RU2311197C1 - Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism - Google Patents

Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism

Info

Publication number
RU2311197C1
RU2311197C1 RU2006133783/13A RU2006133783A RU2311197C1 RU 2311197 C1 RU2311197 C1 RU 2311197C1 RU 2006133783/13 A RU2006133783/13 A RU 2006133783/13A RU 2006133783 A RU2006133783 A RU 2006133783A RU 2311197 C1 RU2311197 C1 RU 2311197C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protein
kda
fractions
pneumoniae
fraction
Prior art date
Application number
RU2006133783/13A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Михаил Валентинович Киселевский (RU)
Михаил Валентинович Киселевский
Федор Витальевич Доненко (RU)
Федор Витальевич Доненко
Константин Евгеньевич Воюшин (RU)
Константин Евгеньевич Воюшин
Александр Владимирович Тришин (RU)
Александр Владимирович Тришин
Екатерина Алексеевна Курбатова (RU)
Екатерина Алексеевна Курбатова
Надежда Борисовна Егорова (RU)
Надежда Борисовна Егорова
Ирина Мироновна Грубер (RU)
Ирина Мироновна Грубер
Нэлли Кимовна Ахматова (RU)
Нэлли Кимовна Ахматова
Ирина Борисовна Семенова (RU)
Ирина Борисовна Семенова
Борис Федорович Семенов (RU)
Борис Федорович Семенов
Original Assignee
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова) filed Critical Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова)
Priority to RU2006133783/13A priority Critical patent/RU2311197C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2311197C1 publication Critical patent/RU2311197C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, microbiology, preparative biochemistry, proteins.
SUBSTANCE: invention relates to vaccine preparations and to a method for preparing protective antigens based on secreting protein-containing fractions of microorganisms. Method involves culturing microorganisms on liquid nutrient media, separation of cultural medium from cells, purification of medium and concentrating by ultrafiltration with the removal threshold of protein of molecular mass 30 kDa and column chromatograpy by gel-filtration on Sephadex G-75 followed by purification on DEAE-Sepharose in gradient of concentration of NACl yielding fractions of molecular mass 30-35 kDa containing protein in the concentration 4-5 mg/ml. Method provides preparing immune preparation eliciting prophylactic and curative properties.
EFFECT: improved preparing method.
2 cl, 8 tbl, 5 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к вакцинным препаратам, и касается способа получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций бактерий, которые могут быть использованы для получения профилактических и лечебных иммунопрепаратов.The invention relates to medicine, namely to vaccine preparations, and relates to a method for producing protective antigens based on secreted protein-containing fractions of bacteria, which can be used to obtain prophylactic and therapeutic immunopreparations.

Проблема бактериальных инфекций на протяжении многих лет является одной из наиболее важных проблем медицинской науки и здравоохранения. Для профилактики этих заболеваний кроме анатоксинов используют большое количество вакцин, конструируемых на основе антигенов микробной клетки. Эти вакцины характеризуются различной степенью протективной активности и строгой серотиповой специфичностью.The problem of bacterial infections over the years is one of the most important problems of medical science and healthcare. For the prevention of these diseases, in addition to toxoids, a large number of vaccines are used, which are designed on the basis of microbial cell antigens. These vaccines are characterized by varying degrees of protective activity and strict serotypic specificity.

Известен способ получения протективных профилактических препаратов (анатоксины), состоящих из белоксодержащих фракций (токсинов), секретируемых токсинобразующими бактериями; дальнейшая обработка культуральной среды, содержащей токсин производится путем обезвреживания токсина формалином, концентрации и очистки от балластных веществ.A known method of obtaining protective prophylactic drugs (toxoids), consisting of protein-containing fractions (toxins) secreted by toxin-forming bacteria; further processing of the culture medium containing the toxin is carried out by neutralizing the toxin with formalin, concentration and purification of ballast substances.

(Анатоксины. Руководство по вакцинному и сывороточному делу под ред. П.Н.Бургасова, 1978, с.103-157.)(Anatoxins. A Guide to the Vaccine and Serum Cases, edited by P.N. Burgasov, 1978, pp. 103-157.)

Недостатком этого метода является невозможность получения протективных секретируемых препаратов при использовании нетоксигенных штаммов бактерий.The disadvantage of this method is the inability to obtain protective secreted drugs when using non-toxigenic bacteria strains.

Техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является создание универсального способа получения бактериальных антигенов из любых видов бактерий на основе секретируемых белоксодержащих фракций различных видов бактерий, характеризующихся высокой внутривидовой перекрестной протективной активностью.The technical result to which this invention is directed is to create a universal method for producing bacterial antigens from any kind of bacteria based on secreted protein-containing fractions of various types of bacteria characterized by high intraspecific cross-protective activity.

Для достижения указанного технического результата в способе получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающем культивирование бактерий на жидких питательных средах, отделение культуральной среды от бактерий, согласно изобретению культуральную среду, содержащую секретируемые белоксодержащие фракции, подвергают очистке и концентрируют методом ультрафильтрации с порогом отсечения белка 30 кДа и колоночной хроматографии с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 и последующей очистке на ДЕАЕ-сефарозе в градиенте NaCl до получения фракций с молекулярной массой 30-50 кДа и содержанием белка 4-5 мг/мл.To achieve the technical result in a method for obtaining a protective protein-containing fraction of bacteria, including culturing bacteria on liquid nutrient media, separating the culture medium from bacteria, according to the invention, the culture medium containing secreted protein-containing fractions is purified and concentrated by ultrafiltration with a protein cut-off threshold of 30 kDa and column chromatography using gel filtration on Sephadex G-75 and subsequent purification on DEAE-Sepharose in a gradient of NaCl d about obtaining fractions with a molecular weight of 30-50 kDa and a protein content of 4-5 mg / ml.

Для получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций используют нетоксигенные штаммы грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов.To obtain protective antigens based on secreted protein-containing fractions, non-toxigenic strains of gram-negative or gram-positive microorganisms are used.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Способ получения протективных секретируемых белоксодержащих антигенов клебсиеллы К2, предусматривающий следующие стадии:Example 1. A method of obtaining a protective secreted protein-containing antigens of Klebsiella K2, comprising the following stages:

а) культивирование клебсиеллы К2 на жидкой полусинтетической питательной среде.a) the cultivation of Klebsiella K2 in a liquid semi-synthetic nutrient medium.

б) инактивация микробной массы;b) inactivation of microbial mass;

в) отделение надосадочной жидкости, центрифугирование;c) separation of the supernatant, centrifugation;

г) концентрирование и очистка надосадочной жидкости методом колоночной хроматографии;d) concentration and purification of the supernatant by column chromatography;

д) фракционирование по молекулярной массе с помощью ультрафильтрации с порогом отсечения белка 30 кДа.d) fractionation by molecular weight using ultrafiltration with a cutoff threshold of protein 30 kDa.

Штамм K.pneumoniae K2 (В5055) из Эталонной международной коллекции клебсиелл, находящийся в лиофилизированном состоянии в ампулах, засевают в 50 мл 0,2% сахарного бульона на 4 часа, затем на жидкую полусинтетическую среду следующего состава:The strain K. pneumoniae K2 (B5055) from the International Standard Klebsiella Collection, which is in a lyophilized state in ampoules, is seeded in 50 ml of 0.2% sugar broth for 4 hours, then on a semi-synthetic liquid medium of the following composition:

КН2РО4 - 4,50 г/лKN 2 RO 4 - 4.50 g / l

К2НРО4 - 5,00 г/лK 2 NRA 4 - 5.00 g / l

(NH4)2SO4-1,00 г/л(NH 4 ) 2 SO 4 -1.00 g / l

MgSO4×7Н2О - 0,30 г/лMgSO 4 × 7H 2 O - 0.30 g / l

Цитрат натрия - 0,50 г/лSodium Citrate - 0.50 g / L

Глюкоза - 10 г/лGlucose - 10 g / l

Аминопептид -103,0 млAminopeptide -103.0 ml

Культивирование штаммов K.pneumoniae проводят в ферментере, например, фирмы "Анкум" при непрерывном перемешивании и подаче воздуха в объеме 10 л при рН 7,8 t=37°C в течение 5-6 часов. Концентрация микроорганизмов составляет (8,0±1,0)·109 микробных клеток/ мл. Микробную суспензию инактивируют азидом натрия. Полноту инактивации микробных клеток контролируют путем высева на питательный агар. Над осадочную жидкость отделяют от микробных клеток центрифугированием при 6 000 g в течение 30 минут при температуре 4°С, как и все последующие процедуры. К полученному супернатанту прибавляют сульфат аммония до 80% насыщения по методу N. Koide et al. Осадок отделяют центрифугированием при 10 000 g в течение 30 минут, растворяют в 50 мл фосфатного буфера рН 7,4, проводят ультрафильтрацию с порогом отсечения белка 30 кДа и фракционируют с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 (Pharmacia, Швеция). Последующую очистку белоксодержащей фракции проводят на DEAE-сефарозе в градиенте NaCl (от 0 до 50 М NaCl) до получения фракций с мол. массой 30-50 кДа и содержанием белка 4-5 мг/мл.The cultivation of K. pneumoniae strains is carried out in a fermenter, for example, Ankum firm with continuous stirring and air supply in a volume of 10 l at pH 7.8 t = 37 ° C for 5-6 hours. The concentration of microorganisms is (8.0 ± 1.0) · 10 9 microbial cells / ml. The microbial suspension is inactivated with sodium azide. The completeness of inactivation of microbial cells is controlled by plating on nutrient agar. Above the sedimentary liquid, they are separated from microbial cells by centrifugation at 6,000 g for 30 minutes at 4 ° C, as with all subsequent procedures. Ammonium sulfate was added to the resulting supernatant to 80% saturation according to the method of N. Koide et al. The precipitate was separated by centrifugation at 10,000 g for 30 minutes, dissolved in 50 ml of phosphate buffer pH 7.4, ultrafiltered with a cut-off threshold of 30 kDa protein and fractionated by gel filtration on Sephadex G-75 (Pharmacia, Sweden). Subsequent purification of the protein-containing fraction is carried out on DEAE-Sepharose in a NaCl gradient (from 0 to 50 M NaCl) to obtain fractions with a mol. weighing 30-50 kDa and a protein content of 4-5 mg / ml.

Принадлежность полученных фракций к белоксодержащим соединениям определяли методом иммуноблоттинга. После электрофоретического разделения исследуемой фракции по молекулярной массе к ним прибавляли гипериммунную сыворотку мышей, иммунизированных препаратом на основе указанной фракции (первичные антитела), а затем прибавляли меченые антитела к иммуноглобулинам мыши (вторичные антитела). Полосы преципитации при тестировании фракций, содержащих иммунологически активные соединения, выявляли в области 35-40 кДа (фиг.1).The belonging of the obtained fractions to protein-containing compounds was determined by immunoblotting. After electrophoretic separation of the studied fraction by molecular weight, hyperimmune serum of mice immunized with a preparation based on the indicated fraction (primary antibodies) was added to them, and then labeled antibodies to mouse immunoglobulins (secondary antibodies) were added. Precipitation bands when testing fractions containing immunologically active compounds were detected in the region of 35-40 kDa (Fig. 1).

Принадлежность исследуемых фракций к секретируемым белкам K.pneumoniae определяли методом проточной цитофлуориметрии. Метод основан на обработке микробных клеток 0,5% параформом в 0,9% фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и рекомендован для фиксации бактериальных клеток или клеток млекопитающих при работе на проточном цитофлуориметре. Перед постановкой реакции микробные клетки трижды отмывали центрифугированием при 800 g в ФСБ без параформа. Отмытые клетки переносили в объеме 200 мкл в специальные пробирки (по 50·103 клеток на пробирку) и добавляли 10, 50 или 100 мкл сыворотки (первичные антитела), полученной после гипериммунизации мышей исследуемыми белковыми фракциями. В контрольные пробирки прибавляли соответствующее количество ФСБ буфера или сыворотки крови интактных мышей (отрицательный контроль). В качестве положительного контроля использовали сыворотки крови мышей, выживших после инфицирования штаммом K.pneumoniae K2. Пробы инкубировали 1 час при 37°С. После этого в каждую пробирку прибавляли по 3 мл изотонического раствора хлорида натрия и трижды отмывали от сыворотки центрифугированием при 800 g. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и вносили вторичные FITC меченые кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (Caltag Labs, США). Пробирки снова инкубировали 30 мин при 37°С. Результаты учитывали на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (фирмы Becton Dickinson, США). Измеряли уровень флуоресценции, выделенной в гейте популяции микробных клеток в канале FL-1H. Среднегеометрическую интенсивность флуоресценции клеток (Gm) рассчитывали с помощью общепринятой программы для обработки данных проточного цитофлуориметра WinMdi 2.8 и выражали в условных единицах (у.е.).The belonging of the studied fractions to secreted proteins of K. pneumoniae was determined by flow cytometry. The method is based on the processing of microbial cells with 0.5% paraform in 0.9% phosphate-buffered saline (FSB) and is recommended for fixing bacterial or mammalian cells when working on a flow cytometer. Before setting up the reaction, microbial cells were washed three times by centrifugation at 800 g in PBS without paraform. The washed cells were transferred in a volume of 200 μl to special tubes (50 · 10 3 cells per tube) and 10, 50 or 100 μl of serum (primary antibodies) obtained after hyperimmunization of mice with the studied protein fractions were added. An appropriate amount of FSB buffer or serum from intact mice was added to control tubes (negative control). As a positive control, the blood serum of mice surviving after infection with a strain of K. pneumoniae K2 was used. Samples were incubated for 1 hour at 37 ° C. After that, 3 ml of an isotonic sodium chloride solution was added to each tube and the serum was washed three times by centrifugation at 800 g. The cells were then resuspended in 200 μl of FSB and secondary FITC-labeled rabbit antibodies against mouse immunoglobulins introduced (Caltag Labs, USA). The tubes were again incubated for 30 min at 37 ° C. The results were taken into account using a FacsCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, USA). The level of fluorescence isolated in the gate of the microbial cell population in the FL-1H channel was measured. The geometric mean cell fluorescence intensity (Gm) was calculated using a generally accepted WinMdi 2.8 flow cytometer for data processing and expressed in arbitrary units (cu).

На фиг.2А показан дот-плот микробных клеток К. pneumoniae. Видно, что выделенная популяция микробных клеток представляет собой однородную клеточную популяцию, формирующую четкое "облако". Факт выделения такой однородной популяции позволяет считать, что использованный метод выделения микробных клеток не вызывает их разрушения или слипания и, следовательно, клеточная популяция пригодна для анализа. На фиг.2Б показана гистограмма свечения исходной популяции микробных клеток в канале FL-1H. Видно, что исходно популяция микробных клеток обладала низким уровнем флуоресценции в присутствии вторичных FITC-меченых антител. Прибавление гипериммунной сыворотки, содержащей антитела к секретируемым белоксодержащим фракциям с молекулярной массой 30-50 кДа в присутствии вторичных FITC-меченых антител, также не приводило к увеличению флуоресценции микробных клеток (рис.2В). Это указывает на отсутствие связывания этих антител с препаратом микробных клеток. Такие же результаты получены для белковой фракции с молекулярной массой 21 кДа. В то же время, добавление сыворотки крови переболевших животных, содержащей антитела к антигенам микробной клетки сопровождалось усилением флуоресценции в присутствии вторичных FITC-меченых антител (средний уровень флуоресценции Gm возрос с 3 до 150 у.е.) (фиг.2Г).On figa shows the dot-plot of the microbial cells of K. pneumoniae. It is seen that the selected population of microbial cells is a homogeneous cell population, forming a clear "cloud". The fact of isolation of such a homogeneous population allows us to consider that the method used to isolate microbial cells does not cause their destruction or adhesion and, therefore, the cell population is suitable for analysis. On figb shows a histogram of the glow of the original population of microbial cells in the channel FL-1H. It is seen that the initial population of microbial cells had a low level of fluorescence in the presence of secondary FITC-labeled antibodies. The addition of hyperimmune serum containing antibodies to secreted protein-containing fractions with a molecular weight of 30-50 kDa in the presence of secondary FITC-labeled antibodies also did not increase the fluorescence of microbial cells (Fig. 2B). This indicates a lack of binding of these antibodies to the microbial cell preparation. The same results were obtained for the protein fraction with a molecular weight of 21 kDa. At the same time, the addition of blood serum from sick animals containing antibodies to microbial cell antigens was accompanied by increased fluorescence in the presence of secondary FITC-labeled antibodies (the average level of Gm fluorescence increased from 3 to 150 cu) (Fig. 2G).

Содержание белка составляет 4-5 мг/мл.The protein content is 4-5 mg / ml.

Определение антигенной и иммуногенной активности полученных белоксодержащих фракций. Для иммунизации животных белоксодержащие фракции штамма К2 предварительно сорбируют на гидроокиси алюминия. Для оценки протективной активности полученных фракций иммунизацию мышей проводят 2-кратно с интервалом 2 недели. Сыворотку крови от иммунизированных животных для изучения антигенной активности, превентивных свойств и других тестов получают через 14 суток после последней иммунизации.Determination of antigenic and immunogenic activity of the obtained protein-containing fractions. To immunize animals, protein-containing fractions of strain K2 are pre-sorbed on aluminum hydroxide. To assess the protective activity of the obtained fractions, immunization of mice is carried out 2 times with an interval of 2 weeks. Blood serum from immunized animals for the study of antigenic activity, preventive properties and other tests receive 14 days after the last immunization.

Для изучения протективной активности белоксодержащих фракций, сорбированных на гидроокиси алюминия, мышей иммунизировали двумя 10-кратно убывающими дозами препаратов и заражали штаммом К. pneumoniae K2 в дозе 500 микробных клеток, что соответствовало 178 LD50 (табл.1, 2). Контроль заражающей дозы проводили на интактных животных. Белоксодержащая фракция с молекулярной массой 21 кДа оказалась малоиммуногенной. Белоксодержащая фракция с молекулярной массой 34-35 кДа характеризовалась высокой протективной активностью, которая имела дозозависимый характер. Защита от заражения при иммунизации иммунизирующей дозой (10 мкл) составляла 70%.To study the protective activity of protein-containing fractions sorbed on aluminum hydroxide, mice were immunized with two 10-fold decreasing doses of the preparations and infected with K. pneumoniae K2 strain at a dose of 500 microbial cells, which corresponded to 178 LD 50 (Tables 1, 2). Contagious dose control was performed on intact animals. The protein-containing fraction with a molecular weight of 21 kDa was found to be low immunogenic. The protein-containing fraction with a molecular weight of 34-35 kDa was characterized by high protective activity, which had a dose-dependent nature. Protection against infection during immunization with an immunizing dose (10 μl) was 70%.

Белоксодержащие фракции с молекулярной массой 30-50 кДа с содержанием белка 4-5 мг/мл, полученные из штамма К16 и нетипируемого 204, обладали внутривидовой перекрестной протективной активностью при заражении штаммом К2 (табл.2, группы 3,4). В свою очередь, препарат из штамма К2 защищал мышей от заражения штаммами К16 и 204 (табл.3).Protein-containing fractions with a molecular weight of 30-50 kDa with a protein content of 4-5 mg / ml, obtained from strain K16 and non-typable 204, had intraspecific cross-protective activity upon infection with strain K2 (Table 2, groups 3.4). In turn, the preparation from strain K2 protected mice from infection with strains K16 and 204 (Table 3).

Белоксодержащая фракция К. pneumoniae K2 с молекулярной массой 30-50 кДа в гомологичной системе обладала протективной активностью без адъюванта (табл.4). В качестве референс-препарата использовали поликомпонентную бактериальную вакцину Иммуновак-ВП-4, состоящую из антигенов микробных клеток Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, содержащую в своем составе в качестве основного компонента ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, пептидогликан, тейхоевые кислоты и лабильные белковые антигены S. aureus. Препараты вводили по единой схеме.The protein-containing fraction of K. pneumoniae K2 with a molecular weight of 30-50 kDa in the homologous system had protective activity without adjuvant (Table 4). The multicomponent bacterial vaccine Immunovac-VP-4, consisting of the antigens of the microbial cells Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli and Staphylococcus aureus, containing as its main component LPS, associated with the outer membrane protein of gram-negative microorganisms, was used as the reference drug. peptidoglycan, teichoic acids and labile protein antigens of S. aureus. The drugs were administered according to a single scheme.

Протективная активность белоксодержащей фракции 30-50 кДа была выше, чем Иммуновак-ВП-4 (содержит с своем составе антигены микробной клетки гетерологичного штамма K.pneumoniae 204, обладающего межвидовой перекрестной протективной активностью).The protective activity of the 30–50 kDa protein-containing fraction was higher than Immunovac-VP-4 (it contains the antigens of the microbial cell of the heterologous strain K. pneumoniae 204, which has interspecific cross-protective activity).

Методом твердофазного ИФА установлено, что при иммунизации мышей фракцией 21 кДа не происходит увеличение уровня антител или они обладают низкой аффинностью (табл.5). При иммунизации мышей фракцией 30-50 кДа выявлено повышение уровня антител, зависящее от величины иммунизирующей дозы. Перекрестной антигенной активности между исследуемыми фракциями выявлено не было, что свидетельствует о хорошей степени очистки исследуемых препаратов.Using the solid-phase ELISA, it was found that when immunizing mice with a fraction of 21 kDa, an increase in the level of antibodies does not occur or they have low affinity (Table 5). When immunizing mice with a fraction of 30-50 kDa, an increase in the level of antibodies was revealed, depending on the size of the immunizing dose. Cross antigenic activity between the studied fractions was not detected, which indicates a good degree of purification of the studied drugs.

Гипериммунная сыворотка, полученная после 4-кратной вакцинации мышей белоксодержащей фракцией 30-50 кДа в дозе 50 мкл, введенная мышам через 2 часа, 1 сутки и 2 суток после заражения, защищала их от летальной клебсиеллезной инфекции, вызванной K.pneumoniae K2. Сыворотка, полученная при иммунизации мышей фракцией 21 кДа была неэффективной (табл.6).Hyperimmune serum obtained after 4-fold vaccination of mice with a protein containing fraction of 30-50 kDa in a dose of 50 μl, administered to mice 2 hours, 1 day and 2 days after infection, protected them from lethal Klebsiella infection caused by K.pneumoniae K2. The serum obtained by immunizing mice with a fraction of 21 kDa was ineffective (Table 6).

Пример 2. Протективная активность секретируемых белоксодержащих фракций пневмококка.Example 2. The protective activity of secreted protein-containing fractions of pneumococcus.

Белоксодержащие фракции получали как в примере 1.Protein-containing fractions were obtained as in example 1.

При иммунизации мышей фракцией 10-30 кДа выявлен слабый протективный эффект (ИЭ 1,99), практически не отличающийся от контроля (табл.7). Значительный эффект был получен при иммунизации мышей фракцией >30 кДа (ИЭ 8,9).When immunizing mice with a fraction of 10-30 kDa, a weak protective effect was revealed (IE 1.99), which practically did not differ from the control (Table 7). A significant effect was obtained by immunizing mice with a fraction> 30 kDa (IE 8.9).

Далее было проведено фракционирование надосадочной жидкости, полученной после культивирования S. pneumoniae типа 3 на фракцию 30-50 кДа и больше 50 кДа (табл.8). Наибольшей протективной активностью характеризовалась фракция с молекулярной массой 30-50 кДа, ИЭ=50,1. Фракция с молекулярной массой более 50 кДа была менее иммуногенной, ИЭ=7,9.Next, fractionation of the supernatant obtained after cultivation of S. pneumoniae type 3 into a fraction of 30-50 kDa and more than 50 kDa was carried out (Table 8). The fraction with a molecular weight of 30-50 kDa, IE = 50.1 was characterized by the highest protective activity. A fraction with a molecular weight of more than 50 kDa was less immunogenic, IE = 7.9.

Преимущество изобретения заключается в создании универсального способа получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций грамотрицательных и грамположительных бактерий, при инфицировании которыми токсинообразование не является ведущим патогенетическим механизмом в развитии заболевания.An advantage of the invention is the creation of a universal method for producing protective antigens based on secreted protein-containing fractions of gram-negative and gram-positive bacteria, upon infection of which toxin formation is not the leading pathogenetic mechanism in the development of the disease.

Таблица 1Table 1 Протективная активность препаратов из штамма Klebsiella pneumoniae K2 при заражении штаммом K.pneumoniae K2 в дозе 178 LD50 The protective activity of drugs from the strain Klebsiella pneumoniae K2 when infected with a strain of K. pneumoniae K2 at a dose of 178 LD 50 № группыGroup number ПрепаратA drug Иммунизирующая доза, мклImmunizing dose, μl Заражающая доза, микр. клетокInfecting Dose, mic. cells ВыжилоSurvived ED50, мклED 50 μl Абс.Abs. % ±m% ± m 1one Белоксодержащая фракция К.pneumoniae K2 с молекулярной массой 21 кДаProtein-containing fraction of K. pneumoniae K2 with a molecular weight of 21 kDa 1one 500500 1/101/10 10,0±9,510.0 ± 9.5 >10,0> 10.0 1010 500500 0/100/10 00 22 Белоксодержащая фракция К.pneumoniae K2 с молекулярной массой 34-35 кДаThe protein-containing fraction of K. pneumoniae K2 with a molecular weight of 34-35 kDa 1one 500500 4/104/10 40,0±15,5*40.0 ± 15.5 * 2,52,5 1010 500500 7/107/10 70,0±14,5*70.0 ± 14.5 * 33 Гидроокись алюминияAluminum hydroxide 1one 500500 0/100/10 00 >10,0> 10.0 1010 500500 0/100/10 00 4four Невакцинированные (контроль)Unvaccinated (control) -- 500500 0/100/10 00 Примечание:Note: 1) достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,01 1) the significance of the difference between the percentage of surviving animals in the experimental groups and in the control, * p <0.01

Таблица 2table 2 Прямая и перекрестная протективная активность препаратов из штамма Klebsiella pneumoniae K2, К16 и 204 при заражении штаммом K.pneumoniae K2 в дозе 15,8 LD50 Direct and cross-protective activity of drugs from the strain Klebsiella pneumoniae K2, K16 and 204 when infected with a strain of K. pneumoniae K2 at a dose of 15.8 LD 50 ГруппаGroup Белоксодержащая фракция К.pneumoniaeProtein-containing fraction of K. pneumoniae Молекулярная масса, кДаMolecular weight, kDa Иммунизирующая доза, мклImmunizing dose, μl Заражаюшая доза, микр. клетокThe infectious dose, micr. cells ВыжилоSurvived ED50, мклED 50 μl Абс.Abs. %±m% ± m 1one K2K2 2121 1one 500500 0/100/10 00 >100> 100 1010 500500 0/100/10 00 100one hundred 500500 3/103/10 30,0±14,530.0 ± 14.5 22 K2K2 34-3534-35 1one 500500 1/101/10 10,0±9,510.0 ± 9.5 3,03.0 1010 500500 10/1010/10 100,0±6,0**100.0 ± 6.0 ** 100one hundred 500500 9/109/10 90±9,5**90 ± 9.5 ** 33 К16K16 34-3534-35 1one 500500 3/103/10 30,0±14,530.0 ± 14.5 60,060.0 1010 500500 3/103/10 30,0±14,530.0 ± 14.5 100one hundred 500500 1/101/10 10,0±9,510.0 ± 9.5 4four 204204 34-3534-35 1one 500500 1/101/10 10,0±9,510.0 ± 9.5 25,025.0 1010 500500 5/105/10 50,0±15,8*50.0 ± 15.8 * 100one hundred 500500 5/105/10 50,0±15,8*50.0 ± 15.8 * 55 Невакцинированные (контроль)Unvaccinated (control) -- 500500 1/101/10 10,0±9,510.0 ± 9.5 Примечание: 1) достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,05, ** р<0,01Note: 1) the significance of the difference between the percentage of surviving animals in the experimental groups and in the control, * p <0.05, ** p <0.01

Таблица 3Table 3 Прямая и перекрестная протективная активность препаратов из штамма Klebsiella pneumoniae K2, К 16 и 204 при заражении штаммом K.pneumoniae К 16 в дозе 2,3 LD50 Direct cross-protective activity and preparations from the strain Klebsiella pneumoniae K2, K 16 and 204 K.pneumoniae when infecting strain K at a dose of 16 2,3 LD 50 ГруппаGroup Белоксодержащая фракция К.pneumoniaeProtein-containing fraction of K. pneumoniae Молекулярная масса, кДаMolecular weight, kDa Иммунизирующая доза, мклImmunizing dose, μl Заражающая доза, ×106 микр. кл/млInfecting dose, × June 10 md. cells / ml ВыжилоSurvived ED50, мклED 50 μl Абс.Abs. %±m% ± m 1one K2K2 34-3534-35 1one 20,020,0 4/104/10 40,0±15,540.0 ± 15.5 8,08.0 1010 20,020,0 6/106/10 60,0±15,5*60.0 ± 15.5 * 100one hundred 20,020,0 6/106/10 60,0±15,5*60.0 ± 15.5 * 22 К16K16 34-3534-35 1one 20,020,0 3/103/10 30,0±14,530.0 ± 14.5 8,08.0 1010 20,020,0 6/106/10 60,0±15,5*60.0 ± 15.5 * 100one hundred 20,020,0 7/107/10 70,0±145**70.0 ± 145 ** 33 204204 34-3534-35 1one 20,020,0 3/83/8 37,5±15,337.5 ± 15.3 2,52,5 1010 20,020,0 6/86/8 75,0±13,7**75.0 ± 13.7 ** 100one hundred 20,020,0 8/88/8 100,0**100.0 ** 4four Невакцинированные (контроль)Unvaccinated (control) -- 20,020,0 1/101/10 10,0±9,510.0 ± 9.5 Примечание: 1) достоверность разности между процентом выживших животных опытных группах и в контроле, * р<0,05, ** р<0,01Note: 1) the significance of the difference between the percentage of surviving animals in the experimental groups and in the control, * p <0.05, ** p <0.01

Таблица 4Table 4 Протективная активность фракции секретируемого белка K.pneumoniae K2 с молекулярной массой 34-35 кДа не сорбированного на гидроокиси алюминия в дозе 2 LD50 The protective activity of the secreted K.pneumoniae K2 protein fraction with a molecular weight of 34-35 kDa not adsorbed on aluminum hydroxide at a dose of 2 LD 50 No. ПрепаратA drug Кратность введения препаратовMultiplicity of drug administration Иммунизирующая дозаImmunizing dose Заражающая доза, микр. клетокInfecting Dose, mic. cells Выжило/ всегоSurvived / Total %±m% ± m Достоверность разности между опытом и контролем, pReliability of the difference between experience and control, p 1one Белоксодержащая фракция K.pneumoniae K2 с молекулярной массой 34-35 кДа, не сорбированная на гидроокиси алюминияProtein-containing fraction of K. pneumoniae K2 with a molecular weight of 34-35 kDa, not sorbed on aluminum hydroxide 22 40,0 мкл40.0 μl 25,025.0 9/99/9 100,0*100.0 * <0,001<0.001 22 Поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-42) Multicomponent vaccine Immunovac-VP-4 2) 22 200 мкг200 mcg 25,025.0 6/106/10 60,0±15,560.0 ± 15.5 0,050.05 Невакцинированные (контроль)Unvaccinated (control) - - - - 25,025.0 2/102/10 20±12,620 ± 12.6 Примечание. 1) Препараты вводили 2-кратно, чередуя внутрибрюшинное и подкожное введение с интервалом 14 суток. Заражение проводили штаммом K.pneumoniae K2 в дозе 25 микробных клеток на 12 сутки.Note. 1) The formulations were administered 2-fold, alternating between intraperitoneal and subcutaneous administration at intervals of 14 days. Infection was carried out with a strain of K. pneumoniae K2 at a dose of 25 microbial cells on day 12. * Достоверность разности между группами вакцинированных мышей (группы 1 и 2), р<0,05* The significance of the difference between the groups of vaccinated mice (groups 1 and 2), p <0.05

Таблица 5Table 5 Антигенная активность секретируемых белоксодержащих антигенов K.pneumoniae K2 с молекулярной массой 34-35 кДа в ИФАAntigenic activity of secreted protein-containing antigens of K. pneumoniae K2 with a molecular weight of 34-35 kDa in ELISA Молекулярая масса белковой фракции для сорбции на планшетах и иммунизации мышей, кДаThe molecular weight of the protein fraction for sorption on tablets and immunization of mice, kDa Иммунизирующая доза исследуемой белковой фракцией, мкл/мышьThe immunizing dose of the investigated protein fraction, μl / mouse Уровень антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных фракциями с молекулярной массой..., кДаThe level of antibodies in the blood serum of mice immunized with fractions with a molecular weight ..., kDa ОП492 OP 492 Δ ОПΔ OP 34-3534-35 1one 0,320±0,0220.320 ± 0.022 0,0660,066 1010 0,368±0,0290.368 ± 0.029 0,1140.114 100one hundred 0,601±0,152***0.601 ± 0.152 *** 0,3470.347 НевакцинированныеUnvaccinated 0,254±0,0160.254 ± 0.016 Примечание.Note. * ОП492 - оптическая плотность при длине волны 492 нм;* OD 492 - optical density at a wavelength of 492 nm; **Δ ОП - разница ОП сыворотки между вакцинированными и невакцинированными мышами** Δ OD - difference in serum OD between vaccinated and unvaccinated mice * * * Достоверность разности уровня антител с сыворотках вакцинированных и невакцинированных мышей р<0,001* * * Reliability of the difference in the level of antibodies with the sera of vaccinated and unvaccinated mice p <0.001

Таблица 6Table 6 Терапевтическая активность противоклебсиеллезной сыворотки при экспериментальной инфекции, вызванной K.pneumoniae К2Therapeutic activity of anti-Klebsiella serum in experimental infection caused by K. pneumoniae K2 No. Сыворотка мышей, иммунизированных белоксодержащией фракцией с молекулярной массойSerum of mice immunized with a protein containing molecular weight fraction Кратность введения сывороткиThe frequency of administration of serum Заражающая доза, микробные клеткиInfectious dose, microbial cells Выжило/всегоSurvived / Total % ±m% ± m 1one 21 кДа21 kDa 22 500500 0/100/10 00 22 34-35 кДа34-35 kDa 33 500500 7/107/10 70,0±14,5*70.0 ± 14.5 * 33 НевакцинированныеUnvaccinated -- 500500 0/100/10 00 * Достоверность разности р2 и 1,3 <0,05* Reliability of the difference p 2 and 1.3 <0.05

Таблица 7Table 7 Протективная активность препаратов из штамма пневмококка серотипа 3 при заражении S.pneumoniae типа 3 в дозе 10,1 LD50 The protective activity of the preparations from the strain of serotype 3 pneumococcal infection when S.pneumoniae type 3 at a dose of 10,1 LD 50 № группыGroup number Белоксодержащая фракция, S.pneumoniae типа 3 иммунизирующая доза 100 мклProtein-containing fraction, S. pneumoniae type 3 immunizing dose 100 μl Заражающая доза, микр. клетокInfecting Dose, mic. cells Выжило/всегоSurvived / Total LD50, микр. клетокLD 50 , mic. cells ИЭIE 1one 10-30 кДа, 6 часов культивирования10-30 kDa, 6 hours of cultivation 7×107 × 10 9/109/10 13801380 1,991.99 7×102 7 × 10 2 7/107/10 7×103 7 × 10 3 2/102/10 22 >30 кДа, 6 часов культивирования> 30 kDa, 6 hours of cultivation 7×107 × 10 10/1010/10 61656165 8,98.9 7×102 7 × 10 2 10/1010/10 7×103 7 × 10 3 4/94/9 33 Невакцинированные (контроль)Unvaccinated (control) 7×107 × 10 9/109/10 692692 -- 7×102 7 × 10 2 3/103/10 7×103 7 × 10 3 3/103/10 Примечание: ИЭ - индекс эффективности - отношение LD50 в опыте к LD50 в контроле;Note: IE - performance index - ratio of LD 50 in the experiment to LD 50 in the control;

Таблица 8Table 8 Протективная активность препаратов из штамма пневмококка серотипа 3 при заражении S. pneumoniae типа 3 в дозе 12,6 LD50.The protective activity of drugs from the pneumococcal strain of serotype 3 upon infection with S. pneumoniae type 3 at a dose of 12.6 LD 50 . № группыGroup number Белоксодержащая фракция, S.pneumoniae типа 3, иммунизирующая доза 100 мклProtein-containing fraction, S. pneumoniae type 3, immunizing dose 100 μl Заражающая доза, микр. клетокInfecting Dose, mic. cells Выжило /всегоSurvived / Total LD50, микр. клетокLD 50 , mic. cells ИЭIE 1one 30-50 кДа30-50 kDa 103 10 3 8/108/10 39810,739810.7 50,150.1 104 10 4 6/106/10 105 10 5 7/107/10 22 >50 кДа> 50 kDa 103 10 3 4/104/10 6309,66309.6 7,97.9 104 10 4 5/105/10 105 10 5 4/104/10 33 Невакцинированные (контроль)Unvaccinated (control) 103 10 3 4/104/10 794,3794.3 - - 104 10 4 0/100/10 105 10 5 0/100/10 Примечание: ИЭ - индекс эффективности - отношение LD50 в опыте к LD50 в контроле;Note: IE - performance index - ratio of LD 50 in the experiment to LD 50 in the control;

Claims (2)

1. Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающий культивирование бактерий на жидких питательных средах, отделение культуральной среды от бактерий, отличающийся тем, что культуральную среду, содержащую секретируемые белоксодержащие фракции, подвергают очистке и концентрируют методом ультрафильтрации с порогом отсечения белка 30 кДа и колоночной хроматографии с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 и последующей очистке на ДЕАЕ-сефарозе в градиенте NaCl до получения фракций с молекулярной массой 30-50 кДа и содержанием белка 4-5 мг/мл.1. A method of obtaining a protective protein-containing fraction of bacteria, including cultivating bacteria on liquid nutrient media, separating the culture medium from bacteria, characterized in that the culture medium containing secreted protein-containing fractions is purified and concentrated by ultrafiltration with a protein cut-off threshold of 30 kDa and column chromatography using gel filtration on Sephadex G-75 and subsequent purification on DEAE-Sepharose in a NaCl gradient to obtain fractions with a molecular weight of 30-50 kDa and Protein holding 4-5 mg / ml. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций используют нетоксигенные штаммы грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов.2. The method according to claim 1, characterized in that to obtain protective antigens based on secreted protein-containing fractions, non-toxigenic strains of gram-negative or gram-positive microorganisms are used.
RU2006133783/13A 2006-09-22 2006-09-22 Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism RU2311197C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006133783/13A RU2311197C1 (en) 2006-09-22 2006-09-22 Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006133783/13A RU2311197C1 (en) 2006-09-22 2006-09-22 Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2311197C1 true RU2311197C1 (en) 2007-11-27

Family

ID=38960162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006133783/13A RU2311197C1 (en) 2006-09-22 2006-09-22 Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2311197C1 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2533815C1 (en) * 2013-09-09 2014-11-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) Method of producing protective protein containing fraction of bacteria
RU2624871C1 (en) * 2016-02-04 2017-07-07 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Method of obtaining pneumococcal hyperimmune sera
RU2660365C1 (en) * 2015-11-20 2018-07-05 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Method for obtaining specific antigenic preparations from clinically significant yeast fungi

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
БУРГАСОВ П.Н. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - М.: Медицина, 1978, с.103-153. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2533815C1 (en) * 2013-09-09 2014-11-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) Method of producing protective protein containing fraction of bacteria
RU2660365C1 (en) * 2015-11-20 2018-07-05 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Method for obtaining specific antigenic preparations from clinically significant yeast fungi
RU2624871C1 (en) * 2016-02-04 2017-07-07 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Method of obtaining pneumococcal hyperimmune sera

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9962434B2 (en) Compositions and methods for treatment of microbial infections
FI111336B (en) Method for Preparing a Vaccine Containing a Type I Polysaccharide Antigen of Staphylococcus epidermis and a Hyperimmunoglobulin against the Antigen
Hu et al. Exploiting bacterial outer membrane vesicles as a cross-protective vaccine candidate against avian pathogenic Escherichia coli (APEC)
US4816253A (en) Novel mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent
CN106928373B (en) Multi-epitope mucosal vaccine for mycoplasma hyopneumoniae
US4567041A (en) Mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent
Langford Mycoplasma agalactiae subsp. bovis in pneumonia and arthritis of the bovine.
CN106243230B (en) Artificial protein with characteristics of vibrio cholerae toxin A subunit and staphylococcus aureus and application thereof
CN109207502B (en) Porcine mycoplasma pneumonia and porcine circovirus type 2 recombinant protein and preparation of bivalent vaccine
RU2311197C1 (en) Method for preparing protective protein-containing fraction of microorganism
Schilperoort et al. Agrobacterium tumefaciens cross-reacting antigens in sterile crown-gall tumors
KR100649286B1 (en) Vaccine preparations containing attenuated toxin
CN111748042B (en) African swine fever fusion protein containing endotoxin and preparation method and application thereof
WO2021109854A1 (en) Immune use of pseudomonas aeruginosa toxins exos and exot, and preparation method therefor
RU2533815C1 (en) Method of producing protective protein containing fraction of bacteria
RU2521651C1 (en) STRAINS OF BACTERIA Moraxella bovoculi &#34;SH-CH6 N-DEP&#34; USED TO MANUFACTURE DIAGNOSTIC PREPARATIONS AND VACCINES AGAINST INFECTIOUS KERATOCONJUNCTIVITIS OF CATTLE
RU2689903C1 (en) Freshly isolated strain of bordetella pertussis bacteria - producer of a complex of protective antigens for production of cell-free pertussis vaccine
RU2407792C1 (en) METHOD FOR PRODUCING IgAl-PROTEASE FROM SEROGROUP A NEISSERIA MENINGITIDIS AND RELATED IMMUNOGENIC PREPARATION
WO2021120019A1 (en) Composition for immunization and preparation method therefor
CN115974988A (en) Recombinant mycoplasma hyopneumoniae IgG binding protein, expression vector, engineering bacterium, application and subunit vaccine
KR970001710B1 (en) Pseudomonas infection preventing agent and the method of preparation thereof
CN118291431A (en) M28 family peptidase, preparation method and application in domestication of immune agonist vaccine adjuvant
RU1835294C (en) Mode to receive the escherichia coli enterotoxin
GB2104527A (en) Antigens as immunostimulant adjuvants

Legal Events

Date Code Title Description
RH4A Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation

Effective date: 20170327