RU2194761C2 - Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции - Google Patents
Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2194761C2 RU2194761C2 RU2001106810A RU2001106810A RU2194761C2 RU 2194761 C2 RU2194761 C2 RU 2194761C2 RU 2001106810 A RU2001106810 A RU 2001106810A RU 2001106810 A RU2001106810 A RU 2001106810A RU 2194761 C2 RU2194761 C2 RU 2194761C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- internal standard
- pcr
- polymerase chain
- chain reaction
- Prior art date
Links
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа определения внутреннего стандарта для количественного определения ДНК методом конкурентной полимеразной цепной реакции. Сущность изобретения: клонирование ДНК, отличающейся по размеру от выявляемой и амплифицирующейся с теми же праймерами, что и определяемая ДНК, в плазмиду, которая может быть выделена из Е. coli, при этом ПЦР проводят при пониженной температуре отжига, что приводит к образованию неспецифических продуктов реакции, отличных по длине от определяемой ДНК, которые используют в качестве внутреннего стандарта в ПЦР. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа и создании универсального стандарта. 2 ил.
Description
Изобретение относится к областям молекулярной биологии и медицины, в которых возникает задача количественной оценки определенной последовательности ДНК, в частности к созданию медицинских диагностикумов для количественного определения выявляемой методом ПЦР последовательности ДНК в биологических жидкостях и тканях. Нами разработан способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК в конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Внутренний стандарт, добавленный в тестируемую пробу, позволяет оценить концентрацию искомой последовательности ДНК и избежать возможности получения ложноотрицательного результата. Внутренний стандарт представляет фрагмент ДНК, имеющий длину, отличную от длины ампликона (участка ДНК, выбранного для амплификации), но общие с ним районы, связывающие праймеры в ПЦР. Таким образом, внесенный в пробу внутренний стандарт и выявляемая последовательность конкурируют за связывание с праймерами и амплификацию в ПЦР. Равные количества продуктов будут амплифицированы в том случае, когда начальные концентрации и того и другого равны. Следует отметить, что при разработке подобных диагностикумов основную трудность представляет конструирование внутреннего стандарта. Ниже приведена работа авторов Ballagi-Pordany A., Belak S. (1), в которой предложен, на наш взгляд, наиболее простой способ конструирования внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта в ПЦР-системе для определения вируса бычьей лейкемии авторы использовали модифицированный фрагмент ДНК гена человеческого β-актина, в который были введены участки, комплементарные праймерам, для определения вируса бычьей лейкемии. Для этого были синтезированы олигонуклеотиды, 3' концы которых являлись праймерами к β-актину, а 5' концы содержали последовательности, комплементарные праймерам для выявления вируса бычьей лейкемии. С синтезированными олигонуклеотидами из ДНК β-актина была проведена ПЦР. В результате реакции был получен продукт, который в дальнейшем мог амплифицироваться как со своими праймерами, так и с праймерами для выявления вируса бычьей лейкемии, что позволило использовать его в качестве внутреннего стандарта для количественного определения последнего.
Метод, предлагаемый нами, не требует, в отличие от прототипа, длительной генно-инженерной работы по модифицированию исходной последовательности ДНК, на базе которой конструируется внутренний стандарт. Мы предлагаем новый способ конструирования внутреннего стандарта для разработки количественных ПЦР- диагностикумов, основанный на том, что при температуре, существенно меньшей, чем оптимальная температура отжига в ПЦР, специфичность взаимодействия "праймер-матрица" снижается, и при этих низких температурах в реакции с произвольной ДНК и праймерами, разработанными для определяемой ДНК, образуется множество неспецифических ПЦР-продуктов, амплифицирующихся с данными праймерами, и, следовательно, коамплифицирующихся с выявляемой ДНК. Полученные ПЦР-продукты, являющиеся фрагментами ДНК, отличными по длине от выявляемого ампликона, после выделения и очистки можно использовать в качестве внутреннего стандарта для выявления искомой ДНК.
Описание предлагаемого способа конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК.
Для конструирования внутреннего стандарта мы предлагаем использовать произвольную ДНК и праймеры, разработанные для выявления искомой ДНК. С произвольной ДНК и праймерами проводят ПЦР, причем в первых пяти циклах температура отжига на 15-20oС ниже температуры, оптимальной для данной пары праймеров, а во всех последующих циклах отжиг осуществляется при оптимальной температуре. Таким образом, в первых пяти циклах образуются неспецифические фрагменты ДНК различной длины, амплифицирующиеся с данными праймерами. При дальнейшей ПЦР эти фрагменты нарабатываются в количестве, достаточном для визуализации в агарозном геле. Полученный ПЦР-продукт представляет собой смесь фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых может служить внутренним стандартом в конкурентной ПЦР для определения наличия и количества данного патогена. Далее выбирают фрагмент, наиболее удобный по длине для использования в качестве внутреннего стандарта. Выбранные фрагменты впоследствии могут быть клонированы в плазмиду, соответствующая плазмида выделена из Е. coli, и после подсчета количества копий плазмидной ДНК в миллилитре водного раствора такие растворы могут быть использованы в качестве внутреннего стандарта для определения концентрации искомой ДНК методом конкурентной полимеразной цепной реакции.
Пример 1: разработка диагностикума для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сывортоке крови человека
В качестве исходной пробы при конструировании внутреннего стандарта для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови человека была взята кДНК, полученная из мононуклеарных клеток крови человека.
В качестве исходной пробы при конструировании внутреннего стандарта для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови человека была взята кДНК, полученная из мононуклеарных клеток крови человека.
ПЦР к ДНК, мкл - 5
10•Буфер (100mМ Tris, pH8.3, 50mМ КСl, 20mМ MgCl2, 40% формамид) - 2,5
dNTP, 2mM, мкл - 2,5
Праймер Нbа, 1мкМ, мкл - 2,5
Праймер Hbs, 1мкМ, мкм - 2,5
TAQ полимераза, ед - 5
Деионизованная вода, мкл - До 25
Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате при следующем температурном режиме:
Первые 5 циклов, oC/с:
94 - 15
37 - 15
72 - 15
Последующие 30 циклов,oC/с:
94 - 15
56 - 15
72 - 15
Анализ ПЦР-продукта осуществляли с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Далее полученный ПЦР-продукт высаживали 96% этиловым спиртом, осадок растворяли в 20 мкл Н2О и легировали в плазмиду pGem-T Easy с последующей трансфекцией в E-coli путем электропорации. Селекцию клеток проводили на чашках Петри с питательной средой в присутствии ампициллина, 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозида и изопропилтиогалактозида. Была отобрана колония клеток, содержащих вектор со вставкой длиной 500 пар оснований. Отобранные клетки были протестированы в ПЦР с праймерами для выявления вируса гепатита В. Полученный в реакции амплификат имел, как и ожидалось, длину 500 пар оснований. Далее, отобранные клетки были размножены в среде 2YT с ампициллином, плазмидная ДНК была выделена, очищена и растворена в воде в концентрации 1010 копий плазмиды в 1 мл. Таким образом, в результате был получен внутренний стандарт - раствор плазмидной ДНК, имеющей район, коамплифицирующийся в ПЦР с определяемой ДНК, в данном случае ДНК вируса гепатита В.
10•Буфер (100mМ Tris, pH8.3, 50mМ КСl, 20mМ MgCl2, 40% формамид) - 2,5
dNTP, 2mM, мкл - 2,5
Праймер Нbа, 1мкМ, мкл - 2,5
Праймер Hbs, 1мкМ, мкм - 2,5
TAQ полимераза, ед - 5
Деионизованная вода, мкл - До 25
Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате при следующем температурном режиме:
Первые 5 циклов, oC/с:
94 - 15
37 - 15
72 - 15
Последующие 30 циклов,oC/с:
94 - 15
56 - 15
72 - 15
Анализ ПЦР-продукта осуществляли с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Далее полученный ПЦР-продукт высаживали 96% этиловым спиртом, осадок растворяли в 20 мкл Н2О и легировали в плазмиду pGem-T Easy с последующей трансфекцией в E-coli путем электропорации. Селекцию клеток проводили на чашках Петри с питательной средой в присутствии ампициллина, 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозида и изопропилтиогалактозида. Была отобрана колония клеток, содержащих вектор со вставкой длиной 500 пар оснований. Отобранные клетки были протестированы в ПЦР с праймерами для выявления вируса гепатита В. Полученный в реакции амплификат имел, как и ожидалось, длину 500 пар оснований. Далее, отобранные клетки были размножены в среде 2YT с ампициллином, плазмидная ДНК была выделена, очищена и растворена в воде в концентрации 1010 копий плазмиды в 1 мл. Таким образом, в результате был получен внутренний стандарт - раствор плазмидной ДНК, имеющей район, коамплифицирующийся в ПЦР с определяемой ДНК, в данном случае ДНК вируса гепатита В.
Был проведен количественный анализ сывороток крови человека на наличие вируса гепатита В. Пробы для анализа были приготовлены по методике, запатентованной нами ранее (2). Коротко: 50 мкл сыворотки были разведены в буфере, содержащем детергент NP-40 и диметилсульфоксид, смесь была прогрета при 95oС в течение 10 мин, после чего образовавшийся сгусток был осажден центрифугированием, а супернатант разлит по 2,5 мкл в пробирки для PCR, за исключением первой пробирки, куда было добавлено 5 мкл Н2О (отрицательный контроль). Во вторую пробирку к сыворотке было добавлено 2,5 мкл Н2О, а в пробирки с 3-й по 10-ю к сыворотке последовательно добавляли по 2,5 мкл внутреннего стандарта в концентрациях от 109 до 103 копий/мл. Электрофореграмма продуктов ПЦР в агарозном геле, содержащем бромистый этидий, приведена на фиг. 1.
Из электрофореграммы видно, что на дорожке N5 - равные количества наработанных в процессе ПЦР продуктов, что означает равенство начальных концентраций матриц. Поскольку концентрация внутреннего стандарта в данном случае 107 копий/ мл, следовательно, концентрация вируса в крови больного тоже 107 копий/ мл.
Пример 2:
Получение внутреннего стандарта для ПЦР-определения рибосомной ДНК грибов.
Получение внутреннего стандарта для ПЦР-определения рибосомной ДНК грибов.
При конструировании внутреннего стандарта для определения рибосомной ДНК грибов в крови человека, как и в предыдущем примере, взята кДНК, полученная из мононуклеарных клеток крови человека. Использованы следующие универсальные пангрибковые праймеры:
Fu-S - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC - 3'
Fu-aS - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'.
Fu-S - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC - 3'
Fu-aS - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'.
Вся последующая работа описана в предыдущем примере.
В результате получен фрагмент ДНК длиной 500 пар нуклеотидов, содержащий на концах последовательности комплементарные праймерам Fu-S и Fu-aS соответственно. Фрагмент использован в качестве внутреннего положительного стандарта при амплификации участка рибосомной ДНК Candida albicans (см. фиг. 2).
Список литературы
1. Mol Cell Probes 1996 Jun; 10(3): 159-64 The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR.
1. Mol Cell Probes 1996 Jun; 10(3): 159-64 The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR.
2. Февралева И.С., Судариков А.Б. Способ определения парвовируса Б 19. Патент на изобретение 2146372, Государственный реестр изобретений Российской Федерации, 10 марта 2000 г., Москва.
Claims (1)
- Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК в конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий амплификацию в ПЦР и клонирование ДНК с измененным по сравнению с выявляемой ДНК размером и амплифицирующейся с теми же праймерами, что и выявляемая ДНК, и выявление плазмидной ДНК, имеющей район, коамплифицирующийся с выявляемой ДНК, отличающийся тем, что ПЦР проводят с использованием в качестве матрицы произвольной ДНК при температуре отжига ниже оптимальной для используемых праймеров и неспецифический продукт амплификации, отличный по длине от выявляемого продукта, используют в качестве внутреннего стандарта.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001106810A RU2194761C2 (ru) | 2001-03-15 | 2001-03-15 | Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001106810A RU2194761C2 (ru) | 2001-03-15 | 2001-03-15 | Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2194761C2 true RU2194761C2 (ru) | 2002-12-20 |
Family
ID=20247103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001106810A RU2194761C2 (ru) | 2001-03-15 | 2001-03-15 | Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2194761C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268945C2 (ru) * | 2003-12-23 | 2006-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова | Способ количественного определения копий днк и рнк мишеней методом полимеразной цепной реакции |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2116349C1 (ru) * | 1991-09-16 | 1998-07-27 | Министр обороны Объединенного королевства Великобритании и Северной Ирландии | Способ обнаружения идентификации и/или количественной оценки материала, набор для анализа, оптический волновод, биосенсор |
| RU2143004C1 (ru) * | 1993-09-27 | 1999-12-20 | АРЧ Девелопмент Корпорейшн | Способ определения последовательности нуклеиновой кислоты (варианты) и набор для использования при определении последовательности нуклеиновой кислоты |
| RU2146707C1 (ru) * | 1996-04-11 | 2000-03-20 | Куликова Валентина Филипповна | Способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот |
-
2001
- 2001-03-15 RU RU2001106810A patent/RU2194761C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2116349C1 (ru) * | 1991-09-16 | 1998-07-27 | Министр обороны Объединенного королевства Великобритании и Северной Ирландии | Способ обнаружения идентификации и/или количественной оценки материала, набор для анализа, оптический волновод, биосенсор |
| RU2143004C1 (ru) * | 1993-09-27 | 1999-12-20 | АРЧ Девелопмент Корпорейшн | Способ определения последовательности нуклеиновой кислоты (варианты) и набор для использования при определении последовательности нуклеиновой кислоты |
| RU2146707C1 (ru) * | 1996-04-11 | 2000-03-20 | Куликова Валентина Филипповна | Способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268945C2 (ru) * | 2003-12-23 | 2006-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова | Способ количественного определения копий днк и рнк мишеней методом полимеразной цепной реакции |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111593145B (zh) | 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒 | |
| ES2773313T3 (es) | Sonda de ácido nucleico con un único marcador fluoróforo unido a una citosina interna para uso en amplificación isotérmica mediada por bucle | |
| ES2439951T3 (es) | Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna | |
| JP6126381B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
| ES2260378T3 (es) | Pcr multiplex cuantitativa con un intervalo dinamico elevado. | |
| CN105821138A (zh) | 一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法 | |
| ES2605303T3 (es) | Detección cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos microbianos | |
| KR102030244B1 (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| CN104131112A (zh) | 一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用 | |
| CN113322308A (zh) | 一种检测hbv的荧光传感器及其制备与应用 | |
| CN105385684B (zh) | 用于为核酸扩增作对照的寡核苷酸 | |
| RU2194761C2 (ru) | Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции | |
| CN114480690A (zh) | 金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒 | |
| US5631129A (en) | Target nucleic acid amplification/detection systems and methods for the use thereof | |
| JP7176682B2 (ja) | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 | |
| CN111206122A (zh) | 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒 | |
| KR102030245B1 (ko) | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| Garafutdinov et al. | New method for microRNA detection based on multimerization | |
| CN110257484A (zh) | 一种核酸恒温荧光扩增检测方法及试剂盒 | |
| CN100487432C (zh) | 采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法 | |
| WO2011087782A2 (en) | Compositions, kits and methods for detection of trypanosoma cruzi using loop-mediated isothermal amplication | |
| Wang et al. | One-step and highly sensitive quantification of fusion genes with isothermal amplification initiated by a fusion-site anchored stem-loop primer | |
| IL143638A (en) | Method for diagnosing the presence of an organism, a development of a disease or an infection and/or of a cell, in a biological sample | |
| GROVER et al. | Simple, sensitive and accurate method for the quantification of prothrombin mRNA by using competitive PCR | |
| CN112322782A (zh) | 聚合酶螺旋反应快速检测kshv的引物组、试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090316 |