RU2139091C1

RU2139091C1 - Method of staphylococcus anatoxin-vaccine preparing

Info

Publication number: RU2139091C1
Application number: RU99100824A
Authority: RU
Inventors: А.А. Евглевский
Original assignee: Закрытое акционерное общество "АгроБизнесЦентр"
Priority date: 1999-01-26
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 1999-10-10

Abstract

FIELD: microbiology, vaccines. SUBSTANCE: invention relates to preparing the preparation used for prophylaxis and treatment of staphylococcus infections and showing an immunostimulating effect. Staphylococcus cells are cultured for 10 days followed by destruction of cells in an autoclave under 1.0 atm for 30 min. Detoxication is carried out by addition of formalin to staphylococcus suspension for two stages. Firstly, formalin is added up to its concentration 0.3-0.4% in medium and incubated at 37-40 C for 7-10 days and then - up to the final concentration 0.5-0.6% and incubation at 44-46 C for 5-8 days. Destruction of staphylococcus cells can be carried out by gamma-irradiation using ⁶⁰Co at the dose 1.0-2.0 x 10⁶ R. Then the end product is sorbed on aluminium hydroxide and sterilized in an autoclave. EFFECT: increased storage period and stabilization of the end product. 2 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано для профилактики и лечения маститов, ускорения заживления ран, иммуностимуляции и неспецифической профилактики ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота. The invention relates to agriculture, in particular to veterinary medicine, and can be used for the prevention and treatment of mastitis, accelerate wound healing, immunostimulation and nonspecific prevention of rhinotracheitis and parainfluenza-3 cattle.

Известен способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины путем выращивания с последующей деструкцией стафилококков, отделением культуральной жидкости, детоксикацией ее формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием (Патент РФ N 1706631, МКИ⁶ A 61 K 39/085. Способ получения анатоксин-вакцины против стафилококкоза птиц. Бюл. N 3, 1992). В известном способе деструкцию проводят нагреванием микробных клеток до 85-100^oC в течение 1,0-1,5 часов, к культуральной жидкости добавляют формалин одномоментно из расчета 0,6-0,8% формалина в конечной концентрации при экспозиции 45-55^oC в течение 7-10 дней.A known method for producing a staphylococcal toxoid vaccine by growing with subsequent destruction of staphylococci, separating the culture fluid, detoxifying it with formalin, sorption of the target product on aluminum hydroxide and its sterilization by autoclaving (RF Patent N 1706631, MKI ⁶ A 61 K 39/085. Method for producing toxoid - vaccines against staphylococcosis of birds. Bull. N 3, 1992). In the known method, the destruction is carried out by heating microbial cells to 85-100 ^o C for 1.0-1.5 hours, formalin is added to the culture fluid simultaneously at the rate of 0.6-0.8% formalin at a final concentration at an exposure of 45-55 ^o C for 7-10 days.

Недостатком известного способа является получение анатоксин-вакцины плохого качества (содержание в ней токсина возрастает через короткое время хранения). The disadvantage of this method is to obtain a toxoid vaccine of poor quality (the toxin content in it increases after a short storage time).

Целью предлагаемого изобретения является увеличение сроков хранения целевого продукта. The aim of the invention is to increase the shelf life of the target product.

Поставленная цель достигается в способе получения стафилококковой анатоксин-вакцины путем выращивания стафилококков с последующей их деструкцией, детоксикацией смеси формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием тем, что формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубацией при температуре 37-40^oC в течение 7-10 суток, а затем - до конечной концентрации формалина в смеси 0,5-0,6% с последующей инкубацией при температуре 44-46^oC в течение 5-8 суток.The goal is achieved in a method for producing a staphylococcal toxoid vaccine by growing staphylococci with their subsequent destruction, detoxification of the mixture with formalin, sorption of the target product on aluminum hydroxide and its sterilization by autoclaving so that formalin is added at the beginning to its concentration in the mixture of 0.3-0, 4% and incubation at a temperature of 37-40 ^o C for 7-10 days, and then to a final concentration of formalin in a mixture of 0.5-0.6%, followed by incubation at a temperature of 44-46 ^o C for 5-8 days.

Поставленная цель достигается также тем, что деструкцию стафилококков проводят гамма-облучением Co⁶⁰ дозой 1,0-2,0•10⁶R.This goal is also achieved by the fact that the destruction of staphylococci is carried out by gamma irradiation of Co ⁶⁰ with a dose of 1.0-2.0 • 10 ⁶ R.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, что позволяет сделать вывод о соответствии предложения условию патентоспособности - "новизна". In the patent and scientific and technical literature unknown technical solutions similar to the claimed, which allows us to conclude that the proposal meets the condition of patentability - "novelty."

Только сочетание заявленных режимов в определенной последовательности позволяет достичь эффекта, указанного в цели изобретения, т.е. заявленный способ удовлетворяет условию патентоспособности - "изобретательский уровень", в частности, проведение добавления формалина в два этапа при определенных соотношениях компонентов позволило получить неочевидный положительный эффект. Нами впервые установлено, что в течение первого этапа добавления формалина при низких его концентрациях происходит взаимодействие свободных аминогрупп, и в первую очередь лизина. При этом образуются метилоламинные группы. На втором этапе в реакции участвуют активные радикалы циклических аминогрупп, содержащие фенольные, гуанидиновые и индольные группы - это тирозин, аргинин, гистидин и триптофан. Эти группы прочно соединяются за счет активных атомов водорода с метилоламинными группами остатков лизина через метиленовые мостики. При этом блокирование формалином активных радикалов токсина приводит к его более качественной детоксикации (обезвреживанию) и образованию полимеров. Следовательно, добавление формалина в два этапа приводит к двум процессам: собственно к детоксикации токсина и стабилизации образовавшегося полимера, которая достигается внесением новой порции формалина и повышением температуры реакционной смеси. Обратное превращение анатоксина в токсин в условиях предлагаемого способа исключено. Only a combination of the claimed modes in a certain sequence allows to achieve the effect indicated in the purpose of the invention, i.e. the claimed method meets the condition of patentability - "inventive step", in particular, the addition of formalin in two stages with certain ratios of components allowed to obtain an unobvious positive effect. We found for the first time that during the first stage of formalin addition at low concentrations, free amino groups react, primarily lysine. In this case, methylolamine groups are formed. At the second stage, the reaction involves active radicals of cyclic amino groups containing phenolic, guanidine and indole groups - these are tyrosine, arginine, histidine and tryptophan. These groups are strongly connected due to the active hydrogen atoms with the methylolamine groups of lysine residues through methylene bridges. Moreover, formalin blocking of the toxin active radicals leads to its better detoxification (neutralization) and the formation of polymers. Therefore, the addition of formalin in two stages leads to two processes: the detoxification of the toxin itself and stabilization of the polymer formed, which is achieved by introducing a new portion of formalin and increasing the temperature of the reaction mixture. The reverse conversion of toxoid to toxin in the conditions of the proposed method is excluded.

Способ используют для получения стафилококковой анатоксин-вакцины, используемой для профилактики стафилококкоза птиц, плотоядных, а также для профилактики и лечения маститов, пневмоний, ускорения заживления ран, иммуностимуляции и неспецифической профилактики ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота, поэтому заявленное предложение соответствует условию патентоспособности - "промышленная применимость". The method is used to obtain staphylococcal toxoid vaccine used for the prevention of staphylococcosis of birds, carnivores, as well as for the prevention and treatment of mastitis, pneumonia, accelerate wound healing, immunostimulation and non-specific prophylaxis of rhinotracheitis and parainfluenza-3 cattle, therefore, the claimed proposal meets the patentability condition - "industrial applicability".

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах. The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Стафилококки выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 10 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 30 минут. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,3% и инкубацией при температуре 37^oC в течение 7 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при температуре 44^oC в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.Example 1. Staphylococci are grown, as in the known method, on a nutrient medium for 10 days. Then autoclaving is carried out at 1.0 atm for 30 minutes. Detoxification is carried out by adding formalin to staphylococcus suspension in two stages: until it is concentrated in a mixture of 0.3% and incubated at 37 ^° C for 7 days, followed by formalin to its final concentration of 0.5% and incubation of the mixture at a temperature of 44 ^o C for 5 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide in a final concentration of 1 mg / ml is added to a suspension of staphylococci, as in the known method, and packaged in vials, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps, autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Пример 2. Стафилококки выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 15 дней. Затем проводят гамма-облучение Co⁶⁰ силой 1,0•10⁶R. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,4% и инкубацией при температуре 40^oC в течение 10 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при температуре 46^oC в течение 8 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.Example 2. Staphylococci are grown, as in the known method, on a nutrient medium for 15 days. Then, gamma irradiation of Co ^{60 is} carried out with a power of 1.0 • 10 ⁶ R. Detoxification is carried out by adding formalin to the suspension of staphylococci in two stages: until it is concentrated in a mixture of 0.4% and incubated at a temperature of 40 ^o C for 10 days, followed by addition formalin to its final concentration of 0.6% and incubation of the mixture at a temperature of 46 ^o C for 8 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide in a final concentration of 1 mg / ml is added to a suspension of staphylococci, as in the known method, and packaged in vials, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps, autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Пример 3. Стафилококки выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 10 дней. Затем проводят гамма-облучение Co⁶⁰ силой 2,0•10⁶R. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,3% и инкубацией при температуре 37^oC в течение 7 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при температуре 44^oC в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.Example 3. Staphylococci are grown, as in the known method, on a nutrient medium for 10 days. Then, Co ⁶⁰ gamma irradiation is performed with a power of 2.0 • 10 ⁶ R. Detoxification is carried out by adding formalin to the suspension of staphylococci in two stages: until it is concentrated in a mixture of 0.3% and incubated at 37 ^° C for 7 days, followed by addition formalin to its final concentration of 0.5% and incubation of the mixture at a temperature of 44 ^o C for 5 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide in a final concentration of 1 mg / ml is added to a suspension of staphylococci, as in the known method, and packaged in vials, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps, autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Пример 4. Стафилококки выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 15 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 20 минут. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,4% и инкубацией при температуре 40^oC в течение 10 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при температуре 46^oC в течение 8 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.Example 4. Staphylococci are grown, as in the known method on a nutrient medium for 15 days. Then autoclaving is carried out at 1.0 atm for 20 minutes. Detoxification is carried out by adding formalin to the suspension of staphylococci in two stages: until it is concentrated in a mixture of 0.4% and incubated at a temperature of 40 ^o C for 10 days, followed by the addition of formalin to its final concentration of 0.6% and incubation of the mixture at a temperature of 46 ^o C for 8 days. At the end of the detoxification process, aluminum hydroxide in a final concentration of 1 mg / ml is added to a suspension of staphylococci, as in the known method, and packaged in vials, closed with rubber stoppers and wrapped in aluminum caps, autoclaved at 0.6 atm for 20 minutes.

Предлагаемый способ позволяет увеличить сроки хранения целевого продукта с 6 месяцев до 3-5 лет, т.е. в 5-10 раз. The proposed method allows to increase the shelf life of the target product from 6 months to 3-5 years, i.e. 5-10 times.

Claims

1. A method of obtaining a staphylococcal toxoid vaccine by growing staphylococci with their subsequent destruction, detoxification of the mixture with formalin, sorption of the target product on aluminum hydroxide and its sterilization by autoclaving, characterized in that formalin is added at the beginning to its concentration in the mixture of 0.3 - 0, 4% with incubation at a temperature of 37 - 40 ^o C for 7 to 10 days, and then to a final concentration of formalin in a mixture of 0.5 - 0.6%, followed by incubation at a temperature of 44 - 46 ^o C for 5 - 8 day

2. The method according to claim 1, characterized in that the destruction of staphylococci is carried out by gamma irradiation of Co ⁶⁰ with a dose of 1.0 - 2.0 • 10 ⁶ R.