RS65840B1 - Stabilne formulacije lipida i lipozoma - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni navodi se odnose na vodene formulacije lipida i/ili lipozoma sa povećanom hemijskom stabilnošću, na postupke za pripremu takvih vodenih formulacija, kao i na komplete koji ih sadrže. Predmetni navodi se dalje odnose na postupke za pripremu farmaceutskih kompozicija na bazi lipida, na farmaceutske kompozicije pripremljene takvim postupcima i na postupke za hemijsku stabilizaciju vodenih formulacija lipida i/ili lipozoma.

Osnov

[0002] Lipidi u vodi mogu da postoje u različitim oblicima lamelarnih ili nelamelarnih (npr. kubnih ili heksagonalnih) faza, koje se često nazivaju liotropne lipidne faze. Na primer, lipozomi se sastoje od uni- ili multilamelarnih dvosloja lipida koji se samostalno zatvaraju dispergovanih u vodi. Uopštenije, oni mogu da se smatraju koloidnim sistemima u kojima su lipidi organizovani u lamelarnom obliku. Mnogi od ovih sistema koji sadrže liotropne lipidne faze su od interesa kao farmaceutske formulacije za isporuku lekova ili druge primene. Jedan od uslova za uvođenje takvih farmaceutskih proizvoda na bazi lipida u kliničku praksu je mogućnost da se obezbedi dovoljan rok upotrebe nakon proizvodnje. Ovde, pored drugih kriterijuma, ograničavajući faktor može da bude hemijska stabilnost lipida koji formiraju lipozom. Lipozomi se obično sklapaju od fosfolipida ili srodnih jedinjenja. Fosfolipidi se sastoje od masnih kiselina, povezanih sa osnovnim lancem triglicerida preko estarskih veza. Ove estarske veze su podložne hemijskoj hidrolizi, koja se ubrzava u kiselim ili baznim uslovima (kisela ili bazna hidroliza estara). Ako lipozomi ili drugi sistemi koji su prisutni kao liotropne lipidne faze treba da se skladište nekoliko meseci ili godina u vodenoj fazi, hidroliza estara može da postane ograničavajući faktor stabilnosti roka upotrebe.

[0003] S obzirom na ubrzanje hidrolize estara u kiselim ili baznim uslovima, obično se očekuje da najbolja stabilnost ili najniža brzina hidrolize za lipide bude u pH opsegu između 6 i 7. Druge opcije za sprečavanje hidrolize su zamrzavanje i/ili liofilizacija lipozoma (Chen et al., 2010; van Winden and Crommelin, 1999; Stark et al., 2010). Protokoli za zamrzavanje i liofilizaciju lipozoma su navedeni u literaturi. Međutim, ovi dodatni tehnički koraci čine proizvodnju komplikovanijom i skupljom. U mnogim slučajevima, potrebno je da se dodaju krioprotektori, što može da bude nemoguće ili nepoželjno za određene proizvode. Na primer, prisustvo krioprotektora i/ili samo zamrzavanje/liofilizacija može da utiče na svojstva proizvoda na neželjen način. Stoga je dugoročna stabilizacija tečnih preparata lipozoma još uvek neispunjena potreba. U ovom kontekstu, postoji značajan interes u tehnici za minimiziranje hidrolize lipozoma ili, uopštenije govoreći, koloidno dispergovanih lipida u tečnoj (vodenoj) fazi. Ovo je naročito slučaj ako su lipozomi namenjeni za upotrebu kao farmaceutski proizvodi, jer u tom slučaju postupak za stabilizaciju mora da ispuni regulatorne i tehnološke zahteve za takve proizvode. U tom kontekstu, najveći izazov predstavljaju proizvodi za parenteralnu (npr. intravensku) primenu, gde, između ostalog, moraju da budu ispunjeni određeni kriterijumi koji se odnose na sterilnost, izbor ekscipijenasa, jonske i pH uslove ili sastav čestica.

[0004] Predmetni navodi imaju za cilj da obezbede postupke i sredstva za povećanje stabilnosti, posebno hemijske stabilnosti lipida i/ili lipozoma formulisanih u vodenim formulacijama, čime se povećava stabilnost roka upotrebe ovih formulacija.

Suština pronalaska

[0005] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Opšti navodi i njihovi različiti aspekti i primeri izvođenja na kojima se zasniva pronalazak opisani su u nastavku:

Suština navoda

[0006] U prvom aspektu, predmetni navodi se odnose na vodenu formulaciju koja sadrži

− najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, i

− najmanje jedan agens za podešavanje pH,

pri čemu vodena formulacija ima pH između 2 i 5.5.

[0007] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je katjonski lipid. U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je katjonski lipid kako je ovde definisano.

[0008] U jednom primeru izvođenja, ukupno neto naelektrisanje lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je pozitivno.

[0009] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija ima pH između 2 i 5, poželjno između 2.5 i 5, poželjnije između 3 i 4.5, poželjnije između 3 i 4, a još poželjnije između 3.5 i 4.

[0010] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza sadrži glicerolipid i/ili glicerofosfolipid.

[0011] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza sadrži katjonski lipid i/ili nekatjonski lipid.

[0012] U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijumpropana (DOTAP), 1,2-dioleoiloksi-3-dimetilamonijumpropana (DODAP) i analoga ovih molekula koji imaju drugačiji sastav fragmenta acilnog lanca.

[0013] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je neutralni lipid, pri čemu je poželjno neutralni lipid izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (DOPC), fosfatidilholina (PC) i dimiristoil fosfatidilholina (DMPC).

[0014] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je anjonski lipid, pri čemu je, poželjno, anjonski lipid izabran iz grupe koja se sastoji od fosfatidilserina (PS), fosfatidilinozitola (PI), fosfatidne kiseline (PA), fosfatidilglicerola (PG) i dimiristoil fosfatidilglicerola (DMPG).

[0015] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija dalje sadrži najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze.

[0016] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze sadrži katjonski lipid i/ili nekatjonski lipid.

[0017] U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijumpropana (DOTMA), 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), dioktadecildi-metilamonijuma (DODA(Br)/DDAB), dioktadecildimetilamonijumhlorida (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietilamonijuma (DMRIE), 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetata (DOSPA) analoga ovih molekula koji imaju različit sastav fragmenta acilnog lanca.

[0018] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je neutralni lipid, pri čemu je poželjno neutralni lipid izabran iz grupe koja se sastoji od holesterola (Chol) i sfingomijelina (SM).

[0019] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je anjonski lipid.

[0020] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži najmanje jedan katjonski lipid i najmanje jedan nekatjonski lipid.

[0021] U jednom primeru izvođenja, molarni odnos najmanje jednog katjonskog lipida prema najmanje jednom nekatjonskom lipidu je od 1:4 do 4:1, poželjno od 1:2 do 4:1.

[0022] U jednom primeru izvođenja, molarna frakcija najmanje jednog katjonskog lipida u odnosu na ukupan lipid je najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, poželjnije najmanje 20%.

[0023] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH sadrži kiselinu i/ili kiseli pufer.

[0024] U jednom primeru izvođenja, kiselina je linearna, razgranata ili ciklična C1-C28, poželjno C1-C22, karboksilna kiselina.

[0025] U jednom primeru izvođenja, kiselina se bira iz grupe koja se sastoji od sirćetne kiseline, askorbinske kiseline, limunske kiseline, hlorovodonične kiseline, fosforne kiseline, razgranatih ili nerazgranatih, zasićenih, mononezasićenih ili polinezasićenih C12-C28masnih kiselina, poželjno C12-C22masnih kiselina (npr. oleinska kiselina).

[0026] U jednom primeru izvođenja, kiseli pufer je na bazi kiseline kako je gore definisano.

[0027] U jednom primeru izvođenja, kiseli pufer se bira iz grupe koja se sastoji od acetatnog pufera, citratnog pufera, fosfatnog pufera i karbonatnog pufera.

[0028] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH sadrži sirćetnu kiselinu i/ili acetatni pufer.

[0029] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je prisutan u količini takvoj, da molarni odnos ukupnog lipida prema najmanje jednom agensu za podešavanje pH ne prelazi 100:1.

[0030] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je prisutan u količini takvoj, da je molarni odnos ukupnog lipida prema najmanje jednom agensu za podešavanje pH od 10:1 do 1:10, poželjno od 5:1 do 1:5, poželjnije od 2:1 do 1:2, poželjnije od 1.5:1 do 1:1.5, još poželjnije oko 1:1.

[0031] U jednom primeru izvođenja, brzina hidrolize najmanje jednog lipida koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je smanjena u poređenju sa brzinom njegove hidrolize na pH između 6 i 7.

[0032] U jednom primeru izvođenja, lipidi prisutni u vodenoj formulaciji formiraju lipozome.

[0033] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je povezan sa lipozomima.

[0034] U daljem aspektu, predmetni navodi se odnose na postupak za pripremu vodene formulacije kako je gore definisano, gde postupak obuhvata

− formiranje lipozoma u vodenom rastvoru koji sadrži najmanje jedan agens za podešavanje pH i koji ima pH između 2 i 5.5 ili

− dodavanje najmanje jednog agensa za podešavanje pH u vodeni rastvor koji sadrži lipozome da bi se pH vodenog rastvora podesio na pH između 2 i 5.5.

[0035] U sledećem aspektu, predmetni navodi se odnose na komplet koji sadrži vodenu formulaciju kao što je gore definisano.

[0036] U jednom primeru izvođenja, komplet dalje sadrži, u posebnom kontejneru, farmaceutski aktivno jedinjenje, pri čemu, poželjno, farmaceutski aktivno jedinjenje sadrži nukleinsku kiselinu, poželjno DNK ili RNK.

[0037] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je obezbeđena u puferisanom rastvoru koji ima pH između 6 i 8.

[0038] U još jednom aspektu, predmetni navodi se odnose na postupak za pripremu farmaceutske kompozicije, pri čemu postupak obuhvata

− obezbeđivanje vodene formulacije kao što je gore definisano; i

− mešanje vodene formulacije sa farmaceutski aktivnim jedinjenjem.

[0039] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivno jedinjenje sadrži nukleinsku kiselinu, poželjno DNK ili RNK, pri čemu je, poželjno, nukleinska kiselina obezbeđena u puferisanom rastvoru koji ima pH između 6 i 8.

[0040] U sledećem aspektu, predmetni navodi se odnose na farmaceutsku kompoziciju pripremljenu postupkom kao što je gore definisano.

[0041] U još jednom aspektu, predmetni navodi se odnose na postupak za hemijsku stabilizaciju vodene formulacije koja sadrži najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, pri čemu postupak obuhvata

− podešavanje pH vodene formulacije na pH između 2 i 5.5.

[0042] U jednom primeru izvođenja, hemijska stabilizacija se dešava inhibicijom hidrolize estarske veze, tioestarske veze i/ili amidne veze.

[0043] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je katjonski lipid. U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je kao što je gore definisano.

[0044] U jednom primeru izvođenja, ukupno neto naelektrisanje lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je pozitivno.

[0045] U jednom primeru izvođenja, pH je podešen na pH između 2 i 5, poželjno između 2.5 i 5, poželjnije između 3 i 4.5, poželjnije između 3 i 4, i još poželjnije između 3.5 i 4.

[0046] U jednom primeru izvođenja, pH vodene formulacije lipida se podešava dodavanjem najmanje jednog agensa za podešavanje pH, poželjno najmanje jednog agensa za podešavanje pH kao što je gore definisano.

[0047] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je kao što je gore definisano.

[0048] U jednom primeru izvođenja, lipidi prisutni u vodenoj formulaciji formiraju lipozome.

Kratak opis slika

[0049]

Slika 1 prikazuje procenat DOPE regenerisanog iz disperzija lipozoma DOTMA/DOPE pripremljenih u disperzionim rastvorima koji imaju različite pH vrednosti. Disperzija lipozoma je skladištena na 37°C, a uzorci su uzeti u različitim vremenskim tačkama.

Slika 2 prikazuje procenat DOPE regenerisanog iz disperzija lipozoma DOTMA/DOPE sa različitim pH vrednostima pripremljenih u prisustvu sirćetne kiseline (HAc) ili različitih koncentracija pufera na bazi sirćetne kiseline (AcB). Disperzija je skladištena 5 nedelja na 40°C.

Slika 3 prikazuje procenat DOPE regenerisanog iz disperzija lipozoma DOTMA/DOPE podvrgnutih stresu, nakon 5 ili 6 nedelja, u funkciji pH vrednosti. Prikazani su rezultati 3 nezavisna eksperimenta.

Slika 4 prikazuje procenat regeneracije lipida iz lipozoma DOTAP/DOPE nakon 2 nedelje na 40°C u funkciji pH vrednosti.

Slika 5 prikazuje procenat regeneracije DOPE iz lipozoma DOTMA/DOPE u vodi za injekcije sa ili bez 5 mM sirćetne kiseline (HAc) nakon skladištenja tokom 3 meseca na 5°C, 25°C ili 40°C.

Slika 6 prikazuje signale bioluminiscencije kod miševa kojima su ubrizgani lipopleksi sa RNK koja kodira luciferazu pripremljeni sa pH-stabilizovanim lipozomima ili lipozomima koji nisu pH-stabilizovani (standard).

Slika 7 prikazuje stabilnost DOPE u lipozomima DOTMA/DOPE u vodi za injekcije (L1) ili u vodi za injekcije sa 5 mM sirćetne kiseline (L2) na 5°C (A), 25°C (B) ili 40°C (C). Lipozomi su pripremljeni u uslovima DPP (dobra proizvođačka praksa, engl. - Good manufacturing practice, GMP) ili uslovima sličnim DPP.

Detaljan opis

[0050] Iako su ovi navodi detaljno opisani u nastavku, treba razumeti da ovi navodi nisu ograničeni na posebne metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisa određenih primera izvođenja i nije namenjena da ograniči obim ovih navoda, koji će biti ograničeni samo priloženim zahtevima. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja koja obično podrazumevaju stručnjaci iz ove oblasti.

[0051] U nastavku će biti opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da oni mogu da se kombinuju na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različito opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetne navode samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba shvatiti tako, da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem otkrivenih i/ili poželjnih elemenata. Osim toga, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim u opisu ove prijave, osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.

[0052] Poželjno, termini koji se ovde koriste su definisani kao što je opisano u „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)“, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

[0053] Praktikovanje ovih navoda će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode hemije, biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (upor. npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0054] U celoj ovoj specifikaciji i zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrže“ i varijacije kao što su „sadrži“ i „koji sadrži“, podrazumevaće uključivanje navedenog elementa, celog broja ili koraka, ili grupe elemenata, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog elementa, celog broja ili koraka, ili grupe elemenata, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takav drugi element, ceo broj ili korak, ili grupa elemenata, celih brojeva ili koraka može da bude isključena, tj. predmet se sastoji u uključivanju navedenog elementa, celog broja ili koraka, ili grupe elemenata, celih brojeva ili koraka. Termini koji označavaju jedninu i slične reference koje se koriste u kontekstu opisivanja navoda (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba da se tumače tako da obuhvataju i jedninu i množinu, osim ako je drugačije naznačeno ovde ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom. Navođenje opsega vrednosti ovde je namenjeno samo da služi kao stenografski metod za pojedinačno upućivanje na svaku zasebnu vrednost koja spada u opseg. Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju, kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu da se izvode bilo kojim pogodnim redosledom, osim ako je drugačije naznačeno ovde ili je na drugi način jasno u suprotnosti sa kontekstom. Ovde data upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr. „kao što je“), ima za cilj samo da bolje ilustruje navode i ne predstavlja ograničenje obima navoda za koji se inače traži zaštita. Nijedan pojam u specifikaciji ne bi trebalo da se tumači kao da ukazuje na bilo koji element za koji se ne traži zaštita bitan za praktikovanje navoda.

[0055] Predmetni navodi obezbeđuju vodenu formulaciju koja sadrži

− najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, poželjno estarskih veza, i

− najmanje jedan agens za podešavanje pH,

pri čemu vodena formulacija ima pH između 2 i 5.5.

[0056] Vodena formulacija u skladu sa ovim navodima (koja se takođe može nazvati vodenom disperzijom lipida) se odlikuje povećanom hemijskom stabilnošću, tačnije povećanom hemijskom stabilnošću najmanje jednog lipida koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, poželjno estarskih veza. U jednom primeru izvođenja, brzina hidrolize najmanje jednog lipida koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, poželjno estarskih veza, smanjena je u poređenju sa brzinom njegove hidrolize na pH između 6 i 7. U jednom primeru izvođenja, brzina hidrolize je smanjena najmanje za faktor 1.5, poželjno najmanje za faktor 2, poželjnije najmanje za faktor 3, još poželjnije najmanje za faktor 4.

[0057] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija ima pH između 2 i 5, poželjno između 2.5 i 5, poželjnije između 3 i 4.5, poželjnije između 3 i 4, i još poželjnije između 3.5 i 4. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, vodena formulacija ima pH između 3.1 i 3.9.

[0058] Termin „lipid“, kako se ovde koristi, namenjen je da označi amfifilni molekul koji sadrži hidrofilni fragment (npr. polarnu glavu) i lipofilni ili hidrofobni fragment. Lipofilni ili hidrofobni fragment može da sadrži najmanje jedan fragment razgranate ili linearne, zasićene ili nezasićene masne kiseline ili derivat ili analog navedenog (npr. fluorougljenik). Fragment masne kiseline suštinski se sastoji od ugljovodoničnog fragmenta/lanca, konkretno acilnog lanca. Poželjno, fragment masne kiseline ili derivat ili analog navedenog ima dužinu od 10 do 30, poželjnije 12 do 25, još poželjnije 14 do 22 atoma ugljenika. U slučaju da lipid sadrži više od jednog, npr. dva ili tri fragmenta masne kiseline ili derivata ili analoga navedenog, ovi fragmenti masnih kiselina ili derivati ili analozi navedenog mogu da budu isti ili različiti. Termin „lipid“ obuhvata katjonske lipide i nekatjonske lipide, tj. neutralne ili anjonske lipide. Lipidi mogu da uključuju fosfolipide ili njihove derivate, glicerolipide ili njihove derivate, sfingolipide (npr. sfingomijelin) ili njihove derivate, ili sterolne lipide (npr. holesterol) ili njihove derivate. Glicerolipidi su sačinjeni od glicerola koji su mono-, di- ili trisupstituisani fragmentima masnih kiselina. Fosfolipidi, čiji hidrofilni fragment sadrži fosfatnu grupu, mogu da budu glicerofosfolipidi. Poželjno, lipidi koji se koriste u skladu sa ovim navodima su lipidi koji formiraju dvosloj. Lipidi takođe mogu biti funkcionalizovani/modifikovani, npr. sa (oligo)peptidima, polimerima (npr. PEG) ili drugim funkcionalnim grupama. U vodenom medijumu, lipidi mogu dalje da budu supramolekularno organizovani, npr. u obliku čestica na bazi lipida ili liotropnih faza, kao što su lipozomi, lamelarne faze, heksagonalne i inverzne heksagonalne faze, kubične faze, micele i reverzne micele sačinjene od monoslojeva. Efekat stabilizacije prema ovom navodima se odnosi na sve vrste supramolekularne organizacije lipida. Poželjno, lipidi koji se koriste u skladu sa ovim navodima su farmaceutski prihvatljivi, npr. pogodni kao ekscipijensi, kao komponente formulacija za isporuku leka i/ili za upotrebu u transfekciji nukleinskih kiselina u ćelije.

[0059] Ako se ovo otkriće odnosi na naelektrisanje, kao što je pozitivno naelektrisanje, negativno naelektrisanje ili neutralno naelektrisanje ili na katjonsko jedinjenje, negativno jedinjenje ili neutralno jedinjenje, to generalno znači da je pomenuto naelektrisanje prisutno na izabranom pH, kao što je fiziološki pH. Na primer, izraz „katjonski lipid“ se odnosi na lipid koji ima pozitivno neto naelektrisanje na izabranom pH, kao što je fiziološki pH. Termin „neutralni lipid“ odnosi se na lipid koji nema pozitivno ili negativno neto naelektrisanje, koji može biti prisutan u obliku nenaelektrisanog molekula ili neutralnog amfoternog (ili cviterjonskog) molekula na odabranom pH, kao što je fiziološki pH. Pod „fiziološkim pH“ ovde se podrazumeva pH između 6 i 8, poželjno između 6.5 i 8, poželjnije od oko 7.5.

[0060] Katjonski lipid poželjno sadrži katjonsku glavu. Polarna glava katjonskih lipida poželjno sadrži derivate amina, kao što su primarni, sekundarni i/ili tercijarni amini, kvarternarni amonijum, različite kombinacije amina, soli amidinijuma, ili grupe guanidina i/ili imidazola, kao i piridinijum, piperizin i aminokiselinske glave, kao što su lizin, arginin, ornitin i/ili triptofan. Još poželjnije, polarna glava katjonskog lipida sadrži derivate amina. Najpoželjnije, polarna glava katjonskog lipida sadrži kvaternarni amonijum. Glava katjonskog lipida može da sadrži jednostruko katjonsko naelektrisanje ili višestruko katjonsko naelektrisanje.

[0061] Anjonski lipid poželjno sadrži anjonsku glavu, kao što je fosfatna grupa. Glava anjonskog lipida može da sadrži jednostruko anjonsko naelektrisanje ili višestruko anjonsko naelektrisanje.

[0062] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je katjonski lipid, poželjno katjonski lipid kao što je ovde definisano.

[0063] U jednom primeru izvođenja, ukupno neto naelektrisanje lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je pozitivno.

[0064] Termin „ukupno neto naelektrisanje“, kako se ovde koristi, označava zbir neto naelektrisanja svih lipida prisutnih u vodenoj formulaciji.

[0065] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid, koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, sadrži glicerolipid i/ili glicerofosfolipid.

[0066] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je glicerolipid. U drugom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je glicerofosfolipid. U još jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži najmanje dva lipida koji imaju jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, pri čemu najmanje dva lipida sadrže glicerolipid i glicerofosfolipid.

[0067] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza obuhvata katjonski lipid i/ili nekatjonski lipid.

[0068] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je katjonski lipid. U drugom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je nekatjonski lipid. U još jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži najmanje dva lipida koji imaju jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, pri čemu najmanje dva lipida sadrže katjonski lipid i nekatjonski lipid.

[0069] U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijumpropana (DOTAP), 1,2-dioleoiloksi-3-dimetilamonijumpropana (DODAP) i analoga ovih molekula koji imaju drugačiji sastav fragmenta acilnog lanca.

[0070] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je neutralni lipid, pri čemu je poželjno neutralni lipid izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (DOPC), fosfatidilholina (PC) i dimiristoil fosfatidilholina (DMPC).

[0071] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je anjonski lipid, pri čemu je, poželjno, anjonski lipid izabran iz grupe koja se sastoji od fosfatidilserina (PS), fosfatidilinozitola (PI), fosfatidne kiseline (PA), fosfatidilglicerola (PG) i dimiristoil fosfatidilglicerola (DMPG).

[0072] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija dalje sadrži najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze. U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija dalje sadrži najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze.

[0073] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze obuhvata glicerolipid i/ili glicerofosfolipid.

[0074] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze je glicerolipid. U drugom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze je glicerofosfolipid. U još jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži najmanje dva lipida koji nemaju nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze, pri čemu najmanje dva lipida sadrže glicerolipid i glicerofosfolipid.

[0075] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze obuhvata katjonski lipid i/ili nekatjonski lipid.

[0076] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze je katjonski lipid. U drugom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji nema nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze je nekatjonski lipid. U još jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži najmanje dva lipida koji nemaju nikakve estarske veze, tioestarske veze ili amidne veze, pri čemu najmanje dva lipida sadrže katjonski lipid i nekatjonski lipid.

[0077] U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid je izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijumpropana (DOTMA), 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), dioktadecildi-metilamonijuma (DODA(Br)/DDAB), dioktadecildimetilamonijumhlorida (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietilamonijuma (DMRIE), 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetata (DOSPA) analoga ovih molekula koji imaju različit sastav fragmenta acilnog lanca.

[0078] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je neutralni lipid, pri čemu je poželjno neutralni lipid izabran iz grupe koja se sastoji od holesterola (Chol) i sfingomijelina (SM).

[0079] U jednom primeru izvođenja, nekatjonski lipid je anjonski lipid.

[0080] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži najmanje jedan katjonski lipid i najmanje jedan nekatjonski lipid, poželjno najmanje jedan katjonski lipid i najmanje jedan neutralni lipid.

[0081] U jednom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži DOTMA i DOPE. U drugom primeru izvođenja, vodena formulacija sadrži DOTAP i DOPE.

[0082] U jednom primeru izvođenja, nekajonski, tj. neutralni ili anjonski, poželjno neutralni, lipid funkcioniše kao „pomoćni lipid“. Termin „pomoćni lipid“ odnosi se na lipid koji je sposoban da poveća efikasnost isporuke čestica na bazi lipida (npr. lipozoma) do cilja, poželjno u ćeliju.

[0083] U jednom primeru izvođenja, molarni odnos najmanje jednog katjonskog lipida prema najmanje jednom nekatjonskom lipidu je od 4:1 do 1:4, poželjno od 1:2 do 4:1.

[0084] U jednom primeru izvođenja, molarna frakcija najmanje jednog katjonskog lipida u odnosu na ukupan lipid je najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, poželjnije najmanje 20%.

[0085] Izraz „agens za podešavanje pH“, kako se ovde koristi, označava bilo koji pH-aktivni agens koji može da se koristi za modifikovanje pH vrednosti (vodenog) rastvora i uključuje agense za acidifikaciju i alkalizaciju. Agensi za acidifikaciju se koriste za snižavanje pH vrednosti, dok se agensi za alkalizaciju koriste za povećanje pH. Poželjno, agens za podešavanje pH u skladu sa ovim navodima je agens za acidifikaciju.

[0086] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH sadrži kiselinu i/ili kiseli pufer.

[0087] U jednom primeru izvođenja, kiselina je linearna, razgranata ili ciklična C1-C28, poželjno C1-C22, karboksilna kiselina.

[0088] U jednom primeru izvođenja, kiselina se bira iz grupe koja se sastoji od sirćetne kiseline, askorbinske kiseline, limunske kiseline, hlorovodonične kiseline, fosforne kiseline, razgranatih ili nerazgranatih, zasićenih, mononezasićenih ili polinezasićenih C12-C28masnih kiselina, poželjno C12-C22masnih kiselina (npr. oleinska kiselina).

[0089] U jednom primeru izvođenja, kiseli pufer je na bazi kiseline, kako je gore definisano.

[0090] U jednom primeru izvođenja, kiseli pufer se bira iz grupe koja se sastoji od acetatnog pufera, citratnog pufera, fosfatnog pufera i karbonatnog pufera.

[0091] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH sadrži sirćetnu kiselinu i/ili acetatni pufer.

[0092] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je prisutan u količini takvoj, da molarni odnos ukupnog lipida prema najmanje jednom agensu za podešavanje pH ne prelazi 100:1.

[0093] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je prisutan u količini takvoj, da je molarni odnos ukupnog lipida prema najmanje jednom agensu za podešavanje pH od 10:1 do 1:10, poželjno od 5:1 do 1:5, poželjnije od 2:1 do 1:2, poželjnije od 1.5:1 do 1:1.5, još poželjnije oko 1:1.

[0094] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je prisutan u koncentraciji od 1 mM do 10 mM.

[0095] U jednom primeru izvođenja, lipidi prisutni u vodenoj formulaciji formiraju čestice na bazi lipida, kao što su lipozomi. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, vodena formulacija je vodena disperzija lipozoma. U jednom primeru izvođenja, ukupno neto naelektrisanje lipida koji formiraju lipozome je pozitivno. U jednom primeru izvođenja, lipozomi su katjonski lipozomi.

[0096] Termin „lipozom“, kako se ovde koristi, označava mikroskopsku lipidnu vezikulu koja često ima jedan ili više dvosloja lipida koji formira vezikule, kao što je fosfolipid, i koja je sposobna da inkapsulira lek. U kontekstu predmetnih navoda mogu da se koriste različite vrste lipozoma, uključujući, bez ograničenja, multilamelarne vezikule (MLV), male unilamelarne vezikule (SUV), velike unilamelarne vezikule (LUV), sterički stabilizovane lipozome (SSL), multivezikularne vezikule (MV) i velike multivezikularne vezikule (LMV), kao i druge dvoslojne oblike poznate u tehnici. Veličina i lamelarnost lipozoma zavisiće od načina pripreme. U jednom primeru izvođenja, lipozomi imaju prosečan prečnik u opsegu od oko 50 nm do oko 1000 nm, poželjno od oko 100 nm do oko 800 nm, poželjno oko 200 nm do oko 600 nm, kao što je oko 300 nm do oko 500 nm.

[0097] Lipozomi mogu da se formiraju korišćenjem standardnih postupaka, kao što je postupak reverzne evaporacije (REV), postupak ubrizgavanja etanola, postupak dehidratacije-rehidratacije (DRV), sonikacija ili drugi pogodni postupci. Poželjno, lipozomi se formiraju primenom postupka ubrizgavanja etanola.

[0098] Izraz „postupak ubrizgavanja etanola“ odnosi se na postupak u kome se rastvor etanola koji sadrži lipide brzo ispušta u vodeni rastvor kroz iglu. Ovaj postupak raspršuje lipide kroz rastvor i podstiče formiranje lipidnih čestica, kao što je formiranje lipozoma.

[0099] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je povezan sa česticama na bazi lipida, poželjno lipozomima. Prema predmetnim navodima, izraz „povezan sa“ znači da je agens za podešavanje pH vezan za, ili da čini deo čestica na bazi lipida, poželjno lipozoma, npr. tako što se inkorporira/ubacuje u lipidnu dvoslojnu membranu. U jednom primeru izvođenja, agens za podešavanje pH koji je povezan sa lipozomima je karboksilna kiselina, poželjno karboksilna kiselina kao što je gore definisano. U jednom primeru izvođenja, karboksilna kiselina je razgranata ili nerazgranata C12-C28, poželjno C12-C22, karboksilna kiselina. U jednom primeru izvođenja, karboksilna kiselina je razgranata ili nerazgranata, zasićena, mononezasićena ili polinezasićena C12-C28masna kiselina, poželjno C12-C22masna kiselina (npr. oleinska kiselina). U jednom primeru izvođenja, čestice na bazi lipida, poželjno lipozomi, sadrže 1 do 10% agensa za podešavanje pH.

[0100] U jednom primeru izvođenja, čestice na bazi lipida, poželjno lipozomi, sadrže (npr., inkapsuliraju) farmaceutski aktivno jedinjenje, pri čemu, poželjno, farmaceutski aktivno jedinjenje sadrži nukleinsku kiselinu, poželjno DNK ili RNK.

[0101] Predmetni navodi takođe obezbeđuju postupak za pripremu vodene formulacije kao što je gore definisano, pri čemu postupak obuhvata

− formiranje lipozoma u vodenom rastvoru koji sadrži najmanje jedan agens za podešavanje pH i koji ima pH između 2 i 5.5 ili

− dodavanje najmanje jednog agensa za podešavanje pH u vodeni rastvor koji sadrži lipozome da bi se pH vodenog rastvora podesio na pH između 2 i 5.5.

[0102] Predmetni navodi takođe obezbeđuju komplet koji sadrži vodenu formulaciju kao što je gore definisano.

[0103] U jednom primeru izvođenja, komplet dalje sadrži, u posebnom kontejneru, farmaceutski aktivno jedinjenje, pri čemu, poželjno, farmaceutski aktivno jedinjenje sadrži nukleinsku kiselinu, poželjno DNK ili RNK.

[0104] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je obezbeđena u puferisanom rastvoru koji ima pH između 6 i 8. Pogodne puferske supstance za upotrebu u takvim puferisanim rastvorima uključuju Tris, HEPES, MOPS i MES.

[0105] Kako se ovde koristi, termin „komplet“ se odnosi na proizvod koji sadrži jedan ili više kontejnera i, opciono, nosač podataka. Navedeni jedan ili više kontejnera mogu biti napunjeni jednim ili većim brojem gore navedenih sredstava ili reagenasa. U komplet mogu da budu uključeni dodatni kontejneri koji sadrže, npr. razblaživače, pufere i dodatne reagense. Navedeni nosač podataka može da bude neelektronski nosač podataka, npr. grafički nosač podataka, kao što je informativni letak, informativni list, bar kod ili pristupni kod, ili elektronski nosač podataka, kao što je disketa, kompakt disk (CD), svestrani digitalni disk (DVD), mikročip ili drugi elektronski nosač podataka zasnovan na poluprovodnicima. Pristupni kod može da omogući pristup bazi podataka, na primer, internet bazi podataka, centralizovanoj ili decentralizovanoj bazi podataka. Navedeni nosač podataka može da sadrži uputstva za upotrebu kompleta u postupcima prema navodima. Pored toga, nosač podataka može da sadrži informacije ili uputstva o tome kako da se sprovedu postupci prema predmetnim navodima.

[0106] Termin „farmaceutski aktivno jedinjenje“ (ili „terapijski agens“), kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koje jedinjenje koje ima pozitivan ili povoljan efekat na stanje ili bolest subjekta kada se daje subjektu u terapijski efikasnoj količini. Poželjno, farmaceutski aktivno jedinjenje ima lekovita ili palijativna svojstva i može se primeniti da poboljša, olakša, ublaži, poništi, odloži početak ili umanji ozbiljnost jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja. Farmaceutski aktivno jedinjenje može da ima profilaktička svojstva i može da se koristiti za odlaganje početka bolesti ili za smanjenje ozbiljnosti takve bolesti ili patološkog stanja.

[0107] Farmaceutski aktivna jedinjenja obuhvataju farmaceutski aktivne peptide ili proteine, farmaceutski aktivne nukleinske kiseline, npr. DNK ili RNK, i druge farmaceutski aktivne organske ili neorganske molekule, npr. jedinjenja malog molekula (tj. bioaktivna organska jedinjenja molekulske težine manje od 900 Daltona).

[0108] Termin „peptid“, kako se ovde koristi, obuhvata prirodne ili neprirodne oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 aminokiselina (npr.10 do 100, 10 do 50, 10 do 40, 20 do 100, 20 do 50 ili 20 do 40 aminokiselina) kovalentno vezanih peptidnim vezama.

Termin „protein“ prvenstveno se odnosi na velike peptide, poželjno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali generalno, termini „peptid“ i „protein“ su sinonimi i ovde se koriste naizmenično.

[0109] Izraz „farmaceutski aktivan peptid ili protein“ uključuje cele proteine ili polipeptide, a može da se odnosi i na njihove farmaceutski aktivne fragmente. Takođe može da uključuje farmaceutski aktivne analoge peptida ili proteina. Termin „farmaceutski aktivan peptid ili protein“ dalje uključuje peptide i proteine koji su antigeni, tj. davanje peptida ili proteina subjektu izaziva imuni odgovor kod subjekta koji može da bude terapijski, ili delimično ili potpuno protektivan.

[0110] Primeri farmaceutski aktivnih proteina uključuju, ali nisu ograničeni na, citokine i proteine imunog sistema, kao što su imunološki aktivna jedinjenja (npr. interleukini, faktor stimulacije kolonija (CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), eritropoetin, faktor nekroze tumora (TNF), interferoni, integrini, adresani, seletini, „homing“ receptori, T-ćelijski receptori, imunoglobulini, rastvorljivi antigeni glavnog kompleksa histokompatibilnosti, imunološki aktivni antigeni, kao što su bakterijski, parazitski ili virusni antigeni, alergeni, autoantigeni, antitela), hormone (insulin, hormon štitne žlezde, kateholamini, gonadotropini, trofički hormoni, prolaktin, oksitocin, dopamin, goveđi somatotropin, leptini i slično), hormone rasta (npr. humani hormon rasta), faktore rasta (npr. epidermalni faktor rasta, faktor rasta nerava, faktor rasta sličan insulinu i slično), receptore faktora rasta, enzime (aktivator tkivnog plazminogena, streptokinaza, enzimi biosinteze ili degradacije holesterola, steroidogeni enzimi, kinaze, fosfodiesteraze, metilaze, demetilaze, dehidrogenaze, celulaze, proteaze, lipaze, fosfolipaze, aromataze, citohromi, adenilat ili guanilat ciklaze, neuramidaze i slično), receptore (receptori steroidnih hormona, peptidni receptori), vezujuće proteine (proteini koji vezuju hormon rasta ili faktor rasta i slično), faktore transkripcije i translacije, proteine koji suzbijaju rast tumora (npr. proteini koji inhibiraju angiogenezu), strukturne proteine (kao što su kolagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, aktin i miozin), proteine krvi (trombin, serumski albumin, faktor VII, faktor VIII, insulin, faktor IX, faktor X, aktivator tkivnog plazminogena, protein C, von Wilebrandov faktor, antitrombin III, glukocerebrozidaza, eritropoetin, faktor stimulacije kolonija granulocita (GCSF) ili modifikovani faktor VIII, antikoagulansi i slično.

[0111] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivni protein prema navodima je citokin koji je uključen u regulaciju limfoidne homeostaze, poželjno citokin koji je uključen i poželjno indukuje ili pojačava razvoj, prajming, ekspanziju, diferencijaciju i/ili preživljavanje T ćelija. U jednom primeru izvođenja, citokin je interleukin. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivni protein prema navodima je interleukin izabran iz grupe koja se sastoji od IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 i IL-21.

[0112] Izraz „imunološki aktivno jedinjenje“ odnosi se na bilo koje jedinjenje koje menja imuni odgovor, poželjno indukcijom i/ili supresijom sazrevanja imunih ćelija, indukcijom i/ili supresijom biosinteze citokina, i/ili menjanjem humoralnog imuniteta stimulisanjem proizvodnje antitela od strane B ćelija. Imunološki aktivna jedinjenja poseduju moćnu imunostimulatornu aktivnost uključujući, ali ne ograničavajući se na, antivirusnu i antitumorsku aktivnost, a takođe mogu nishodno da regulišu druge aspekte imunog odgovora, na primer pomeranje imunog odgovora sa TH2 imunog odgovora, što je korisno za lečenje širokog spektra bolesti posredovanih TH2. Imunološki aktivna jedinjenja mogu da budu korisna kao adjuvansi za vakcine.

[0113] Nukleinska kiselina je prema navodima poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetička RNK. Nukleinske kiseline obuhvataju prema navodima genomsku DNK, cDNK, iRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetizovane molekule. Prema navodima, nukleinska kiselina može da bude u obliku molekula koji je jednolančan ili dvolančan i linearan, ili kovalentno zatvoren, tako da formira krug.

[0114] Nukleinske kiseline takođe mogu da budu sadržane u vektoru. Termin „vektor“, kako se ovde koristi, uključuje sve vektore poznate stručnjaku, uključujući plazmidne vektore, kozmidne vektore, vektore na bazi faga, kao što je lambda fag, virusne vektore, kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektore u vidu veštačkog hromozoma, kao što su bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC) ili veštački hromozomi P1 (PAC). Navedeni vektori obuhvataju ekspresione vektore, kao i vektore za kloniranje. Ekspresioni vektori obuhvataju plazmide, kao i virusne vektore i generalno sadrže željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju funkcionalno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu-domaćinu (npr. bakterija, kvasac, biljka, insekt ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Vektori za kloniranje se generalno koriste za konstruisanje i amplifikaciju određenog željenog DNK fragmenta i mogu da im nedostaju funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata.

[0115] U kontekstu predmetnih navoda, termin „DNK“ se odnosi na molekul koji sadrži dezoksiribonukleotidne ostatke i poželjno je u potpunosti ili suštinski sačinjen od dezoksiribonukleotidnih ostataka. „Dezoksiribonukleotid“ se odnosi na nukleotid kome nedostaje hidroksilna grupa na 2'-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin „DNK“ obuhvata izolovanu DNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena DNK, suštinski čista DNK, sintetička DNK i rekombinantno generisana DNK i uključuje modifikovanu DNK koja se razlikuje od prirodne DNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu da uključuju adiciju nenukleotidnog materijala, na primer na kraj/krajeve DNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida DNK. Nukleotidi u molekulima DNK takođe mogu da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su neprirodni nukleotidi ili hemijski sintetisani nukleotidi. Ove izmenjene DNK se mogu nazvati analozima ili analozima prirodne DNK.

[0116] U kontekstu predmetnih navoda, termin „RNK“ se odnosi na molekul koji sadrži ribonukleotidne ostatke i poželjno je u potpunosti ili suštinski sačinjen od ribonukleotidnih ostataka. „Ribonukleotid“ se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2'-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin „RNK“ obuhvata izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čista RNK, sintetička RNK i rekombinantno generisana RNK i uključuje modifikovanu RNK koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu da uključuju adiciju nenukleotidnog materijala, na primer na kraj/krajeve RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su neprirodni nukleotidi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK se mogu nazvati analozima ili analozima prirodne RNK.

[0117] Termin „farmaceutski aktivna nukleinska kiselina“ se odnosi na nukleinske kiseline koje imaju biološke aktivnosti, kao što je ekspresija proteina, interferencija sa ekspresijom gena ili imunostimulacija. Takve nukleinske kiseline su, prema tome, korisne za ometanje ekspresije gena (npr. antisens RNK ili siRNK), modifikovanje aktivnosti proteina (npr. DNK aptameri ili RNK aptameri) ili aktiviranje imuniteta (npr. isRNK ili DNK vakcine ili iRNK vakcine). „Farmaceutski aktivna nukleinska kiselina“ takođe može da bude nukleinska kiselina koja kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein ili je farmaceutski aktivna sama po sebi, na primer, ima jednu ili više farmaceutskih aktivnosti kao što su one opisane za farmaceutski aktivne proteine.

[0118] Prema navodima, izraz „nukleinska kiselina koja kodira peptid ili protein“ znači da nukleinska kiselina, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može da usmerava sklapanje aminokiselina kako bi tokom procesa translacije nastao peptid ili protein. Poželjno, nukleinske kiseline prema navodima mogu da stupe u interakciju sa ćelijskom translacionom mašinerijom omogućavajući translaciju peptida ili proteina.

[0119] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je RNK.

[0120] Prema navodima, „RNK“ se odnosi na jednolančanu RNK ili dvolančanu RNK i obuhvata informacionu RNK (iRNK) (eng. messenger RNA – mRNA), transportnu RNK (eng. transfer, tRNK), ribozomalnu RNK (eng. ribosomic, rRNK), malu nuklearnu RNK (eng. small nuclear, snRNK), malu inhibitornu RNK (eng. small inhibitory, siRNK), malu RNK u vidu ukosnice (eng.

small hairpin, shRNK), mikroRNK (eng. micro, miRNK), antisens RNK, imunostimulirajuću RNK (eng. immunostimulating, isRNK) i RNK aptamere. U poželjnom primeru izvođenja, RNK se bira iz grupe koja se sastoji od iRNK, siRNK, shRNK, miRNK, antisens RNK, isRNK i RNK aptamera.

[0121] RNK može da sadrži samokomplementarne sekvence koje omogućavaju delovima RNK da se presavijaju i međusobno upare formirajući dvostruke spirale. Prema navodima, kao RNK poželjni su sintetički oligonukleotidi od 6 do 100, poželjno 10 do 50, posebno 15 do 30 ili 15 do 20 nukleotida ili informaciona RNK (iRNK) sa više od 50 nukleotida, poželjno od 50 do 10000, poželjno 100 do 5000, posebno 200 do 3000 nukleotida.

[0122] Prema predmetnim navodima, termin „informaciona RNK (iRNK)“, se odnosi na „transkript“ koji može da se generiše korišćenjem DNK matrice i može da kodira peptid ili protein. Tipično, iRNK sadrži 5'-netranslirani region, region koji kodira protein i 3'-netranslirani region. U kontekstu predmetnih navoda, iRNK može da bude generisana pomoću in vitro transkripcije sa DNK matrice. Metodologija in vitro transkripcije je poznata stručnjaku. Na primer, postoji niz komercijalno dostupnih kompleta za in vitro transkripciju.

[0123] Prema predmetnim navodima, termin „mala inhibitorna RNK (siRNK)“ odnosi se na dvolančane kratke (dužine obično 19-23, poželjno 21 nukleotid) oligonukleotide koji mogu da se koriste da indukuju uništavanje ciljne iRNK kroz prepoznavanje cilja pomoću jednog lanca siRNK, mehanizmom koji se naziva RNK interferencija (eng. RNA interference, RNKi).

[0124] Izraz „mala RNK u vidu ukosnice (shRNK)“ se odnosi na sekvencu RNK koja formira petlju u vidu ukosnice i može da se koristi za utišavanje ekspresije ciljnog gena putem RNKi.

[0125] Termini „mikroRNK“ ili „miRNK“ odnose se na mali nekodirajući RNK molekul (tipično dužine 19-25 nukleotida), koji ispoljava svoje delovanje u transkripcionoj i post-transkripcionoj regulaciji ekspresije gena.

[0126] Prema predmetnim navodima, termin „antisens RNK“ se odnosi na jednolančanu RNK, obično sintetički oligonukleotid koji je dizajniran tako da su mu baze komplementarne bazama ciljane ćelijske iRNK, čime se fizički inhibira proces translacije i na kraju izaziva uništenje ciljane iRNK.

[0127] Prema predmetnim navodima, „imunostimulirajuća RNK (isRNK)“ se odnosi na RNK koja može da aktivira urođene imune receptore, kao što su, na primer, endoplazmatski TLR-3, 7 i 8 ili citosolni protein RIG-1. U jednom primeru izvođenja, isRNK sadrži jedan ili više uridinskih (U) nukleotida.

[0128] Prema predmetnim navodima, termin „RNK aptamer“ se odnosi na RNK koja zbog svoje precizne trodimenzionalne strukturu može da se koristi kao antitelo, tj. napravljena da se specifično vezuje za određene strukture i na taj način aktivira ili blokira biološke mehanizme.

[0129] Prema navodima, RNK može da se modifikuje. Na primer, RNK može da se stabilizuje pomoću jedne ili više modifikacija koje imaju stabilizujuće efekte na RNK.

[0130] Termin „modifikacija“ u kontekstu RNK, kako se koristi u skladu sa ovim navodima, uključuje bilo koju modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.

[0131] U jednom primeru izvođenja navoda, RNK koja se koristi prema navodima nema 5'-trifosfate bez kape. Uklanjanje takvih 5'-trifosfata bez kape može da se postigne tretiranjem RNK fosfatazom.

[0132] RNK prema navodima može da ima modifikovane prirodne ili neprirodne (sintetičke) ribonukleotide kako bi se povećala njena stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost i/ili modulirao njen imunostimulatorni potencijal. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se koristi u skladu sa navodima, uridin je delimično ili potpuno supstituisan, poželjno potpuno, pseudouridinom.

[0133] U jednom primeru izvođenja, termin „modifikacija“ se odnosi na dodavanje 5'-kape ili analoga 5'-kape na RNK. Termin „5'-kapa“ se odnosi na strukturu kape koja se nalazi na 5'-kraju molekula iRNK i generalno se sastoji od guanozinskog nukleotida povezanog sa iRNK preko neuobičajene 5' - 5' trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilovan na poziciji 7. Termin „konvencionalna 5'-kapa“ odnosi se na prirodnu 5'-kapu RNK, poželjno na 7-metilguanozin kapu (m<7>G). U kontekstu predmetnih navoda, termin „5'-kapa“ uključuje analog 5'-kape koji podseća na strukturu kape RNK i modifikovan je tako da poseduje sposobnost stabilizacije RNK ako je pričvršćen za nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji. Dodavanje 5'-kape ili analoga 5'-kape na RNK može da se postigne in vitro transkripcijom DNK matrice u prisustvu pomenute 5'-kape ili analoga 5'-kape, pri čemu se pomenuta 5'-kapa ko-transkripciono ugrađuje u generisani lanac RNK, ili RNK može da se generiše, na primer, in vitro transkripcijom, a 5'-kapa može da se generiše post-transkripciono korišćenjem enzima za dodavanje kape, na primer, enzima za dodavanje kape virusa vakcinije.

[0134] RNK može da sadrži dalje modifikacije. Na primer, modifikacija iRNK koja se koristi u predmetnim navodima može da bude produženje ili skraćenje prirodnog poli(A) repa.

[0135] Termin „stabilnost“ RNK se odnosi na „poluživot“ RNK. „Poluživot“ se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu predmetnih navoda, poluživot RNK je indikativan za stabilnost navedene RNK.

[0136] Ako je, prema predmetnim navodima, poželjno smanjiti stabilnost RNK, takođe je moguće modifikovati RNK tako da interferira sa funkcijom elemenata koji, kako je gore opisano, povećavaju stabilnost RNK.

[0137] Prema predmetnim navodima, RNK može da se dobije hemijskom sintezom ili in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice. U kontekstu predmetnih navoda, termin „transkripcija“ se odnosi na proces u kome se genetski kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Nakon toga, RNK može da se translatira u protein. Prema predmetnim navodima, termin „transkripcija“ obuhvata „in vitro transkripciju“, pri čemu se termin „in vitro transkripcija“ odnosi na proces u kome se RNK, konkretno iRNK, sintetiše in vitro u sistemu bez ćelija, poželjno korišćenjem odgovarajućih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, za generisanje transkripata se koriste vektori za kloniranje. Ovi vektori za kloniranje su generalno označeni kao transkripcioni vektori i prema predmetnim navodima su obuhvaćeni terminom „vektor“. Promotor za kontrolu transkripcije može da bude bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Posebni primeri RNK polimeraza su RNK polimeraze T7, T3 i SP6. DNK matrica za in vitro transkripcija može da se dobije kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK. Poželjno, vektori za kloniranje se koriste za proizvodnju transkripata koji su generalno označeni kao transkripcioni vektori.

[0138] Izraz „translacija“ prema navodima odnosi se na proces u ribozomima ćelije pomoću kojeg lanac informacione RNK usmerava sklapanje aminokiselinske sekvence da bi nastao peptid ili protein.

[0139] Termin „inhibicija ekspresije gena“ se odnosi na proces u kome RNK oligonukleotidi (npr. jednolančana antisens ili dvolančana siRNK) mogu da se koriste za vezivanje specifičnih sekvenci iRNK čime se indukuje bilo degradacija ciljane iRNK i/ili blokada translacije.

[0140] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivno jedinjenje je antigen ili nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegov fragment, npr. antigen povezan sa bolešću.

[0141] Termin „bolest“ se odnosi na nenormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često shvata kao zdravstveno stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može da bude uzrokovana faktorima koji potiču iz spoljašnjeg izvora, kao što je zarazna bolest, ili može da bude uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimune bolesti.

[0142] Prema navodima, izraz „bolest“ se odnosi i na bolesti kancera. Izrazi „bolest kancera“ ili „kancer“ (medicinski termin: maligna neoplazma) odnose se na klasu bolesti u kojima grupa ćelija pokazuje nekontrolisani rast (deoba izvan granica normale), invaziju (ulazak i uništavanje susednih tkiva), a ponekad i metastazu (širenje na druge lokacije u telu putem limfe ili krvi). Ova tri maligna svojstva kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su samoograničeni i ne dovode do invazije, niti metastaziraju. Većina kancera formira tumor, tj. otok ili leziju nastalu nenormalnim rastom ćelija (koje se nazivaju neoplastične ćelije ili tumorske ćelije), ali neki, poput leukemije, to ne čine. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, gliom i leukemiju. Tačnije, primeri takvih kancera uključuju kancer kostiju, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni maligni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, karcinom polnih i reproduktivnih organa, Hočkinovu bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni kancer, tumore kičmenog stuba, gliom, meningiom i adenom hipofize. Termin „kancer“ prema navodima obuhvata i metastaze kancera.

[0143] Maligni melanom je ozbiljna vrsta kancera kože. Nastaje zbog nekontrolisanog rasta pigmentnih ćelija, zvanih melanociti.

[0144] Prema navodima, „karcinom“ je maligni tumor nastao iz epitelnih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i debelog creva.

[0145] Limfom i leukemija su maligne bolesti koje potiču od hematopoetskih (krvotvornih) ćelija.

[0146] Sarkom je kancer koji nastaje iz transformisanih ćelija u jednom od brojnih tkiva koja se razvijaju iz embrionalnog mezoderma. Dakle, sarkomi uključuju tumore kostiju, hrskavice, masnog tkiva, mišića, vaskularnih i hematopoetskih tkiva.

[0147] Blastni tumor ili blastom je tumor (obično maligni) koji podseća na nezrelo ili embrionalno tkivo. Mnogi od ovih tumora su najčešći kod dece.

[0148] Gliom je vrsta tumora koji počinje u mozgu ili kičmi. Zove se gliom jer nastaje iz glijalnih ćelija. Najčešća lokacija glioma je mozak.

[0149] Pod „metastazom“ se podrazumeva širenje ćelija kancera sa prvobitnog mesta na drugi deo tela. Formiranje metastaza je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, prodora kroz endotelne bazalne membrane zbog ulaska u telesnu šupljinu i sudove, a zatim, nakon transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora, tj. sekundarnog tumora ili metastatskog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora se često javlja čak i nakon uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu da zaostanu i razviju metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin „metastaza“ prema navodima se odnosi na „udaljenu metastazu“ koja označava metastazu udaljenu od primarnog tumora i sistema regionalnih limfnih čvorova.

[0150] Termin „zarazna bolest“ se odnosi na bilo koju bolest koja može da se prenese sa osobe na osobu ili sa organizma na organizam, a uzrokovana je mikrobnim agensom (npr. prehlada). Primeri zaraznih bolesti uključuju zarazne bolesti izazvane virusima, kao što su AIDS (HIV), hepatitis A, B ili C, herpes, herpes zoster (varičele), nemačke boginje (virus rubeole), žuta groznica, denga itd. flavivirusi, virusi gripa, hemoragične zarazne bolesti (Marburg ili Ebola virusi) i teški akutni respiratorni sindrom (SARS), bakterijske zarazne bolesti, kao što je legionarska bolest (Legionella), polno prenosive bolesti (npr. hlamidija ili gonoreja), čir na želucu (Helicobacter), kolera (Vibrio), tuberkuloza, difterija, infekcije bakterijom E. coli, stafilokokama, salmonelom ili streptokokama (tetanus); infekcije patogenim protozoama, kao što su malarija, bolest spavanja, lajšmanijaza; toksoplazmoza, odnosno infekcije plazmodijumom, tripanozomama, lajšmanijom i toksoplazmom; ili gljivične infekcije, koje su uzrokovane npr. vrstama Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis ili Candida albicans.

[0151] Termin „autoimuna bolest“ odnosi se na bilo koju bolest u kojoj telo proizvodi imunogeni odgovor (tj. odgovor imunog sistema) na neki sastojak sopstvenog tkiva. Drugim rečima, imuni sistem gubi sposobnost da prepozna neko tkivo ili sistem u telu kao sebe, i prepoznaje ga kao cilj i napada kao da je strano. Autoimune bolesti se mogu klasifikovati na one kod kojih je zahvaćen pretežno jedan organ (npr. hemolitička anemija i antiimuni tiroiditis) i na one kod kojih je proces autoimune bolesti rasprostranjen kroz mnoga tkiva (npr. sistemski eritemski lupus). Na primer, smatra se da je multipla skleroza uzrokovana T ćelijama koje napadaju ovojnice koje okružuju nervna vlakna mozga i kičmene moždine. To dovodi do gubitka koordinacije, slabosti i zamagljenog vida. Autoimune bolesti su poznate u tehnici i uključuju, na primer, Hašimotov tiroiditis, Grejvsovu bolest, lupus, multiplu sklerozu, reumatski artritis, hemolitičku anemiju, antiimuni tiroiditis, sistemski eritemski lupus, celijakiju, Kronovu bolest, kolitis, dijabetes, sklerodermu, psorijazu i sl.

[0152] Termin „antigen“ se odnosi na agens koji sadrži epitop protiv koga treba da se generiše imuni odgovor. Termin „antigen“ uključuje posebno proteine, peptide, polisaharide, nukleinske kiseline, posebno RNK i DNK, i nukleotide. Termin „antigen“ takođe uključuje agense, koji postaju antigeni - i senzibilišući - samo transformacijom (npr. neposredno u molekulu ili kompletiranjem sa telesnim proteinom). Antigen poželjno mogu da prezentuju ćelije imunog sistema, kao što su antigen-prezentujuće ćelije poput dendritskih ćelija ili makrofaga. Pored toga, antigen, ili proizvod njegove obrade poželjno može da bude prepoznat od strane receptora T ili B ćelija, ili molekula imunoglobulina, kao što je antitelo. U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa bolešću, kao što je antigen povezan sa tumorom, virusni antigen, ili bakterijski antigen.

[0153] Termin „antigen povezan sa bolešću“ se upotrebljava u najširem smislu da označi bilo koji antigen povezan sa bolešću. Antigen povezan sa bolešću je molekul koji sadrži epitope koji će stimulisati imuni sistem domaćina da ostvari ćelijski antigen-specifični imuni odgovor i/ili humoralni odgovor antitelom protiv bolesti. Antigen povezan sa bolešću može stoga da se koristi u terapijske svrhe. Antigeni povezani sa bolešću poželjno su povezani sa infekcijom mikrobima, obično mikrobnim antigenima, ili su povezani sa kancerom, tipično tumorima.

[0154] Izraz „bolest koja uključuje antigen“ odnosi se na bilo koju bolest koja implicira antigen, npr. bolest koju karakteriše prisustvo antigena. Bolest koja uključuje antigen može da bude zarazna bolest, autoimuna bolest ili bolest kancera, ili jednostavno kancer. Kao što je gore pomenuto, antigen može da bude antigen povezan sa bolešću, kao što je antigen povezan sa tumorom, virusni antigen ili bakterijski antigen.

[0155] U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je antigen povezan sa tumorom. Poželjno, oboleli organ ili tkivo su okarakterisani bolesnim ćelijama kao što su ćelije kancera koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću i/ili se karakterišu vezivanjem antigena koji je povezan sa bolešću sa njihovom površinom. Imunizacija intaktnim ili suštinski intaktnim antigenima povezanim sa tumorom ili njihovim fragmentima, kao što su peptidi MHC klase I i klase II ili nukleinske kiseline, posebno iRNK, koja kodira takav antigen ili fragment omogućava izazivanje odgovora tipa MHC klase I i/ili klase II i, prema tome, stimuliše T ćelije kao što su CD8+ citotoksični T limfociti koji su sposobni da liziraju ćelije kancera i/ili CD4+ T ćelije. Takva imunizacija takođe može da izazove humoralni imuni odgovor (B-ćelijski odgovor) koji rezultuje proizvodnjom antitela prema antigenu povezanom sa tumorom. Osim toga, antigen-prezentujuće ćelije (APC), kao što su dendritske ćelije (DC), mogu da se napune peptidima koje prezentuje MHC klase I putem in vitro transfekcije nukleinskim kiselinama koje kodiraju tumorske antigene, i primene kod pacijenta. U jednom primeru izvođenja, termin „antigen povezan sa tumorom“ odnosi se na konstituent ćelija kancera koji može da potiče iz citoplazme, ćelijske površine i ćelijskog nukleusa. Posebno, odnosi se na one antigene koji se proizvode, poželjno u velikoj količini, unutarćelijski ili kao površinski antigeni na ćelijama tumora. Primeri za antigene tumora uključuju HER2, EGFR, VEGF, CAMPATH1-antigen, CD22, CA-125, HLA-DR, Hočkinov limfom ili mucin-1, ali nisu ograničeni na njih.

[0156] Prema predmetnim navodima, antigen povezan sa tumorom poželjno sadrži bilo koji antigen koji je karakterističan za tumore ili kancere, kao i za ćelije tumora ili kancera s obzirom na tip i/ili nivo ekspresije. U jednom primeru izvođenja, termin „antigen povezan sa tumorom“ odnosi se na proteine koji su u normalnim uslovima, tj. u zdravom subjektu, specifično eksprimirani u ograničenom broju organa i/ili tkiva ili u specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, antigen povezan sa tumorom može biti u normalnim uslovima specifično eksprimiran u stomačnom tkivu, poželjno u želudačnoj mukozi, u reproduktivnim organima, npr. u testisima, u tkivu trofoblasta, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimirani su ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U tom kontekstu, „ograničeni broj“ poželjno označava ne više od 3, poželjnije ne više od 2 ili 1. Antigeni povezani sa tumorom u kontekstu predmetnih navoda uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za ćelijski tip, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom ćelijskom tipu u određenom stadijumu diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i ponekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu predmetnih navoda, antigen povezan sa tumorom se poželjno ne eksprimira, ili se samo retko eksprimira, u normalnim tkivima, ili je mutiran u ćelijama tumora. Poželjno, antigen povezan sa tumorom ili aberantna ekspresija antigena povezanog sa tumorom identifikuje ćelije kancera. U kontekstu predmetnih navoda, antigen povezan sa tumorom koji eksprimira ćelija kancera kod subjekta, npr. pacijenta koji pati od bolesti kancera, poželjno je sopstveni protein navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom u kontekstu predmetnih navoda se eksprimira u normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji je ne-esencijalan, tj. tkivima ili organima koji kada se oštete imunim sistemom ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koji imunom sistemu nisu dostupni, ili su teško dostupni. Antigen povezan sa tumorom je poželjno prezentovan u kontekstu MHC molekula od strane ćelije kancera u kojoj je eksprimiran.

[0157] Primeri za antigene diferencijacije koji idealno ispunjavaju kriterijum za antigene povezane sa tumorom kako je nagovešteno ovim navodima kao ciljne strukture u imunoterapiji protiv tumora, posebno, u vakcinisanju protiv tumora, su proteini ćelijske površine iz porodice klaudina (Claudin), kao što su CLDN6 i CLDN18.2. Ovi antigeni diferencijacije se eksprimiraju kod tumora različitog porekla, i posebno su pogodni kao ciljne strukture u vezi sa imunoterapijom protiv kancera koja je posredovana antitelima zbog njihove selektivne ekspresije (bez ekspresije u normalnom tkivu relevantnom za toksičnost) i lokalizacije u ćelijskoj membrani.

[0158] Dalji primeri antigena koji mogu da budu korisni u ovim navodima su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (or hTRT), LAGE, LD-LR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGEA8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT, poželjno WT-1.

[0159] Termin „virusni antigen“ označava bilo koju virusnu komponentu koja ima antigena svojstva, tj. sposobna je da izazove imuni odgovor kod pojedinca. Virusni antigen može biti virusni ribonukleoprotein ili protein omotača.

[0160] Termin „bakterijski antigen“ označava bilo koju bakterijsku komponentu koja ima antigena svojstva, tj. sposobna je da izazove imuni odgovor kod pojedinca. Bakterijski antigen može da potiče iz ćelijskog zida ili membrane citoplazme bakterije.

[0161] Termin „imuni odgovor“, kako se ovde koristi, odnosi se na reakciju imunog sistema na primer na imunogene organizme, kao što su bakterije ili virusi, ćelije ili supstance. Termin „imuni odgovor“ uključuje urođeni imuni odgovor i adaptivni imuni odgovor. Poželjno, imuni odgovor je povezan sa aktivacijom imunih ćelija, indukcijom biosinteze citokina i/ili proizvodnjom antitela.

[0162] Prema predmetnim navodima, izraz „lečenje bolesti“ uključuje izlečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, usporavanje ili inhibiranje napredovanja ili pogoršanja bolesti ili njenih simptoma.

[0163] Izraz „imunoterapija“ se odnosi na lečenje koje poželjno uključuje specifičnu imunu reakciju i/ili imunu efektorsku funkciju/funkcije.

[0164] Termin „imunizacija“ ili „vakcinacija“ opisuje postupak lečenja subjekta iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.

[0165] Termin „subjekt“, kako se ovde koristi, poželjno se odnosi na sisare. Na primer, sisari u kontekstu predmetnih navoda su ljudi, primati koji nisu ljudi, pripitomljene životinje kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci itd., kao i životinje u zatočeništvu, kao što su životinje u zoološkim vrtovima. U poželjnom primeru izvođenja, subjekt je čovek.

[0166] Predmetni navodi takođe obezbeđuju postupak za pripremu farmaceutske kompozicije, pri čemu postupak obuhvata

− obezbeđivanje vodene formulacije kao što je gore definisano; i

− mešanje vodene formulacije sa farmaceutski aktivnim jedinjenjem.

[0167] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivno jedinjenje sadrži nukleinsku kiselinu, pri čemu je, poželjno, nukleinska kiselina obezbeđena u puferisanom rastvoru koji ima pH između 6 i 8.

[0168] Predmetni navodi takođe obezbeđuju farmaceutsku kompoziciju pripremljenu postupkom kao što je gore definisano.

[0169] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži lipozome napunjene farmaceutski aktivnim jedinjenjem.

[0170] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži lipoplekse nukleinske kiseline.

[0171] Izrazi „lipopleks nukleinske kiseline“ ili „lipopleks“, kako se ovde koriste, odnose se na kompleks lipida i nukleinskih kiselina, kao što su DNK ili RNK, poželjno RNK. Lipopleksi nastaju spontano kada se katjonski lipidi (npr. u obliku katjonskih lipozoma, koji često uključuju i neutralne pomoćne lipide), katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim naelektrisanjem pomešaju sa nukleinskim kiselinama, i pokazalo se da isporučuju nukleinske kiseline u ćelije. U jednom primeru izvođenja, lipopleksi imaju prosečan prečnik u opsegu od oko 50 nm do oko 1000 nm, poželjno od oko 100 nm do oko 800 nm, poželjno oko 200 nm do oko 600 nm, kao što je oko 300 nm do oko 500 nm.

[0172] Prosečni „prečnik“ ili „veličina“ čestica na bazi lipida (npr. lipozoma ili lipopleksa) opisanih ovde je generalno „nominalna veličina“ ili ciljna veličina čestica na bazi lipida pripremljenih prema utvrđenom postupku. Veličina može da bude direktno izmerena dimenzija, kao što je prosečni ili maksimalni prečnik, ili može da bude određena indirektnim testom, kao što je test filtracionog skrininga. Direktno merenje veličine čestica se obično sprovodi dinamičkim rasejanjem svetlosti. Često se rezultati merenja dinamičkog rasejanja svetlosti izražavaju u terminima Zprosečno(mera za prosečnu veličinu) i indeks polidisperznosti, PI ili PDI (mera za polidisperznost). Kako se tokom postupka proizvodnje javljaju manje varijacije u veličini, varijacija do 40% navedene mere je prihvatljiva i smatra se da je unutar navedene veličine. Alternativno, veličina se može odrediti testovima filtracionog skrininga. Na primer, preparat čestica je manji od navedene veličine, ako najmanje 97% čestica prođe kroz filter „tipa sita“ navedene veličine.

[0173] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je povezan sa lipozomima i/ili lipopleksima.

[0174] Farmaceutske kompozicije prema navodima su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu lipida ili čestica na bazi lipida (npr. lipozoma ili lipopleksa). Farmaceutske kompozicije mogu takođe da sadrže dodatne agense kao što je ovde diskutovano, kao što je dodatni terapijski agens ili antigen. Farmaceutske kompozicije prema navodima mogu dalje da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa. Farmaceutska kompozicija prema navodima može dalje da sadrži najmanje jedan adjuvans.

[0175] „Efikasna količina“ se odnosi na količinu koja ostvaruje željenu reakciju ili željeni efekat sama, ili zajedno sa daljim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se prvenstveno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo uključuje usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekid ili preokretanje napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može takođe da bude odlaganje početka ili prevencija pojave navedene bolesti ili navedenog stanja. Efikasna količina zavisi od stanja koje se leči, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, vrstu prateće terapije (ako postoji), specifičan način primene, i sličnih faktora. Shodno tome, primenjene doze mogu da zavise od raznih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna pri primeni početne doze, mogu da se koriste veće doze (ili efektivno veće doze koje se postižu drugačijim, lokalizovanijim putem primene).

[0176] Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu da se daju bilo kojim konvencionalnim putem. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za sistemsku primenu. Prema predmetnim navodima, sistemska primena je poželjno parenteralna, uključujući injekciju ili infuziju, npr. intravenskom, intraarterijskom, supkutanom primenom, primenom u limfni čvor, intradermalnom ili intramuskularnom primenom.

[0177] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan u odnosu na krv primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i razblaživača/rastvarača su sterilna voda (npr. voda za injekcije), Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, obično se kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje koriste sterilna, fiksna ulja.

[0178] Termin „farmaceutski prihvatljiv“, kako se ovde koristi, odnosi se na netoksičnost materijala koji, poželjno, ne stupa u interakciju sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.

[0179] Termin „ekscipijens“, kada se ovde koristi, ima za cilj da označi sve supstance koje mogu da budu prisutne u farmaceutskoj kompoziciji prema ovim navodima, a koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr. nosači, vezivni agensi, lubrikansi, zgušnjivači, površinski aktivni agensi, konzervansi, emulgatori, puferi, arome ili boje.

[0180] Termin „adjuvans“ se odnosi na jedinjenja koja produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imuni odgovor. S tim u vezi, postoje različiti mehanizmi, u zavisnosti od različitih vrsta adjuvanasa. Na primer, jedinjenja koja omogućavaju sazrevanje DC, npr. lipopolisaharidi ili CD40 ligand, čine prvu klasu pogodnih adjuvanasa. Uopšteno, bilo koji agens koji utiče na imuni sistem tipa „signala opasnosti“ (LPS, GP96, dsRNK itd.) ili citokina, kao što je GM-CSF, može da se koristi kao adjuvans koji omogućava da se imunološki odgovor intenzivira i/ili da se na njega utiče na kontrolisan način. Oligodezoksinukleotidi CpG takođe mogu opciono da se koriste u ovom kontekstu, iako se moraju uzeti u obzir njihovi neželjeni efekti koji se javljaju pod određenim okolnostima, kao što je gore objašnjeno. Posebno poželjni adjuvansi su citokini, kao što su monokini, limfokini, interleukini ili hemokini, npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFα, INF-γ, GM-CSF, LT-α ili faktori rasta, npr. hGH. Sledeći poznati adjuvansi su aluminijum hidroksid, Freundov adjuvans ili ulje kao što je Montanide<®>, najpoželjnije Montanide<®>ISA51. Lipopeptidi, kao što je Pam3Cys, su takođe pogodni za upotrebu kao adjuvansi u farmaceutskim kompozicijama ovih navoda.

[0181] Farmaceutske kompozicije prema ovim navodima takođe mogu da se koriste u sprezi sa drugim terapijskim agensom koji može da se primeni pre, istovremeno sa ili posle primene farmaceutskih kompozicija prema ovim navodima. Takvi terapijski agensi uključuju imunomodulacione agense, koji mogu da budu imunostimulatorni ili imunosupresivni, hemoterapijske lekove za pacijente sa kancerom, npr. gemcitabin, etopofos, cis-platin, karboplatin, antivirusne agense, antiparazitske agense ili antibakterijske agense i, ako se primenjuju istovremeno, mogu da budu prisutni u farmaceutskoj kompoziciji prema ovim navodima.

[0182] Farmaceutska kompozicija prema ovim navodima može da se koristi za izazivanje imunog odgovora, posebno imunog odgovora usmerenog na antigen povezan sa bolešću ili na ćelije koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću, kao što je imuni odgovor protiv kancera. Shodno tome, farmaceutska kompozicija može da se koristi za profilaktičko i/ili terapijsko lečenje bolesti koja uključuje antigen povezan sa bolešću ili ćelije koje eksprimiraju antigen povezan sa bolešću, kao što je kancer. Poželjno, pomenuti imuni odgovor je T-ćelijski odgovor. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je tumorski antigen.

[0183] Predmetni navodi takođe obezbeđuju farmaceutsku kompoziciju ili komplet kako je ovde definisano za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti ili za upotrebu u postupku za imunostimulaciju.

[0184] Predmetni navodi se takođe odnose na upotrebu farmaceutske kompozicije ili kompleta kako je ovde definisano u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju bolesti ili za upotrebu u postupku za imunostimulaciju.

[0185] Predmetni navodi dalje obezbeđuju postupak za lečenje ili prevenciju bolesti ili postupak za imunostimulaciju, pri čemu postupci obuhvataju korak davanja farmaceutske kompozicije kao što je ovde definisano subjektu kome je to potrebno.

[0186] Konačno, predmetni navodi obezbeđuju postupak za hemijsku stabilizaciju vodene formulacije koja sadrži najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza, poželjno estarskih veza, pri čemu postupak obuhvata

− podešavanje pH vodene formulacije na pH između 2 i 5.5.

[0187] U jednom primeru izvođenja, hemijska stabilizacija se dešava inhibicijom hidrolize estarske veze, tioestarske veze i/ili amidne veze, poželjno hidrolize estarske veze.

[0188] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je katjonski lipid, poželjno katjonski lipid kao što je ovde definisano.

[0189] U jednom primeru izvođenja, ukupno neto naelektrisanje lipida prisutnih u vodenoj formulaciji je pozitivno.

[0190] U jednom primeru izvođenja, pH je podešen na pH između 2 i 5, poželjno između 2.5 i 5, poželjnije između 3 i 4.5, poželjnije između 3 i 4, i još poželjnije između 3.5 i 4. U daljem poželjnom primeru izvođenja, vodena formulacija ima pH između 3.1 i 3.9.

[0191] U jednom primeru izvođenja, pH vodene formulacije lipida se podešava dodavanjem najmanje jednog agensa za podešavanje pH, poželjno najmanje jednog agensa za podešavanje pH kao što je gore definisano.

[0192] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid koji ima jednu ili više veza izabranih iz grupe koja se sastoji od estarskih veza, tioestarskih veza i amidnih veza je kao što je gore definisano.

[0193] U jednom primeru izvođenja, lipidi prisutni u vodenoj formulaciji formiraju lipozome.

[0194] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan agens za podešavanje pH je povezan sa lipozomima.

[0195] Predmetni navodi su dalje ilustrovani sledećim primerima koje ne treba tumačiti kao ograničavajući za obim navoda.

Primeri

Materijali

[0196]

• (R)-N,N,N-trimetil-2,3-dioleiloksi-1-1propanaminijum hlorid (R-DOTMA), Merck & Cie. • 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), Corden Pharma

• Etanol 99.5% Ph. Eur., Carl Roth

• Sirćetna kiselina prema Farmakopeji Sjedinjenih Država (USP), AppliChem

• Natrijum acetat USP, AppliChem

• HEPES pufer, Life Technologies

• Voda za injekcije, Baxter

• Špric inject-F od 1 mL, B. Braun

• Igla 0.9x40 mm Microlance 3, BD

• Staklene bočice R6 tipa I, Wheaton

• Aluminijumske zaptivke od 20 mm, Wheaton

• Butil zapušači od 20 mm, Wheaton

Primer 1: Priprema lipozoma

[0197] Svi materijali u kontaktu sa rastvorima i preparatima lipozoma bili su sterilni i za jednokratnu upotrebu. Lipozomi su formirani takozvanom tehnikom ubrizgavanja etanola (Batzri and Korn, 1973), gde se lipidi rastvoreni u etanolu ubrizgavaju u vodenu fazu uz mešanje.

[0198] Odnosi lipida i koncentracije lipida u etanolu su varirali u zavisnosti od željene formulacije i veličine čestica. Za lipozome DOTMA/DOPE, rastvor etanola je sadržao DOTMA i DOPE u molarnom odnosu 2:1 pri ukupnoj koncentraciji lipida od oko 330 mM. Za lipozome DOTAP/DOPE, rastvor etanola je sadržao DOTAP i DOPE u molarnom odnosu 2:1 pri ukupnoj koncentraciji lipida od oko 330 mM. Rastvori su sterilisani filtracijom kroz filter veličine pora 0.2 µm (Millipore Millex MP).

[0199] Sterilni rastvori lipida u etanolu su zatim ubrizgani u spiner-bocu za jednokratnu upotrebu koja sadrži vodenu fazu i mešani pri brzini od 150 o/min najmanje jedan sat. Vodena faza je bila ili voda za injekcije (wfi) ili Milli-Q-filtrirana voda sa provodljivošću od 1.3 µS/cm na 25°C, ili je to bio puferski rastvor sastavljen od puferskih soli i kiselina kako je naznačeno. Svi materijali su bili farmaceutskog kvaliteta. Ubrizgavanje je sprovođeno do finalne koncentracije lipida od 5-10 mM, u zavisnosti od eksperimenta. Većina eksperimenata je izvedena pri finalnoj ukupnoj koncentraciji lipida u vodenoj fazi od 6.6 mM.

[0200] Dobijeni preparati lipozoma su filtrirani kroz celulozno-acetatni filter veličine pora od 0.45 µm. Preparat filtrata je zatim razblažen disperzionim rastvorom do željene koncentracije i uskladišten u bioprocesnim vrećama. Za standardne eksperimente, 4 mM je odabrano kao finalna koncentracija. Temperatura skladištenja pre eksperimenata stabilnosti u funkciji pH bila je 2-5°C.

Primer 2: Stabilnost lipozoma DOTMA/DOPE u funkciji pH vrednosti

[0201] Stabilnost DOPE u lipozomima DOTMA/DOPE je ispitivana nakon podešavanja pH na različite vrednosti između pH 7 i pH 4. Za pH 7 korišćen je 10 mM HEPES pufer. Za sve niže pH vrednosti korišćeni su puferi na bazi sirćetne kiseline (svih 10 mM) (videti tabelu 1). Staklene bočice R6 tipa I su napunjene sa 2 mL disperzije lipozoma i skladištene u komori za stabilnost na 37°C. pH vrednosti su merene potenciometrijom korišćenjem WTW pH-metra inoLab pH 7310, Weilheim, Nemačka.

Tabela 1: Disperzioni rastvori

[0202] Stabilnost lipida je ispitivana u različitim vremenskim tačkama do 6 nedelja nakon pripreme lipozoma merenjem koncentracije lipida u preparatu lipozoma korišćenjem HPLC sistema (Agilent Technologies 1200 opremljen detektorima DAD i ELSD, Santa Clara, CA, SAD).

[0203] Rezultati su dati na slici 1. Grafički je prikazana normalizovana regeneracija DOPE (u procentima) iz lipozoma DOTMA/DOPE. Prikazan je samo DOPE, jer za DOTMA, ni pod jednim uslovima nisu pronađene indikacije degradacije, što je posledica činjenice da DOTMA umesto estarskih veza sadrži etarske veze. Lipozomi u vodenoj fazi sa najnižim pH, pH 4, pokazali su najbolju stabilnost bez značajne degradacije nakon 6 nedelja. Nasuprot tome, na pH 5 već je primećena značajna degradacija sa regeneracijom od samo 80% početne vrednosti. Stabilnost se smanjivala sa povećanjem pH, a najveća degradacija je zapažena za pH 6 i pH 7 (opseg u kojem bi se očekivala najbolja stabilnost).

Primer 3: Uticaj koncentracije pufera na stabilnost lipozoma

[0204] Dalje je ispitana stabilnost DOPE u lipozomima DOTMA/DOPE (DOTMA:DOPE u molarnom odnosu 2:1) u niskom pH opsegu. U ovom eksperimentu, još niže pH vrednosti su ispitivane dodavanjem čiste sirćetne kiseline (10 mM). Puferi na bazi sirćetne kiseline su dodavani u tri različite koncentracije, naime 1 mM, 5 mM i 10 mM. Uzorci su izlagani stresu na 40°C tokom 5 nedelja.

[0205] Na slici 2 je data regeneracija DOPE za različite uslove. Kao potvrda rezultata eksperimenta opisanog u primeru 2 (Slika 1), stabilnost se kontinuirano poboljšavala sa snižavanjem pH. Pokazalo se da je čista sirćetna kiselina (10 mM; pH 3.2) bar jednako dobra ili bolja od acetatnog pufera pH 3.5 (AcB) pri istoj koncentraciji. Stabilizujući efekat kiselih pufera zavisio je od koncentracije, što se najjasnije može videti na pH 5 i 6. Može se uočiti trend da veće koncentracije pufera rezultuju boljom zaštitom od hidrolize. Pri veoma niskim vrednostima pH ovaj efekat je bio manje izražen. Može se zaključiti da dodavanje čiste sirćetne kiseline u odgovarajućoj koncentraciji može da predstavlja jednostavan i direktan način da se postigne stabilizacija DOPE u pogledu hidrolize estara.

Primer 4: Poređenje rezultata različitih studija pod uslovima stresa

[0206] Na slici 3 sumirani su rezultati nekoliko nezavisnih studija pod uslovima stresa. U svakom slučaju, lipozomi DOTMA/DOPE su podvrgnuti stresu u sirćetnoj kiselini i rastvorima pufera na bazi sirćetne kiseline (svi 10 mM) na različitim pH vrednostima na 40°C. Prikazani su rezultati nakon 5 ili 6 nedelja (kvadrati sa različitim ispunama). Puna linija je povučena da bi se vizuelizovao opšti trend.

[0207] Korelacija između stabilnosti lipida i pH vrednosti može lako da se uoči. Maksimalna stabilnost se postiže u pH opsegu ispod 4, gde zaštitni efekat očigledno dostiže plato. Niže pH vrednosti ili veće koncentracije pufera/kiseline mogu dovesti do još bolje zaštite od hidrolize. Međutim, u predmetnom kontekstu, ekstremno visoke koncentracije pufera ili ekstremno niske pH vrednosti nisu poželjne, jer tako strogi uslovi ne bi trebalo da se koriste u formulacijama za davanje pacijentima.

Primer 5: Stabilnost lipozoma DOTAP/DOPE u funkciji pH vrednosti

[0208] U ovoj studiji je ispitivana stabilnost lipozoma sa DOTAP umesto DOTMA. DOTAP je katjonski lipid sa sličnom strukturom kao DOTMA, ali sadrži estarske veze umesto etarskih veza. Prema tome, DOTAP bi trebalo da bude podložan hidrolizi estara na sličan način kao DOPE. Osim zamene DOTMA sa DOTAP, svi ostali uslovi su ostali nepromenjeni.

[0209] Na slici 4, rezultati merenja regeneracije lipida posle dve nedelje na 40°C prikazani su za različite pH uslove u vodenoj fazi. Prikazani su rezultati za DOTAP i DOPE. Kod oba lipida došlo je do hidrolize, pri čemu je opšte ponašanje bilo ekvivalentno i slično nalazu za DOPE u lipozomima DOTMA/DOPE. Prema tome, hidroliza DOTAP bi mogla da se spreči na isti način kao i za DOPE, dodavanjem kiselih pufera ili kiselina, kao što je sirćetna kiselina.

Primer 6: Poređenje razgradnje DOPE u lipozomima DOTMA/DOPE u vodi za injekcije sa ili bez 5 mM sirćetne kiseline

[0210] Ispitano je dodavanje sirćetne kiseline za stabilizaciju lipozoma za farmaceutsku upotrebu, koji su prethodno bili proizvedeni u čistoj vodi za injekcije (wfi). Na slici 5 prikazani su rezultati studija stresa sa i bez sirćetne kiseline. Za stabilizovane lipozome, u vodenu fazu je pre formiranja lipozoma dodato 5 mM sirćetne kiseline. Prikazani su rezultati merenja regeneracije DOPE nakon 3 meseca skladištenja na tri različite temperature, 5°C, 25°C i 40°C. U sva tri slučaja, regeneracija je bila veća kada je sirćetna kiselina bila prisutna u vodenoj fazi. Efekat je postao izraženiji na višim temperaturama (uslovi stresa) i najjasnije je bio vidljiv na 40°C, gde je regeneracija mogla da se poboljša sa oko 60% na oko 90%.

[0211] Kada se uporedi stabilnost na različitim temperaturama, dodavanje 5 mM sirćetne kiseline imalo je sličan efekat kao snižavanje temperature skladištenja za 15 do 35°C. Uzimajući u obzir pravilo da snižavanje temperature za 10°C dovodi do smanjenja brzine hidrolize za faktor dva, to bi odgovaralo povećanju stabilnosti (ili smanjenju brzine hidrolize) na datoj temperaturi za faktor od oko 4 (pod pretpostavkom da je efekat ekvivalentan smanjenju temperature za 20°C).

Primer 7: Formiranje lipopleksa

[0212] pH-stabilizovani lipozomi DOTMA/DOPE su korišćeni za formiranje formulacija RNK lipopleksa za intravensku injekciju ekvivalentnog ili boljeg kvaliteta u pogledu fizikohemijskih karakteristika u poređenju sa lipopleksima napravljenim od lipozoma koji nisu pH-stabilizovani.

[0213] RNK lipopleksi su pripremljeni prema sledećem protokolu:

1. Dodavanje 4 mL 0.9 % rastvora NaCl u 1.1 mL RNK;

2. Dodavanje 0.4 mL lipozoma u smešu RNK/NaCl; i

3. Ekvilibracija 3 minuta na sobnoj temperaturi

[0214] U tabeli 2 prikazani su rezultati fizikohemijske karakterizacije lipozoma i lipopleksa. Prečnik lipozoma je meren dinamičkim rasipanjem svetlosti pomoću PSS-Nicomp 380 ZLS, Santa Barbara, CA, SAD. Dok su veličina i indeks polidisperznosti (PDI) lipozoma sa sirćetnom kiselinom bili nešto manji od onih bez sirćetne kiseline, veličina čestica lipopleksa je bila nešto veća sa sirćetnom kiselinom nego bez nje, dok je indeks polidisperznosti bio manji. Veća veličina se smatra povoljnom u smislu biološke aktivnosti, dok je manji indeks polidisperznosti povoljan u pogledu zahteva kvaliteta. Broj nevidljivih čestica, koje ne smeju da budu prisutne u injekcionim proizvodima iznad određenih pragova, bio je značajno manji kada su stabilizovani lipozomi korišćeni za pripremu lipopleksa. pH vrednost finalne formulacije bila je iznad 6 i stoga je bila pogodna za injekcije. Osmolarnost je bila ekvivalentna fiziološkim uslovima.

Tabela 2: Fizikohemijska karakterizacija lipozoma i RNK lipopleksa

Primer 8: Biološka procena lipopleksa

[0215] Biološka aktivnost lipopleksa formiranih od pH-stabilizovanih lipozoma (dodavanjem sirćetne kiseline) ispitivana je merenjima bioluminiscencije. Preuzimanje i translacija formulisane RNK koja kodira luciferazu svica (luc RNK lipopleksi) su procenjeni in vivo bioluminiscentnim snimanjem pomoću sistema za snimanje Xsenogen IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Ukratko, vodeni rastvor D-luciferina (75 mg/kg telesne težine) (Caliper Life Sciences) je ubrizgan miševima i.p. 6 h nakon primene 20 µg luc RNK lipopleksa. Fotoni koje emituju žive životinje ili ekstrahovana tkiva kvantifikovani su 10 minuta kasnije sa vremenom ekspozicije od 1 min. Regioni od interesa (ROI) su označeni sa dobijenih slika, a bioluminiscencija je kvantifikovana kao srednja osvetljenost (fotoni/s/cm2/sr, predstavljeno obojenim stubićima) korišćenjem softvera IVIS Living Image 4.0.

[0216] Kao što je prikazano na slici 6, signali dobijeni sa lipopleksima formiranim od pH-stabilizovanih lipozoma (videti tabelu 3) bili su samo nešto niži od onih sa lipopleksima formiranim od lipozoma koji nisu pH-stabilizovani. Veoma mali pad apsolutnog broja bio je manji od granice greške merenja i stoga nije značajan.

Tabela 3: pH vrednosti uzoraka lipopleksa

Primer 9: Stabilnost DOPE u lipozomima DOTMA/DOPE pripremljenim pod uslovima DPP ili uslovima sličnim DPP u vodi za injekcije ili vodi za injekcije koja sadrži 5 mM sirćetne kiseline

[0217] Lipozomi koji se sastoje od DOTMA/DOPE u molarnom odnosu 2/1 proizvedeni su tehnikom ubrizgavanja etanola do koncentracije od oko 4 mM (ukupni lipid). Kao vodena faza, korišćena je ili voda za injekcije (wfi) ili wfi koja sadrži 5 mM sirćetne kiseline. Lipozomi u wfi su označeni kao lipozomi L1, lipozomi u wfi koja sadrži 5 mM sirćetne kiseline (što rezultuje pH vrednošću između 3 i 4) su označeni kao lipozomi L2. Osim prisustva ili odsustva sirćetne kiseline, svi ostali uslovi proizvodnje su bili identični. Korišćeni su lipidi DPP kvaliteta, a proizvodnja je obavljena u uslovima DPP ili uslovima sličnim DPP. Proizvedeno je nekoliko serija lipozoma L1 i L2, a nakon punjenja u staklene bočice, testirana je stabilnost na sledećim temperaturama:

1. 5°C (2-8°C);

2. 25°C (22-28°C) = ubrzani uslovi;

3. 40°C (38-42°C) = uslovi stresa.

[0218] Podaci o stabilnosti za lipozome L1 i L2 su prikupljeni tokom perioda do 25 meseci (L1), odnosno do 9 meseci (L2). Studije stabilnosti su još uvek u toku. Na slici 7 A do C, prikazani su podaci o stabilnosti za različite serije lipozoma L1 i L2 na različitim temperaturama. U svim temperaturnim uslovima i za sve proizvedene serije stabilnost DOPE u lipozomima L2 je bila suštinski bolja od one u lipozomima L1.

[0219] Ovo ukazuje da podešavanje pH na kisele uslove dodavanjem 5 mM sirćetne kiseline u vodenu fazu značajno poboljšava stabilnost DOPE u lipozomima. Rok upotrebe lipozoma može se povećati približno za faktor 4.

Reference

[0220]

Batzri, S. and E. D. Korn (1973). „Single bilayer liposomes prepared without sonication.“ Biochim Biophys Acta 298(4): 1015-1019.

Chen, C. J., D. D. Han, C. F. Cai and X. Tang (2010). „An overview of liposome lyophilization and its future potential.“ Journal of Controlled Release 142(3): 299-311.

Stark, B., G. Pabst and R. Prassl (2010). „Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure.“ European Journal of Pharmaceutical Sciences 41(3-4): 546-555.

van Winden, E. C. and D. J. Crommelin (1999). „Short term stability of freeze-dried, lyoprotected liposomes.“ J Control Release 58(1): 69-86.

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Komplet koji sadrži

(i) vodenu disperziju lipozoma koja sadrži

- lipozome koji sadrže 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE) i najmanje jedan katjonski lipid izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijumpropana (DOTMA) i 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijumpropana (DOTAP), gde su navedeni lipozomi katjonski na fiziološkom pH, pri čemu fiziološki pH ima pH između 6 i 8, i

- najmanje jedan agens za podešavanje pH,

pri čemu vodena disperzija lipozoma ima pH između 2 i 4.5, i

(ii) u posebnom kontejneru, farmaceutski aktivnu nukleinsku kiselinu, pri čemu je farmaceutski aktivna nukleinska kiselina obezbeđena u puferisanom rastvoru koji ima pH između 6 i 8.

2. Komplet prema zahtevu 1, gde molarni odnos najmanje jednog katjonskog lipida prema DOPE iznosi od 1:4 do 4:1, poželjnije od 1:2 do 4:1.

3. Komplet prema zahtevu 1 ili 2, gde najmanje jedan agens za podešavanje pH sadrži kiselinu i/ili kiseli pufer.

4. Komplet prema zahtevu 3, gde je kiselina sirćetna kiselina.

5. Komplet prema zahtevu 3, gde je kiseli pufer acetatni pufer.

6. Komplet prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde su brzine hidrolize DOPE i/ili DOTAP smanjene u poređenju sa brzinama njihove hidrolize na pH između 6 i 7.

7. Komplet prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je najmanje jedan agens za podešavanje pH povezan sa lipozomima.

8. Postupak za pripremu farmaceutske kompozicije, gde postupak obuhvata

- obezbeđivanje vodene disperzije lipozoma kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 7; i

- mešanje vodene disperzije lipozoma sa farmaceutski aktivnom nukleinskom kiselinom, pri čemu je farmaceutski aktivna nukleinska kiselina obezbeđena u puferisanom rastvoru koji ima pH između 6 i 8.

9. Postupak za hemijsku stabilizaciju vodene disperzije lipozoma koja sadrži lipozome koji sadrže 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE) i najmanje jedan katjonski lipid izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijumpropana (DOTMA) i 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijumpropana (DOTAP), pri čemu su navedeni lipozomi katjonski na fiziološkom pH, gde postupak obuhvata

- podešavanje pH vodene disperzije lipozoma na pH između 2 i 4.5, pri čemu, poželjno, do hemijske stabilizacije dolazi inhibicijom hidrolize estarske veze.