RU2230569C2

RU2230569C2 - Method for preparing tuberculosis anatoxin

Info

Publication number: RU2230569C2
Application number: RU2001116680/13A
Authority: RU
Inventors: А.А. Евглевский (RU); А.А. Евглевский; В.М. Коломиец (RU); В.М. Коломиец; Анатолий Михайлович Коваленко (UA); Анатолий Михайлович Коваленко; Владимир Александрович Бусол (UA); Владимир Александрович Бусол
Original assignee: Закрытое акционерное общество "АгроБизнесЦентр" "AgroBusinessCentre"
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2004-06-20

Abstract

FIELD: veterinary microbiology.

SUBSTANCE: method involves culturing tuberculosis mycobacteria and their following destruction. Cultural fluid is removed and formalin is added to it. The end product is sorbed on aluminum hydroxide and sterilized it by autoclaving method. Formalin is added to cultural fluid for three stages with interval for 5-9 days in the final concentration 0.2-0.25%, 0.3-0.4% and 0.5-0.6%, respectively. In the first formalin addition the temperature of reaction medium is maintained in the range 40-42 C, in the second addition - in the range 43-45 C, and in the third addition - in the range 46-47 C. Method provides enhancing activity of the end product.

EFFECT: improved preparing method.

1 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано в технологии получения биологических препаратов для специфической профилактики инфекционных заболеваний животных.The invention relates to agriculture, in particular to veterinary medicine, and can be used in the technology of biological preparations for the specific prevention of infectious diseases of animals.

Известен способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания микобактерий туберкулеза с последующей их деструкцией, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием (Патент РФ № 2053791, МКИ⁶ А 61 К 39/04. Способ получения анатоксина. Бюл. № 4, 1996). В известном способе к культуральной жидкости добавляют формалин одномоментно из расчета 1 мг на 1 мл анатоксина.A known method of producing tuberculous toxoid by growing mycobacterium tuberculosis followed by their destruction, separation of the culture fluid, adding formalin to it, sorption of the target product on aluminum hydroxide and its sterilization by autoclaving (RF Patent No. 2053791, MKI ⁶ A 61 K 39/04. Production method toxoid Bul. No. 4, 1996). In the known method, formalin is added to the culture fluid simultaneously at the rate of 1 mg per 1 ml of toxoid.

Недостатком известного способа является получение туберкулезного анатоксина плохого качества (содержание в нем высокой концентрации токсина и формалина - токсических для организма веществ) с небольшим сроком хранения.The disadvantage of this method is to obtain a tubercular toxoid of toxin of poor quality (the content in it of a high concentration of toxin and formalin - toxic substances for the body) with a short shelf life.

Известен также способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания с последующей деструкцией микобактерий туберкулеза, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием, причем формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубацией при температуре 37-40°С в течение 7-10 суток, а затем - до конечной концентрации формалина в смеси 0,5-0,6% с последующей инкубацией при температуре 44-46°С в течение 5-8 суток, а деструкцию микобактерий туберкулеза проводят гамма облучением Со⁶⁰ дозой 1,0-2,0×10⁶R (патент РФ № 2139090, МКИ А 61 К 39/04. Бюл. 28, 1999). В известном способе к культуральной жидкости добавляют формалин двукратно.There is also a method for producing tuberculous toxoid by growing with subsequent destruction of mycobacterium tuberculosis, separating the culture fluid, adding formalin to it, sorbing the target product on aluminum hydroxide and sterilizing it by autoclaving, with formalin being added at the beginning to its concentration in the mixture of 0.3-0, 4% and incubation at a temperature of 37-40 ° C for 7-10 days, and then to a final concentration of formalin in a mixture of 0.5-0.6%, followed by incubation at a temperature of 44-46 ° C for 5-8 days, and destruction Mycobacterium tuberculosis is carried out gamma irradiation dose of ⁶⁰ Co 1,0-2,0 × ¹⁰ June R (RF Patent № 2139090, IPC A 61 K 39/04. Bull. 28, 1999). In the known method, formalin is added twice to the culture fluid.

Однако в результате использования известного способа получают туберкулезный анатоксин недостаточно высокого качества.However, as a result of using the known method, a tuberculous toxoid of insufficient quality is obtained.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение качества целевого продукта.The aim of the invention is to increase the quality of the target product.

Поставленная цель достигается в способе получения туберкулезного анатоксина путем выращивания с последующей деструкцией микобактерий туберкулеза, отделением культуральной жидкости, детоксикации ее формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизации автоклавированием тем, что формалин к культуральной жидкости добавляют трехкратно с интервалом 5-9 суток в конечной концентрации 0,2-0,25%, 0,3-0,4% и 0,5-0,6% соответственно, причем при первом добавлении формалина температура реакционной среды поддерживается в интервале 40-42°С, втором - 43-45°С, третьем - 46-47°С.The goal is achieved in a method for producing tuberculous toxoid by growing with subsequent destruction of mycobacterium tuberculosis, separation of the culture fluid, detoxification with formalin, sorption of the target product on aluminum hydroxide and sterilization by autoclaving so that formalin is added to the culture fluid three times with an interval of 5-9 days in the final concentration of 0.2-0.25%, 0.3-0.4% and 0.5-0.6%, respectively, with the first addition of formalin, the temperature of the reaction medium is maintained in the range ie 40-42 ° C, the second - 43-45 ° C, the third - 46-47 ° C.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, что позволяет сделать вывод о соответствии предложения условию патентоспособности - “новизна”.In the patent and scientific and technical literature, technical solutions similar to the claimed are unknown, which allows us to conclude that the proposal meets the patentability condition - “novelty”.

Только сочетание заявленных режимов в определенной последовательности позволяет достичь эффект, указанный в цели изобретения, т.е. заявленный способ удовлетворяет условию патентоспособности - “изобретательский уровень”, в частности проведение добавления формалина в три этапа при определенных соотношениях компонентов и при определенной температуре реакционной среды позволило получить неочевидный положительный эффект. Нами впервые установлено, что в течение первого этапа добавления формалина при низких его концентрациях происходит взаимодействие свободных аминогрупп и в первую очередь лизина. При этом образуются метилоламинные группы. На втором этапе в реакции участвуют активные радикалы циклических аминогрупп, содержащие фенольные, гуанидиновые и индольные группы - это тирозин, аргинин, гистидин и триптофан. Эти группы прочно соединяются за счет активных атомов водорода с метилоламинными группами остатков лизина через метиленовые мостики. При этом блокирование формалином активных радикалов токсина приводит к его детоксикации (обезвреживанию) и образованию полимеров. Добавление формалина на третьем этапе приводит к необратимой стабилизации анатоксина и исключает реверсию токсикоаллергенов.Only a combination of the claimed modes in a certain sequence allows to achieve the effect indicated in the purpose of the invention, i.e. the claimed method satisfies the condition of patentability - “inventive step”, in particular, the addition of formalin in three stages with certain ratios of components and at a certain temperature of the reaction medium allowed to obtain a non-obvious positive effect. We found for the first time that during the first stage of formalin addition at low concentrations, free amino groups interact, primarily lysine. In this case, methylolamine groups are formed. At the second stage, the reaction involves active radicals of cyclic amino groups containing phenolic, guanidine and indole groups - these are tyrosine, arginine, histidine and tryptophan. These groups are firmly connected due to the active hydrogen atoms with the methylolamine groups of lysine residues through methylene bridges. Moreover, formalin blocking of the toxin active radicals leads to its detoxification (neutralization) and the formation of polymers. The addition of formalin in the third stage leads to the irreversible stabilization of the toxoid and eliminates the reversal of toxicoallergens.

Способ используют для получения биологических препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний животных, поэтому заявленное предложение соответствует условию патентоспособности - “промышленная применимость”.The method is used to obtain biological preparations for the specific prophylaxis of animal infectious diseases, therefore, the claimed proposal meets the patentability condition - “industrial applicability”.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 60 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 120 минут, а отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в три этапа: а) до концентрации его в смеси 0,2% и инкубацией при температуре 40°С в течение 5 суток; б) далее формалин добавляют к реакционной смеси до конечной концентрации 0,3% и инкубации при температуре 43°С в течение 5 суток; в) и, в заключении, формалин добавляют до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при температуре 46°С в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.Example 1. Mycobacterium tuberculosis is grown, as in the known method on a nutrient medium for 60 days. Then autoclaving is carried out at 1.0 atm for 120 minutes, and the separation of the culture fluid is carried out by filtration. Detoxification is carried out by adding formalin to the culture fluid in three stages: a) until it is concentrated in a mixture of 0.2% and incubated at a temperature of 40 ° C for 5 days; b) then formalin is added to the reaction mixture to a final concentration of 0.3% and incubation at a temperature of 43 ° C for 5 days; c) and, in conclusion, formalin is added to its final concentration of 0.5% and incubation of the mixture at a temperature of 46 ° C for 5 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide is added to the culture fluid, as in the known method, at a final concentration of 1 mg / ml.

Через 12 часов после отстоя надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновьми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками и повторно подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.12 hours after settling, the supernatant is removed (50% of the total liquid volume), and the remaining precipitate (target product) is packaged in bottles, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps and re-autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Пример 2. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 55 дней. Затем проводят гамма-облучение Со⁶⁰ дозой 1,0×10⁶R. Отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в три этапа: а) до концентрации его в смеси 0,25% и инкубацией при температуре 42°С в течение 9 суток; б) далее формалин добавляют к реакционной смеси до конечной концентрации 0,4% и инкубации при температуре 45°С в течение 9 суток; в) и, в заключении, формалин добавляют до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при температуре 47°С в течение 9 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.Example 2. Mycobacterium tuberculosis is grown, as in the known method on a nutrient medium for 55 days. Then, gamma irradiation With ^{60 is} carried out with a dose of 1.0 × 10 ⁶ R. The separation of the culture fluid is carried out by filtration. Detoxification is carried out by adding formalin to the culture fluid in three stages: a) until it is concentrated in a mixture of 0.25% and incubated at 42 ° C for 9 days; b) then formalin is added to the reaction mixture to a final concentration of 0.4% and incubation at a temperature of 45 ° C for 9 days; c) and, in conclusion, formalin is added to its final concentration of 0.6% and incubation of the mixture at a temperature of 47 ° C for 9 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide is added to the culture fluid, as in the known method, at a final concentration of 1 mg / ml.

Сразу после центрифугирования надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.Immediately after centrifugation, the supernatant is removed (50% of the total liquid volume), and the remaining precipitate (target product) is packaged in vials, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps, autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Пример 3. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 60 дней. Затем микобактерии разбивают на ультразвуковом дезинтеграторе при длине волны 4 мкм и экспозиции 30 минут, а отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в три этапа: а) до концентрации его в смеси 0,225% и инкубацией при температуре 41°С в течение 7 суток; б) далее формалин добавляют к реакционной смеси до конечной концентрации 0,35% и инкубацией при температуре 44°С в течение 7 суток; в) и, в заключении, формалин добавляют до его конечной концентрации 0,55% и инкубацией смеси при температуре 46,5°С в течение 7 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.Example 3. Mycobacterium tuberculosis is grown, as in the known method on a nutrient medium for 60 days. Then, mycobacteria are broken up on an ultrasonic disintegrator at a wavelength of 4 μm and an exposure of 30 minutes, and the culture fluid is separated by filtration. Detoxification is carried out by adding formalin to the culture fluid in three stages: a) until it is concentrated in a mixture of 0.225% and incubated at 41 ° C for 7 days; b) then formalin is added to the reaction mixture to a final concentration of 0.35% and incubation at a temperature of 44 ° C for 7 days; c) and, in conclusion, formalin is added to its final concentration of 0.55% and incubation of the mixture at a temperature of 46.5 ° C for 7 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide is added to the culture fluid, as in the known method, at a final concentration of 1 mg / ml.

Через 12 часов после отстоя надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.12 hours after sludge, the supernatant is removed (50% of the total liquid volume), and the remaining precipitate (target product) is packaged in bottles, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps, autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Протективные свойства туберкулезного анатоксина, полученного согласно примерам 1-3, были испытаны на морских свинках. Схемой проведения опытов предусматривалось одно - двукратная иммунизация морских свинок вакциной БЦЖ и туберкулезным анатоксином (полученного согласно примерам 1-3) с последующим их заражением суспензией микобактерий туберкулеза штамма Валле в дозе 0,00001 мг/мл из расчета на одно животное. Полученные туберкулезный анатоксин вводили морским свинкам в область внутренней поверхности бедра животного. Результаты испытаний представлены в таблице.The protective properties of the tuberculous toxoid obtained according to examples 1-3 were tested in guinea pigs. The experimental design provided for one - two-fold immunization of guinea pigs with BCG vaccine and tuberculosis toxoid (obtained according to examples 1-3), followed by their infection with a suspension of Mycobacterium tuberculosis of the strain Vallee at a dose of 0.00001 mg / ml per animal. The resulting tuberculous toxoid was administered to guinea pigs in the region of the inner thigh of the animal. The test results are presented in the table.

Предлагаемый способ позволяет увеличить качество целевого продукта за счет повышения протективных свойств целевого продукта, в частности исключается заболевание туберкулезом у животных, иммунизированных туберкулезным анатоксином, полученным согласно заявляемому способу.The proposed method allows to increase the quality of the target product by increasing the protective properties of the target product, in particular, the disease of tuberculosis in animals immunized with tuberculous toxoid obtained according to the claimed method is excluded.

Claims

A method of producing tuberculous toxoid by growing with subsequent destruction of mycobacterium tuberculosis, separation of the culture fluid, detoxification with formalin, sorption of the target product on aluminum hydroxide and its sterilization by autoclaving, characterized in that formalin is added to the culture fluid three times with an interval of 5-9 days in a final concentration 0.2-0.25%, 0.3-0.4% and 0.5-0.6%, respectively, with the first addition of formalin, the temperature of the reaction medium is maintained in the range 40-42 ° C, the second 43-45 C, the third - 46-47 ° C.