яичников, на доклинической стадии заболевания, позволило бы проводить у носителей мутаций профилактику онкологических заболеваний. Кроме того, предлагаемый способ предполагает сокращение времени исследования до 1 дня.

Claims (1)

  1. Способ прогнозирования риска развития рака яичников, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и комплексную детекцию мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2) у одного пациента, при этом выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят наборами реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови, а амплификацию участка ДНК, содержащего мутацию p.R145W (CHEK2), проводят с помощью последовательностей олигонуклеотидов: (F) 5′-ttgctttgatgaaccactgc-3′, (R) 5′-tgtttcagactttgaatagcagaga-3′ посредством анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью, и обнаружение хотя бы одной из мутаций c.5266dupC (BRCA1), c.181T>G (BRCA1), del5395 (CHEK2) и p.R145W (CHEK2) свидетельствует о повышенном риске развития рака яичников.
RU2015120884/15A 2015-06-01 2015-06-01 Способ прогнозирования риска развития рака яичников RU2599502C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015120884/15A RU2599502C1 (ru) 2015-06-01 2015-06-01 Способ прогнозирования риска развития рака яичников

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015120884/15A RU2599502C1 (ru) 2015-06-01 2015-06-01 Способ прогнозирования риска развития рака яичников

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2599502C1 true RU2599502C1 (ru) 2016-10-10

Family

ID=57127513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015120884/15A RU2599502C1 (ru) 2015-06-01 2015-06-01 Способ прогнозирования риска развития рака яичников

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2599502C1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756294A (en) * 1995-09-25 1998-05-26 Oncormed, Inc. Susceptibility mutation for breast and ovarian cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756294A (en) * 1995-09-25 1998-05-26 Oncormed, Inc. Susceptibility mutation for breast and ovarian cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEGEL V. et al. The occurrence of germline BRCA1 and BRCA2 sequence alterations in Slovenian population. BMC Med Genet. 2011 Jan 14; 12:9 [Найдено 29.03.2016] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21232165 MYSZKA A. et al. Irrelevance of CHEK2 variants to diagnosis of breast/ovarian cancer predisposition in Polish cohort. J Appl Genet. 2011 May; 52(2): 185-191. Epub 2010 Dec 1. *
ПРОКОФЬЕВА Д.С. Изучение генетических факторов риска развития рака яичников. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Уфа, 2013, 24 с. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jardin et al. Diffuse large B-cell lymphomas with CDKN2A deletion have a distinct gene expression signature and a poor prognosis under R-CHOP treatment: a GELA study
US11613786B2 (en) Clonal haematopoiesis
Magrangeas et al. Minor clone provides a reservoir for relapse in multiple myeloma
Le Guellec et al. CTNNB1 mutation analysis is a useful tool for the diagnosis of desmoid tumors: a study of 260 desmoid tumors and 191 potential morphologic mimics
Leroy et al. p53 gene mutations are associated with poor survival in low and low-intermediate risk diffuse large B-cell lymphomas
Chan et al. Genomic copy number analysis of a spectrum of blue nevi identifies recurrent aberrations of entire chromosomal arms in melanoma ex blue nevus
Zhang et al. Searching for large genomic rearrangements of the BRCA1 gene in a Nigerian population
Abdel-Rahman et al. Frequency, molecular pathology and potential clinical significance of partial chromosome 3 aberrations in uveal melanoma
Guo et al. Analysis of the mitochondrial 4977 bp deletion in patients with hepatocellular carcinoma
Negura et al. Complete BRCA mutation screening in breast and ovarian cancer predisposition families from a North-Eastern Romanian population
Kooshyar et al. Identification of germline BRCA1 mutations among breast cancer families in Northeastern Iran
Weischer et al. CHEK2* 1100delC and risk of malignant melanoma: Danish and German studies and meta-analysis
Li et al. Recurrently mutated genes differ between leptomeningeal and solid lung cancer brain metastases
El Khachibi et al. Screening of exon 11 of BRCA1 gene using the high resolution melting approach for diagnosis in Moroccan breast cancer patients
Li et al. Assessment of ctDNA in CSF may be a more rapid means of assessing surgical outcomes than plasma ctDNA in glioblastoma
Abramzon et al. Investigating RFC1 expansions in sporadic amyotrophic lateral sclerosis
Ahani et al. RB1 gene mutations in Iranian patients with retinoblastoma: report of four novel mutations
RU2599502C1 (ru) Способ прогнозирования риска развития рака яичников
Silva et al. Ewing's sarcoma: analysis of single nucleotide polymorphism in the EWS gene
Moschos et al. TCF4 and COL8A2 gene polymorphism screening in a Greek population of late-onset Fuchs endothelial corneal dystrophy
Shadrina et al. Expression analysis of suppression of tumorigenicity 13 gene in patients with Parkinson's disease
RU2440415C1 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для определения нуклеотидной последовательности кодирующей части гена brca1 и выявления мутаций, ассоциированных с наследственными формами рака молочной железы
Wang et al. Association between a p73 gene polymorphism and genetic susceptibility to non-small cell lung cancer in the South of China
RU2495427C1 (ru) Способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе
Jaure et al. BRCA1 polymorphism in breast cancer patients from Argentina

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20180907

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190602