RU2052995C1 - Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок - Google Patents
Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок Download PDFInfo
- Publication number
- RU2052995C1 RU2052995C1 RU93058064A RU93058064A RU2052995C1 RU 2052995 C1 RU2052995 C1 RU 2052995C1 RU 93058064 A RU93058064 A RU 93058064A RU 93058064 A RU93058064 A RU 93058064A RU 2052995 C1 RU2052995 C1 RU 2052995C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- homogenate
- viral antigen
- mink
- ultracentrifugation
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: ветеринарная вирусология, а именно получение диагностических препаратов. Сущность изобретения, органы инфицированных алеутской болезнью норок (селезенки, почки, печень) гомогенизируют в буферной системе, содержащей детергенты, гомогенат обрабатывают ультразвуком. Для осаждения неразрушенных клеток гомогенат дважды центрифугируют. К супернатанту добавляют полиэтиленгликоль и смесь выдерживают в течение 4 ч при 4oС. Осажденный антиген уплотняют центрифугированием, осадок растворяют в минимальном количестве буфера. Вирусный антиген из раствора осаждают ультрацентрифугированием при 300000 g в течение 2 ч. Полученный вирусный препарат очищают от сопутствующих белков гель-хроматографией на сефарозе 6В. Вирусный антиген обладает высокой антигенной активностью и специфичностью. 1 з. п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов.
Известен способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок, основанный на экстракции комплексов вируса с антителами с последующим разрушением этих комплексов с помощью фреонов [1] Недостатком данного способа является снижение антигенной активности вирусного препарата при обработке комплексов фреонами и неполная очистка от сопутствующих белков, что значительно снижает специфичность и чувствительность определения в радиоиммунном анализе (РИА) [2]
В качестве прототипа выбран способ получения антигена, включающий гомогенизацию селезенок больных алеутской болезнью норок в физиологическом растворе, содержащем антибиотики, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, воздействие детергентом тритоном Х-100, ультрацентрифугирование при 100000 g и дальнейшую доочистку антигена с помощью гель-фильтрации [3]
Известный способ не обеспечивает достаточной степени очистки вирусного антигена от ферритина и других балластных тканевых белков, что снижает антигенную активность и специфичность препарата. Это ограничивает возможность применения данного антигена для диагностики алеутской болезни норок с помощью радиоиммунологического анализа.
В качестве прототипа выбран способ получения антигена, включающий гомогенизацию селезенок больных алеутской болезнью норок в физиологическом растворе, содержащем антибиотики, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, воздействие детергентом тритоном Х-100, ультрацентрифугирование при 100000 g и дальнейшую доочистку антигена с помощью гель-фильтрации [3]
Известный способ не обеспечивает достаточной степени очистки вирусного антигена от ферритина и других балластных тканевых белков, что снижает антигенную активность и специфичность препарата. Это ограничивает возможность применения данного антигена для диагностики алеутской болезни норок с помощью радиоиммунологического анализа.
Настоящее изобретение направлено на получение вирусного антигена, свободного от примесей ферритина и других тканевых белков, обладающего большей антигенной активностью и специфичностью.
Поставленная задача решена тем, что в способе получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок, включающем гомогенизацию внутренних органов больных норок, проводят обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, ультрацентрифугирование и гель-фильтрацию антигена, ткань гомогенизируют в буферной системе, содержащей детергенты, (рН 7,2), антиген осаждают, добавляя к обработанному ультразвуком гомогенату полиэтиленгликоль, а ультрацентрифугирование осуществляют при 300000 g в течение 2 ч. Доочистку антигена осуществляют на сефарозе 6В.
Отличительной особенностью заявляемого способа от прототипа является то, что выделение антигена проводят комплексом детергентов в буферной системе непосредственно из гомогената тканей норок, а не из супернатанта после осаждения остатков ткани, как в известном способе. Экспериментально показано, что это позволяет увеличить выход антигена в 1,5 раза по сравнению с выходом антигена по методике способа-прототипа. Кроме того, осаждение антигена полиэтиленгликолем упрощает методику очистки. Ультрацентрифугирование при 300000 g в течение двух часов и рехроматография на сефарозе 6В освобождает препарат от сопутствующих клеточных белков, что способствует высокой степени очистки получаемого антигена, а отсутствие ферритина в препарате позволяет избежать ошибок, связанных с определением антител к ферритину.
Выделенный вирус алеутской болезни норок иммунохимически идентичен промышленному антигену, так как кроличьи антитела к полученному вирусу реагируют с коммерческим препаратом антигена в РИОЭФ (реакции осмоиммуноэлектрофореза) и полосы преципитации этих антигенов сливаются.
Важной для диагностики алеутской болезни норок характеристикой очищенного антигена является его участие в конкуренции с меченым 125 I-промышленным антигеном за связывание с ограниченным количеством антител. Меченый антиген был получен путем радиоактивного иодирования коммерческого антигена [2]
Экспериментально показано, что использование меченого 125 I-антигена, полученного на основе высокоочищенного вирусного препарата, выделенного заявляемым способом, позволяет повысить чувствительность и специфичность радиоиммунологических анализов, направленных на раннее выявление заболевания норок алеутской болезнью. Так с помощью РИА можно определить 5-10 нг/мл антигена алеутской болезни норок, полученного заявляемым способом, и только 40-50 нг/мл антигена, полученного известным способом. Связывание иодированного вируса, полученного заявленным способом, с сывороткой больных норок более специфично по сравнению со связыванием иодированного вируса, выделенного по способу-прототипу. Предлагаемый препарат вируса с одним и тем же количеством антисыворотки связывается на 30% от внесенной радиоактивности, а полученный известным способом на 50% Повышение связывания вируса, выделенного по прототипу, объясняется присутствием в его составе примесных антигенов, которые реагируют с соответствующими антителами сыворотки больных норок.
Экспериментально показано, что использование меченого 125 I-антигена, полученного на основе высокоочищенного вирусного препарата, выделенного заявляемым способом, позволяет повысить чувствительность и специфичность радиоиммунологических анализов, направленных на раннее выявление заболевания норок алеутской болезнью. Так с помощью РИА можно определить 5-10 нг/мл антигена алеутской болезни норок, полученного заявляемым способом, и только 40-50 нг/мл антигена, полученного известным способом. Связывание иодированного вируса, полученного заявленным способом, с сывороткой больных норок более специфично по сравнению со связыванием иодированного вируса, выделенного по способу-прототипу. Предлагаемый препарат вируса с одним и тем же количеством антисыворотки связывается на 30% от внесенной радиоактивности, а полученный известным способом на 50% Повышение связывания вируса, выделенного по прототипу, объясняется присутствием в его составе примесных антигенов, которые реагируют с соответствующими антителами сыворотки больных норок.
Предлагаемый способ подтверждается следующим примером конкретного выполнения.
Органы (50 г) инфицированных алеутской болезнью норок (селезенки, почки, печень) гомогенизируют в соотношении 1:10 в буферной системе, содержащей детергенты (50 мМ трис-НСl, 0,15 М NaCl, 1% тритона Х-100, 1 мМ фенилметил-сульфонилфторида, 1% дезоксихолата натрия, рН 7,2). Гомогенат обрабатывают ультразвуком трехкратно по одной минуте при частоте 22 кГц/с на аппарате УЗДН-2Т в сосуде со льдом при 4оС. Для осаждения неразрушенных клеток гомогенат дважды центрифугируют по 30 мин при 12000 об/мин и 4оС на центрифуге К-24. К супернатанту добавляют полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) и смесь выдерживают в течение 4 ч при 4оС. Осажденный антиген уплотняют центрифугированием при 12000 об/мин 30 мин при 4оС. Осадок растворяют в минимальном количестве ТНЭ-буфера (10 мМ трис-НСl, 0,1 М NaCl, 1 мМ натриевой соли ЭДТА, 0,05% NP-40, рН 7,4). Вирусный антиген из раствора осаждают ультрацентрифугированием при 300000 g в течение 2 ч при 4оС, а затем осажденный антиген растворяют в 0,5 мл ТНЭ-буфера. Полученный вирусный препарат далее очищают от сопутствующих белков, в том числе и ферритина, гель-хроматографией на сефарозе 6В. Для более полной очистки вирус рехроматографируют в тех же условиях. Содержание белка в элюате контролируют проточным спектрофотометром при длине волны 280 нм.
Для определения фракций, содержащих вирусный антиген, используют конкурентный радиоиммунный анализ с меченым 125 I-коммерческим антигеном.
Фракции, содержащие вирус, объединяют, концентрируют ультрафильтрацией до содержания белка 0,5 мг/мл и диализуют против физиологического раствора, забуференного фосфатами, рН 7,2.
Гомогенность препарата контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Чистоту полученного препарата и его соответствие антигену алеутской болезни подтверждают полосы полипептидов с М. М. 86, 76 и 28 КД и отсутствие дополнительных полос, в том числе соответствующих ферритину.
По данным электронной микроскопии полученный вирус имеет круглую форму и размеры 24-25 нм, что согласуется с данными.
Claims (2)
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК, включающий гомогенизацию внутрених органов больных норок, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, ультрацентрифугирование и гель-фильтрацию препарата, отличающийся тем, что гомогенизацию осуществляют в буферной системы, содержащей детергенты с рН 7,2, после обработки ультразвуком к гомогенату добавляют полиэтиленгликоль, а ультрацентрифугирование проводят при 300000 g в течение 2 ч.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гель-фильтрацию осуществляют на сефарозе CB.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93058064A RU2052995C1 (ru) | 1993-12-30 | 1993-12-30 | Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93058064A RU2052995C1 (ru) | 1993-12-30 | 1993-12-30 | Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2052995C1 true RU2052995C1 (ru) | 1996-01-27 |
RU93058064A RU93058064A (ru) | 1997-03-20 |
Family
ID=20151071
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93058064A RU2052995C1 (ru) | 1993-12-30 | 1993-12-30 | Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2052995C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2592232C1 (ru) * | 2015-08-24 | 2016-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФГБУН БПИ ДВО РАН) | Способ получения диагностической сыворотки для выявления вируса алеутской болезни норок |
-
1993
- 1993-12-30 RU RU93058064A patent/RU2052995C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Porter D.D. Cho H.I. Comprehensive virology 1980, 16, p.238. 2. Авторское свидетельство СССР N 247307, кл. A 61K 39/12, опублик. 1988. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2592232C1 (ru) * | 2015-08-24 | 2016-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФГБУН БПИ ДВО РАН) | Способ получения диагностической сыворотки для выявления вируса алеутской болезни норок |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH03504975A (ja) | 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法 | |
JP2004515202A5 (ru) | ||
JP2001231555A (ja) | 抗−プロカルシトニン抗体、その調製および使用 | |
Kitajima et al. | Nodular primary cutaneous amyloidosis: isolation and characterization of amyloid fibrils | |
JPS60501241A (ja) | ウイルス抗原、その製法および診断と治療(ワクチン)におけるその使用 | |
US5616685A (en) | snRNP-A antigen and fragments thereof | |
JPS62501563A (ja) | リウマチ性関節炎の特徴である蛋白質 | |
RU2052995C1 (ru) | Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок | |
US6992061B2 (en) | Purification method | |
JP2875226B2 (ja) | 原発性胆汁肝硬変自己抗原 | |
JPS6053009B2 (ja) | 肝炎ウイルスbによる急性または慢性の感染治療用の新規医薬 | |
IMAMURA et al. | Pemphigus foliaceus, myasthenia gravis, thymoma and red cell aplasia A CASE REPORT AND INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE STUDY ON 38 PATIENTS WITH MYASTHENIA GRAVIS | |
Kanalas et al. | Isolation of a 330-kDa glycoprotein from human kidney similar to the Heymann nephritis autoantigen (gp330). | |
White et al. | Immunoglobulin D myeloma and amyloidosis: immunochemical and structural studies of Bence Jones and amyloid fibrillar proteins | |
JPH0132839B2 (ru) | ||
Linke et al. | Hemodialysis: Demonstration of truncated β [SUB2]-microglobulin in AB-amyloid in situ. | |
EP0357637B1 (en) | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use | |
US3630840A (en) | Process for purifying solutions of the foot-and-mouth disease virus | |
Weiss et al. | Ultrastructural features of the plasma cells in “non-secretory” myeloma | |
Bhattacharyya et al. | Chemical approaches to penicillin allergy—II: The involvement of a carrier-receptor protein in penicillin allergenesis | |
ES2304340T3 (es) | Anticuerpos dirigidos contra procalcitonina, su preparacion y uso. | |
EP0407451A1 (en) | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use | |
RU93058064A (ru) | Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок | |
JPS6346760B2 (ru) | ||
JPS60105964A (ja) | 蛋白質mp2およびその製法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071231 |