RU2052995C1 - Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок - Google Patents

Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок Download PDF

Info

Publication number
RU2052995C1
RU2052995C1 RU93058064A RU93058064A RU2052995C1 RU 2052995 C1 RU2052995 C1 RU 2052995C1 RU 93058064 A RU93058064 A RU 93058064A RU 93058064 A RU93058064 A RU 93058064A RU 2052995 C1 RU2052995 C1 RU 2052995C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antigen
homogenate
viral antigen
mink
ultracentrifugation
Prior art date
Application number
RU93058064A
Other languages
English (en)
Other versions
RU93058064A (ru
Inventor
Г.А. Набережных
А.М. Ковалевская
Р.В. Гладких
Л.А. Минская
Original Assignee
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН filed Critical Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН
Priority to RU93058064A priority Critical patent/RU2052995C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2052995C1 publication Critical patent/RU2052995C1/ru
Publication of RU93058064A publication Critical patent/RU93058064A/ru

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Использование: ветеринарная вирусология, а именно получение диагностических препаратов. Сущность изобретения, органы инфицированных алеутской болезнью норок (селезенки, почки, печень) гомогенизируют в буферной системе, содержащей детергенты, гомогенат обрабатывают ультразвуком. Для осаждения неразрушенных клеток гомогенат дважды центрифугируют. К супернатанту добавляют полиэтиленгликоль и смесь выдерживают в течение 4 ч при 4oС. Осажденный антиген уплотняют центрифугированием, осадок растворяют в минимальном количестве буфера. Вирусный антиген из раствора осаждают ультрацентрифугированием при 300000 g в течение 2 ч. Полученный вирусный препарат очищают от сопутствующих белков гель-хроматографией на сефарозе 6В. Вирусный антиген обладает высокой антигенной активностью и специфичностью. 1 з. п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов.
Известен способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок, основанный на экстракции комплексов вируса с антителами с последующим разрушением этих комплексов с помощью фреонов [1] Недостатком данного способа является снижение антигенной активности вирусного препарата при обработке комплексов фреонами и неполная очистка от сопутствующих белков, что значительно снижает специфичность и чувствительность определения в радиоиммунном анализе (РИА) [2]
В качестве прототипа выбран способ получения антигена, включающий гомогенизацию селезенок больных алеутской болезнью норок в физиологическом растворе, содержащем антибиотики, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, воздействие детергентом тритоном Х-100, ультрацентрифугирование при 100000 g и дальнейшую доочистку антигена с помощью гель-фильтрации [3]
Известный способ не обеспечивает достаточной степени очистки вирусного антигена от ферритина и других балластных тканевых белков, что снижает антигенную активность и специфичность препарата. Это ограничивает возможность применения данного антигена для диагностики алеутской болезни норок с помощью радиоиммунологического анализа.
Настоящее изобретение направлено на получение вирусного антигена, свободного от примесей ферритина и других тканевых белков, обладающего большей антигенной активностью и специфичностью.
Поставленная задача решена тем, что в способе получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок, включающем гомогенизацию внутренних органов больных норок, проводят обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, ультрацентрифугирование и гель-фильтрацию антигена, ткань гомогенизируют в буферной системе, содержащей детергенты, (рН 7,2), антиген осаждают, добавляя к обработанному ультразвуком гомогенату полиэтиленгликоль, а ультрацентрифугирование осуществляют при 300000 g в течение 2 ч. Доочистку антигена осуществляют на сефарозе 6В.
Отличительной особенностью заявляемого способа от прототипа является то, что выделение антигена проводят комплексом детергентов в буферной системе непосредственно из гомогената тканей норок, а не из супернатанта после осаждения остатков ткани, как в известном способе. Экспериментально показано, что это позволяет увеличить выход антигена в 1,5 раза по сравнению с выходом антигена по методике способа-прототипа. Кроме того, осаждение антигена полиэтиленгликолем упрощает методику очистки. Ультрацентрифугирование при 300000 g в течение двух часов и рехроматография на сефарозе 6В освобождает препарат от сопутствующих клеточных белков, что способствует высокой степени очистки получаемого антигена, а отсутствие ферритина в препарате позволяет избежать ошибок, связанных с определением антител к ферритину.
Выделенный вирус алеутской болезни норок иммунохимически идентичен промышленному антигену, так как кроличьи антитела к полученному вирусу реагируют с коммерческим препаратом антигена в РИОЭФ (реакции осмоиммуноэлектрофореза) и полосы преципитации этих антигенов сливаются.
Важной для диагностики алеутской болезни норок характеристикой очищенного антигена является его участие в конкуренции с меченым 125 I-промышленным антигеном за связывание с ограниченным количеством антител. Меченый антиген был получен путем радиоактивного иодирования коммерческого антигена [2]
Экспериментально показано, что использование меченого 125 I-антигена, полученного на основе высокоочищенного вирусного препарата, выделенного заявляемым способом, позволяет повысить чувствительность и специфичность радиоиммунологических анализов, направленных на раннее выявление заболевания норок алеутской болезнью. Так с помощью РИА можно определить 5-10 нг/мл антигена алеутской болезни норок, полученного заявляемым способом, и только 40-50 нг/мл антигена, полученного известным способом. Связывание иодированного вируса, полученного заявленным способом, с сывороткой больных норок более специфично по сравнению со связыванием иодированного вируса, выделенного по способу-прототипу. Предлагаемый препарат вируса с одним и тем же количеством антисыворотки связывается на 30% от внесенной радиоактивности, а полученный известным способом на 50% Повышение связывания вируса, выделенного по прототипу, объясняется присутствием в его составе примесных антигенов, которые реагируют с соответствующими антителами сыворотки больных норок.
Предлагаемый способ подтверждается следующим примером конкретного выполнения.
Органы (50 г) инфицированных алеутской болезнью норок (селезенки, почки, печень) гомогенизируют в соотношении 1:10 в буферной системе, содержащей детергенты (50 мМ трис-НСl, 0,15 М NaCl, 1% тритона Х-100, 1 мМ фенилметил-сульфонилфторида, 1% дезоксихолата натрия, рН 7,2). Гомогенат обрабатывают ультразвуком трехкратно по одной минуте при частоте 22 кГц/с на аппарате УЗДН-2Т в сосуде со льдом при 4оС. Для осаждения неразрушенных клеток гомогенат дважды центрифугируют по 30 мин при 12000 об/мин и 4оС на центрифуге К-24. К супернатанту добавляют полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) и смесь выдерживают в течение 4 ч при 4оС. Осажденный антиген уплотняют центрифугированием при 12000 об/мин 30 мин при 4оС. Осадок растворяют в минимальном количестве ТНЭ-буфера (10 мМ трис-НСl, 0,1 М NaCl, 1 мМ натриевой соли ЭДТА, 0,05% NP-40, рН 7,4). Вирусный антиген из раствора осаждают ультрацентрифугированием при 300000 g в течение 2 ч при 4оС, а затем осажденный антиген растворяют в 0,5 мл ТНЭ-буфера. Полученный вирусный препарат далее очищают от сопутствующих белков, в том числе и ферритина, гель-хроматографией на сефарозе 6В. Для более полной очистки вирус рехроматографируют в тех же условиях. Содержание белка в элюате контролируют проточным спектрофотометром при длине волны 280 нм.
Для определения фракций, содержащих вирусный антиген, используют конкурентный радиоиммунный анализ с меченым 125 I-коммерческим антигеном.
Фракции, содержащие вирус, объединяют, концентрируют ультрафильтрацией до содержания белка 0,5 мг/мл и диализуют против физиологического раствора, забуференного фосфатами, рН 7,2.
Гомогенность препарата контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Чистоту полученного препарата и его соответствие антигену алеутской болезни подтверждают полосы полипептидов с М. М. 86, 76 и 28 КД и отсутствие дополнительных полос, в том числе соответствующих ферритину.
По данным электронной микроскопии полученный вирус имеет круглую форму и размеры 24-25 нм, что согласуется с данными.

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК, включающий гомогенизацию внутрених органов больных норок, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, ультрацентрифугирование и гель-фильтрацию препарата, отличающийся тем, что гомогенизацию осуществляют в буферной системы, содержащей детергенты с рН 7,2, после обработки ультразвуком к гомогенату добавляют полиэтиленгликоль, а ультрацентрифугирование проводят при 300000 g в течение 2 ч.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гель-фильтрацию осуществляют на сефарозе CB.
RU93058064A 1993-12-30 1993-12-30 Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок RU2052995C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU93058064A RU2052995C1 (ru) 1993-12-30 1993-12-30 Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU93058064A RU2052995C1 (ru) 1993-12-30 1993-12-30 Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2052995C1 true RU2052995C1 (ru) 1996-01-27
RU93058064A RU93058064A (ru) 1997-03-20

Family

ID=20151071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU93058064A RU2052995C1 (ru) 1993-12-30 1993-12-30 Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2052995C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2592232C1 (ru) * 2015-08-24 2016-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФГБУН БПИ ДВО РАН) Способ получения диагностической сыворотки для выявления вируса алеутской болезни норок

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Porter D.D. Cho H.I. Comprehensive virology 1980, 16, p.238. 2. Авторское свидетельство СССР N 247307, кл. A 61K 39/12, опублик. 1988. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2592232C1 (ru) * 2015-08-24 2016-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (ФГБУН БПИ ДВО РАН) Способ получения диагностической сыворотки для выявления вируса алеутской болезни норок

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH03504975A (ja) 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法
JP2004515202A5 (ru)
JP2001231555A (ja) 抗−プロカルシトニン抗体、その調製および使用
Kitajima et al. Nodular primary cutaneous amyloidosis: isolation and characterization of amyloid fibrils
JPS60501241A (ja) ウイルス抗原、その製法および診断と治療(ワクチン)におけるその使用
US5616685A (en) snRNP-A antigen and fragments thereof
JPS62501563A (ja) リウマチ性関節炎の特徴である蛋白質
RU2052995C1 (ru) Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок
US6992061B2 (en) Purification method
JP2875226B2 (ja) 原発性胆汁肝硬変自己抗原
JPS6053009B2 (ja) 肝炎ウイルスbによる急性または慢性の感染治療用の新規医薬
IMAMURA et al. Pemphigus foliaceus, myasthenia gravis, thymoma and red cell aplasia A CASE REPORT AND INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE STUDY ON 38 PATIENTS WITH MYASTHENIA GRAVIS
Kanalas et al. Isolation of a 330-kDa glycoprotein from human kidney similar to the Heymann nephritis autoantigen (gp330).
White et al. Immunoglobulin D myeloma and amyloidosis: immunochemical and structural studies of Bence Jones and amyloid fibrillar proteins
JPH0132839B2 (ru)
Linke et al. Hemodialysis: Demonstration of truncated β [SUB2]-microglobulin in AB-amyloid in situ.
EP0357637B1 (en) General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use
US3630840A (en) Process for purifying solutions of the foot-and-mouth disease virus
Weiss et al. Ultrastructural features of the plasma cells in “non-secretory” myeloma
Bhattacharyya et al. Chemical approaches to penicillin allergy—II: The involvement of a carrier-receptor protein in penicillin allergenesis
ES2304340T3 (es) Anticuerpos dirigidos contra procalcitonina, su preparacion y uso.
EP0407451A1 (en) General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use
RU93058064A (ru) Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок
JPS6346760B2 (ru)
JPS60105964A (ja) 蛋白質mp2およびその製法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20071231