RU2115432C1

RU2115432C1 - Method of tuberculosis anatoxin preparing

Info

Publication number: RU2115432C1
Application number: RU96115761A
Authority: RU
Inventors: А.А. Евглевский
Original assignee: Курская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.И.И.Иванова
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 1998-07-20

Abstract

FIELD: biotechnology, veterinary science. SUBSTANCE: method involves detoxication of tuberculosis mycobacterium endotoxin with formalin, sorption on aluminium hydroxide and sterilization. Native cultural fluid of tuberculosis bovis mycobacterium at initial allergic activity 100 000 tuberculin units/1 ml is used as an endotoxin. Detoxication of cultural fluid is carried out with 0.25-0.3% formalin at 44-45 C for 7 days and sorption on 3-4% aluminium hydroxide gel adding at amount 25-30% to total volume and discarding 50-55% inactive supernatant. Anatoxin is used for specific prophylaxis of tuberculosis in animals. EFFECT: improved method of preparing. 2 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методу получения туберкулезного анатоксина для специфической профилактики туберкулеза животных. The invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing tuberculous toxoid for specific prophylaxis of animal tuberculosis.

Аналогом препарата, предназначенного для активной профилактики туберкулеза, является живая вакцина БЦЖ. Однако в ветеринарной медицине ее, за редким исключением, не применяют из-за аллергизации организма животных к туберкулину и невозможности по этой причине проводить дефференциацию поствакцинальной аллергии от заболевания туберкулезом. An analogue of the drug intended for the active prevention of tuberculosis is the live BCG vaccine. However, in veterinary medicine, with rare exceptions, it is not used because of the allergization of the animal organism to tuberculin and the inability for this reason to differentiate the post-vaccination allergy from tuberculosis.

За прототип взят впервые разработанный способ получения туберкулезного анатоксина. Указанный способ получения туберкулезного анатоксина предусматривает детоксикацию токсических и инактивацию аллергенных свойств туберкулина формалином с последующей сорбцией препарата на гидроокиси алюминия. В качестве токсина используют смесь, состоящую из 2 г порошка туберкулина ППД/100 тыс. туберкулиновых единиц (Т.Е.) и 1 мл безальбумозного туберкулина с активностью 90-100 тыс. Т.Е. в 1 мл. Указанную смесь токсиноаллергенов микробактерий туберкулеза инактивируют 0,8-1%-ным формалином в течение 10-15 дней при 37-45^oC, проводят сорбцию на гидроокиси алюминия из расчета 1 мг окиси алюминия на 1 мл анатоксина с последующей стерилизацией при 0,8 атм в течение 20-30 мин.For the prototype taken the first developed method for producing tuberculous toxoid. The specified method for producing tuberculous toxoid involves the detoxification of toxic and inactivation of the allergenic properties of tuberculin with formalin, followed by sorption of the drug on aluminum hydroxide. As a toxin, a mixture is used consisting of 2 g of PPD tuberculin powder / 100 thousand tuberculin units (T.E.) and 1 ml of non-albuminous tuberculin with an activity of 90-100 thousand T.E. in 1 ml. The specified mixture of tuberculosis toxin allergens is inactivated with 0.8-1% formalin for 10-15 days at 37-45 ^o C, sorption on aluminum hydroxide is carried out at the rate of 1 mg of aluminum oxide per 1 ml of toxoid, followed by sterilization at 0.8 atm for 20-30 minutes

Недостатками указанного способа получения туберкулезного анатоксина являются необходимость использования для усиления иммуногенных свойств препарата в качестве токсина порошка туберкулина ППД и слишком высокая, до 1% концентрация формалина, обеспечивающая тем не менее на 70-80% инактивацию токсических и аллергенных свойств смеси туберкулинов, содержащую в среднем 200 тыс. Т.Е. в 1 мл. Подкожное введение препарата как крупному рогатому скоту, так и лабораторным животным (морские свинки, кролики) с такой концентрацией формалина во многих случаях приводит к нежелательным воспалительным реакциям на месте инъекции препарата, снижающих протективный эффект иммунизации и в целом отрицательно влияющих на иммунобиологическую реактивность организма животных. The disadvantages of this method of producing tuberculous toxoid are the need to use PPD powder as a toxin to enhance the immunogenic properties of the drug and too high a formalin concentration of up to 1%, which nevertheless provides an inactivation of toxic and allergenic properties of a mixture of tuberculins by 70-80%, containing on average 200 thousand T.E. in 1 ml. Subcutaneous administration of the drug to both cattle and laboratory animals (guinea pigs, rabbits) with such a concentration of formalin in many cases leads to undesirable inflammatory reactions at the injection site, which reduce the protective effect of immunization and generally negatively affect the immunobiological reactivity of animals.

Цель изобретения - оптимизация способа изготовления туберкулезного анатоксина и повышение иммуногенной и протективной активности целевого конечного продукта. The purpose of the invention is the optimization of the method of manufacturing tuberculous toxoid and increase the immunogenic and protective activity of the target end product.

Для достижения указанной цели используется автоклавированная нативная культуральная жидкость после двухмесячного выращивания микобактерий туберкулеза бовис на жидкой синтетической среде Курской биофабрики с активностью 100 тыс. Т.Е. в 1 мл. В указанную культуральную жидкость после отделения ее от биомассы микобактерий туберкулеза, с целью инактивации токсических и аллергенных свойств добавляли формалин 0,25-0,3%-ной концентрации и выдерживали 7-10 дней при 44-45^oC с последующей сорбцией на 3-4%-ном геле гидроокиси алюминия и отбрасыванием 50-55%-ной неактивной надосадочной жидкости.To achieve this goal, an autoclaved native culture fluid is used after two months of growing Mycobacterium tuberculosis bovis on a synthetic liquid in the Kursk Biofactory with an activity of 100 thousand T.E. in 1 ml. After separation of it from the biomass of Mycobacterium tuberculosis, in order to inactivate toxic and allergenic properties, formalin of 0.25-0.3% concentration was added to the indicated culture fluid and kept for 7-10 days at 44-45 ^o C followed by sorption of 3- 4% gel of aluminum hydroxide and discarding 50-55% inactive supernatant.

Детоксикацию эндотоксина культуральной жидкости проводили 0,1; 0,2; 0,25; 0,3%-ной концентрацией формалина при 45^oC. Контроль за степенью инактивации аллергенных свойств туберкулезного анатоксина проводили на аллергизированных вакциной БЦЖ морских свинках путем постановки внутрикожных проб с разведениями испытуемого и контрольного, неинативируемого препаратов. В результате опытов установлено, что 0,1; 0,2 и 0,25%-ная концентрация формалина обеспечивала конечную инактивацию аллергенных свойств препарата соответственно на 30-40, 55-65 и 75-80% по сравнению с аллергенной активностью неинактивированной культуральной жидкостью. Добавление к культуральной жидкости 0,3%-ного формалина обеспечило полную инактивацию аллергенных свойств препарата, что подтверждалось отсутствием кожных реакций у аллергизированных морских свинок при наличии реакций на препарат, не подвергнутый обработке формалином.Detoxification of the endotoxin of the culture fluid was carried out 0.1; 0.2; 0.25; 0.3% formalin concentration at 45 ^o C. Control over the degree of inactivation of the allergenic properties of tuberculous toxoid was carried out on guinea pigs allergized with BCG vaccine by placing intradermal samples with dilutions of the test and control, non-inactive drugs. As a result of experiments, it was found that 0.1; 0.2 and 0.25% formalin concentration provided the final inactivation of the allergenic properties of the drug by 30–40, 55–65, and 75–80%, respectively, in comparison with the allergenic activity of uninactivated culture fluid. The addition of 0.3% formalin to the culture fluid ensured the complete inactivation of the allergenic properties of the drug, which was confirmed by the absence of skin reactions in allergic guinea pigs in the presence of reactions to the drug not subjected to formalin treatment.

Таким образом, было установлено, что культуральная жидкость с исходной активностью в 100 тыс. Т.Е. в 1 мл полностью инактивируется 0,3%-ной концентрацией формалина. Thus, it was found that the culture fluid with an initial activity of 100 thousand T.E. in 1 ml is completely inactivated by a 0.3% concentration of formalin.

При определении влияния температуры на продолжительность инактивации аллергенных свойств препарата установлено, что температурный режим в 37^oC, как наиболее часто применяемый в практике биотехнологии получения анатоксинов, обеспечивал полную инактивацию аллергенных свойств культуральной жидкости 0,3%-ной концентрацией формалина на 14-й день. Повышение температурного режима на каждый градус ускоряло процесс инактивации на сутки, что подтверждалось последовательным редуцированием кожной чувствительности у аллергизированных морских свинок. Однако, начиная с 44^oC, ускорения процесса детоксикации не наблюдали. Для облегчения контроля за соблюдением температурного режима и ускорения процесса инактивации аллергенных свойств культуральной жидкости оптимальной температурой следует считать 45^oC.When determining the effect of temperature on the duration of inactivation of the allergenic properties of the drug, it was found that a temperature of 37 ^o C, as the most commonly used in the practice of biotechnology for the production of toxoids, ensured the complete inactivation of the allergenic properties of the culture fluid with a 0.3% formalin concentration on day 14 . An increase in the temperature regime by every degree accelerated the inactivation process for a day, which was confirmed by a consistent reduction in skin sensitivity in allergic guinea pigs. However, starting at 44 ^o C, acceleration of the detoxification process was not observed. To facilitate monitoring of compliance with the temperature regime and accelerate the process of inactivation of allergenic properties of the culture fluid, the optimum temperature should be considered 45 ^o C.

Таким образом, 0,3%-ная концентрация формалина обеспечивает полную инактивацию аллергенных свойств культуральной жидкости с исходной аллергенной активностью в 100 тыс. Т.Е. в 1 мл, а повышение температуры до 45^oC ускоряет процесс инактивации до 7 дней, против 14 дней при 37^oC, как ранее было определено в прототипе.Thus, a 0.3% concentration of formalin ensures complete inactivation of the allergenic properties of the culture fluid with an initial allergenic activity of 100 thousand T.E. in 1 ml, and an increase in temperature to 45 ^o C accelerates the inactivation process up to 7 days, against 14 days at 37 ^o C, as previously determined in the prototype.

После определения оптимального режима инактивации аллергенных и токсических свойств культуральной жидкости перед нами стоял вопрос о доведении требуемой активности конечного продукта в 200 тыс. Т.Е. в 1 мл. С учетом того, что культуральная жидкость после инактивации формалином утратила аллергенные свойства, поэтому первоначальные опытные исследования по концентрации конечного препарата провели с культуральной жидкостью, не подвергнутой обработке формалином. Решение этого вопроса было достигнуто путем сорбции туберкулопротеина культуральной жидкости на адъюванте и последующим отбрасыванием неактивной надосадочной жидкости. After determining the optimal mode of inactivation of the allergenic and toxic properties of the culture fluid, we were faced with the question of bringing the required activity of the final product to 200 thousand TE in 1 ml. Considering the fact that the culture fluid after inactivation with formalin lost its allergenic properties, therefore, initial experimental studies on the concentration of the final preparation were carried out with the culture fluid not subjected to formalin treatment. The solution to this problem was achieved by sorption of the tuberculoprotein of the culture fluid on an adjuvant and subsequent discarding of the inactive supernatant.

Полноту сорбции туберкулопротеина на геле гидроокиси алюминия проводили путем исследования на аллергизированных морских свинках аллергенной активности отбрасываемой надосадочной жидкости и исследовании белка по методу Къельдаля. При этом было установлено, что добавление 3%-ного геля гидроокиси алюминия к культуральной жидкости в количестве 20, 25, 27, 30% к общему объему обеспечивает последовательное "истощение" аллергенной активности надосадочной жидкости соответственно на 50-60, 70-80, 80-90, 90-95% и содержание белка в ней соответственно до 0,9, 0,5, 0,2, 0,1 мг. The complete sorption of tuberculoprotein on an aluminum hydroxide gel was carried out by examining the allergenic activity of the discarded supernatant on allergic guinea pigs and studying the protein by the Kjeldahl method. It was found that the addition of a 3% gel of aluminum hydroxide to the culture fluid in an amount of 20, 25, 27, 30% of the total volume provides a consistent "depletion" of allergenic activity of the supernatant by 50-60, 70-80, 80, respectively -90, 90-95% and the protein content in it, respectively, to 0.9, 0.5, 0.2, 0.1 mg.

Таким образом установлено, что добавление 3%-ного геля гидроокиси алюминия в количестве 30% к общему объему культуральной жидкости, содержащей100 тыс. Т.Е. в 1 мл, является оптимальным, т.к. обеспечивает практически полностью сорбцию туберкулопротеина. При этом активность остающейся культуральной жидкости после отбрасывания менее 50% надосадочной жидкости находилась в пределах 180 тыс. Т.Е. в 1 мл, что было ниже, чем в прототипе, а при отбрасывании более 60% надосадочной жидкости приводило к большей потере конечного продукта, т.к. в декантированной жидкости содержалось до 0,2 мг туберкулопротеина. Следует отметить, что полностью избежать потерь туберкулопротеина при декантировании неактивной надосадочной жидкости не удается, тем не менее при отбрасывании 50-55% потери туберкулопротеина были минимальными и составляли в среднем до 0,1 мг, а выход конечного концентрированного продукта с активностью 200 тыс. Т.Е. в 1 мл составлял 97-98%. Thus, it was found that the addition of a 3% gel of aluminum hydroxide in an amount of 30% to the total volume of the culture fluid containing 100 thousand T.E. in 1 ml is optimal, because provides almost completely sorption of tuberculoprotein. The activity of the remaining culture fluid after discarding less than 50% of the supernatant was within 180 thousand T.E. in 1 ml, which was lower than in the prototype, and when discarding more than 60% of the supernatant led to a greater loss of the final product, because up to 0.2 mg of tuberculoprotein was contained in the decanted liquid. It should be noted that it is not possible to completely avoid the loss of tuberculoprotein when decanting inactive supernatant, however, when discarding 50-55%, the loss of tuberculoprotein was minimal and amounted to an average of 0.1 mg, and the yield of the final concentrated product with an activity of 200 thousand T .E. in 1 ml was 97-98%.

Биохимическое исследование сорбированной культуральной жидкости показало, что в ней содержится 2,8±0,3 мг/мл белка, против 1,4 мг/мл до сорбции на адъюванте. A biochemical study of the sorbed culture fluid showed that it contained 2.8 ± 0.3 mg / ml protein, versus 1.4 mg / ml prior to sorption on the adjuvant.

С учетом указанной возможности повышения активности конечного продукта путем сорбции туберкулопротеина на геле гидроокиси алюминия провели изготовление туберкулезного анатоксина. Taking into account the indicated possibility of increasing the activity of the final product by sorption of tuberculoprotein on an aluminum hydroxide gel, a tuberculous toxoid was produced.

Пример. Для получения туберкулезного анатоксина использовали нативную культуральную жидкость микобактерий туберкулеза бовис с исходной аллергенной активностью 100 тыс. Т. Е. в 1 мл. Инактивацию токсических и аллергенных свойств культуральной жидкости провели 0,3%-ной концентрацией формалина в течение 7 дней при 45^oC. Полученный анатоксин подвергли сорбции путем добавления в него 3%-ного геля гидроокиси алюминия в количестве 30% к общему объему с последующим отбрасыванием 50% надосадочной жидкости. После осаждения сорбированного анатоксина белок в надосадочной жидкости не определялся, что указывало на высокое и прочное его связывание с носителем.Example. To obtain tuberculous toxoid, the native culture fluid of mycobacterium tuberculosis bovis was used with the initial allergenic activity of 100 thousand T.E. in 1 ml. Inactivation of the toxic and allergenic properties of the culture fluid was carried out with a 0.3% formalin concentration for 7 days at 45 ^o C. The resulting toxoid was sorbed by adding 3% aluminum hydroxide gel in an amount of 30% to the total volume, followed by discarding 50% of the supernatant. After precipitation of the adsorbed toxoid, the protein in the supernatant was not determined, which indicated its high and strong binding to the carrier.

Полученный целевой продукт - туберкулезный анатоксин при испытании аллергенной активности на аллергизированных морских свинках не вызывал у них ответных аллергических реакций. На внутрикожное введение гомологично аллергизированному крупному рогатому скоту сорбированного на гидроокиси алюминия туберкулезного анатоксина в дозе 0,2 мл ответных реакций также не отмечалось, при наличии кожных реакций на параллельное введение неинактивированного токсина культуральной жидкости в аналогичной дозе. The resulting target product, the tuberculous toxoid, when testing allergenic activity in allergic guinea pigs, did not cause allergic reactions in them. A 0.2 ml tuberculous toxoid sorbed on aluminum hydroxide at a dose of 0.2 ml was also not observed for intracutaneous administration of cattle in the presence of skin reactions to the parallel administration of uninactivated toxin of the culture fluid in a similar dose.

Двукратное и трехкратное подкожное введение туберкулезного анатоксина в дозе 5 мл молодняку крупного рогатого скота не индуцировало у них состояния повышенной чувствительности к туберкулину в течение 6 месяцев (срок наблюдения). Double and triple subcutaneous administration of tuberculosis toxoid in a dose of 5 ml to young cattle did not induce in them a state of hypersensitivity to tuberculin for 6 months (observation period).

Протективный эффект противотуберкулезной иммунизации т туберкулезным анатоксином на морских свинках и приведен в табл. 1 и 2. The protective effect of tuberculosis immunization with tuberculosis toxoid on guinea pigs is given in table. 1 and 2.

В опытах использовали туберкулезный анатоксин, полученный по схеме прототипа, и новый его вариант. Иммунизацию морских свинок туберкулезным анатоксином провели подкожно одно-и двукратно в дозе 1 и 2 мл соответственно. Спустя 30 дней после проведенной иммунизации лабораторных животных всех опытных и одной контрольной (интактной) групп заразили подкожно суспензией микобактерий туберкулеза штамм Валле в дозе 0,00001 мг/мл из расчета на одну морскую свинку. Наблюдение за зараженными животными провели в течение 60 дней, после чего всех оставшихся в живых морских свинок умертвили и провели детальный анализ патоморфологических изменений. In the experiments used tuberculous toxoid obtained according to the prototype scheme, and its new version. Immunization of guinea pigs with tuberculous toxoid was performed subcutaneously once and twice at a dose of 1 and 2 ml, respectively. 30 days after the immunization of laboratory animals, all experimental and one control (intact) groups were infected subcutaneously with a suspension of Mycobacterium tuberculosis strain Vallee at a dose of 0.00001 mg / ml per one guinea pig. Observation of infected animals was carried out for 60 days, after which all surviving guinea pigs were killed and a detailed analysis of pathomorphological changes was performed.

При убое животных из 1 и 2 опытных групп, единичные туберкулезные поражения, величиною с просяное зерно, находили у морских свинок, имевших местную воспалительную реакцию на прививку. Характер воспалительной реакции проявлялся через 2-3 дня после прививки в виде образования плотного, величиною с крупную горошину утолщения на месте введения препарата. When animals from 1 and 2 experimental groups were slaughtered, single tuberculous lesions the size of millet grain were found in guinea pigs that had a local inflammatory response to vaccination. The nature of the inflammatory reaction manifested itself 2-3 days after vaccination in the form of a dense, pea-sized thickening at the injection site.

Преимущество нового способа получения туберкулезного анатоксина заключается в том, что в отличие от прототипа подкожное введение данного варианта препарата не оказало отрицательного действия на организм иммунизированных животных, тем самым усилило на 14,1-18,2% протективную и иммуногенную его активность по сравнению с прототипом. Вместе с тем новый способ получения туберкулезного анатоксина является экономически выгодным, если учесть, что в прототипе для усиления иммуногенных свойств конечного продукта требуется добавление порошка туберкулина ППД, потери которого при биофабричном производстве составляют до 80%, что во много раз повышает себестоимость целевого продукта. The advantage of the new method for producing tuberculous toxoid is that, unlike the prototype, subcutaneous administration of this variant of the drug did not have an adverse effect on the body of immunized animals, thereby increasing its protective and immunogenic activity by 14.1-18.2% compared with the prototype . However, a new method for producing tuberculosis toxoid is cost-effective, given that in the prototype to enhance the immunogenic properties of the final product, the addition of PPD tuberculin powder is required, the loss of which in biofactory production is up to 80%, which many times increases the cost of the target product.

Используемая литература:
1. Труды ВИЭМ, 1984, N 61, с.41-44.Used Books:
1. Proceedings of VIEM, 1984, N 61, s.41-44.

2. Патент РФ N 2053791, A 61 K 39/04, 1996. 2. RF patent N 2053791, A 61 K 39/04, 1996.

Claims

A method for producing tuberculous toxoid, including detoxification of endotoxin of tuberculosis mycobacteria with formalin, sorption on aluminum hydroxide, sterilization, characterized in that native culture fluid of mycobacterium tuberculosis bovis is used as endotoxin with an initial allergenic activity of 100 thousand tuberculin units in 1 ml, which is detoxified , 25 - 0.3% concentration of formalin at 44 - 45 ^o C holding for 7 days and sorption on a 3 - 4% gel of aluminum hydroxide, added at the rate of 25 - 30% to about total volume and discarding 50 - 55% of the supernatant.