RU2080121C1

RU2080121C1 - Method of vaccine producing for cholera prophylaxis

Info

Publication number: RU2080121C1
Application number: SU884501686A
Authority: RU
Inventors: П.И. Анисимов; А.К. Адамов; М.Н. Джапаридзе; А.В. Наумов; Г.П. Никитина
Original assignee: Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1997-05-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves Ogava O-antigen preparing by submerged culturing vibrios in reactor, rendering harmless, microbe bodies separation, isolation and purification of O-antigen from cultural fluid followed by dialysis, lyophilic drying, addition of oral vaccine to components, tabletting and coating with acid-resistant envelope. Ogava O-antigen is prepared from cultural fluid kept at 10-12 C for 20-30 days with 0.2-0.3% formalin by precipitation with ammonium sulfate (at 0.5 saturation) at pH = 7.0 $$$ 0.3 and fractionation between 0.3-0.4 saturation at pH = 6.8 $$$ 0.1, at protein concentration 1.0 $$$ 0.2% followed by lyophilization and concentration the preparation with the prepared Ogava antigen. EFFECT: improved method of vaccine preparing. 2 cl, 2 dwg, 3 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, точнее к специфической профилактике инфекционных болезней, а именно холеры, методом пероральной вакцинации, и является усовершенствованием известного способа. The invention relates to medicine, more specifically to the specific prevention of infectious diseases, namely cholera, by the method of oral vaccination, and is an improvement of the known method.

Описан способ выделения обезвреженного формальдегидом анатоксина и соматического О-антигена из культуральной жидкости штамма 569 B холерного вибриона серовара Инаба путем осаждения сульфатом аммония между 0,2-0,8 насыщения, что обеспечивает возможность включения в вакцинный препарат двух компонентов, ответственных за формирование антитоксического и антибактериального иммунитета к вибрионам серовара Инаба, повышению содержания О-антигена Инаба в рецептуре и увеличению выхода целевого продукта. A method is described for the isolation of formaldehyde-neutralized toxoid and somatic O-antigen from the culture fluid of strain 569 B of the cholera vibrio of Serovar Inaba by precipitation of ammonium sulfate between 0.2-0.8 saturation, which makes it possible to include in the vaccine preparation two components responsible for the formation of antitoxic and antibacterial immunity to Vibrio serovar Inaba, increasing the content of Inaba O-antigen in the formulation and increasing the yield of the target product.

Вакцину изготавливают в виде таблеток с ацидорезистентным покрытием, что обеспечивает возможность орального применения препарата. The vaccine is made in the form of tablets with an acid-resistant coating, which provides the possibility of oral administration of the drug.

Недостатком известного способа является то, что полученная вакцина не может обеспечить защиту людей от заражения вибрионами двух сероваров Инаба и Огава, которые существуют в природе, так как в ней отсутствует О-антиген серовара Огава. Полноценная холерная вакцина по рекомендациям ВОЗ, сделанных на основании результатов неоднократных полевых испытаний (Бангладеш, Филиппины), должна включать антигены обоих сероваров, так как не подтверждена возможность создания перекрестного иммунитета между двумя сероварами. The disadvantage of this method is that the obtained vaccine cannot protect people from infection by vibrios of two serovars Inaba and Ogawa, which exist in nature, since it does not have O-antigen of serovar Ogawa. A complete cholera vaccine according to WHO recommendations based on the results of repeated field trials (Bangladesh, Philippines) should include antigens of both serovars, since the possibility of creating cross-immunity between two serovars has not been confirmed.

Целью изобретения является повышение специфической активности и эффективности защиты от заражения штаммами Огавы оральной холерной вакцины включением в нее дополнительного компонента О-антигена серовара Огава. The aim of the invention is to increase the specific activity and the effectiveness of protection against strains of the Ogawa oral cholera vaccine by the inclusion of an additional component of O-antigen of Serovar Ogawa.

Цель достигается тем, что к специфическим компонентам холерной химической вакцины (анатоксину и О-антигену Инаба), полученной из штампа 569B Инаба, добавляют О-антиген серовара Огава, что обеспечивает создание иммунитета также к штаммам серовара Огава. The goal is achieved in that the specific components of a chemical cholera vaccine (toxoid and Inaba O-antigen), obtained from Inaba stamp 569B, are added to the Ogawa serovar O-antigen, which also provides immunity to Ogawa serovar strains.

Получение дополнительного компонента вакцины заключается в выделении О-антигена серовара Огава, которое проводят из культуральной жидкости, выдержанной в течение 20-30 дней при 10-12^oC в присутствии формалина (0,2-0,3%), что обеспечивает нативность структуры антигена в антисептических условиях и большой его выход из-за секреции антигена штаммами в среду и низкую его токсичность.Obtaining an additional component of the vaccine consists in the isolation of O-antigens of Serovar Ogawa, which is carried out from the culture fluid, aged for 20-30 days at 10-12 ^o C in the presence of formalin (0.2-0.3%), which ensures the native structure antigen under antiseptic conditions and its large yield due to the secretion of antigen by strains into the medium and its low toxicity.

Очистку О-антигена Огава от балластных белков проводят легкодоступным, щадящим методом: осаждением сернокислым аммонием при 0,5 насыщения с последующим фракционированием между 0,3-0,4 насыщения, что обеспечивает сохранение структуры антигена и выход гомогенного препарата, содержащего 90% О-антигена Огава (табл. 1). Этот простой метод возможно было применить после обнаружения, что О-антиген Огава по молекулярной массе более чем в 10 раз отличается от всех других компонентов культуральной жидкости (фиг.1, где показана гель-фильтрация через сефарозу 4B культуральной жидкости штамма холерного вибриона серовара Огава. По оси ординат: содержание О-антигена, суммарного белка (сплошная кривая), протеиназы (Пр, в ПЕ/мл), нейраминидазы (НА, в НЕ/мл), фосфолипазы (Фф; в ЛЕ/мл); по оси абсцисс номер проб (фракций) и величина молекулярной массы). Ogawa O-antigen is purified from ballast proteins by a readily available, gentle method: precipitation with ammonium sulfate at 0.5 saturation followed by fractionation between 0.3-0.4 saturation, which ensures the preservation of the antigen structure and the yield of a homogeneous preparation containing 90% O- Ogawa antigen (Table 1). This simple method could be applied after the discovery that the Ogawa O antigen in molecular weight is more than 10 times different from all other components of the culture fluid (Fig. 1, which shows gel filtration through Sepharose 4B of the culture fluid of the cholera vibrio strain of Serovar Ogawa. The ordinate axis: the content of O-antigen, total protein (solid curve), proteinase (Pr, in PE / ml), neuraminidase (HA, in HE / ml), phospholipase (Ph; in LE / ml); the abscissa axis number samples (fractions) and molecular weight).

Способ получения вакцины холерной химической таблетированной заключает в себе, во-первых, способ, описанный в авт. св. N 102735, использованный для изготовления первого компонента вакцины, и во-вторых, дополнительно, способ получения О-антигена холерного вибриона серовара Огава. Этот дополнительный способ заключается в следующем:
В качестве продуцента О-антигена Огава используют штаммы холерного вибриона Vibuo cholerae cholerae, Ogawa (например, NN 41, М41). Штампы серовара Огава должны быть типичными для S=форм по морфологическим культуральным, биохимическим и серологическим свойствам; должны обладать холерогенными, иммуногенными свойствами для лабораторных животных. Холерный вибрион выращивают при 37^oC в реакторе 250 л бульона из ферментативного перевара казеина (pH 8,0-8,1, 200 мг% аминного азота, Na₂HPO₄ - 0,05% NaCl 0,5%), или бульоне Хоттингера в условиях глубинного культивирования с подкормкой глюкозой и аммиаком. В стационарной фазе роста (10-12 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 80-110 млрд.м.т. в 1 мл, оставалась постоянной в течение 3 ч, выращивание прекращают добавлением 0,6% формалина. Бульонную культуру с формалином перемешивают 15 мин и выдерживают 14-18 ч, убитые формалином микробные тела отделяют в центрифуге СГО-100 при 15000 об/мин, а стерильную надосадочную жидкость, содержащую 0,2-0,3% формалина, выдерживают в течение 20-30 дней при 10-12^oC и pH 7,0±0,3 для детоксикации О-антигена. В случае падения величины pH добавляют щелочь (10-ный раствор NaOH). После этого приступают к выделению и очистке антигена из культуральной жидкости путем осаждения сульфатом аммония при 0,5 насыщения, добавляя 380 г соли на 1 л и оставляя на 18-20 ч при температуре 20±2^oC. (В случае отклонения от указанной температуры делают пересчет количества сульфата аммония с учетом его растворимости). После центрифугирования и диализа осадка в проточной водопроводной воде получают О-антигеносодержащую фракцию (обем около 10 л), имеющую pH 6,7-6,9 и содержащую 1,0±0,2% белка и с большей в 20-25 раз, чем исходный материал концентрацией О-антигена. Из этой фракции проводят повторное осаждение О-антигена сульфатом аммония между 0,3-0,4 насыщения, добавляя при 20±2^oC 228 г, а затем 76 г соли на 1 л первоначального объема. Смесь оставляют на 18-20 ч. После центрифугирования и диализа в проточной водопроводной воде препарат дробно стерилизуют (или фильтруют через бактериальные свечи) и проводят его лиофильное высушивание и контролируют качество второго компонента вакцины. Этот компонент должен иметь титр в РПГА с холерной О-сывороткой не ниже 1:100, а с типовой Огава не ниже 1:25.A method of obtaining a chemical cholerae vaccine tablet includes, firstly, the method described in ed. St. N 102735, used for the manufacture of the first component of the vaccine, and secondly, additionally, a method for producing the O-antigen of cholera vibrio serovar Ogawa. This additional way is as follows:
As a producer of Ogawa O-antigen, Vibuo cholerae cholerae, Ogawa strains of cholera vibrio are used (for example, NN 41, M41). Stamps of Serovar Ogawa should be typical for S = forms according to morphological cultural, biochemical and serological properties; must have cholerogenic, immunogenic properties for laboratory animals. Vibrio cholerae is grown at 37 ^o C in a reactor of 250 l of broth from the enzymatic digest of casein (pH 8.0-8.1, 200 mg% of amine nitrogen, Na ₂ HPO ₄ - 0.05% NaCl 0.5%), or broth Hottinger in deep cultivation with top dressing with glucose and ammonia. In the stationary phase of growth (10-12 hours of cultivation), when the concentration of microbial bodies, reaching 80-110 billion m.t. in 1 ml, remained constant for 3 hours, the cultivation was stopped by adding 0.6% formalin. The broth culture with formalin is stirred for 15 minutes and allowed to stand for 14-18 hours, the microbial bodies killed by formalin are separated in an SGO-100 centrifuge at 15,000 rpm, and the sterile supernatant containing 0.2-0.3% formalin is kept for 20 -30 days at 10-12 ^o C and pH 7.0 ± 0.3 for detoxification of O-antigen. In the event of a drop in pH, alkali (10% NaOH solution) is added. After that, they begin to isolate and purify the antigen from the culture fluid by precipitation with ammonium sulfate at 0.5 saturation, adding 380 g of salt per 1 liter and leaving it for 18-20 hours at a temperature of 20 ± 2 ^o C. (In case of deviation from the indicated temperature recalculate the amount of ammonium sulfate, taking into account its solubility). After centrifugation and dialysis of the precipitate in running tap water, an O-antigen-containing fraction (volume of about 10 l) is obtained, having a pH of 6.7-6.9 and containing 1.0 ± 0.2% protein and with a greater 20-25 times, than the starting material by the concentration of O-antigen. From this fraction, O-antigen is re-precipitated with ammonium sulfate between 0.3-0.4 saturations, adding 228 g at 20 ± 2 ^° C and then 76 g of salt per 1 liter of the original volume. The mixture is left for 18-20 hours. After centrifugation and dialysis in running tap water, the preparation is fractionally sterilized (or filtered through bacterial suppositories) and freeze-dried, and the quality of the second component of the vaccine is monitored. This component should have a titer in RPHA with cholera O-serum not lower than 1: 100, and with a typical Ogawa not lower than 1:25.

Результаты проведенного исследования по выбору оптимального способа выделения дополнительного компонента О-антигена Огава представлены в табл. 1. Как видно, отличия между препаратами были обусловлены не только условиями фракционирования, но и экспозицией безмикробного центрифугата от момента его получения до осаждения фракций. Изучение последнего вопроса было необходимо, поскольку культуральная жидкость содержит, кроме О-антигена, большое количество экзоферментов, в том числе липаз, протеиназ и др. способных вызвать расщепление липополисахаридного комплекса антигена. В то же время известно, что токсичность и антигенность О-антигенов (эндотоксинов) находится в прямой зависимости от величины молекулярной массы их компонентов. The results of the study on the selection of the optimal method for isolating the additional component of Ogawa O-antigen are presented in table. 1. As can be seen, the differences between the preparations were caused not only by the conditions of fractionation, but also by the exposure of the microbial centrifugate from the moment it was received to the precipitation of the fractions. The study of the last question was necessary, since the culture fluid contains, in addition to the O-antigen, a large number of exoenzymes, including lipases, proteinases, and others that can cause splitting of the lipopolysaccharide complex of the antigen. At the same time, it is known that the toxicity and antigenicity of O-antigens (endotoxins) is directly dependent on the molecular weight of their components.

Как видно из табл. 1, фракция 6 (экспозиция 25±5 дн, 31-40% сульфата аммония) содержит наибольшее количество О-антигена (90% титр преципитации 1: 256), по химическому составу препарат соответствует О-антигенам, по данным (см. фиг. 2, где показаны ИК-спектроскопии, ИК-спектры О-антигенсодержащих фракций, выделенных их культуральной жидкости штамма серовара Огава). As can be seen from the table. 1, fraction 6 (exposure 25 ± 5 days, 31-40% ammonium sulfate) contains the largest amount of O-antigen (90% precipitation titer 1: 256), the chemical composition of the drug corresponds to O-antigens, according to (see Fig. 2, which shows IR spectroscopy, IR spectra of O-antigen-containing fractions isolated from their culture fluid of Ogawa serovar strain).

1 фракция 1-8; 2- фракция И-30; 3 фракция V-30; 4 фракция 11-8. По оси абсцисс частота (в см^-1); по оси ординат поглощение (в).1 fraction 1-8; 2- fraction I-30; 3 fraction V-30; 4 fraction 11-8. The abscissa axis shows frequency (in cm ^-1 ); along the ordinate axis absorption (c).

Она является специфическим липополисахариднобелковым комплексом - О-антигеном холерного вибриона, она достаточно растворима, малотоксична (LD₅₀=9 мг), в высоком титре вызывает образование специфических антител (1:1020). При экспозиции в 8 дней из культуральной жидкости не удалось выделить аналогичную по эффективности фракцию. Так фракция 1 (экспозиция 8 дн, 20-30% сульфата аммония) была мало растворима, содержала меньше О-антигена (64% титр преципитации 1:128), более токсична (LD₅₀=4 мг) и вызывала менее активный синтез антител (титр 1:420).It is a specific lipopolysaccharide-protein complex - O-antigen of cholera vibrio, it is quite soluble, low toxic (LD ₅₀ = 9 mg), in the high titer it causes the formation of specific antibodies (1: 1020). When the exposure was 8 days from the culture fluid, it was not possible to isolate a fraction similar in efficiency. So fraction 1 (exposure 8 days, 20-30% ammonium sulfate) was slightly soluble, contained less O-antigen (64% titer precipitation 1: 128), more toxic (LD ₅₀ = 4 mg) and caused less active synthesis of antibodies ( titer 1: 420).

Сухой О-антиген Огава добавляют к сухой специфической фракции Инаба, прибавляют таблеточный наполнитель (сахар, крахмал, тальк, стеарат кальция), делают таблетки и наносят ацидорезистентное покрытие. Одна таблетка вакцины массой 0,3 г содержит (в мг) 10-50 фракции Инаба (авт. св. N 102735), 5-10 О-антигена Огава, 140-185 сахара, 80 крахмала, 10 талька и 10 стеарата. В тесте активной защиты мышей (в основном по рекомендациям ВОЗ для холерных вакцин) величина ED₅₀ составляет менее 1/20000 таблетки к штаммам серовара Огава и Инаба, а по реакции преципитации в геле с холерной О-сывороткой активность О-антигена Огава составляет 0,001 (0,0005) часть таблетки. Выход препарата с одного реактора обеспечивает получение 1000-12500 таблеток.Ogawa dry O-antigen is added to the Inaba dry specific fraction, a tablet excipient (sugar, starch, talc, calcium stearate) is added, tablets are made and an acid-resistant coating is applied. One 0.3 g vaccine tablet contains (in mg) 10-50 Inaba fractions (ed. St. N 102735), 5-10 Ogawa O-antigen, 140-185 sugar, 80 starch, 10 talc and 10 stearate. In the active mouse protection test (mainly according to WHO recommendations for cholera vaccines), the ED ₅₀ value is less than 1/20000 tablets for Ogawa and Inaba serovar strains, and according to the precipitation reaction in a gel with cholera O-serum, the Ogawa O-antigen activity is 0.001 ( 0,0005) part of the tablet. The output of the drug from one reactor provides 1000-12500 tablets.

Сравнительная характеристика двух вакцин приведена в табл. 2. Comparative characteristics of the two vaccines are given in table. 2.

Как видно, добавление О-антигена Огава улучшило защитные свойства вакцины по ED₅₀ до 1/36000 вместо 1:18000, а титры вибриоцидных антител к серовару Огава возросли более чем в три раза.As you can see, the addition of the Ogawa O-antigen improved the protective properties of the ED ₅₀ vaccine to 1/36000 instead of 1: 18000, and the titers of vibriocidal antibodies to Ogawa serovar increased by more than three times.

В табл. 3 приведена характеристика экспериментально-производственных серий вакцины, изученных в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и включенных для испытаний на добровольцах. Как видно, серии достаточно стабильны. In the table. 3 shows the characteristics of the experimental-production series of vaccines studied in the GISK them. L.A. Tarasevich and included for testing on volunteers. As you can see, the series are quite stable.

Результаты хроматографического разделения компонентов культуральной жидкости штамма Огава, выдержанной 30 дн при 10^oC и 0,2% формалина, показали, что по молекулярной массе эти компоненты четко разделяются на две группы. О-антигеносодержащие фракции выходили вслед за голубыми декстраном (молекулярная масса 2•10⁶) с первым пиком (молекулярная масса 1•10⁶). Основное же количество белков имело молекулярную массу менее 100000. (Присутствие протеиназы в первых порциях элюата вызвано ее сорбцией на липополисахариде). Такой состав культурной жидкости был свойственен только штаммам серовара Огава.The results of chromatographic separation of the components of the culture fluid of the Ogawa strain, aged 30 days at 10 ^o C and 0.2% formalin, showed that the molecular weight of these components are clearly divided into two groups. O-antigen-containing fractions followed the blue dextran (molecular weight 2 • 10 ⁶ ) with the first peak (molecular weight 1 • 10 ⁶ ). The main amount of proteins had a molecular weight of less than 100,000. (The presence of proteinase in the first portions of the eluate is caused by its sorption on the lipopolysaccharide). Such a composition of the culture fluid was characteristic only of strains of the serovar Ogawa.

Интерпретацию спектрограмм проводили на основе имеющихся в литературе сведений и данных химических анализов фракций. Как видно, ИК-спектры фракции 1-8, 6-30 почти идентичны и определенно отличаются от таковых фракций 2-8 и 5-30. Так область частот спектра от 700 см^-1 по 1400 см^-1 имеет ряд полос поглощения, большинство из которых следует, по-видимому, отнести к полисахаридной части комплексов. В спектрах препаратов 2-8 и 5-30 поглощение в этой области уменьшается по интенсивности. Полосы поглощения 1545 см^-1 и 1660 см^-1, характерные для белков и пептидов, отмечены во всех препаратах, но были более выражены во фракциях 2-8 и 5-30. Особо следует подчеркнуть отличия в содержании липидов: фракции 1-8 и 6-30 имели относительно более богатый ИК-спектр в этой области. Только у этих фракций в спектрах обнаружены полосы поглощения при 1730 см^-1, за счет колебания карбонильной группы с=о липидов, а полосы при 2860 см^-1 и 2930 см^-1, обусловленные симметричными колебаниями CH₂ -групп жирных кислот, были у них более выражены. Полоса поглощения при 1240 см^-1, характерная для нуклеиновых кислот, была слабо выражена.The interpretation of the spectrograms was carried out on the basis of the literature data and the data of chemical analysis of fractions. As can be seen, the IR spectra of fractions 1-8, 6-30 are almost identical and definitely differ from those of fractions 2-8 and 5-30. So, the frequency range of the spectrum from 700 cm ^-1 to 1400 cm ^-1 has a number of absorption bands, most of which, apparently, should be attributed to the polysaccharide part of the complexes. In the spectra of preparations 2–8 and 5–30, the absorption in this region decreases in intensity. Absorption bands of 1545 cm ^-1 and 1660 cm ^-1 , characteristic of proteins and peptides, were noted in all preparations, but were more pronounced in fractions 2-8 and 5-30. The differences in lipid content should be emphasized: fractions 1-8 and 6-30 had a relatively richer IR spectrum in this region. Only in these fractions in the spectra were absorption bands detected at 1730 cm ^-1 due to the vibration of the carbonyl group c = o lipids, and the bands at 2860 cm ^-1 and 2930 cm ^-1 , due to symmetric vibrations of the CH ₂ groups of fatty acids, were They are more pronounced. The absorption band at 1240 cm ^-1 , characteristic of nucleic acids, was weakly expressed.

Использование предлагаемого способа по сравнению с известным дает следующее основное преимущество возможность обогащения оральной вакцины Инаба О-антигеном серовара Огава для создания невосприимчивости к обоим сероварам V. cholerae. Способ позволяет проводить производственное получение антигена. Выращивание холерного вибриона проводят в реакторе емкостью 250 л методом глубинного культивирования, что дает большой выход растворимого О-антигена Огава. Выделение и очистку О-антигена проводят щадящим его нативную структуру способом из культуральной жидкости фракционированием сульфатом аммония. О-антиген Огава служит компонентом холерной химической таблетированной вакцины, с ацидорезистентным покрытием таблетки, что обеспечивает оральное применение препарата. Using the proposed method in comparison with the known one gives the following main advantage: the possibility of enriching the Inaba oral vaccine with the O-antigens of Serovar Ogawa to create immunity to both V. cholerae serovars. The method allows for the production of antigen. The cultivation of cholera vibrio is carried out in a reactor with a capacity of 250 l by the method of deep cultivation, which gives a large yield of soluble Ogawa O-antigen. Isolation and purification of O-antigen is carried out by a method that spares its native structure from the culture fluid by fractionation of ammonium sulfate. Ogawa O-antigen serves as a component of a cholera chemical tablet vaccine, with an acid-resistant tablet coating, which provides oral administration of the drug.

Claims

1. A method of manufacturing a vaccine for the prevention of cholera, including cultivating the cholera vibrio of Inaba strain 569B, its inactivation, isolation and purification, characterized in that, in order to increase the specific activity and effectiveness of protection against infection by Ogawa strains, Ogawa O-antigen is additionally introduced into the drug the isolation and purification of which is carried out from the culture fluid of a typical strain of Vibrio cholerae Ogawa 41 or M41, by precipitation with ammonium sulfate at 0.5 saturation at pH 7.0 ± 0.3, followed by fractionation between 0.3 0, 4 saturations at pH 6.8 ± 0.1 and protein concentration 1.0 ± 0.2%
2. The method according to claim 1, characterized in that, in order to reduce the toxicity of the Ogawa O-antigen, a culture fluid containing 0.2 0.3% formalin is incubated for 20 30 days at 10 12 ^o C.