RU2584596C1 - Способ получения жидкой стабильной сыворотки - Google Patents
Способ получения жидкой стабильной сыворотки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2584596C1 RU2584596C1 RU2015121531/10A RU2015121531A RU2584596C1 RU 2584596 C1 RU2584596 C1 RU 2584596C1 RU 2015121531/10 A RU2015121531/10 A RU 2015121531/10A RU 2015121531 A RU2015121531 A RU 2015121531A RU 2584596 C1 RU2584596 C1 RU 2584596C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- serum
- salmonella
- liquid
- final concentration
- reaction
- Prior art date
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000005862 Whey Substances 0.000 title description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 72
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 5
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 abstract 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 2
- 241000156948 Aphantopus hyperantus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010049190 Red blood cell agglutination Diseases 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000596091 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Anatum Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241001546666 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport Species 0.000 description 1
- 241000531795 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002050 international nonproprietary name Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
- G01N33/5304—Reaction vessels, e.g. agglutination plates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии, а именно к получению жидкой стабильной шигеллезной сыворотки, которая может быть использована для постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), а также в реакции агглютинации (РА). Изобретение может быть также использовано для получения набора для выявления специфических антител к различным видам шигелл в сыворотке крови человека в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Изобретение представляет собой способ получения стабильной жидкой сыворотки диагностической сальмонеллезной, имеющей способность сохранять функциональную активность антител при их длительном нахождении в водных растворах, с использованием полиглюкина и сорбита, сыворотку диагностическую сальмонеллезную, полученную таким способом, и набор для выявления специфических антител к различным видам сальмонелл в сыворотке крови, включающий такую сыворотку. Изобретение позволяет в любой момент времени иметь уже готовую к использованию сыворотку, сократить расход используемых материалов, исключить из стадии получения трудоемкую и энергозатратную стадию лиофильной сушки, что значительно упрощает процесс получения сыворотки. 5 н.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии, а именно к получению жидкой стабильной сыворотки, которая может быть использована для постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), а также в реакции агглютинации (РА). Изобретение может быть также использовано для получения набора для выявления специфических антител к различным видам сальмонелл в сыворотке крови человека в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Сальмонеллы (лат. Salmonella) - род неспороносных бактерий, имеющих форму палочек. Род назван в честь американского ветеринара Д.Э. Салмона (англ. Daniel Elmer Salmon; 1850-1914). Сальмонеллы являются грамотрицательными подвижными факультативно анаэробными палочками, которые, как правило, не ферментируют лактозу и патогенны для людей и животных при пероральном введении. Одно из опаснейших заболеваний, которое вызывается серотипами бактерий сальмонеллы, это сальмонеллез. Это заболевание характеризуется разными клиническими симптомами, от совершенно бессимптомного проявления, до тяжелых септических форм. Особенно часто заболевание протекает с сильным поражением органов пищеварения. Другим заболеванием, вызываемым сальмонеллой, является брюшной тиф - острая циклически протекающая кишечная антропонозная инфекция, вызываемая бактериями Salmonella typhi (Salmonella enterica серотип typhi), с алиментарным путем передачи. Заболевание характеризуется лихорадкой, явлениями общей интоксикации с развитием тифозного статуса, розеолезными высыпаниями на коже, гепато- и спленомегалией и специфическим поражением лимфатической системы нижнего отдела тонкой кишки.
При заболевании сальмонеллой можно выделить следующие формы, это субклиническая форма, когда диагностируется заболевание по выделениям сальмонеллы из фекалий, и при этом добавляется титр противосальмонеллезных антител в серологических реакциях. Еще одной формой определения наличия сальмонелл является бактерионосительство, когда отсутствуют клинические симптомы, а сальмонелла выявляется при серологических и бактериологических исследованиях.
Существует и реализуется на настоящий момент множество диагностикумов, позволяющих определить в крови специфические антитела к антигенам сальмонелл. Для выявления антител к сальмонеллам используется реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) (Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы, М.: Медицина, 1976). Агглютинация подразделяется на прямую (активную) и непрямую (пассивную). Феномен прямой (активной) агглютинации реализуется при специфическом взаимодействии узнающих антител с собственными структурными антигенами мембран эритроцитов или бактериальных клеток.
Действующим началом диагностикумов, используемых в реакции РПГА, являются антигены сальмонелл, находящиеся на поверхности эритроцитов. При взаимодействии с сыворотками, содержащими антитела к сальмонеллам, наблюдается феномен агглютинации эритроцитов.
В настоящее время выпускается для РПГА несколько видов эритроцитарных диагностикумов (комплексный, групповой и т.д.). Реакцию ставят с парными сыворотками в соответствии с рекомендациями к указанным диагностическим препаратам. Диагностически достоверным показателем, подтверждающим заболевание, является увеличение титра антител не менее чем в 8 раз.
В патентной литературе также описаны эритроцитарные диагностикумы для выявления антител к антигенам сальмонелл (см., например, RU 2257581, 27.07.2005, 95117746, 10.10.1997 и т.д.).
В настоящее время для постановки реакции РПГА, также как и для постановки реакции агглютинации (РА) сухая лиофильно высушенная сальмонеллезная сыворотка требует разведения, например, раствором хлорида натрия. Однако полученный разведенный раствор имеет маленький срок хранения. В лабораториях обычно используется лишь малая часть сыворотки из вскрытой ампулы. Большую часть приходится утилизировать, поскольку в разведенном состоянии сыворотка быстро теряет свою специфическую активность. Таким образом, на настоящий момент существует задача сохранения функциональной активности антител сывороток, т.е. способности к специфическому взаимодействию с соответствующим антигеном при длительном их нахождении в водных растворах.
Ранее были предприняты попытки по увеличению срока годности сывороток. Так, в автореферате Михайловой В.А. «Разработка технологии получения кроличьей холерной агглютинизирующей О-сыворотки», Иркутск, 1998, был изложен способ стабилизации кроличьей холерной О-сыворотки с целью повышения срока ее годности. При поиске стабилизатора диагностических сывороток были исследованы вещества, известные своим стабилизирующим действием на молекулы иммуноглобулинов, прежде всего многоатомные спирты (сорбит), углеводы (сахароза) и аминокислоты (цистеин, глутамин). В качестве стабилизатора испытаны также тиосульфат натрия и глутатион - исходя из предположения, что эти вещества как антиоксиданты могут предотвратить свободнорадикальное окисление.
В результате сравнительных исследований установлено, что наилучший стабилизирующий эффект оказывает смесь сахарозы (в концентрации от 2.2 до 3.0%) и тиосульфата натрия (от 0.75 до 1.0%). Оба компонента стабилизатора растворяют в 0.9% растворе хлористого натрия и вносят в сыворотку в соотношении, зависящем от специфической активности сыворотки. Сыворотку с титром антител 1:3200 и выше разводят 3:1 стабилизатором, содержащим 9% сахарозы и 3% тиосульфата натрия, с титром антител не ниже 1:1600 - 12:1 раствором, содержащим 30% сахарозы и 10% тиосульфата натрия. Конечное содержание стабилизирующих веществ в сыворотке в обоих случаях было одинаково: 3% - сахарозы и 1% - тиосульфата натрия. В результате стабильность экспериментальной сыворотки была выше, чем у контрольной, в 5 и более раз. Кроме того, сахароза и тиосульфат натрия значительно улучшали растворимость препарата. На специфическую активность и растворимость оказывала влияние остаточная влажность препарата: наиболее стабильными были холерные агглютинирующие О-сыворотки с остаточной влажностью не более 2.0-2.2%.
Авторами же настоящего изобретения было обнаружено, что можно получить жидкую сыворотку с длительным сроком хранения вплоть до 3 лет с сохранением ее функциональной активности. Таким образом, получение такой сыворотки позволяет в любой момент времени иметь уже готовую к использованию сыворотку, сократить расход используемых материалов, исключить из стадии получения трудоемкую и энергозатратную стадию лиофильной сушки, что значительно упрощает и удешевляет процесс получения сыворотки.
Это также приводит к упрощению проведения реакции агглютинации, поскольку жидкие сыворотки не требуют стадии разведения сухой сыворотки раствором для разведения.
Таким образом, технический результат заключается в сохранении функциональной активности антител сыворотки при длительном нахождении в водном растворе, что приводит также и к упрощению способа получения сыворотки, а также к упрощению проведения реакции агглютинации.
Технический результат достигается тем, что в качестве основного разводящего и стабилизирующего раствора исходной жидкой адсорбированной сыворотки использовали растворы, содержащие полиглюкин (ПГ) - международное непатентованное название - декстран (ср. мол. масса 50000-70000)(крупномолекулярный стабилизатор антител) - 60 г; натрия хлорид - 9 г, вода для инъекций - до 1 л; прозрачная бесцветная или слегка желтоватая жидкость, азид натрия в конечной концентрации 0.2% и 0,2% сорбит в конечной концентрации.
Известно, что полиглюкин используют в качестве криопротектра при лиофильном высушивании препаратов, поскольку он оказывает защитное действие на белковые молекулы (см., например, RU 2326655, 20.06.2008, RU 2214836, 27.10.2003, RU 2236866,27.09.2004).
При этом в уровне техники не описана возможность использования полиглюкина для придания сохранения свойств, входящих в состав сывороток антител при нахождении их в водном растворе.
Таким образом, изобретение представляет собой:
1. Набор для выявления специфических антител к различным видам сальмонелл в сыворотке крови, включающий:
- диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный, представляющий собой взвесь формалинзированных эритроцитов барана, сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из сальмонелл в буферном растворе,
- стабильную жидкую сыворотку диагностическую сальмонеллезную, полученную путем разведения жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации,
- взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана,
- планшет для иммунологических реакций;
2. Способ получения стабильной жидкой сыворотки диагностической сальмонеллезной, менингококковой, коклюшной или паракоклюшной, включающий разведение соответствующей жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации;
3. Сыворотку диагностическую сальмонеллезную, полученную способом, включающим разведение жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации;
4. Применение стабильной жидкой сыворотки, полученной способом по п. 2, в реакции агглютинации (РА);
5. Применение стабильной жидкой сыворотки, полученной способом по п. 2, в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Изобретение осуществляется следующим способом.
В качестве неограничивающего примера осуществления показано получение сальмонеллезной сыворотки и ее использование в реакциях РА и РПГА. Аналогичным образом были протестированы менингококковые, коклюшные и паракоклюшные сыворотки. Полученные результаты показывают, что во всех случаях для всех указанных сывороток применение в качестве разбавляющего именно раствора полиглюкина с азидом натрия и сорбитом позволяет сохранить стабильность сывороток в жидком виде в течение трех лет.
Были приготовлены разводящие растворы для сыворотки.
В 6%-ный полиглюкин был внесен азид натрия в конечной концентрации 0.2% и сорбит в конечной концентрации 0,2%
Исходную жидкую адсорбированную сальмонеллезную сыворотку разбавляют раствором, полученным внесением в полиглюкин 0.2% азида натрия и 0,2% сорбита.
В качестве дополнительных стабилизаторов были использованы - лс-18 - 0,2%, сорбит 2%, глицин 0,2%, глютатион 0,2%, тиосульфат натрия 0,2 и 0,4% (в дальнейшем от использования тиосульфата натрия отказались в связи с резким снижением активности сывороток), красгемодез 8000 (ГД).
Степень разведения сывороток зависит от того, какая сыворотка используется в качестве исходной и для какой реакции (РА или РПГА). Однако вне зависимости от степени разведения сыворотки использование в качестве стабилизирующего и разводящего раствора полиглюкина с 0.2%-ным азидом натрия или раствора красгемодеза 8000 с 0.2%-ным сорбитом и 0.2%-ным азидом натрия позволяет получить жидкую стабильную в течение трех лет диагностическую сыворотку.
Полученные сыворотки были проверены по показателю специфическая активность в реакции РПГА с использованием сальмонеллезных диагностикумов, производимых ООО «Био-Диагностика» - 1,2,12; 1,4,12; 6,7;6,8;1,9,12;3,10; Ви; комплексный в разведении 1/10 и 1/100 и в реакции РА без разведения с использованием тест штаммов- Salmonella paratyphi А №392, S.typhimurium №415, S.enteritidis (gertneri) №921, S.cholerae suis №92, S. newport, S.anatum №61, S. typhi Vi
Были исследованы сыворотки в различных вариантах, а именно:
| 1. ПГ без добавок | 6. ГД без добавок |
| 2. ПГ + лс-18 0,2% | 7. ГД + лс-18 0,2% |
| 3. ПГ + сорбит 2% | 8. ГД + сорбит 2% |
| 4. ПГ + глютатион 0,2% | 9. ГД + глицин 0,2% |
| 5. ПГ + глицин 0,2% |
В процессе хранения все сыворотки проверялись в реакциях РПГА и РА. В РПГА все сыворотки использовались в разведении 1/10. В РА сыворотки использовали без разведения.
Реакция РА.
Когда бактериальная культура смешивается с антисывороткой, специфичной строго к компонентам поверхности клеток бактерий, клетки скрепляются вместе благодаря взаимодействию антиген-антитело и формируют агрегаты (происходит агглютинация). Обычно данную реакцию можно наблюдать невооруженным глазом в виде хлопьев в суспензии. Благодаря смешиванию специфичной антисыворотки с культурой микроорганизмов (например, Salmonella), происходит идентификация определяемых антигенов (например, О и Н). На основе наблюдаемой агглютинации образца серотип определяется по схеме Кауффманна-Уайта.
Реакция протекает следующим образом:
1. Готовят клетки микроорганизмов для постановки реакции. Суспензию обезвреженных клеток микроорганизмов разводят физиологическим раствором (0.9% NaCl, рН=6.5-7.2) до концентрации 20-40 МЕ/мл (используя стандарт мутности МакФарланда). Либо исследуемую культуру берут бактериологической петлей, добавляют в лунку планшета к раствору для разведения и растирают ее до получения однородной суспензии бежево-белого цвета мутностью от 20 до 40 МЕ/мл;
2. Используют сыворотку для реакции, учитывая титр антител (если известен). Исходная сыворотка разводится таким образом, чтобы минимальный титр составлял не менее 1/80. То есть при использовании исходной сыворотки с титром 1/320, развести необходимо будет в 4 раза:
k=t/80, где k - коэффициент разведения, t - титр исходной сыворотки.
Исходную жидкую адсорбированную сальмонеллезную сыворотку разбавляют раствором, полученным внесением в полиглюкин 0.2% азида натрия и 0,2» сорбита;
3. В центр лунки 8-луночного планшета для реакции агглютинации вносится 50 мкл исследуемой культуры и рядом 50 мкл разведенной сыворотки. Капли соединяют, наклоняя планшет. Реакцию определяют визуально в течение 2-6 минут. При развитии реакции агглютинации происходит выпадение агрегатов клеток с антителами, при этом раствор становится более прозрачным.
Учет реакции проводится по четырехкрестной системе:
(4+) - отчетливый агглютинат при полном просветлении жидкости;
(3+) - отчетливый агглютинат на фоне мутноватой жидкости;
(2+) - незначительный агглютинат на фоне мутной жидкости;
(1+) - незначительное количество агглютината на фоне мутной жидкости;
(-) - признаков агглютинации нет. Однородная мутная жидкость.
Положительной считается реакция агглютинации интенсивностью не менее чем на (3+).
Реакция РПГА.
Принцип РПГА заключается в том, что при специфическом взаимодействии антител к различным видам сальмонелл исследуемой сыворотки крови с антигенами, фиксированными на поверхности индикаторных эритроцитов, наблюдается их характерная агглютинация.
Реакция РПГА проводится в соответствии с рекомендациями используемого диагностикума. В состав набора для диагностики входят:
- диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный, представляющий собой взвесь формалинзированных эритроцитов барана, сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из сальмонелл в буферном растворе,
- стабильная жидкая сыворотка диагностическая сальмонеллезная, полученная путем разведения жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации;
- взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана,
- планшет для иммунологических реакций.
Учет РПГА проводится по четырехкрестной системе:
(4+) - все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки в виде "зонтика";
(3+) - агглютинированы почти все эритроциты, на фоне их имеется малозаметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;
(2+) - наряду с равномерным агглютинатом на дне лунки имеется осадок в виде маленького " колечка " или "пуговки";
(1+) - большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в виде маленького "колечка" в центре дна лунки;
(-) - признаков агглютинации нет. Эритроциты осели в виде "пуговки" или "колечка".
Результаты исследований представлены в таблице 1.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что все сальмонеллезные сыворотки рекомендовано разбавлять полиглюкином с натрия азидом 0,2% и с сорбитом 0.2%. Это позволяет сделать сыворотку в жидком виде стабильной в течение длительного времени (до трех лет).
Аналогичным образом были получены и протестированы жидкие диагностические менингокковые, коклюшные и паракоклюшные сыворотки. В результате проведенных опытов было установлено, что менингокковые, коклюшные и паракоклюшные сыворотки для придания им стабильности в жидком виде, также как и сальмонеллезные сыворотки, следует разбавлять полиглюкином с натрия азидом 0,2% и с сорбитом 0.2%. Такие сыворотки также сохраняют свою стабильность в течение трех лет.
Таким образом, в результате осуществления изобретения было подтверждено, что можно получить жидкую сыворотку с длительным сроком хранения вплоть до 3 лет с сохранением ее функциональной активности.
Claims (5)
1. Набор для выявления специфических антител к различным видам сальмонелл в сыворотке крови, включающий:
- диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный, представляющий собой взвесь формалинзированных эритроцитов барана, сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из сальмонелл в буферном растворе,
- стабильную жидкую сыворотку диагностическую сальмонеллезную, полученную путем разведения жидкой адсорбированной сальмонеллезной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0,2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации,
- взвесь формалинзированных несенсибилизированных эритроцитов барана,
- планшет для иммунологических реакций.
- диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный, представляющий собой взвесь формалинзированных эритроцитов барана, сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из сальмонелл в буферном растворе,
- стабильную жидкую сыворотку диагностическую сальмонеллезную, полученную путем разведения жидкой адсорбированной сальмонеллезной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0,2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации,
- взвесь формалинзированных несенсибилизированных эритроцитов барана,
- планшет для иммунологических реакций.
2. Способ получения стабильной жидкой сыворотки диагностической сальмонеллезной, менингококковой, коклюшной или паракоклюшной, включающий разведение соответствующей жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0,2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации.
3. Стабильная жидкая сыворотка диагностическая сальмонеллезная, полученная способом, включающим разведение жидкой адсорбированной сальмонеллезной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0,2% азида натрия в конечной концентрации и 0,2% сорбит в конечной концентрации.
4. Применение стабильной жидкой сыворотки, полученной способом по п.2, в реакции агглютинации (РА).
5. Применение стабильной жидкой сыворотки, полученной способом по п.2, в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015121531/10A RU2584596C1 (ru) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Способ получения жидкой стабильной сыворотки |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015121531/10A RU2584596C1 (ru) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Способ получения жидкой стабильной сыворотки |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2584596C1 true RU2584596C1 (ru) | 2016-05-20 |
Family
ID=56012211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015121531/10A RU2584596C1 (ru) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Способ получения жидкой стабильной сыворотки |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2584596C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2110801C1 (ru) * | 1995-10-25 | 1998-05-10 | Научно-производственная фирма "Диавак" | Пастереллезный антительный эритроцитарный диагностикум и способ его приготовления |
| RU2257581C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2005-07-27 | Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт | Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при сальмонеллезах животных |
-
2015
- 2015-06-05 RU RU2015121531/10A patent/RU2584596C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2110801C1 (ru) * | 1995-10-25 | 1998-05-10 | Научно-производственная фирма "Диавак" | Пастереллезный антительный эритроцитарный диагностикум и способ его приготовления |
| RU2257581C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2005-07-27 | Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт | Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при сальмонеллезах животных |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МИХАЙЛОВА В.А. Разработка технологии получения кроличьей холерной агглютинизирующей О-сыворотки, автореферат, Иркутск, 1998. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jokipii et al. | Cryptosporidium: a frequent finding in patients with gastrointestinal symptoms | |
| Reddy et al. | Secretory IgA in protein-calorie malnutrition. | |
| Tennant et al. | Use of the glutaraldehyde coagulation test for detection of hypogammaglobulinemia in neonatal calves | |
| CN103901208A (zh) | 能够更好地在医疗制品中检测非内毒素致热污染物的改进的单核细胞活化测试 | |
| Goekce et al. | Determination of Clostridium perfringens toxin-types in sheep with suspected enterotoxemia in Kars Province, Turkey | |
| Philip | Detection of neonatal sepsis of late onset | |
| Chand et al. | Comparison of milk-ELISA and serum-ELISA for the diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep | |
| CN101592660A (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒 | |
| Bokkenheuser | Vibrio fetus infection in man: a serological test | |
| Braconier et al. | Fulminant meningococcal infections in a family with inherited deficiency of properdin | |
| RU2584596C1 (ru) | Способ получения жидкой стабильной сыворотки | |
| Fahey et al. | Quantitation by ELISA of pili and sheep antibodies to the pili of Bacteroides nodosus | |
| RU2584595C1 (ru) | Способ получения жидкой стабильной сыворотки | |
| Wallace et al. | The bentonite flocculation test in the assay of Neisseria antibody | |
| US5093235A (en) | Immuno-dye reagent and assay for detection of endotoxin | |
| Blazer et al. | Serum IgG antibodies to gliadin in children with celiac disease as measured by an immunofluorescence method | |
| US20060127960A1 (en) | Process for preparation of an agglutination reagent for rapid detection of typhoid | |
| Tilton | Counterimmunoelectrophoresis in biology and medicine | |
| Tiwary et al. | Prevalence of anemia in hookworm infestation in children of slum areas in and around Dhanbad | |
| Suzuki et al. | Hemolysis in immune rabbits of autologous erythrocytes modified with common enterobacterial antigen | |
| RU2805871C1 (ru) | Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного сухого | |
| SU594173A1 (ru) | Способ получени антигена дл диагностики пуллороза-тифа птиц | |
| RU2232989C1 (ru) | Способ получения тест-системы для определения антигенов цитотоксинассоциированных белков helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией коагглютинации | |
| RU2714305C1 (ru) | Способ изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) | |
| RU2754465C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при клостридиозах животных |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180606 |