RU2001110103A

RU2001110103A - Способ получения инсерционных мутаций

Info

Publication number: RU2001110103A
Application number: RU2001110103/13A
Authority: RU
Inventors: Уилльям С. РЕЗНИКОФФ; Игор Ю. ГОРИШИН
Original assignee: Висконсин Элумни Рисёч Фаундейшн
Priority date: 1998-09-23
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2003-05-27

Claims

1. Способ получения инсерционной мутации в случайном или псевдослучайном положении в клеточной нуклеиновой кислоте в клетке-мишени, предусматривающий стадию интродукции в клетку-мишень синаптического комплекса, который включает (а) протеин Tn5-транспозазы и (б) полинуклеотид, который включает пару нуклеотидных последовательностей, адаптированных к функциональному взаимодействию с Tn5-транспозазой с образованием синаптического комплекса, и мобильную нуклеотидную последовательность между ними, в условиях, которые опосредуют транспозиции в клеточной нуклеиновой кислоте.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию объединения протеина Tn5-транспозазы и полинуклеотида in vitro в условиях, которые являются неблагоприятными для переноса полинуклеотидной цепи с образованием синаптического комплекса.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что протеин Tn5-транспозазы и полинуклеотид объединяют in vitro в реакционной смеси, которая содержит ионы магния в концентрации, недостаточной для поддержания переноса полинуклеотидной цепи.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в реакционной смеси отсутствуют ионы магния.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что Tn5-транспозаза представляет собой мутантную Tn5-транспозазу, модифицированную относительно Tn5-транспозазы дикого типа, мутантная транспозаза включает мутацию в положении 54 и мутацию в положении 372, причем мутантная транспозаза обладает большей авидностью по отношению к инвертированным повторяющимся последовательностям на концах Tn5 донорной ДНК и пониженной способностью образовывать мультимеры по сравнению с Tn5-транспозазой дикого типа.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что мутация в положении 54 представляет собой мутацию, характеризующуюся заменой.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в положении 54 находится лизин.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что мутация в положении 372 представляет собой мутацию, характеризующуюся заменой.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в положении 372 находится пролин.

10. Способ по п.5, отличающийся тем, что Tn5-транспозаза дополнительно имеет мутацию, характеризующуюся заменой в положении 56, причем мутантная транспозаза лишена ингибирующей активности.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в положении 56 находится аланин.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, адаптированная к функциональному взаимодействию с Tn5-транспозазой, представляет собой полинуклеотидную последовательность, состоящую из 18 или 19 пар оснований, которая включает нуклеотид А в положении 10, нуклеотид Т в положении 11 и нуклеотид А в положении 12.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность имеет последовательность 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3'.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность имеет последовательность 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3'.

15. Способ получения синаптического комплекса между (а) протеином Tn5-транспозазы и (б) полинуклеотидом, который включает пару нуклеотидных последовательностей, адаптированных к функциональному взаимодействию с Tn5-транспозазой, с образованием синаптического комплекса, и мобильную нуклеотидную последовательность между ними, способ предусматривает стадию объединения ингредиентов, указанных в (а) и (б), in vitro в условиях, которые являются неблагоприятными для переноса полинуклеотидной цепи с образованием синаптического комплекса.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что протеин Tn5-транспозазы и полинуклеотид объединяют in vitro в реакционной смеси, которая содержит ионы магния в концентрации, недостаточной для поддержания переноса полинуклеотидной цепи.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что в реакционной смеси отсутствуют ионы магния.

18. Способ получения банка инсерционных мутаций в случайных и псевдослучайных положениях в клеточной нуклеиновой кислоте в многочисленных клетках-мишенях, предусматривающий стадии интродукции в клетку-мишень синаптического комплекса, который включает (а) протеин Tn5-транспозазы и (б) полинуклеотид, который включает пару нуклеотидных последовательностей, адаптированных к функциональному взаимодействию с Tn5-транспозазой, с образованием синаптического комплекса, и мобильную нуклеотидную последовательность между ними, причем мобильная нуклеотидная последовательность включает селектируемый маркер, в условиях, которые опосредуют транспозиции in vitro в клеточной нуклеиновой кислоте, и отбора клеток, которые содержат селектрируемый маркер.