RU2269360C2 - Способ получения бруцеллезного диагностикума - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к получению диагностических препаратов, и может быть использовано для получения диагностикума, предназначенного для выявления антител к бруцеллезному антигену в микрореакции агглютинации (МРА), в пробирочной реакции агглютинации (РА) и в пластинчатой реакции агглютинации на стекле. Способ включает смыв микробной массы Brucella abortus 19 ВА 0,9% раствором натрия хлорида, при этом концентрацию микробной массы доводят до 20-30 млрд. м.к./мл, инактивацию микробной взвеси 1% раствором формалина, которую осуществляют при температуре 22°С в течение 2-х часов, отмывку центрифугированием дважды при 7000 об/мин в течение 30 мин, окрашивание микробной взвеси 0,04% раствором гематоксилина Караци, который добавляют в равном объеме к полученному осадку после добавления 0,9% раствора натрия хлорида до первоначального объема, после чего смесь перемешивают, прогревают при температуре 56°С в течение 16-18 часов. После окрашивания взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 минут, затем супернатант центрифугируют при 7000 об/мин в течение 30 мин, затем осадок ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида и центрифугируют в тех же условиях 3-4 раза, после чего к осадку добавляют 0,1% раствор формалина до первоначального объема и стабилизатор в количестве 0,1 мл на 1 мл полученного диагностикума. Стабилизатор выбирают из группы 1,5% раствор поливинилпирролидона и 7% раствор сахарозы в соотношении 1:1 или 0,03% карбонатный буфер и 3% раствор сахарозы в соотношении 1:1. Далее диагностикум лиофильно высушивают. Способ позволяет получить диагностикум, имеющий более высокую специфичность, широкую область применения (микрореакция агглютинации, пробирочная реакция агглютинации и пластинчатая реакция агглютинации на стекле), длительный срок годности, удобный для транспортировки. При этом способ получения прост и доступен. 1 табл.

Description

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к получению диагностических препаратов, и может быть использовано для получения диагностикума, предназначенного для выявления антител к бруцеллезному антигену в микрореакции агглютинации (МРА), в пробирочной реакции агглютинации (РА) и в пластинчатой реакции агглютинации на стекле.

Разработка и внедрение в практику здравоохранения диагностических бруцеллезных тест-систем, обладающих высокой активностью, специфичностью, удобных в использовании, отвечающих современным требованиям безопасности производства и доступных для применения в практических лабораториях, остается актуальной задачей.

Известен способ получения диагностикума бруцеллезного, жидкого, для РА объемным (пробирочным) и пластинчатым методами для обнаружения антител в сыворотках крови людей и животных, включающий смыв микробной массы штамма Brucella abortus 19 ВА 12% раствором натрия хлорида, получение микробной взвеси с концентрацией 20 млрд. м.к./мл, инактивацию микробных клеток нагреванием, консервирование 0,5% раствором фенола, окрашивание смесью 0,004% раствора бриллиантового зеленого и 0,002% раствора генцианвиолета (Фармакопейная статья. Диагностикум бруцеллезный, жидкий, для реакции агглютинации. ФС 42-3555-98). Диагностикум, полученный этим способом, представляет собой жидкость, с концентрацией 20 млрд. м.к./мл, с рабочим разведением 1:10.

Однако данный способ имеет следующие недостатки: диагностикум, получаемый этим способом, имеет недостаточно высокую специфичность, стабильность, используется только в реакциях агглютинации объемной и пластинчатой, поэтому имеет ограниченную область применения; имеет невысокое рабочее разведение (1:10), что приводит к большему расходу диагностикума, кроме того, диагностикум получают в жидком виде, что создает неудобство для потребителя, связанное с небольшим сроком его годности (2 года) и с необходимостью поддерживать определенную температуру при транспортировке препарата.

Целью изобретения является получение диагностикума, имеющего более высокую стабильность, специфичность, более широкую область применения, более длительный срок годности, более удобного в работе.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения бруцеллезного диагностикума включает смыв микробной массы В. abortus 19 ВА 0,9% раствором натрия хлорида, доведение концентрации микробной массы до 20-30 млрд.м.к./мл, инактивацию микробной взвеси 1% раствором формалина, окрашивание микробной взвеси 0,04% раствором гематоксилина Караци, при определенных условиях. После окрашивания осуществляют отмывание микробной массы. После этого к осадку добавляют 0,1% раствор формалина до первоначального объема и стабилизатор в количестве 0,1 мл на 1 мл полученного диагностикума. Затем диагностикум лиофильно высушивают.

Сопоставительный анализ с протопипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что смыв микробной массы проводится 0,9% раствором натрия хлорида, при этом концентрацию микробной массы доводят до 20-30 млрд. м.к./мл, инактивацию проводят 1% раствором формалина, окрашивание - гематоксилином Караци, консервацию - формалином. Кроме того, способ включает добавление стабилизатора и лиофильное высушивание получаемого диагностикума.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найдены способы получения диагностикумов, которые включают предлагаемые режимы, а именно, данные режимы позволяют достичь поставленную цель - получить диагностикум, который имеет высокую специфичность, расширенную область применения (МРА, РА объемная и пластинчатая на стекле), длительный срок годности, удобен в работе и при транспортировке. Кроме того, способ получения диагностикума прост в исполнении. Сроки получения результатов короче по времени с использованием получаемого диагностикума, экономически выгодны.

Данный способ может быть использован в лабораторном и промышленном производстве при выпуске диагностических препаратов.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом: для приготовления бруцеллезного диагностикума двухсуточную агаровую культуру вакцинного штамма В.abortus 19 ВА смывают 0,9% раствором натрия хлорида и доводят до концентрации 20-30 млрд. м.к./мл, добавляют равный объем 2% раствора формалина с таким расчетом, чтобы микробная взвесь содержала 1% формалина. Инактивацию проводят при температуре 22°С в течение двух часов. Через два часа формалинизированную микробную взвесь отмывают от формалина два раза путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин, соблюдая правила безопасности при работе с условно-заразным материалом. В стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема и равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С и оставляют на 16-18 часов. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в раствор 3% хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют в тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 3-4 раза, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями сначала наливают небольшой объем 0,1% раствора формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доводят до первоначального объема. Затем добавляют стабилизатор 1,5% водный раствор поливинилпирролидона (ПВП) и 7% раствор сахарозы, взятые в соотношении 1:1, или 0,03% раствор карбонатного буфера и 3% раствор сахарозы, взятые в соотношении 1:1 в количестве 0,1 мл на 1 мл диагностикума, и лиофильно высушивают в стандартных условиях.

Получают стабильный сухой цветной антигенный бруцеллезный диагностикум с рабочим разведением от 1:16 до 1:18.

Пример 1. Двухсуточную агаровую культуру бруцелл штамма В. abortus 19 ВА смывают 0,9% раствором хлорида натрия и доводят до концентрации 20 млрд. м.к. в 1 мл взвеси по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича и инактивируют 1% раствором формалина. Инактивацию проводят при температуре 22°С в течение двух часов. Через два часа формалинизированную микробную взвесь отмывают от формалина два раза путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин, соблюдая правила безопасности при работе с условно-заразным материлом. В стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема. Во флаконы с отмытой микробной взвесью наливают равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С и оставляют на 16 часов. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в 3% раствор хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют при тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 3 раза. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями наливают 0,1% раствор формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доливают до первоначального объема. Перед лиофильным высушиванием добавляют стабилизатор - 1,5% водный раствор ПВП и 7% раствор сахарозы взятые в соотношении 1:1 в дозе 0,1 мл на 1 мл диагностикума.

Получают сухой диагностикум, у которого проверяют специфическую стерильность, активность, специфичность и устанавливают рабочее разведение. Приготовленный по предлагаемому способу диагностикум имеет рабочее разведение 1:16.

Активность бруцеллезного диагностикума сухого проверяли в МРА, РА объемной и пластинчатой на стекле с коммерческой бруцеллезной сывороткой (серия 7). В МРА титр антител составлял 1:3000±200, в РА объемной - 1:2400±800, в пластинчатой реакции на стекле сыворотка в дозах 0,04; 0,02; 0,01 дает положительную реакцию на четыре креста.

Специфичность полученного диагностикума проверяли в МРА и в РА объемной с коммерческими сыворотками: иерсиниозной серовара О:9 (серия 81) титр неспецифических антител составлял 1:720±80; холерной агглютинирующей О1 (серия 280) - 1:124±66; туляремийной (серия 3) - 1:45±5, тогда как с иерсиниозной серовара О:3 (серия 82), сальмонеллезной (серия 25), шигеллезной (серия 81), чумной (серия 55), эшерихиозной отрицательные результаты.

Пример 2. Двухсуточную агаровую культуру бруцелл штамма В.abortus 19 ВА смывают 0,9% раствором натрия хлорида и доводят до концентрации 30 млрд. м.к. в 1 мл взвеси по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича, и инактивируют 1% раствором формалина. Инактивацию проводят при температуре 22°С в течение двух часов. Через два часа формалинизированную микробную взвесь отмывают от формалина два раза путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин, соблюдая правила безопасности при работе с условно-заразным материалом. В стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема и равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С, и оставляют на 18 часов. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в раствор 3% хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют при тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 4 раза. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями наливают 0,1% раствор формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доводят до первоначального объема. Перед лиофильным высушиванием добавляют стабилизатор - 0,03% раствор карбонатного буфера и 3% раствор сахарозы, взятые в соотношении 1:1 в дозе 0,1 мл на 1 мл диагностикума.

Получают сухой диагностикум, у которого проверяют специфическую стерильность, активность, специфичность и устанавливают рабочее разведение. Приготовленный по предлагаемому способу диагностикум имеет рабочее разведение 1:18.

Активность бруцеллезного диагностикума сухого проверяли в МРА, РА объемной и пластинчатой на стекле с коммерческой бруцеллезной сывороткой (серия 7). В МРА титр антител составлял 1:3000±200, в РА объемной - 1:2400±800, в пластинчатой реакции на стекле сыворотка в дозах 0,04; 0,02; 0,01 дает положительную реакцию на четыре креста. Специфичность полученного диагностикума проверяли в МРА и в РА объемной с коммерческими сыворотками: иерсиниозной серовара О:9 (серия 81) титр неспецифических антител составлял 1:720±80; холерной агглютинирующей О1 (серия 280) - 1:124±66; туляремийной (серия 3) - 1:45±5, тогда как с иерсиниозной серовара О:3 (серия 82), сальмонеллезной (серия 25), шигеллезной (серия 81), чумной (серия 55), эшерихиозной ОКА (серия 74), псевдотуберкулезной (серия 77) показали отрицательные результаты.

Таким образом, диагностикумы с рабочими разведениями 1:16 и 1:18 по активности и специфичности не отличаются между собой. Результаты представлены в таблице. Как видно из таблицы, получаемый по предлагаемому способу диагностикум используется в реакциях: МРА, РА пробирочной и пластинчатой, тогда как диагностикум, полученный по способу-прототипу, используется только в РА пробирочной и пластинчатой. Полученный по предлагаемому способу диагностикум обладает активностью в МРА в разведении сыворотки 1:3200±200; в РА - 1:2400±800, не отличающуюся от прототипа. Специфичность сконструированного диагностикума с коммерческими сыворотками иерсиниозной серовара О:9 и холерной агглютинирующей О 1 выше у диагностикума, полученного по способу-прототипу, а с коммерческими иерсиниозной О:3, сальмонеллезной, чумной агглютинирующей, эшерихиозной, шигеллезной ОКА, псевдотуберкулезной отмечены отрицательные результаты, как у сконструированного диагностикума, так и у диагностикума, полученного по способу-прототипу.

Диагностикум, полученный по предлагаемому способу, более специфичен, имеет более широкую область применения по сравнению с диагностикумом, полученным по способу-протопипу. Кроме того, предлагаемый способ позволяет получить диагностикум с более длительным сроком годности (до 5 лет), удобным для транспортирования в любое время года при температуре от - 20°С до +25°С, тогда как диагностикум, полученный по способу-прототипу, - при температуре от 0°С до +25°С, исключающей замораживание. При этом способ получения прост и доступен.

Claims (1)

1. Способ получения бруцеллезного диагностикума, отличающийся тем, что двухсуточную культуру бруцелл штамма Brucella abortus 19 ВА смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида и доводят до концентрации 20-30 млрд м.к. в 1 мл взвеси, затем инактивируют микробную взвесь 1%-ным раствором формалина при температуре 22°С в течение двух часов, далее проводят отмывание дважды центрифугированием при 7000 об/мин в течение 30 мин, добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида до первоначального объема и равный объем 0,04%-ного раствора гематоксилина Караци, перемешивают, прогревают до температуры 56°С в течение 16-18 ч, после чего окрашенную взвесь центрифугируют при 2000 об/мин 15 мин, отделяют надосадочную жидкость и центрифугируют ее при 7000 об/мин 30 мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и центрифугируют при тех же условиях 3-4 раза, затем к осадку добавляют 0,1%-ный раствор формалина до первоначального объема и стабилизатор в количестве 0,1 мл на 1 мл полученного диагностикума, выбранный из группы: 1,5%-ный раствор поливинилпирролидона и 7%-ный раствор сахарозы в соотношении 1:1 или 0,03%-ный карбонатный буфер и 3%-ный раствор сахарозы в соотношении 1:1, после чего диагностикум лиофильно высушивают.