RU2226106C2 - Method for specific prophylaxis of radiation-caused body lesions and method for obtaining preparation for preventing radiation-caused body lesions - Google Patents
Method for specific prophylaxis of radiation-caused body lesions and method for obtaining preparation for preventing radiation-caused body lesions Download PDFInfo
- Publication number
- RU2226106C2 RU2226106C2 RU2001125786/15A RU2001125786A RU2226106C2 RU 2226106 C2 RU2226106 C2 RU 2226106C2 RU 2001125786/15 A RU2001125786/15 A RU 2001125786/15A RU 2001125786 A RU2001125786 A RU 2001125786A RU 2226106 C2 RU2226106 C2 RU 2226106C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- radiation
- radiotoxin
- days
- preparation
- toxoid
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности, к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики радиационных поражений организма.The invention relates to veterinary medicine and medicine, in particular, to the production and use of biological products intended for the specific prevention of radiation injuries of the body.
Известен способ специфической профилактики радиационных поражений организма и способ получения препарата для специфической профилактики радиационных поражений организма путем подкожного введения тканевого антигена от облученных животных за 15-30 сут до облучения (см. Патент РФ №2145877, МПК А 61 К 39/00, 41/00 за 2000 г.).A known method of specific prophylaxis of radiation damage to the body and a method for producing a preparation for specific prevention of radiation damage to the body by subcutaneous injection of tissue antigen from irradiated animals 15-30 days before irradiation (see RF Patent No. 2145877, IPC A 61 K 39/00, 41 / 00 for 2000).
Недостатком этого способа является реактогенность радиозащитного препарата, обусловленная наличием в составе тканевых антигенов-цитотоксинов, которые будучи введенными в организм за 5-10 дней до облучения оказывают обратный эффект, уменьшая процент выживаемости облученных животных. Другим существенным недостатком способа является использование в качестве технологического сырья дорогостоящего материала - органов и тканей лабораторных или сельскохозяйственных животных, что ведет к существенному увеличению себестоимости конечного продукта. Кроме того, тканевые препараты от животных, являясь слабыми антигенами, не могут обеспечить длительную и напряженную радиорезистентность организма, поскольку, будучи тимуснезависимыми, быстро элиминируются из организма, прекращая радиозащитный эффект.The disadvantage of this method is the reactogenicity of the radioprotective drug, due to the presence in the composition of tissue antigens-cytotoxins, which, when introduced into the body 5-10 days before irradiation, have the opposite effect, reducing the survival rate of the irradiated animals. Another significant disadvantage of the method is the use of expensive raw materials as organs and tissues of laboratory or farm animals, which leads to a significant increase in the cost of the final product. In addition, tissue preparations from animals, being weak antigens, cannot provide long-term and intense radioresistance of the body, because, being thymus-independent, they are rapidly eliminated from the body, stopping the radioprotective effect.
Задачей изобретения является снижение реактогенности препарата, повышение его противолучевой эффективности для специфической профилактики радиационных поражений организма, увеличение срока радиозащитного действия (пролонгирование), удешевление способа, снижение иммунизирующей дозы препарата и повышение производительности труда.The objective of the invention is to reduce the reactogenicity of the drug, increase its radiation resistance for specific prophylaxis of radiation damage to the body, increase the duration of radioprotective action (prolongation), reduce the cost of the method, reduce the immunizing dose of the drug and increase labor productivity.
Поставленная задача решается тем, что способ специфической профилактики радиационных поражений организма, предусматривающий введение в организм антигенсодержащего биологического препарата, в качестве антигенсодержащего биологического препарата используют бактериальный антигенный комплекс, состоящий из протективного антигена, анатоксина и радиотоксина -E.coli “ПЛ-6”, который вводят однократно подкожно в дозах 0,09-0,10 мг на 1 кг живой массы за 5-90 суток до облучения.The problem is solved in that the method of specific prophylaxis of radiation injuries of the body, involving the introduction of an antigen-containing biological product into the body, uses a bacterial antigenic complex consisting of a protective antigen, toxoid and radiotoxin -E.coli “PL-6” as an antigen-containing biological preparation, which administered once subcutaneously in doses of 0.09-0.10 mg per 1 kg of live weight 5-90 days before irradiation.
Препарат для профилактики радиационных поражений организма получают путем предварительного приготовления каждого в отдельности, сначала протективный антиген, анатоксин и радиотоксин, затем составляют бактериальный антигенный комплекс протективного антигена, анатоксина и радиотоксина при их массовом соотношении 90:5:5 соответственно, а содержание белка в комплексе доводят до 1,75-1,92 мг/мл.The drug for the prevention of radiation injuries of the body is obtained by preliminary preparation of each separately, first a protective antigen, toxoid and radiotoxin, then a bacterial antigenic complex of protective antigen, toxoid and radiotoxin is made up with their mass ratio of 90: 5: 5, respectively, and the protein content in the complex is adjusted up to 1.75-1.92 mg / ml.
Препарат для профилактики радиационных поражений организма получают от облученного энтеротоксигенного штамма E.coli, который выращивают на оптимальной для токсинообразования питательной среде (бульон Хоттингера или специальная среда по а.с. СССР №1682394, 1997 г.) с последующим переводом энтеротоксина в анатоксин; получения микробного радиотоксина облучением эшерихиозной суспензии на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с последующим инкубированием облученной культуры в течение 4 ч при 37°С; получения эшерихиозного протективного антигена путем добавления к микробной взвеси гексаметилентетрамина до конечной концентрации 10%, инкубирования смеси в течение 7 дней при 36-37°С с последующим выдерживанием смеси в течение 30-40 дней для полного снижения токсигенности микробной культуры.The drug for the prevention of radiation damage to the body is obtained from the irradiated enterotoxigenic E. coli strain, which is grown on a nutrient medium optimal for toxin formation (Hottinger broth or special medium according to the USSR AS No. 1682394, 1997), followed by transfer of enterotoxin to toxoid; obtaining a microbial radiotoxin by irradiating an Escherichia suspension in a gamma unit at a dose of 140-150 Gy, followed by incubation of the irradiated culture for 4 hours at 37 ° C; obtaining escherichiose protective antigen by adding hexamethylenetetramine to a microbial suspension to a final concentration of 10%, incubating the mixture for 7 days at 36-37 ° C, followed by maintaining the mixture for 30-40 days to completely reduce the toxigenicity of the microbial culture.
Технология получения препарата для профилактики радиационных поражений животных состоит из 4 этапов.The technology for producing the drug for the prevention of radiation injuries of animals consists of 4 stages.
На первом этапе получают эшерихиозный анатоксин (ЭАТ). Для его получения энтеропатогенный штамм E.coli (например, штамм “ПЛ-6”) засевают в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (рН 7,8) или (предпочтительнее) специальной средой, состоящей из 2,5-3,5 мас.% питательного агара, 0,5-1,5 мас.% пептона, 0,008-0,1 мас.%, 1,4 бензохинон гуанилгидразонтиосемикарбазона (см. а.с. СССР №1682394), выращивают 5-7 дней при температуре 37°С. Затем к культуре добавляют гексаметилентетрамин до конечной концентрации 10% или формалина до 0,4-0,5%-ной концентрации и термостатируют при 37°С в течение 10-12 дней. Полученный анатоксин осаждают 10%-ным стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем. После отстаивания анатоксина в течение 2-3 дней надосадочную жидкость декантируют, осадок в виде геля используют как анатоксин (AT).At the first stage, an Escherichia toxoid (EAT) is obtained. To obtain it, the enteropathogenic E. coli strain (for example, PL-6 strain) is seeded in two-liter flasks with Hottinger medium (pH 7.8) or (preferably) a special medium consisting of 2.5-3.5 wt.% nutrient agar, 0.5-1.5 wt.% peptone, 0.008-0.1 wt.%, 1.4 benzoquinone guanylhydrazontiosythicemicarbazone (see AS USSR No. 1682394), grown for 5-7 days at a temperature of 37 ° FROM. Then hexamethylenetetramine is added to the culture to a final concentration of 10% or formalin to 0.4-0.5% concentration and thermostatted at 37 ° C for 10-12 days. The resulting toxoid is precipitated with a 10% sterile solution of alum-potassium alum at the rate of 1% for the entire volume. After sedimentation of the toxoid for 2-3 days, the supernatant is decanted, the gel precipitate is used as an toxoid (AT).
На втором этапе технологического цикла получают микробный радиотоксин (РТ). Для получения РТ штамма Е/соli (“ПЛ-6”) высевают на полноценную твердую питательную среду (бактопептон 0,8%, хлорид натрия 0,5%, агар 0,5%) и выращивают в аэробных условиях в течение 48 ч. Затем биомассу смывают физиологическим раствором, центрифугируют при 8000 об/мин, повторяя эту процедуру трехкратно. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе в концентрации 1,2·1010 м.к./см3 и используют для выделения РТ. Для этой цели микробную суспензию с указанной концентрацией облучают на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с последующим термостатированием в течение 3,5-4,5 ч при 36-37°С. Затем проводят экстрагирование радиотоксина в 70% подкисленном (0,05% НС1) до рН 5,5 этаноле до полной экстракции. Экстрагирование проводят 3-кратно. Полученный экстракт упаривают на роторном испарителе при 20°С до исходного объема и нейтрализуют 0,1н. КОН до рН 6,5-7,0. Полученный раствор РТ разводят физиологическим раствором в 4 раза и используют в работе в качестве радиотоксина.At the second stage of the technological cycle, microbial radiotoxin (RT) is obtained. To obtain the RT strain E / coli (“PL-6”), seeded on a complete solid nutrient medium (bactopeptone 0.8%, sodium chloride 0.5%, agar 0.5%) and grown under aerobic conditions for 48 hours Then the biomass is washed off with physiological saline, centrifuged at 8000 rpm, repeating this procedure three times. The precipitate is resuspended in physiological saline at a concentration of 1.2 · 10 10 MK./cm 3 and used to isolate RT. For this purpose, a microbial suspension with the indicated concentration is irradiated on a gamma-ray apparatus at a dose of 140-150 Gy, followed by temperature control for 3.5-4.5 hours at 36-37 ° C. Then carry out the extraction of radiotoxin in 70% acidified (0.05% HC1) to a pH of 5.5 ethanol until complete extraction. Extraction is carried out 3 times. The resulting extract was evaporated on a rotary evaporator at 20 ° C to the original volume and neutralized with 0.1N. KOH to a pH of 6.5-7.0. The resulting RT solution is diluted with physiological saline 4 times and used in the work as a radiotoxin.
На третьей стадии получают эшерихозный протективный антиген. Для этой цели энтеротоксигенный штамм E.coli “ПЛ-6” выращивают 24 ч на МПА при 36-37°С, смывают 0,25%-ным стерильным раствором хлорида натрия, готовят микробную суспензию в концентрации 1,2·1010 м.к./см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Культуру проверяют на чистоту, морфологическую и серологическую типичность в соответствии с общепринятыми методами. К микробной взвеси, имеющей вышеуказанную концентрацию, добавляют сухой порошок гексаметилентитерамина до конечной концентрации 10% (или формалина до 0,4-0,5%), перемешивают на автоматической мешалке в течение 45-55 мин при 150-170 качаний/мин. Смесь выдерживают при 36-37°С в течение 6,5-7,5 дней до полного снижения токсичности эшерихиозной микробной взвеси (30-40 дней). Инактивированная микробная взвесь, разведенная 0,2 М раствором хлорида натрия до концентрации 30 млрд/см3, представляет собой эшерихиозный протективный антиген (ПА).At the third stage, an escherichic protective antigen is obtained. For this purpose, the enterotoxigenic E. coli strain “PL-6” is grown 24 hours on MPA at 36-37 ° C, washed off with a 0.25% sterile sodium chloride solution, and a microbial suspension is prepared at a concentration of 1.2 · 10 10 m. K. / cm 3 optical optical turbidity GISK them. Tarasevich. The culture is checked for purity, morphological and serological typicality in accordance with generally accepted methods. To the microbial suspension having the above concentration, dry powder of hexamethylenetiteramine is added to a final concentration of 10% (or formalin to 0.4-0.5%), mixed on an automatic mixer for 45-55 min at 150-170 swings / min. The mixture is kept at 36-37 ° C for 6.5-7.5 days until the toxicity of Escherichia microbial suspension is completely reduced (30-40 days). Inactivated microbial suspension, diluted with a 0.2 M sodium chloride solution to a concentration of 30 billion / cm 3 , is an Escherichia protective antigen (PA).
На четвертом этапе технологического цикла составляют трехвалентную композицию антигенов на основе эшерихиозного протективного антигена (ПА), анатоксина (AT) и радиотоксина (РТ). Для этой цели к 30 миллиардной суспензии протективного антигена (ПА) добавляют анатоксин (AT) и радитоксин (РТ) в соотношениях, мас.% 90:5:5 соответственно на 100 см3 радиопротективного препарата. К этой смеси добавляют 6% геля гидроокиси алюминия - 10 см3 на 100 см3 радиопротективного препарата. Проверяют чистоту, стерильность и безвредность препарата общепринятым методом (см. кн. Руководство по вакцинному и сывороточному делу/Под ред. П.Н.Бургасова. - М.: Медицина, 1978, 439 с.), определяют содержание белка биуретовым методом (см. кн. Экспериментальная иммунология./Под ред. П.Н. Холчева. - М.: Медицина, 1968, 665с.), доводят путем разведения в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) до оптимальной концентрации - 1,75-1,92 мг белка в 1 мл.At the fourth stage of the technological cycle, a trivalent composition of antigens based on Escherichia protective antigen (PA), toxoid (AT) and radiotoxin (RT) is composed. For this purpose, toxoid suspension of protective antigen (PA) is added to 30 billion toxoid (AT) and raditoxin (RT) in ratios, wt.% 90: 5: 5, respectively, per 100 cm 3 radioprotective drug. To this mixture is added 6% gel of aluminum hydroxide - 10 cm 3 per 100 cm 3 of the radioprotective drug. Check the purity, sterility and harmlessness of the drug by the generally accepted method (see the book. A guide to vaccine and serum case / Ed. By PN Burgasov. - M .: Medicine, 1978, 439 pp.), Determine the protein content by the biuret method (see The book of experimental immunology. / Under the editorship of PN Kholchev. - M .: Medicine, 1968, 665s.), adjusted by dilution in phosphate-buffered saline (pH 7.2-7.4) to the optimal concentration - 1.75-1.92 mg of protein in 1 ml.
Фасуют готовый протективный антиген (иммуноген-вакцину) в условиях бокса в стерильные стеклянные флаконы емкостью 100 см3, закрывают резиновыми пробками, заливают сургучом и этикетируют.Packed ready-made protective antigen (immunogen vaccine) in boxing conditions in sterile glass bottles with a capacity of 100 cm 3 , closed with rubber stoppers, filled with wax and labeled.
Контроль вакцины на стерильность, безвредность и иммунологическую активность осуществляют по общепринятой методике (Экспериментальная иммунология, 1968). Срок хранения иммуногена (протективного антигена) при 2-6°С до 1,5 года.The vaccine is monitored for sterility, safety and immunological activity according to generally accepted methods (Experimental Immunology, 1968). The shelf life of the immunogen (protective antigen) at 2-6 ° C up to 1.5 years.
Способ профилактики радиационных поражений организма и способ получения препарата для его осуществления иллюстрируются следующими примерами.A method for the prevention of radiation damage to the body and a method for producing a drug for its implementation are illustrated by the following examples.
Пример 1. Для получения эшерихиозного протективного антигена с высокой серологической активностью использовали энтеротоксигенные штаммы E.coli (К-88, ПЛ-6, А-09 и O-35), которые выращивали на МПА 24, 48, 72 ч при температуре 36-37 и 38°С, готовили суспензии в концентрациях 60, 100, 120, 130 и т.д. млрд м.к./см3, добавляли сухой порошок гексаметилентетрамина до конечной концентрации 5, 10, 15%, перемешивали на мешалке 20, 30, 60, 90 мин при 100, 130, 160, 170, 180 качаний/мин, выдерживали при 35, 36, 37, 38°С в течение 3, 5, 7, 10 дней при температуре 2, 3, 4, 5, 6°С в течение 10, 20, 30, 40, 50, 60 дней, затем инактивированную взвесь разводили 0,2М раствором хлорида натрия до концентрации 10, 20, 30, 40, 50 млрд м.к./см3. В полученных протективных антигенах определяли концентрацию микробных клеток в 1 см3, содержание аминного азота по Къелдалю и серологическую активность антигенов в реакции агглютинации (РА) с агглютинирующими сыворотками.Example 1. To obtain an Escherichia protective antigen with high serological activity, enterotoxigenic strains of E. coli (K-88, PL-6, A-09 and O-35) were used, which were grown on MPA 24, 48, 72 hours at a temperature of 36- 37 and 38 ° C, suspensions were prepared in concentrations of 60, 100, 120, 130, etc. billion cubic meters / cm 3 , dry powder of hexamethylenetetramine was added to a final concentration of 5, 10, 15%, stirred on a mixer for 20, 30, 60, 90 min at 100, 130, 160, 170, 180 swings / min, kept at 35, 36, 37, 38 ° С for 3, 5, 7, 10 days at a temperature of 2, 3, 4, 5, 6 ° С for 10, 20, 30, 40, 50, 60 days, then inactivated suspension diluted with 0.2 M sodium chloride solution to a concentration of 10, 20, 30, 40, 50 billion MK./cm 3 . In the obtained protective antigens, the concentration of microbial cells in 1 cm 3 , the Kjeldahl amine nitrogen content, and the serological activity of antigens in the agglutination (RA) reaction with agglutinating serums were determined.
Результаты опытов показали, что наибольший выход антигенного материала (0,32 мг/мл аминного азота) с наибольшей серологической активностью (титры антигена в РА - 1:128-1:256) получали при выращивании энтеротоксигенного штамма E.coli “ПЛ-6” на МПА в течение 24 ч при 37°С, который обеспечивал максимальный выход микробных клеток. Установлено, что максимальный выход протективного антигена (ПА) достигается при концентрации микробной суспензии 120 млрд м.к./см3, добавлении гексаметилентетрамина в концентрации 10%, перемешивании на мешалке при 160-170 качаний/мин, выдерживании 6-7 дней при температуре 36-37°С. Полная инактивация микробной взвеси наступает за 30-40 дней при концентрации микробов 25-35 млрд м.к./см3.The results of the experiments showed that the highest yield of antigenic material (0.32 mg / ml of amine nitrogen) with the highest serological activity (antigen titers in RA - 1: 128-1: 256) was obtained by growing the enterotoxigenic strain E. coli “PL-6” on MPA for 24 hours at 37 ° C, which provided the maximum yield of microbial cells. It was found that the maximum yield of protective antigen (PA) is achieved with a concentration of microbial suspension of 120 billion cubic meters / cm 3 , the addition of hexamethylenetetramine at a concentration of 10%, stirring on a mixer at 160-170 swings / min, keeping it for 6-7 days at a temperature 36-37 ° C. Complete inactivation of microbial suspension occurs in 30-40 days at a concentration of microbes of 25-35 billion cubic meters / cm 3 .
Пример 2. Для получения эшерихиозного анатоксина (AT) энтеротоксигенный штамм E.coli “ПЛ-6” засевали в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (рН 7,8) и специальной питательной средой состава, мас.%: гидролизат казеина - 20, сыворотка крови - 20, раствор Хенкса - 40 и МПБ - 20 (рН 7,8), выращивали в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 дней при температуре 35, 36, 37, 38, 39°С. Затем к культуре добавляли гексаметилентетрамин в концентрациях 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14% (или формалин до концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 0,6 и 0,7%), выдерживали в термостате при 35, 36, 37, 38°С в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней. Полученный анатоксин осаждали 5, 7, 9, 10, 12, 14%-ным стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 0,5, 0,7, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2% на весь объем. После отстаивания анатоксина в течение 1, 2, 3, 4, 5 дней надосадочную жидкость декантировали. Полученный осадок в виде геля использовали как анатоксин (AT).Example 2. To obtain the Escherichia toxoid (AT), the enterotoxigenic strain E. coli “PL-6” was seeded in two-liter flasks with Hottinger medium (pH 7.8) and a special nutrient medium composition, wt.%: Casein hydrolyzate - 20, blood serum - 20, Hanks solution - 40 and MPB - 20 (pH 7.8), were grown for 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 days at a temperature of 35, 36, 37, 38, 39 ° С . Then hexamethylenetetramine was added to the culture at concentrations of 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14% (or formalin to a concentration of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0, 5 0.6 and 0.7%), kept in a thermostat at 35, 36, 37, 38 ° C for 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 days. The obtained toxoid was precipitated with 5, 7, 9, 10, 12, 14% sterile solution of alum-potassium alum at the rate of 0.5, 0.7, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2% for the entire volume . After sedimentation of the toxoid for 1, 2, 3, 4, 5 days, the supernatant was decanted. The resulting gel pellet was used as an toxoid (AT).
Результаты опытов по определению серологической активности полученных образцов анатоксинов (AT) в РНГА с антитоксическими диагностикумами показали, что стабильную наибольшую серологическую активность проявлял анатоксин, полученный из штамма “ПЛ-6”, выращенного на специальной среде в течение 5-7 дней при температуре 37°С, при добавлении к культуре гексаметилентетрамина до конечной концентрации 10% и последующим термостатировании при 37°С 10-12 дней, осаждении 10%-ным стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем и отстаивании анатоксина в течение 3 дней с удалением супернатанта.The results of experiments to determine the serological activity of the obtained toxoid samples (AT) in RNGA with antitoxic diagnostics showed that the stable highest serological activity was shown by the toxoid obtained from the strain PL-6, grown on a special medium for 5-7 days at a temperature of 37 ° C, when hexamethylenetetramine is added to the culture to a final concentration of 10% and then thermostated at 37 ° C for 10-12 days, precipitated with a 10% sterile solution of potassium alum at the rate of 1% for the whole volume and Ivan toxoid for 3 days to remove the supernatant.
Пример 3. Для получения эшерихиозного радиотоксина (РТ) штамм E.coli “ПЛ-6” высевали на обычную (МПА) и полноценную питательную среду (бактопептон 0,8%, хлорид натрия 0,5%, агар 0,5%) и выращивали в аэробных условиях в течение 24, 48 и 72 ч. Затем бакмассу смывали физиологическим раствором, центрифугировали при 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 об/мин, повторяя эту процедуру 1, 2, 3, 4, 5 раз. Осадок ресуспендировали в физиологическом растворе из расчета 1·109, 2·109; 5·109; 1,0·1010; 1,1·1010; 1,2·1010; 1,3·1010 м.к./см3 и облучали на гамма-установке “Исследователь” (источник - кобальт-60) в дозах 50, 100, 150, 200, 250, 300 Гр при мощности 2,064 Кл. После облучения культуру инактивировали при 35, 36, 37, 38, 39°С в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 ч и проводили экстрагирование радиотоксинов с использованием 50, 60, 70, 80, 90%-ного неподкисленного и подкисленного (0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07% НС1) до рН 5,1, 5,2, 5,3, 5,5, 5,6 и 5,7 этанола, повторяя эту операцию 2, 3, 4, 5 раз. Полученные экстракты упаривали на роторном испарителе при 10, 15, 20, 25°С до исходного объема и нейтрализовали 0,05, 0,07, 0,1, 0,2, 0,3н. КОН до рН 6,4, 6,5, 6,7, 6,8, 7,0, 7,1 и 7,2. Полученный раствор РТ разводили физиологическим раствором в 4 раза и использовали в работе.Example 3. To obtain Escherichia radiotoxin (RT), the E. coli strain “PL-6” was plated on a normal (MPA) and complete culture medium (bactopeptone 0.8%, sodium chloride 0.5%, agar 0.5%) and they were grown under aerobic conditions for 24, 48, and 72 hours. Then, the bakmass was washed off with physiological saline and centrifuged at 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 rpm, repeating this procedure 1, 2, 3, 4, 5 times. The precipitate was resuspended in physiological saline at the rate of 1 · 10 9 , 2 · 10 9 ; 5 · 10 9 ; 1.0 · 10 10 ; 1.1 · 10 10 ; 1.2 · 10 10 ; 1.3 · 10 10 m.k./cm 3 and was irradiated with the “Explorer” gamma installation (source - cobalt-60) in doses of 50, 100, 150, 200, 250, 300 Gy at a power of 2.064 C. After irradiation, the culture was inactivated at 35, 36, 37, 38, 39 ° C for 1, 2, 3, 4, 5, 6 hours, and radiotoxins were extracted using 50, 60, 70, 80, 90% non-acidified and acidified (0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07% HC1) to a pH of 5.1, 5.2, 5.3, 5.5, 5.6 and 5.7 ethanol, repeating this operation 2, 3, 4, 5 times. The obtained extracts were evaporated on a rotary evaporator at 10, 15, 20, 25 ° C to the initial volume and neutralized 0.05, 0.07, 0.1, 0.2, 0.3 n. KOH to a pH of 6.4, 6.5, 6.7, 6.8, 7.0, 7.1 and 7.2. The resulting RT solution was diluted with physiological saline 4 times and used in the work.
Результаты опытов по оценке активности радиотоксинов показали, что наибольший выход радиотоксина (из 100 см биомассы 20-30 мг конечного продукта) с высокой серологической активностью (титр радиотоксина в РНГА - 1:128-1:256) достигается при выращивании культуры на специальной среде в течение 48 ч, 3-кратном центрифугировании при 8000 об/мин, ресуспендировании до концентрации 1,2-1010 м.к./см3, облучении на гамма-установке в дозе 140-150 Гр, последующем инкубировании при 37°С в течение 4 ч, 3-кратном экстрагировании РТ из культуры в 70% подкисленном (0,05% НС1) до рН 5,5 этаноле, последующем упаривании экстракта на роторном испарителе при 20°С до исходного объема и нейтрализации 0,1н. КОН до рН 6,7-7,0.The results of experiments evaluating the activity of radiotoxins showed that the highest yield of radiotoxin (from 100 cm of biomass 20-30 mg of the final product) with high serological activity (radiotoxin titer in RNGA - 1: 128-1: 256) is achieved when the culture is grown on a special medium in for 48 hours, 3-fold centrifugation at 8000 rpm, resuspension to a concentration of 1.2-10 10 m.k./cm 3 , irradiation on a gamma installation at a dose of 140-150 Gy, followed by incubation at 37 ° C in for 4 hours, 3-fold extraction of RT from the culture in 70% acidified (0.05% HCl) to a pH of 5.5 Tanoli, subsequent evaporation of the extract on a rotary evaporator at 20 ° C until the starting volume and neutralizing 0.1N. KOH to a pH of 6.7-7.0.
Пример 4. Опыты по изучению радиозащитных свойств полученных антигенов проводили на 260 белых мышах живой массой 18-20 г, разделенных на 8 групп по 40 мышей в первых 6 группах и по 10 в двух последних. Животным первых 7 групп (опытные) за 5, 10, 15, 20, 25, 30 дней до тотального облучения (8,5 Гр) подкожно вводили предполагаемые радиозащитные препараты в дозе 0,1 см3 (2 млрд. м.к.), что составляет 0,64 мг белка или 0,112 мг аминного азота. Животные 8-й группы иммунизации не подвергались (контроль). Через вышеуказанные сроки животных всех групп подвергали гамма-облучению в дозах, вызывающих абсолютный летальный эффект - гибель всех животных (ЛД100=9,0 Гр). Оценку радиозащитной активности испытанных антигенов проводили по критерию выживаемости в вышеуказанные срок после иммунизации и облучения животных.Example 4. Experiments on the study of the radioprotective properties of the obtained antigens were carried out on 260 white mice with a live weight of 18-20 g, divided into 8 groups of 40 mice in the first 6 groups and 10 in the last two. The animals of the first 7 groups (experimental) 5, 10, 15, 20, 25, 30 days before the total exposure (8.5 Gy) were injected subcutaneously with the putative radioprotective drugs at a dose of 0.1 cm 3 (2 billion m.c.) , which is 0.64 mg of protein or 0.112 mg of amine nitrogen. Animals of the 8th group were not immunized (control). After the above periods, the animals of all groups were subjected to gamma irradiation in doses causing an absolute lethal effect - the death of all animals (LD 100 = 9.0 Gy). Evaluation of the radioprotective activity of the tested antigens was carried out according to the criterion of survival in the above period after immunization and exposure of animals.
Результаты определения радиозащитной активности антигенов в отдельности и в сочетании представлены в табл. 1.The results of determining the radioprotective activity of antigens individually and in combination are presented in table. 1.
Из материалов табл. 1 видно, что испытанные антигены в отдельности не обладают достаточно высокой радиозащитной активностью. Сочетанное применение 2 антигенов (диантигены) увеличивают процент защиты на 10-15%, а сочетание всех трех антигенов обеспечивает максимальную защиту (80-90%) животных от радиационной гибели.
Пример 5. В опытах на белых крысах устанавливали оптимальную дозу антигенного комплекса, используя для этой цели 150 животных живой массой 150-180 г, разделенных на 8 групп. Животных первых 6 групп подкожно однократно иммунизировали тривакциной (ПА+АТ+РТ), 7-ой группы - известной вакциной (контроль вакцины), 8-ой - не иммунизировали (контроль облучения). Оценку радиозащитной активности препаратов проводили согласно примеру 4.Example 5. In experiments on white rats, the optimal dose of the antigenic complex was established using 150 animals with a live weight of 150-180 g divided into 8 groups for this purpose. The animals of the first 6 groups were subcutaneously immunized once with a trivacine (PA + AT + PT), the 7th group - with the known vaccine (vaccine control), the 8th - were not immunized (radiation control). Evaluation of the radioprotective activity of the preparations was carried out according to example 4.
Результаты опытов представлены в табл. 2.The results of the experiments are presented in table. 2.
Из материалов табл. 2 видно, что оптимальной дозой антигенов является 0,09-0,10 мг/мл, которая обеспечивает выживаемость 80-90% летально облученных животных. В отличие от предлагаемого, известный препарат обладает высокой реактогенностью - иммунизация за 5 дней до облучения увеличивает процент гибели животных, проявляя защитный эффект только при иммунизации за 15-30 суток.
Пример 6. Опыты по изучению оптимального соотношения компонентов-антигенов тривакцины проводили на 120 белых мышах живой массой 18-20 г, разделенных на 6 групп по 20 мышей в каждой, которым за 5 и 15 дней до летального облучения (8,5 Гр) вводили предлагаемый радиозащитный препарат в оптимальной иммунизирующей дозе (0,95 мг/кг) при различных объемных соотношениях компонентов тривакцины. Оценку эффективности препаратов проводили согласно примеру 4. Результаты опытов представлены в табл. 3.Example 6. Experiments to study the optimal ratio of the components of the antiviral vaccine were carried out on 120 white mice with a live weight of 18-20 g, divided into 6 groups of 20 mice each, which were introduced 5 and 15 days before lethal exposure (8.5 Gy) the proposed radioprotective drug in the optimal immunizing dose (0.95 mg / kg) at various volume ratios of the components of the tri-vaccine. Evaluation of the effectiveness of the preparations was carried out according to example 4. The results of the experiments are presented in table. 3.
Из материалов таблицы видно, что оптимальными соотношениями антигенов в предлагаемом защитном препарате является 90:5:5 мас.%, которое обеспечивает максимальную защиту животных от радиационной гибели. Любые изменения этого соотношения как в сторону увеличения, так и снижения его ведут к снижению защитного эффекта препарата.
Пример 7. Сроки наступления радиорезистентности и ее продолжительность проверены на 130 белых крысах, иммунизированных за 5, 10, 20, 30, 60 и 90 дней до летального облучения (9,0 Гр). Для сравнения параллельно проводили опыты с использованием известного способа. Результаты сравнительных опытов представлены в табл. 4.
Из материалов табл. 4 видно, что применение предлагаемого препарата создает радиорезистентность за 5 дней до летального облучения животных, обеспечивая 80%-ную защиту от радиационной гибели, продолжительность радиорезистентности животных сохраняется длительное время (90 суток, срок наблюдения). В отличие от предлагаемого, известный способ обеспечивает защиту от ионизирующего излучения только за 15-20 и более суток до облучения, причем продолжительность радиорезистентности составляет не более 60 суток, затем она резко падает.From the materials of the table. Figure 4 shows that the use of the proposed drug creates a radioresistance 5 days before the lethal exposure of animals, providing 80% protection against radiation death, the duration of the radioresistance of animals remains for a long time (90 days, observation period). In contrast to the proposed, the known method provides protection against ionizing radiation only 15-20 or more days before irradiation, and the duration of radioresistance is not more than 60 days, then it drops sharply.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает раннюю (за 5 сут. до облучения) и продолжительную (до 3 месяцев) радиозащиту организма, обеспечивая выживаемость 80-90% животных. Препарат, в отличие от известного, не обладает реактогенностью, значительно более экономичен и более доступен.Thus, the proposed method provides early (5 days. Before irradiation) and long (up to 3 months) radiation protection of the body, ensuring the survival of 80-90% of the animals. The drug, unlike the known one, does not have reactogenicity, is significantly more economical and more accessible.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001125786/15A RU2226106C2 (en) | 2001-09-20 | 2001-09-20 | Method for specific prophylaxis of radiation-caused body lesions and method for obtaining preparation for preventing radiation-caused body lesions |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001125786/15A RU2226106C2 (en) | 2001-09-20 | 2001-09-20 | Method for specific prophylaxis of radiation-caused body lesions and method for obtaining preparation for preventing radiation-caused body lesions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001125786A RU2001125786A (en) | 2003-06-27 |
| RU2226106C2 true RU2226106C2 (en) | 2004-03-27 |
Family
ID=32390073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001125786/15A RU2226106C2 (en) | 2001-09-20 | 2001-09-20 | Method for specific prophylaxis of radiation-caused body lesions and method for obtaining preparation for preventing radiation-caused body lesions |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2226106C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2682712C1 (en) * | 2018-06-25 | 2019-03-21 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Method of treatment of radiation damages of body |
| RU2697828C1 (en) * | 2019-06-03 | 2019-08-21 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Method of producing a preparation for preventing and treating radiation damage of animals and a method for preventing and treating radiation damage of animals |
-
2001
- 2001-09-20 RU RU2001125786/15A patent/RU2226106C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2682712C1 (en) * | 2018-06-25 | 2019-03-21 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Method of treatment of radiation damages of body |
| RU2697828C1 (en) * | 2019-06-03 | 2019-08-21 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Method of producing a preparation for preventing and treating radiation damage of animals and a method for preventing and treating radiation damage of animals |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112870341B (en) | Goat infectious pleuropneumonia subunit vaccine and preparation method and application thereof | |
| KR20220133283A (en) | anti-tumor composition | |
| Prager et al. | Immunization with chemically modified lymphoma cells | |
| KR100221452B1 (en) | Preparation for vaccine composition against enteric infection | |
| JP2016516721A (en) | Toxoids, compositions and related methods | |
| RU2226106C2 (en) | Method for specific prophylaxis of radiation-caused body lesions and method for obtaining preparation for preventing radiation-caused body lesions | |
| CN108794628A (en) | A kind of Yolk antibody preparation method and application of anti-helicobacter pylori | |
| RU2378011C1 (en) | Method for prophylactics of cattle brucellosis | |
| RU2764600C1 (en) | Vaccine against escherichiosis of calves and piglets | |
| RU2524612C2 (en) | Method of treating radiation, chemical and/or biological damage to organism and method of obtaining globulins for treatment of radiation, chemical and/or biological damage to organism | |
| RU2813771C1 (en) | Method of preventing escherichiosis in calves | |
| EP1108738B1 (en) | Immunostimulating carrier for vaccines | |
| RU2814593C1 (en) | Method of preventing escherichiosis in calves | |
| RU2806810C1 (en) | Hydroxide aluminum oil vaccine against escherichiosis in calves and piglets | |
| RU2753410C2 (en) | Method for obtaining toxoid vaccine against escherichiosis of animals | |
| RU2650628C1 (en) | Method of obtaining vaccine associated with colibacillosis, streptococcosis and enterococcal infection of calves and piglets | |
| RU2396978C1 (en) | Method for prevention of cattle leukosis development | |
| RU2813752C1 (en) | Method of producing aluminum hydroxide oil vaccine against escherichiosis in calves and piglets | |
| RU2065749C1 (en) | Method of prophylaxis of brucellosis in cattle | |
| RU2766549C1 (en) | Method for preventing escherichiosis in piglets | |
| CN103721254A (en) | Method for preparing swine A-type clostridium perfringens aluminum hydroxide inactivated vaccine | |
| RU2766249C1 (en) | Method for preventing escherichiosis in calves | |
| RU2316344C1 (en) | Associated vaccine against colibacteriosis, salmonellosis, streptococcosis and enterococcal infection in nutrias | |
| Sleptsov et al. | Structure and biological properties of artificial vaccinating compounds for treating brucellosis in agricultural animals | |
| RU2021818C1 (en) | Associated vaccine against hay fever and campylobacteriosis of cattle |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050921 |