RU2209829C2 - Способ культивирования микроорганизмов mycobacterium tuberculosis - Google Patents
Способ культивирования микроорганизмов mycobacterium tuberculosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2209829C2 RU2209829C2 RU2001123409A RU2001123409A RU2209829C2 RU 2209829 C2 RU2209829 C2 RU 2209829C2 RU 2001123409 A RU2001123409 A RU 2001123409A RU 2001123409 A RU2001123409 A RU 2001123409A RU 2209829 C2 RU2209829 C2 RU 2209829C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- cells
- monolayer
- mycobacterium tuberculosis
- cell culture
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области микробиологии, медицины и биотехнологии. Способ включает введение Mycobacterium tuberculosis в жидкую питательную среду и выращивание на указанной питательной среде. В качестве питательной среды используют жидкую питательную среду для культур клеток млекопитающих с монослоем этих культур клеток на подложке в концентрации не менее 105 кл/см2, а выращивание Mycobacterium tuberculosis осуществляют совместно с культурой клеток млекопитающих до стадии открепления последних от подложки. Причем жидкая питательная среда для культур клеток млекопитающих содержит общий белок не менее 60 г/л. В качестве культуры клеток млекопитающих используют перевиваемую линию клеток VERO. В качестве жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду BSK-II. Способ культивирования приближен к естественным условиям, что обеспечивает возможность длительного культивирования без потери чувствительности к противотуберкулезным препаратам и без изменения биологических свойств. 3 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области микробиологии, медицины и биотехнологии, а именно, к способам культивирования микроорганизмов.
В связи с широким распространением туберкулеза во всем мире ВОЗ поставило это заболевание в число приоритетных в части совершенствования диагностических средств и способов его лечения. Для изучения возбудителя туберкулеза (бактерий Mycobacterium tuberculosis) необходимо создание более совершенных способов его культивирования, позволяющих поддерживать биологические свойства Mycobacterium tuberculosis в течение нескольких пассажей.
Известен способ культивирования бактерий рода Mycobacterium из патологического материала от больных туберкулезом, заключающийся в использовании яичной среды Левенштейна-Йенсена, поддержании температуры культивирования 37-38oС и рН 7,0-7,2 (Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. М.: Медгиз, 1963, с. 94-99). Способ позволяет выращивать бактерии на агаризованных средах. В питательных средах необходимо присутствие белкового компонента, глицерина, факторов роста (биотин, никотиновая кислота, рибофловин).
Недостатками данного способа является то, что культивирование идет очень медленно, каждый цикл деления происходит в среднем за 14-18 часов. На агаризованной среде наблюдается рост на 14-40 сутки в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Среда нестабильна по химическому составу из-за присутствия в ней яиц. При длительном культивировании через несколько пересевов (пассажей) изменяются биологические свойства штамма, а также изменяется спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам.
Известен способ культивирования бактерий рода Mycobacterium, заключающийся в использовании жидкой синтетической среды Сотона, поддержании температуры культивирования 37-38oС и рН 7,0-7,2 (Васильев В.Н. Миобактериозы и микозы легких. София, 1971, с. 156). Основные недостатки данного способа культивирования совпадают с первым способом-аналогом. Культивирование идет очень медленно, каждый цикл деления происходит в среднем за 14-18 часов. При длительном культивировании через несколько пересевов (пассажей) изменяются биологические свойства штамма, а также изменяется спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам.
Известен способ культивирования медленнорастущих микобактерий, включающий выращивание микобактерий на жидкой синтетической питательной среде Сотона с добавлением катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции среды Сотона (патент РФ 2106879, МПК7 А 61 К 39/04, С 12 N 1/20, опубл. 20.03.98 г.).
Однако при длительном культивировании через несколько пересевов (пассажей) изменяются биологические свойства штамма, а также изменяется спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам.
Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому способу является способ культивирования бактерий рода Mycobacterium, заключающийся в использовании жидкой среды Школьникова с добавлением плазмы, снятой с цитратной крови человека, поддержании температуры культивирования 37-38oС и рН 7,0-7,2 (Справочник фтизиатра под редакцией Н.А.Шмелева, М.: Медицина, 1975, с. 96) или (Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под редакцией К.И.Матвеевой и М.И.Соколова, М.: Медицина, 1964, - с. 421). Способ позволяет выращивать бактерии суспензионно. В течение выращивания спектр чувствительности к противотуберкулезным препаратам изменяется незначительно.
Основным недостатком способа-прототипа является то, что при длительном культивировании штамма микобактерий через несколько пассажей изменяются его биологические свойства.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является приближение способа культивирования Mycobacterium tuberculosis к естественным условиям, возможность длительного культивирования без потери чувствительности к противотуберкулезным препаратам и без изменения биологических свойств Mycobacterium tuberculosis.
Указанный технический результат достигается тем, что выращивание Mycobacterium tuberculosis осуществляют совместно с культурой клеток млекопитающих до стадии открепления последних от подложки.
Для модели использовались два варианта питательных сред.
В качестве первой жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду BSK-II. Причем данная жидкая питательная среда для культур клеток млекопитающих содержит общий белок не менее 60 г/л. Динамику роста Mycobacterium tuberculosis в этой системе описывают по отличиям от контрольного флакона с культурой клеток на среде BSK-II.
В качестве второй жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Динамику роста Mycobacterium tuberculosis в этой системе описывают по отличиям от контрольного флакона с культурой клеток на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes.
В качестве культуры клеток млекопитающих используют два варианта линий клеток. Первым вариантом линии клеток является перевиваемая линия клеток VERO. Вторым вариантом линии клеток является перевиваемая культура клеток почки кошки ПК-91.
Использование культуры клеток для совместного выращивания Mycobacterium tuberculosis в питательной среде, например BSK-II, является новым, неизвестным ранее свойством, которое позволяет приблизить Mycobacterium tuberculosis к естественным условиям развития и обеспечивает, по крайней мере, в течение 5 пассажей сохранение без изменения биологических свойств Mycobacterium tuberculosis. При этом не наблюдается какого-либо замутнения среды.
Анализ антибиотикоустойчивости выращиваемого штамма показал сохранение его устойчивости в течение 5 пассажей.
Характерной особенностью культивирования Mycobacterium tuberculosis предлагаемым методом является сохранение времени удвоения клеток при пассировании. Известно, что при выращивании клеток традиционными методами, наблюдается процесс адаптации микобактерий к питательной среде, что выражается в изменении морфологии клеток, уменьшении времени удвоения, но параллельно при этом происходит изменение биологических свойств штамма. Предлагаемый метод не обладает вышеописанными недостатками.
Способ культивирования обеспечивает стабильные скорости роста, морфологические параметры, устойчивость к лекарственным препаратам в течение, по меньшей мере, 5 пассажей.
Перевиваемая линия культуры клеток Vero получена из почки зеленой мартышки (Новые методы культуры животных тканей под редакцией проф. Ю.М.Оленова. - М.: Мир, 1978, с. 116-129).
Перевиваемая линия культуры клеток ПК-91 получена из почки кошки (патент РФ 2121501 от 19.12.94).
Питательная среда для культур клеток BSK II (Каталог фирмы Sigma Chemical Company. -1997, с. 1337) содержит следующие компоненты в 1 литре:
- питательная среда SMRL-1066 до 1 литра;
- желатин 11,4 г;
- неопептон 5,0 г;
- дрожжевой экстракт 2,54 г;
- бычий сывороточный альбумин 50,0 г;
- Hepes 5 г;
- глюкоза 5 г;
- цитрат Na 0,7 г;
- перуват Na 0,8 г;
- N-ацетил-О-глюкозамин 0,4 г;
- бикарбонат Na 2,2 г;
- L-глютамина 0,1 г;
- сыворотка бычья (или кроличья) фетальная 0,08 л;
- рифампицин 0,051 г;
- налидиксовая кислота 0,1 г.
- питательная среда SMRL-1066 до 1 литра;
- желатин 11,4 г;
- неопептон 5,0 г;
- дрожжевой экстракт 2,54 г;
- бычий сывороточный альбумин 50,0 г;
- Hepes 5 г;
- глюкоза 5 г;
- цитрат Na 0,7 г;
- перуват Na 0,8 г;
- N-ацетил-О-глюкозамин 0,4 г;
- бикарбонат Na 2,2 г;
- L-глютамина 0,1 г;
- сыворотка бычья (или кроличья) фетальная 0,08 л;
- рифампицин 0,051 г;
- налидиксовая кислота 0,1 г.
На данный момент известно, что на питательной среде BSK-II культивируют бактерии рода Borrelia при температуре 33oС и рН 7,0-7,2.
Питательная среда для культур клеток Игла MEM в модификации Дульбеко (Каталог фирмы ISN, biochemicals and reagents catalog, 2002-2003 г., с. 791, 1033220) с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes содержит следующие компоненты в 1 литре:
- питательная среда DMEM (ISN, 2002-2003, 1033220) навеска на 1 литр,
- BSA V фракция (ISN, 2002-2003, 194772 - 2 г,
- Hepes 1 M (ISN, 2002-2003, 1688449) - 15 мл,
- рифампицин 0,051 г.
- питательная среда DMEM (ISN, 2002-2003, 1033220) навеска на 1 литр,
- BSA V фракция (ISN, 2002-2003, 194772 - 2 г,
- Hepes 1 M (ISN, 2002-2003, 1688449) - 15 мл,
- рифампицин 0,051 г.
На данной среде производят культивирование многих перевиваемых и первичных культур клеток.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Подготовка клеток культуры Vero к совместному культивированию
Перевиваемую линию культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:3-1:5. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 4-5 суток.
Перевиваемую линию культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:3-1:5. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 4-5 суток.
В пластиковые флаконы с площадью поверхности 25 см2 засевают по 1•106 (0,04•106 кл/см2) клеток на указанной ростовой среде в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5oC. Через двое суток при плотности монослоя клеток 105 кл/см2 ростовую среду сливают и заливают среду BSK-II в объеме 10 мл или среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5oC. Визуальный осмотр культуры клеток Vero проводят ежедневно с использованием инвертируемого микроскопа. Плотный монослой клеток при использовании среды BSK-II сохраняется до 30 суток. Плотный монослой клеток при использовании среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes сохраняется до 18 суток
Подготовка клеток культуры ПК-91 к совместному культивированию
Перевиваемую линию культуры клеток ПК-91 (почка кошки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:4-1:7. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 5-6 суток.
Подготовка клеток культуры ПК-91 к совместному культивированию
Перевиваемую линию культуры клеток ПК-91 (почка кошки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:4-1:7. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 5-6 суток.
В пластиковые флаконы с площадью поверхности 25 см2 засевают по 1•106 (0,04•106 кл/см2) клеток на указанной ростовой среде в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5oC. Через двое суток при плотности монослоя клеток 105 кл/см2 ростовую среду сливают и заливают среду BSK-II в объеме 10 мл или среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37±0,5oC. Визуальный осмотр культуры клеток ПК-91 проводят ежедневно с использованием инвертируемого микроскопа. Плотный монослой клеток при использовании среды BSK-II сохраняется до 21 суток. Плотный монослой клеток при использовании среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes сохраняется до 14 суток
Изоляты Mycobacterium tuberculosis для экспериментальных исследований.
Изоляты Mycobacterium tuberculosis для экспериментальных исследований.
Изолят 542 получен из Муниципального специализированного объединения "ФТИЗИАТРИЯ" 1, выделен из мокроты больного, диагноз: инфильтративная форма туберкулеза легких, 07.10.99 г., посевом на среду Левенштейна-Иенсена и ФИНН-2. Скорость роста - 48 дней. Лекарственная устойчивость - резистентен к рифампицину и стрептомицину. На плотных питательных средах образует отдельные мелкие колонии желтоватого цвета, плохо снимающиеся с поверхности среды.
Изолят 569 получен из Муниципального специализированного объединения "ФТИЗИАТРИЯ" 1, выделен из мокроты больного, диагноз: инфильтративная форма туберкулеза легких, 04.10.99 г., посевом на среду Левенштейна-Иенсена и ФИНН-2. Скорость роста - 28 дней. Лекарственная устойчивость - резистентен к рифампицину и стрептомицину. На плотных питательных средах обильный рост в виде мелких колоний желтоватого цвета, плохо снимающихся с поверхности среды.
Оба изолята при пересеве их с плотной питательной среды (ФИНН-2) на жидкую питательную среду (Сотона) вели себя одинаково: через 10 дней после посева на пробирку отмечалось начало роста, интенсивность которого медленно нарастала и через один месяц островки роста на поверхности среды сливались в морщинистую пленку, при встряхивании разбивающуюся на хлопья, опускающиеся на дно пробирки.
Для экспериментальных исследований использовали одномесячную взвесь Mycobacterium tuberculosis в среде Сотона.
Производственный штамм BCG:
Ампулы, г. Ташкент, вакцина БЦЖ, С527 KN 871.
Ампулы, г. Ташкент, вакцина БЦЖ, С527 KN 871.
Пример 2. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). В два других флакона с культурой клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) вносят в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). В два других флакона с культурой клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) вносят в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
Далее проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero. Динамика роста Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) в этой системе будет описываться только по отличиям от контрольного флакона с культурой клеток Vеrо на среде BSK-II.
В первую неделю изменений не наблюдается.
К 7 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицировались как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью этих клеток. Такие зоны обнаруживают по всей площади монослоя (25 см2) от 10 до 20, по размерам не более 30-50 клеток.
К 14 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.
К 21 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие шаровидные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
- часть темных образований шаровидной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие шаровидные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
К 28 суткам большое количество темных шаровидных образований взвешенно в среде. 40% монослоя клеток разрушено. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно. Размеры этих 200-400 мкм.
На этой стадии культивирование прекращают, собирают из флаконов среду, диспергируют встряхиванием и пересевают по 0,2 мл смеси Mycobacterium tuberculosis с клеточным детритом в подготовленные флаконы с новой культурой клеток Vero на среде BSK-II. Два флакона содержат монослой клеток Vero с Mycobacterium tuberculosis и один флакон контрольный с чистым монослоем клеток Vero.
Таким образом, было проведено 5 последовательных пассажей Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) на культуре клеток Vero с использованием среды BSK-II. Визуальная картина и сроки роста (±2 суток) сохранялись в течение всех пяти пассажей. Среда во флаконах с культурой клеток Vero (контрольном и инфицированных) всегда оставалась прозрачной.
Пример 3. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5), в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero.
В первую неделю изменений не наблюдается.
К 7 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживют по всей площади монослоя (25 см2) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.
К 14 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.
К 21 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной, вытянутой, эллипсовидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
- часть темных образований шаровидной, вытянутой, эллипсовидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
К 28 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20х12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований от 100 до 800 мкм.
На этой стадии культивирование прекращают. Собирают из флаконов среду, диспергируют встряхиванием и пересевают по 0,2 мл в подготовленные флаконы с культурой клеток Vero на среде BSK-II. Два флакона инфицируют и один флакон контрольный.
Таким образом проводят 5 последовательных пассажей Mycobacterium tuberculosis (изолят 569) на культуре клеток Vero с использованием среды BSK-II. Визуальная картина и сроки роста (±2 суток) сохраняются в течение всех пяти пассажей. Среда во флаконах с культурой клеток Vero (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.
Пример 4. Культивирование BCG с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры BCG и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры BCG и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
Проводится ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero.
В первую неделю изменений не наблюдается.
К 7-8 суткам на части клеток в монослое обнаруживают темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживают по всей площади монослоя (25 см2) около 10, по размерам не более 5-10 клеток.
До 10 суток наблюдают положительную динамику увеличения этих темных образований.
К 14 суткам происходит полная элиминация этих образований, и они больше не определяются.
К 28 суткам инфицированные флаконы ничем не отличалются от контрольного.
Провели еще трижды опыт с инфицированием BCG. Картина полностью повторилась.
Таким образом, из приведенных выше примеров видно, что данная система позволяет визуально различать разные изоляты Mycobacterium tuberculosis (пример 2 и пример 3) по характеру роста и по разрушающему действию на монослой культуры клеток, начиная с первого пассажа. Данные изменения сохраняются, по крайней мере, на протяжении пяти последовательных пассажей. Клетки микобактерий сохраняли свои морфологические характеристики, что подтверждает неизменность биологических свойств Mycobacterium tuberculosis и устойчивость к противотуберкулезным препаратам.
Пример 5. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes и культуры клеток Vero
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток Vero проводят смену среды: ростовой на Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток Vero на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл). Два других флакона культуры клеток Vero на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток Vero.
К 3 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20•12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживают по всей площади монослоя (25 см2) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.
К 5 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.
К 7 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
К 10 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований около 100 мкм.
На этой стадии культивирование прекращают. Среда во флаконах с культурой клеток Vero (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.
Пример 6. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды BSK-II и культуры клеток ПК-91
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток ПК-91 проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток ПК-91 на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток ПК-91 на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток ПК-91 проводят смену среды: ростовой на BSK-II. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток ПК-91 на среде BSK-II (10 мл). Два других флакона культуры клеток ПК-91 на среде BSK-II (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток ПК-91.
В первую неделю изменений не наблюдается.
К 7 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20х12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживют по всей площади монослоя (25 см2) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.
К 14 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.
К 21 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
К 28 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований от 200 до 400 мкм.
На этой стадии культивирование прекращают. Среда во флаконах с культурой клеток ПК-91 (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.
Пример 7. Культивирование Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) с использованием ростовой среды Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes и культуры клеток ПК-91
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток ПК-91 проводят смену среды: ростовой на Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток ПК-91 на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл). Два других флакона культуры клеток ПК-91 на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
В трех пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см2 с двухсуточным монослоем культуры клеток ПК-91 проводят смену среды: ростовой на Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes. Один пластиковый флакон используют как контроль чистой культуры клеток ПК-91 на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл). Два других флакона культуры клеток ПК-91 на среде Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes (10 мл) инфицируют, внося в среду 0,2 мл культуры Mycobacterium tuberculosis (изолят 542) и перемешивают покачиванием (разведение в 50 раз).
Проводят ежедневный визуальный просмотр (инвертированный микроскоп "Olimpus", увеличение 5•12,5; 10•12,5; 20•12,5) в сравнении с контрольным флаконом культуры клеток ПК-91.
К 3 суткам на части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна. При увеличении 20х12,5 они идентифицируются как темные нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью клеток. Такие зоны обнаруживют по всей площади монослоя (25 см2) от 15 до 30, по размерам не более 30-50 клеток.
К 5 суткам эти темные образования увеличиваются, приобретают шаровидную форму и выступают над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.
К 7 суткам наблюдается смешанная картина:
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
- часть темных образований шаровидной и неправильной формы открепилась от монослоя клеток и находилась в питательной среде во взвешенном состоянии;
- мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток;
- множество отдельных темных образований.
К 10 суткам большое количество темных образований разных форм и размеров взвешенно в среде. 100% разрушение монослоя клеток. При увеличении от 20•12,5 эти образования выглядят как конгломераты клеток Vero, плотно скрепленные с нитчатыми образованиями. Края этих образований выглядят неровно ("мохнатые"). Размеры этих образований около 100 мкм.
На этой стадии культивирование прекращают. Среда во флаконах с культурой клеток ПК-91 (контрольном и инфицированных) остается прозрачной.
Таким образом, из приведенных выше примеров видно, что при замене перевиваемой культуры клеток линии Vero на перевиваемую культуру клеток линии ПК-91 в данной системе культивирования при использовании ростовой среды BSK-II не наблюдается существенных различий в характере роста Mycobacterium tuberculosis (пример 2 и пример 6).
Из приведенных выше примеров видно, что при замене ростовой среды BSK-II на ростовую среду Игла MEM в модификации Дульбеко с 0,2% BSA (V фракция) и 15 mM Hepes меняются только сроки роста Mycobacterium tuberculosis, но характеристика роста Mycobacterium tuberculosis остается неизменной.
При использовании предлагаемого метода культивирования наблюдается несколько фаз в процессе роста микобактерий туберкулеза, которые являются общими и не зависят от используемой ростовой среды и перевиваемой культуры клеток.
Обязательно присутствует фаза прикрепления микобактерий туберкулеза к клеткам монослоя. Второй фазой является фаза роста микобактерий на клеточном субстрате с видимым увеличением биомассы. Третья фаза - смешанная, когда присутствуют элементы, растущие на субстрате и во взвешенном состоянии. Четвертая фаза - разрушение монослоя и продолжение роста во взвешенном состоянии.
При использовании разных ростовых сред наблюдается только изменение сроков роста и размеров конгломератов, но количество и порядок перечисленных фаз остается неизменным.
Claims (4)
1. Способ культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis, включающий введение посевной дозы Mycobacterium tuberculosis в жидкую питательную среду и выращивание их на указанной питательной среде, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют жидкую питательную среду для культур клеток млекопитающих с монослоем этих культур клеток на подложке в концентрации не менее 105 кл/см2, а выращивание Mycobacterium tuberculosis осуществляют совместно с культурой клеток млекопитающих до стадии открепления последних от подложки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкая питательная среда для культур клеток млекопитающих содержит общий белок не менее 60 г/л.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток млекопитающих используют перевиваемую линию клеток VERO.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды для культур клеток млекопитающих используют среду BSK-II.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001123409A RU2209829C2 (ru) | 2001-08-20 | 2001-08-20 | Способ культивирования микроорганизмов mycobacterium tuberculosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001123409A RU2209829C2 (ru) | 2001-08-20 | 2001-08-20 | Способ культивирования микроорганизмов mycobacterium tuberculosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001123409A RU2001123409A (ru) | 2003-06-20 |
| RU2209829C2 true RU2209829C2 (ru) | 2003-08-10 |
Family
ID=29245751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001123409A RU2209829C2 (ru) | 2001-08-20 | 2001-08-20 | Способ культивирования микроорганизмов mycobacterium tuberculosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2209829C2 (ru) |
-
2001
- 2001-08-20 RU RU2001123409A patent/RU2209829C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МАТВЕЕВА К.И. и др. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. - М.: Медицина, 1964, с.421. ШМЕЛЕВА Н.А. Справочник фтизиатра. - М.: Медицина, 1975, с. 91-96. СИДОРОВ М.А. и др. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. - М.: Колос, 1995, с. 145-156. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Singh | A method of estimating the numbers of soil protozoa, especially amoebae, based on their differential feeding on bacteria | |
| KR101950245B1 (ko) | 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법 | |
| CN109609460B (zh) | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
| Noman et al. | Single spore isolation as a simple and efficient technique to obtain fungal pure culture | |
| CN105462884B (zh) | 鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法 | |
| CN110475855A (zh) | 用于从牙髓组织衍生的细胞制备牙髓干细胞的方法 | |
| DE2749023C2 (de) | Verfahren zur schnellen Vermehrung von SV3T3 Zellen in vitro | |
| Karapetyan | In vitro cultivation of Giardia duodenalis | |
| CN115261233B (zh) | 一株西红花茎腐病生防真菌及其应用 | |
| CN103849602A (zh) | 一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用 | |
| Lee et al. | Growth and Physiology of Foraminifera in the Laboratory: Part 3: Initial Studies of Rosalina floridana (Cushman) | |
| CN113897300A (zh) | 一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的动物双歧杆菌 | |
| Ross | Pure cultures of some Myxomycetes | |
| RU2209829C2 (ru) | Способ культивирования микроорганизмов mycobacterium tuberculosis | |
| CN102250841A (zh) | 可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN113481108B (zh) | 一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质及其制备方法和用法 | |
| CN106635865B (zh) | 一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用 | |
| CN106544296B (zh) | 促进冈比亚藻生长、光合作用及分泌雪卡毒素的微生物、方法及试剂盒 | |
| Van Kammen | Beijerinck’s contribution to the virus concept—an introduction | |
| CN111548943B (zh) | 黄花棘豆内生真菌及其应用 | |
| RU2648160C2 (ru) | Питательная среда для выделения бактерий yersinia enterocolitica | |
| RU2451743C2 (ru) | Способ получения биомассы туляремийного микроба | |
| RU2106879C1 (ru) | Способ культивирования медленнорастущих микобактерий | |
| CN110272855A (zh) | 一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌ccpm7650及其应用 | |
| RU1347448C (ru) | Штамм гетероплоидных клеток почки теленка таурус-1, используемый для культивирования вирусов |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140821 |