RS64397B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raznih tumora (seq id 25 - mrax5-003) - Google Patents

Description

Opis

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumorasociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.

Predmetni pronalazak odnosi se na nekoliko novih peptidnih sekvenci i njihove varijante dobijene iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.

OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU

Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (SZO), rak je bio među četiri glavne nezarazne smrtonosne bolesti širom sveta u 2012. godini. Za istu godinu, kolorektalni karcinom, rak dojke i maligni tumori respiratornog trakta bili su rangirani u 10 najčešćih uzorka smrti u bogatim zemljama (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/).

Epidemiologija

U 2012. godini procenjeno je da je širom sveta bilo 14,1 milion novih slučajeva raka, da je 32,6 miliona pacijenata bolovalo od raka (u okviru 5 godina od postavljanja dijagnoze), kao i da je bilo 8,2 miliona smrtnih slučajeva usled raka (Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

U okviru grupa raka mozga, leukemije i raka pluća, prikazana objava se specifično fokusira na glioblastom (GB), hroničnu limfocitnu leukemiju (HLL) i akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), odnosno nesitnoćelijski i sitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC i SCLC).

GB je najčešći malignitet centralnog nervnog sistema sa stopom incidencije prilagođenom za uzrast od 3,19 na 100.000 stanovnika u Sjedinjenim Američkim Državama. GB ima veoma lošu prognozu sa stopom 1-godišnjeg preživljavanja od 35%, te stopom 5-godišnjeg preživljavanja manjom od 5%. Čini se da su muški pol, starija dob i etnička pripadnost faktori rizika za GB (Thakkar et al., 2014).

HLL je najčešći tip leukemije u zapadnom svetu gde čini oko jednu trećinu svih leukemija. Stope incidencije su slične u SAD i Evropi, a procenjeni broj novih slučajeva je oko 16.000 godišnje. HLL je češća kod belaca nego kod Afrikanaca, ređa kod ljudi hispano porekla i Indijanaca a retka kod Azijata. Kod ljudi azijskog porekla, stope incidencije HLL su 3 puta manje nego kod belaca (Gunawardana et al., 2008). Ukupno petogodišnje preživljavanje za pacijente sa HLL iznosi oko 79% (http://www.cancer.net/cancer-types/leukemia-chronic-lymphocytic-cll/statistics).

Rak pluća je najčešća vrsta raka širom sveta i vodeći je uzrok smrti od raka u mnogim zemljama. Rak pluća se deli na sitnoćelijski karcinom pluća i nesitnoćelijski karcinom pluća. NSCLC obuhvata histološke tipove adenokarcinom, skvamocelulalrni karcinom i krupnoćelijski karcinom i čini 85% svih karcinoma pluća u Sjedinjenim Američkim Državama. Incidencija NSCLC je u bliskoj korelaciji sa prevalencijom pušenja, uključujući aktivne i bivše pušače a prijavljeno je da je stopa petogodišnjeg preživljavanja 15% (World Cancer Report, 2014; Molina et al., 2008).

Terapija

Rak dojke

Standardna terapija za pacijente sa rakom dojke zavisi od različitih parametara: stadijuma tumora, statusa hormonskog receptora i obrasca ekspresije HER2. Standardno lečenje podrazumeva kompletnu hiruršku resekciju tumora nakon koje sledi zračna terapija. Hemioterapija uglavnom antraciklinima i taksanima može da se započne pre ili nakon resekcije. Pacijenti sa HER2-pozitivnim tumorima dobijaju antiHER2 antitelo trastuzumab u dodatku hemioterapeutika (S3-Leitlinie Mammakarzinom, 2012). Rak dojke je imunogeni tumorski entitet a različite vrste infiltrirajućih imunskih ćelija u primarnim tumorima pokazuju osoben prognostički i prediktivni značaj. Veliki broj ispitivanja imunoterapije u ranoj fazi je sprovedeno kod pacijenata sa rakom dojke. Klinički podaci o efektima modulacije imunske kontrolne tačke pomoću ipilimumaba i drugih antitela koja aktiviraju T ćelije kod pacijenata sa rakom dojke su u razvoju (Emens, 2012).

Hronična limfocitna leukemija

Iako HLL trenutno nije izlečiva, mnogi pacijenti pokazuju samo sporu progresiju bolesti ili pogoršanje simptoma. Za pacijente sa simptomatskom ili brzo progredirajućom bolešću dostupno je nekoliko opcija lečenja. One obuhvataju hemioterapiju, ciljanu terapiju, imunološke terapije poput monoklonalnih antitela, himernih antigenskih receptora (CAR-ova) i aktivne imunoterapije, kao i transplantaciju matičnih ćelija.

Nekoliko završenih i ispitivanja koja su u toku su zasnovana na veštački napravljenim autolognim T ćelijama sa modifikovanim himernim antigenskim receptorom (CAR) koje su CD19-specifične (Maus et al., 2014). Do sada je samo manji broj pacijenata pokazalo detektabilne ili perzistentne CAR-ove. Detektovani su jedan delimičan odgovor (PR) i dva kompletna odgovora (CR) u CAR T-ćelijskim ispitivanjima od strane autora Porter i sar. i Kalos i sar. (Kalos et al., 2011; Porter et al., 2011).

Aktivna imunoterapija uključuje sledeće strategije: gensku terapiju, vakcine sa celim modifikovanim tumorskim ćelijama, vakcine zasnovane na DĆ i peptidne vakcine dobijene iz tumor-asociranog antigena (TAA).

Nekoliko TAA je prekomerno eksprimirano u HLL i prikladno za vakcinacije. Između ostalih to su fibromodulin (Mayr et al., 2005), RHAMM/CD168 (Giannopoulos et al., 2006), MDM2 (Mayretal., 2006), hTERT (Counter et al., 1995), onkofetalni antigennezreli protein receptora za laminin (OFAiLRP) (Siegel et al., 2003), adipofilin (Schmidt et al., 2004), survivin (Granziero et al., 2001), KW1 do KW14 (Krackhardt et al., 2002) i region lgVHCDR3 dobijen iz tumora (Harig et al., 2001; Carballido et al., 2012). Sprovedeno je kliničko ispitivanje faze I pomoću R3 peptida dobijenog iz RHAMM u vidu vakcine. Pet of šest pacijenata imalo je detektabilne R3-specifične CD8+ T-ćelijske odgovore (Giannopoulos et al., 2010).

Kolorektalni karcinom

U zavisnosti od stadijuma kolorektalnog karcinoma (CRC), dostupne su različite standardne terapije za rak kolona i rektuma. Standardni postupci obuhvataju hiruršku intervenciju, zračnu terapiju, hemioterapiju i ciljanu terapiju za CRC (Berman et al., 2015a; Berman et al., 2015b).

Najnovija klinička ispitivanja analiziraju aktivnu imunoterapiju kao terapijsku opciju za CRC. Te strategije uključuju vakcinaciju peptidima iz tumor-asociranih antigena (TAA), celim tumorskim ćelijama, putem vakcina zasnovanih na dendritičnim ćelijama (DĆ) i virusnim vektorima (Koido et al., 2013).

Peptidne vakcine su dosad bile usmerene protiv karcinoembrionskog antigena (CEA), mucina 1, EGFR, antigena skvamocelularnog karcinoma kojeg prepoznaju T ćelije 3 (SART3), beta-humanog horionskog gonadotropina (beta-hCG), antigena 1 Vilmsovog tumora (WT1), survivina-2B, MAGE3, p53, ring prst proteina 43 i translokaze spoljašnje mitohondrijalne membrane 34 (TOMM34) ili mutiranog KRAS. U nekoliko kliničkih ispitivanja faze I i II pacijenti su pokazali antigen-specifične CTL odgovore ili proizvodnju antitela. Za razliku od imunoloških odgovora, mnogi pacijenti nisu imali koristi od peptidnih vakcina na kliničkom nivou (Koido et al., 2013; Miyagi et al., 2001; Moulton et al., 2002; Okuno et al., 2011).

Vakcine zasnovane na dendritičnim ćelijama obuhvataju DĆ pulsirane sa peptidima izvedenim iz TAA, lizatima tumorskih ćelija, apoptotičnim tumorskim ćelijama ili RNK tumora odnosno proizvode fuzije DĆ i tumorskih ćelija. Premda su mnogi pacijenti ispoljili specifične imunološke odgovore u ispitivanjima faze I/II, samo je kod manjine došlo do kliničke koristi (Koido et al., 2013).

Rak jednjaka

Primarna terapijska strategija za rak jednjaka zavisi od stadijuma i lokacije tumora, histološkog tipa tumora i zdravstvenog stanja pacijenta. Hemioterapijski režimi uključuju oksaliplatin plus fluorouracil, karboplatin plus paklitaksel, cisplatin plus fluorouracil, FOLFOX i cisplatin plus irinotekan. Pacijenti sa HER2-pozitivnim tumorima treba da se leče u skladu sa smernicama za rak želuca, jer su randomizovani podaci za ciljane terapije kod raka jednjaka veoma ograničeni (Stahl et al., 2013).

Podaci o imunoterapijskim pristupima kod raka jednjaka su oskudni, zato što je sproveden samo veoma ograničen broj kliničkih ispitivanja ranih faza. Vakcina koja sadrži tri peptida dobijena od tri različita karcinom-testis antigena (TTK protein kinaza, lokus K kompleksa 6 limfocitnog antigena i insulinu-sličan faktor rasta (IGF)-II iRNK vezujući protein 3) davana je pacijentima sa uznapredovalim rakom jednjaka u ispitivanju faze I sa umerenim rezultatima. Intratumorska injekcija aktiviranih T ćelija nakon in vitro izazova sa autolognim malignim ćelijama izazvala je kompletne ili parcijalne tumorske odgovore kod četiri od jedanaest pacijenata u studiji faze I/II (Toomey et al., 2013).

Rak želuca

Karcinom želuca (GC) započinje u ćelijama koje sačinjavaju sluznicu i kako raste širi se kroz spoljašnje slojeve. Koriste se četiri vrste standardnog lečenja. Lečenje karcinoma želuca može uključivati endoskopsku ili hiruršku resekciju, hemioterapiju, zračnu terapiju ili hemioiradijaciju (Leitlinie Magenkarzinom, 2012).

Efikasnost aktuelnih terapijskih režima za uznapredovali GC je loša, što rezultuje niskim stopama 5-godišnjeg preživljavanja. Imunoterapija može biti alternativni pristup za poboljšanje preživljavanja pacijenata sa GC. Adoptivni transfer tumorasociranih limfocita i citokinom indukovanih ćelija ubica, vakcine zasnovane na peptidima koje ciljaju HER2/neu, MAGE-3 ili receptor 1 i 2 vaskularnog endotelijalnog faktora rasta i vakcine zasnovane na dendritičnim ćelijama koje ciljaju HER2/neu pokazali su obećavajuće rezultate u kliničkim ispitivanjima karcinoma želuca. Inhibicija imunske kontrolne tačke i inženjeringom stvorene T ćelije mogu predstavljati dodatne terapijske opcije, što se trenutno procenjuje u pretkliničkim i kliničkim studijama (Matsueda and Graham, 2014).

Glioblastom

Terapijske opcije za glioblastom (SZO gradus IV) su veoma ograničene. Ispituju se različiti imunoterapijski pristupi za lečenje GB, uključujući inhibiciju imunske kontrolne tačke, vakcinaciju i adoptivni transfer inženjeringom stvorenih T ćelija.

Trenutno se ispituju različite strategije vakcinacije za pacijente sa GB, uključujući vakcine zasnovane na peptidima, vakcine proteinom toplotnog stresa, vakcine autolognim tumorskim ćelijama, vakcine zasnovane na dendritičnim ćelijama i vakcine zasnovane na virusnom proteinu. U ovim pristupima daju se peptidi dobijeni od GB-asociranih proteina poput varijante III receptora epidermalnog faktora rasta (EGFRvlll) ili proteina toplotnog stresa ili dendritičnih ćelija pulsiranih sa lizatom autolognih tumorskih ćelija ili komponentama citomegalovirusa kako bi se indukovao antitumorski imunski odgovor kod pacijenata sa GB. Nekoliko od ovih studija pokazuju dobre profile bezbednosti i podnošljivosti kao i obećavajuće podatke o efikasnosti.

Adoptivni transfer genetski modifikovanih T ćelija je dodatni imunoterapijski pristup za lečenje GB. Različita klinička ispitivanja trenutno procenjuju bezbednost i efikasnost T ćelija koje nose himerni antigenski receptor koje su usmerene protiv HER2, receptora alfa 2 IL-13 i EGFRvlll (Ampie et al., 2015).

Rak jetre

Lečenje bolesti zavisi od stadijuma tumora u vreme postavljanja dijagnoze i celokupnog stanja jetre. Hemioterapija protiv HCC obuhvata kombinacije doksorubicina, 5-fluorouracila i cisplatina za sistemsku terapiju i doksorubicin, floksuridin i mitomicin C za infuzije u hepatičku arteriju. Međutim, većina HCC pokazuje visoku rezistenciju na hemioterapeutike (Enguita-German and Fortes, 2014).

Terapijske opcije kod uznapredovalog neresektabilnog HCC su ograničene na Sorafenib, inhibitor više tirozin kinaza (Chang et al., 2007; Wilhelm et al., 2004). Sorafenib je jedini sistemski lek za koji je potvrđeno da povećava preživljavanje za oko 3 meseca i trenutno predstavlja jedinu eksperimentalnu terapijsku opciju za takve pacijente (Chapiro et al., 2014; Llovet et al., 2008).

U poslednje vreme je sproveden ograničen broj imunoterapijskih ispitivanja za HCC. Citokini su korišćeni za aktivaciju podskupova imunskih ćelija i/ili povećavanje imunogenosti tumora (Reinisch et al., 2002; Sangro et al., 2004). Ostala ispitivanja su bila fokusirana na infuziju tumor-infiltrišućih limfocita ili aktiviranih limfocita periferne krvi (Shi et al., 2004; Takayama et al., 1991; Takayama et al., 2000).

Do sada je sproveden mali broj ispitivanja sa terapijskom vakcinacijom. Butterfield i sar. su sproveli dva ispitivanja primenom peptida izvedenih iz alfa-fetoproteina (AFP) u vidu vakcine ili DĆ napunjenih AFP peptidima ex vivo (Butterfield et al., 2003; Butterfield et al., 2006). U dve različite studije, autologne dendritične ćelije (DĆ) su bile pulsirane ex vivo sa autolognim lizatom tumora (Lee et al., 2005) ili lizatom ćelijske linije hepatoblastoma HepG2 (Palmer et al., 2009). Do sada su ispitivanja sa vakcinacijom pokazala samo ograničena poboljšanja u kliničkim ishodima.

Melanom

Standardna terapija melanoma je kompletna hirurška resekcija sa okolnim zdravim tkivom. Terapijske opcije obuhvataju monohemioterapiju, polihemioterapiju i ciljane terapije sa specifičnim inhibitorima (S3-Leitlinie Melanom, 2013).

Nekoliko različitih pristupa vakcinacije je već procenjivano kod pacijenata sa uznapredovalim melanomom. Do sada su ispitivanja faze III otkrila prilično razočaravajuće rezultate a strategije vakcinacije očigledno moraju da se poboljšaju. Stoga, nova klinička ispitivanja, poput ispitivanja OncoVEX GM-CSF ili ispitivanja DERMA, imaju za cilj poboljšanje kliničke efikasnosti bez smanjivanja podnošljivosti (http://www.cancerresearchuk.org).

Adoptivni transfer T ćelija deluje veoma obećavajuće za lečenje melanoma u uznapredovalom stadijumu. In vitro ekspandirani autologni tumor-infiltrišući limfociti kao i T ćelije koje nose visoko afinitetni T-ćelijski receptor za karcinom-testis antigen NY-ESO-1 su imali značajne korisne i niske toksične efekte nakon transfera u pacijente sa melanomom. Nažalost, T ćelije sa visoko afinitetnim T-ćelijskim receptorom za antigene specifične za melanocite MART1 i gp100 i karcinom-testis antigen MAGEA3 su izazvale značajne toksične efekte u kliničkim ispitivanjima. Stoga, adoptivni transfer T ćelija ima visok terapijski potencijal, ali mora da se dodatno poveća bezbednost i podnošljivost ovih terapija (Phan and Rosenberg, 2013; Hinrichs and Restifo, 2013).

Nesitnoćelijski karcinom pluća

Opcije lečenja određene su tipom (sitnoćelijski ili nesitnoćelijski) i stadijumom karcinoma, a obuhvataju operaciju, zračnu terapiju, hemioterapiju i ciljane biološke terapije kao što su bevacizumab, erlotinib i gefitinib (S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011).

Kako bi se proširile terapijske opcije za NSCLC, ispitivani su različiti imunoterapijski pristupi, ili se i dalje ispituju. Iako vakcinacija sa L-BLP25 ili MAGEA3 nije uspela da pokaže prednost u preživljavanju posredovanu vakcinom kod pacijenata sa NSCLC, vakcina dobijena od alogene ćelijske linije pokazala je obećavajuće rezultate u kliničkim studijama. Pored toga, trenutno su u toku dodatna ispitivanja vakcinacije kojom se ciljaju gangliozidi, receptor epidermalnog faktora rasta i nekoliko drugih antigena. Alternativna strategija za pojačavanje pacijentovog antitumorskog T-ćelijskog odgovora sastoji se od blokiranja inhibitornih receptora T ćelije ili njihovih liganada pomoću specifičnih antitela. Terapijski potencijal nekoliko od ovih antitela, uključujući ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A i MEDI-4736, kod NSCLC se trenutno procenjuje u kliničkim ispitivanjima (Reinmuth et al., 2015).

Rak jajnika

Hirurška resekcija je primarna terapija u ranom kao i u uznapredovalom stadijumu karcinoma jajnika (S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

Čini se da je imunoterapija obećavajuća strategija da se poboljša lečenje pacijenata sa rakom jajnika, budući da prisustvo proinflamatornih tumor-infiltrišućih limfocita, posebno CD8-pozitivnih T ćelija, korelira sa dobrom prognozom a T ćelije specifične za tumor-asocirane antigene mogu biti izolovane iz tkiva raka.

Stoga, ulaže se dosta naučnog truda u istraživanje različitih imunoterapija kod raka jajnika. Značajan broj pretkliničkih i kliničkih studija je već sproveden i trenutno su u toku dalje studije. Klinički podaci su dostupni za citokinsku terapiju, vakcinaciju, tretman monoklonskim antitelima, adoptivni ćelijski transfer i imunomodulaciju.

Studije vakcinacije faze I i II, koristeći pojedinačne ili multiple peptide, izvedene iz nekoliko tumor-asociranih proteina (Her2/neu, NY-ESO-1, p53, Vilmsov tumor-1) ili celokupne tumorske antigene, izvedene iz autolognih tumorskih ćelija pokazale su dobre profile bezbednosti i podnošljivosti, ali samo niske do umerene kliničke efekte.

Adoptivni transfer imunskih ćelija postigao je heterogene rezultate u kliničkim ispitivanjima. U pilot ispitivanju je pokazano da je adoptivni transfer autolognih, in vitro ekspandiranih tumor infiltrišućih T ćelija obećavajući pristup. Nasuprot tome, transfer T ćelija koje nose himerni antigenski receptor specifičan za folatni receptor alfa nije izazvao značajan klinički odgovor u ispitivanju faze I. Pokazano je da dendritične ćelije pulsirane sa lizatom tumorskih ćelija ili tumor-asociranim proteinima in vitro povećavaju antitumorski T ćelijski odgovor nakon transfera, ali opseg aktivacije T ćelija nije korelirao sa kliničkim efektima. Transfer ćelija prirodnih ubica izazvao je značajne toksičnosti u studiji faze II.

Unutrašnja antitumorska imunost kao i imunoterapija su ograničene imunosupresivnom tumorskom mikrosredinom. Da se prevaziđe ova prepreka, imunomodulatorni lekovi, kao ciklofosfamid, anti-CD25 antitela i pegilovani lipozomalni doksorubicin su testirani u kombinaciji sa imunoterapijom. Najpouzdaniji podaci su trenutno dostupni za ipilimumab, anti-CTLA4 antitelo, koje povećava aktivnost T ćelija. Pokazano je da ipilimumab izaziva značajne antitumorske efekte kod pacijenata sa rakom jajnika (Mantia-Smaldone et al., 2012).

Rak pankreasa

Terapijske opcije za pacijente sa rakom pankreasa su veoma ograničene. Jedan veliki problem za efikasno lečenje je tipično uznapredovali stadijum tumora u vreme postavljanja dijagnoze.

Strategije vakcinacije se ispituju kao dalja inovativna i obećavajuća alternativa za lečenje raka pankreasa. Vakcine zasnovane na peptidima koje ciljaju mutacije KRAS, reaktivnu telomerazu, gastrin, survivin, CEA i MUC1 su već procenjivane u kliničkim ispitivanjima, delimično sa obećavajućim rezultatima. Pored toga, klinička ispitivanja za vakcine zasnovane na dendritičnim ćelijama, vakcine alogenim ćelijama koje sekretuju GM-CSF i algenpantucel-L kod pacijenata sa rakom pankreasa su takođe otkrila povoljne efekte imunoterapije. Dodatna klinička ispitivanja koja dalje ispituju efikasnost različitih protokola vakcinacije su trenutno u toku (Salman et al., 2013).

Rak prostate

Terapijska strategija za rak prostate uglavnom zavisi od stadijuma raka. Za lokalno ograničen rak prostate bez metastaza, terapijske opcije uključuju aktivni nadzor (čekanje i posmatranje), kompletnu hiruršku resekciju prostate i lokalnu visokodoznu zračnu terapiju sa ili bez brahiterapije (S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 2014).

Vakcina bazirana na dendritičnim ćelijama sipuleucel-T bila je prva antitumorska vakcina koju je odobrila američka Uprava za hranu i lekove (FDA). Zbog njenog pozitivnog efekta na preživljavanje kod pacijenata sa CRPC, uložen je veliki napor u razvoj daljih imunoterapija. U pogledu vakcinalnih strategija, peptidna vakcina prostata-specifični antigen (PSA)-TRICOM, personalizovana peptidna vakcina PPV, DNK vakcina pTVG-HP i celoćelijska vakcina koja eksprimira GM-CSF GVAX pokazale su obećavajuće rezultate u različitim kliničkim ispitivanjima. Pored toga, pokazano je da su vakcine bazirane na dendritičnim ćelijama koje nisu sipuleucel-T, naime BPX-101 i DCVAC/Pa izazvale kliničke odgovore kod pacijenata obolelih od raka prostate. Inhibitori imunske kontrolne tačke kao što su ipilimumab i nivolumab se trenutno procenjuju u kliničkim studijama kao monoterapija kao i u kombinaciji sa drugim terapijama, uključujući terapiju deprivacije androgena, lokalnu zračnu terapiju, PSA-TRICOM i GVAX. Imunomodulatorna supstanca taskvinimod, koja je značajno usporila progresiju i povećala preživljavanje bez progresije bolesti u ispitivanju faze II, trenutno se dalje ispituje u ispitivanju faze III. Lenalidomid, drugi imunomodulator, imao je obećavajuće efekte u kliničkim studijama rane faze, ali nije uspeo da poboljša preživljavanje u ispitivanju faze III. Uprkos ovim razočaravajućim rezultatima, ispitivanja lenalidomida i dalje su u toku (Quinn et al., 2015).

Karcinom bubrežnih ćelija

Inicijalno lečenje je najčešće bilo delimično ili potpuno uklanjanje zahvaćenog(ih) bubrega i ostaje glavni oslonac kurativnog lečenja (Rini et al., 2008). Za terapiju prve linije pacijenata sa lošim prognostičkim skorom, smernice razrađene od strane nekoliko organizacija i društava za rak preporučuju inhibitore receptorskih tirozin kinaza (TKI) sunitinib i pazopanib, monoklonalno antitelo bevacizumab u kombinaciji sa interferonom-α (IFN-α) i inhibitor mTOR temsirolimus. Na osnovu smernica razrađenih od strane američke Nacionalne sveobuhvatne mreže za rak (National Comprehensive Cancer Network, NCCN) kao i evropskih EAU (Evropsko udruženje urologa) i ESMO (Evropsko društvo za medicinsku onkologiju), TKI-jevi sorafenib, pazopanib ili od nedavno aksitinib su preporučeni kao terapija druge linije kod pacijenata sa RCC kod kojih prethodna terapija sa citokinima (IFN-a, IL-2) nije imala uspeha. Smernice NCCN u ovim okolnostima preporučuju takođe i sunitinib (dokazi visokog stepena prema NCCN kategoriji I).

Poznata imunogenost RCC predstavlja osnovu koja podržava upotrebu imunoterapije i antitumorskih vakcina kod uznapredovalog RCC. Interesantna korelacija između ekspresije PD-1 limfocita i uznapredovalog stadijuma, stepena i prognoze RCC, kao i selektivne ekspresije PD-L1 od strane tumorskih ćelija RCC i njena potencijalna povezanost sa lošijim kliničkim ishodima, doveli su razvoja novih anti PD-1/PD-L1 agenasa, samostalno ili u kombinaciji sa antiangiogenim lekovima i drugim imunoterapijskim pristupima za lečenje RCC (Massari et al., 2015). Kod uznapredovalog RCC, ispitivanje antitumorske vakcine iz faze III koje se zove studija TRIST procenjuje da li TroVax (vakcina koja koristi tumor-asocirani antigen, 5T4, sa poks virusnim vektorom), dodata standardnoj terapiji prve linije, produžava preživljavanje pacijenata sa lokalno uznapredovalim ili metastatskim RCC. Srednje preživljavanje nije bilo postignuto u obe grupe sa 399 pacijenata (54%) koji su ostali u studiji, međutim, analiza podataka potvrđuje ranije kliničke rezultate koji pokazuju da je TroVax i imunološki aktivna i da postoji korelacija između jačine 5T4-specifičnog odgovora antitelima i poboljšanog preživljavanja. Pored toga, postoji nekoliko studija koje traže peptidne vakcine primenom epitopa koji su prekomerno eksprimirani u RCC.

Istraživani su razni pristupi antitumorskih vakcina. Studije primenom pristupa čitavog tumora, uključujući lizate tumorskih ćelija, fuzije dendritičnih ćelija sa tumorskim ćelijama, ili čitave RNK tumora su sprovedene kod pacijenata sa RCC, a u nekim od ovih ispitivanja prijavljene su remisije tumorskih lezija (Avigan et al., 2004; Holtl et al., 2002; Marten et al., 2002; Su et al., 2003; Wittig et al., 2001).

Sitnoćelijski karcinom pluća

Lečenje i prognoza SCLC jako zavise od dijagnostikovanog stadijuma karcinoma. Određivanje stadijuma SCLC na osnovu kliničkih rezultata je češće od patohistološkog određivanja stadijuma. Kliničko određivanje stadijuma koristi rezultate fizikalnog pregleda, raznih imidžing testova i biopsija. Standardna hemioterapija za SCLC koristi kombinaciju ili etopozida ili irinotekana sa ili cisplatinom ili karboplatinom (Američko udruženje za rak, 2015; S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011).

Imunoterapija predstavlja opsežno ispitivano polje terapije karcinoma. Ispitivani su razni pristupi u lečenju SCLC. Jedan od pristupa cilja blokiranje CTLA-4, prirodnog humanog imunskog supresora. Namera inhibicije CTLA-4 jeste da se pojača imunski sistem kako bi se borio sa rakom. Nedavno je započet razvoj obećavajućih inhibitora imunske kontrolne tačke za lečenje SCLC. Drugi pristup je zasnovan na antitumorskim vakcinama koje su trenutno dostupne za lečenje SCLC u kliničkim studijama (Američko udruženje za rak, 2015; Nacionalni institut za rak, 2015).

Akutna mijeloidna leukemija

Lečenje AML je podeljeno u dve faze: indukciona terapija i postremisiona/ „konsolidaciona terapija“. Indukciona terapija se daje kako bi se indukovala remisija i sastoji se od kombinovane hemioterapije. Konsolidaciona terapija se sastoji od dodatne hemioterapije ili transplantacije hematopoetskih ćelija (HCT) (Showel and Levis, 2014).

Klinička ispitivanja se preporučuju pacijentima koji pripadaju prognostičkim grupama nepovoljna i umerena-2. Opcije lečenja uključuju hipometilirajuće agense (HMA) kao što je azacitidin ili decitabin, CPX-351, koji je lipozomalna formulacija daunorubicina i citarabina u 1:5 „optimalnom“ molarnom odnosu, i volasertib koji je inhibitor polo kinaza. Volasertib se daje u kombinaciji sa LDAC (niskodoznim citarabinom). U slučaju mutacija FLT3 može se dati nekoliko različitih inhibitora FLT3. Oni uključuju sorafenib, koji se daje u kombinaciji sa 3+7, kvizartinibom, selektivnijim inhibitorom FLT3 ITD koji takođe inhibira CKIT, krenolanib i midostaurin, neselektivni inhibitor FLT3 ITD. Druga opcija lečenja je ciljanje CD33 sa konjugatima antitelo-lek (anti-CD33 kalehiamicin, SGN-CD33a, anti-CD33 aktinijum-225), bispecifičnim antitelima (prepoznavanje CD33 CD3 (AMG 330) ili CD33 CD16) i himernim antigenskim receptorima (CAR-ovi) (Estey, 2014).

Non-Hodžkinov limfom

NHL ima preko 60 podtipova. Tri najčešća podtipa su difuzni B-krupnoćelijski limfom (DLBCL, najčešći podtip), folikularni limfom (FL, drugi najčešći podtip) i sitnoćelijski limfocitni limfom/hronični limfocitni limfom (SLL/CLL, treći najčešći podtip). DLBCL, FL i SLL/CLL čine oko 85% svih NHL (Li et al., 2015). Lečenje NHL zavisi od histološkog tipa i stadijuma (Nacionalni institut za rak, 2015).

Kod pacijenata obolelih od limfoma može se zapaziti spontana regresija tumora. Zato je aktivna imunoterapija terapijska opcija (Palomba, 2012).

Važna vakcinalna opcija uključuje Id vakcine. B limfociti eksprimiraju površinske imunoglobuline sa specifičnom aminokiselinskom sekvencom u varijabilnim regionima svojih teških i lakih lanaca, jedinstvenom za svaki ćelijski klon (= idiotip, Id). Idiotip funkcioniše kao tumor-asocirani antigen.

Aktivna imunizacija uključuje ubrizgavanje rekombinantnog proteina (Id) konjugovanog sa adjuvansom (KLH), koji se daje zajedno sa GM-CSF kao imunskim adjuvansom. Tumor-specifični Id se proizvodi pomoću kultura hibridoma ili primenom tehnologije rekombinantne DNK (plazmidi) pomoću kulture bakterijskih, insektskih ili sisarskih ćelija.

Rak materice

Više od 80% malignih tumora endometrijuma javlja se u obliku endometrioidnih adenokarcinoma (tip I), oblika koji se povezan sa izlaganjem estrogenu i koji je dobro do umereno diferenciran. Lečenje karcinoma endometrijuma i raka grlića materice zavisi od stadijuma (World Cancer Report, 2014).

Takođe postoje određeni imunoterapijski pristupi koji se trenutno testiraju. U kliničkom ispitivanju faze I/II pacijentkinje koje boluju od raka materice su bile vakcinisane autolognim dendritičnim ćelijama (DĆ) elektroporisanim sa iRNK gena 1 Vilmsovog tumora (WT1). Pored jednog slučaja lokalne alergijske reakcije na adjuvans, nisu zabeležena nepovoljna neželjena dejstva a 3 od 6 pacijentkinja pokazalo je imunološki odgovor (Coosemans et al., 2013).

Adenokarcinom žučne kese i holangiokarcinom

Holangiokarcinom (CCC) se teško leči i obično je smrtonosan. Jedina opcija kurativnog lečenja je kompletna resekcija (R0). Efikasnost bioloških terapija kod malignih tumora bilijarnog trakta je mešovita. Lekovi koji ciljaju rast krvnih sudova kao što su sorafenib, bevacizumab, pazopanib i regorafenib se sada ispituju za lečenje CCC. Pored toga, lekovi koji ciljaju EGFR kao što su cetuksimab i panitumumab se koriste u kliničkim studijama u kombinaciji sa hemioterapijom (Američko udruženje za rak, 2015). Za većinu lekova koji su testirani do sada, kontrola bolesti i ukupno preživljavanje nisu bili značajno poboljšani, ali u toku su dalja klinička ispitivanja.

Rak žučne kese (GBC) je najčešći i agresivan malignitet bilijarnog trakta širom sveta. Zbog toga što se karcinomi bilijarnog trakta uopšteno retko javljaju postoji samo nekoliko studija specifičnih za GBC ili CCC, dok većina njih obuhvata sve maligne tumore bilijarnog trakta. Ovo je razlog zašto se lečenje nije poboljšalo tokom poslednjih decenija te je R0 resekcija i dalje jedina opcija kurativnog lečenja.

Rak mokraćne bešike

Standardna terapija za rak mokraćne bešike uključuje operaciju, zračnu terapiju, hemioterapiju i imunoterapiju (Nacionalni institut za rak, 2015).

Efikasan imunoterapijski pristup je ustanovljen za lečenje agresivnog mišićnoneinvazivnog karcinoma mokraćne bešike (NMIBC). Pritom se u vidu intravezikalnog rastvora daje oslabljeni oblik bakterije Mycobacterium bovis (bacillus Calmette-Guérin = BCG). Glavni efekat BCG terapije je značajna dugotrajna (do 10 godina) zaštita od ponovnog javljanja raka i smanjena stopa progresije. U principu, lečenje sa BCG indukuje lokalni zapaljenski odgovor koji stimuliše ćelijski imunski odgovor. Imunski odgovor na BCG je zasnovan na sledećim ključnim koracima: inficiranje tumorskih ćelija urotela i mokraćne bešike BCG-om, nakon čega sledi povećana ekspresija antigen-prezentujućih molekula, indukcija imunskog odgovora posredovana putem oslobađanja citokina, indukcija antitumorske aktivnosti putem uključivanja raznih imunskih ćelija (naime citotoksičnih T limfocita, neutrofila, ćelija prirodnih ubica i makrofaga) (Fuge et al., 2015; Gandhi et al., 2013).

Imajući u vidu teška neželjena dejstva i troškove povezane sa lečenjem raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji se mogu koristiti u lečenju raka uopšteno i konkretno hepatocelularnog karcinoma (HCC), kolorektalnog karcinoma (CRC), glioblastoma (GB), raka želuca (GC), raka jednjaka, nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), raka pankreasa (PC), karcinoma bubrežnih ćelija (RCC), benigne hiperplazije prostate (BPH), raka prostate (PCA), raka jajnika (OC), melanoma, raka dojke, hronične limfocitne leukemije (CLL), karcinoma Merkelovih ćelija (MCC), sitnoćelijskog karcinoma pluća (SCLC), non-Hodžkinovog limfoma (NHL), akutne mijeloidne leukemije (AML), raka žučne kese i holangiokarcinoma (GBC, CCC), raka mokraćne bešike (UBC), raka materice (UEC). Takođe postoji potreba da se identifikuju faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za gore navedene vrste raka, koji bi doveli do boljeg dijagnostikovanja raka, bolje procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumorasociranih antigena. Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her- 2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični. f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumorasociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.

MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.

Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).

Elongirani peptidi iz ove objave mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.

T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferonagama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

Budući da obe vrste odgovora, CD8- i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji se vezuju za MHC klasa I su obično dužine 8–12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne, ili u uporedivo malim količinama, od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumorspecifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju objave je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR-ovi) i antitela ili drugih vezujućih molekula (skele) u skladu sa objavom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.

Patent W02015/018805A1 iznosi peptid dobijen od gena MXRA5 koji se vezuje za HLA- A*02, ali ne iznosi peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 25 koji ima ukupnu dužinu od 11 do 16 aminokiselina.

Rad Bassani-Sternberg i sar. (2015) iznosi masenu spektrometriju visokog protoka za identifikaciju peptida koji prezentuju HLA povezanih sa rakom, ali ne iznosi peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 25 koji ima ukupnu dužinu od 11 do 16 aminokiselina.

Patent WO02/086443A2 iznosi gen MXRA5 povezan sa rakom, ali ne iznosi peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 25 koji ima ukupnu dužinu od 11 do 16 aminokiselina.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 25 kako je definisan u priloženom patentnom zahtevu 1. Dalji aspekti pronalaska definisani su u priloženim patentnim zahtevima.

U prvom aspektu predstavljen je peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihovu varijantnu sekvencu koja je najmanje 77%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288, naznačeno time što se navedena varijanta vezuje za MHC i/ili indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.

Iako je najvažniji kriterijum da bi peptid funkcionisao kao cilj terapije za rak njegova prekomerna prezentacija na primarnim tumorskim tkivima u poređenju sa normalnim tkivima, profil ekspresije RNK odgovarajućeg gena može takođe da pomogne da se izaberu odgovarajući peptidi. Konkretno, neke peptide je teško detektovati masenom spektrometrijom, bilo zbog njihovih hemijskih svojstava ili zbog njihovog malog broja kopija na ćelijama, te skrining pristup koji se fokusira na detekciju prezentacije peptida može biti neuspešan za identifikaciju ovih ciljeva. Međutim, ovi ciljevi mogu da se detektuju alternativnim pristupom koji započinje sa analizom ekspresije gena u normalnim tkivima a nakon toga procenjivanjem prezentacije peptida i ekspresija gena u tumorima. Ovaj pristup je realizovan u ovoj objavi primenom podataka o iRNK iz javno dostupne baze podataka (Lonsdale, 2013) u kombinaciji sa daljim podacima o ekspresiji gena (uključujući uzorke tumora), kao i podataka o prezentaciji peptida. Ako je iRNK gena skoro odsutna u normalnim tkivima, posebno u vitalnim sistemima organa, verovatnije je da će ciljanje odgovarajućih peptida pomoću čak i veoma potentnih strategija (kao što su bispecifična afinitetno-optimizovana antitela ili T-ćelijski receptori), biti bezbedno. Takvi peptidi, čak i ako su identifikovani samo na malom procentu tumorskih tkiva, predstavljaju interesantne ciljeve. Rutinska analiza masenom spektrometrijom nije dovoljno senzitivna da proceni ciljnu pokrivenost na peptidnom nivou. Tim pre se ekspresija tumorske iRNK može koristiti za procenu pokrivenosti. Za detekciju samog peptida može biti neophodan pristup ciljane masene spektrometrije sa većom senzitivnošću umesto rutinskog skrininga, i on može dovesti do bolje procene pokrivenosti na nivou prezentacije peptida.

Takođe je predstavljen peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihova varijanta, koja je najmanje 77%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288, naznačeno time što navedeni peptid ili njegova varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

U sledećim tabelama prikazan je peptid u skladu sa predmetnom objavom, njegov odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) gen za ovaj peptid. Peptid u tabeli 1 vezuje se za HLA-A*02.

Tabela 1: peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom

Naročito su poželjni peptidi – samostalni ili u kombinaciji – u skladu sa predmetnom objavom izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 i njihove upotrebe u imunoterapiji hepatocelularnog karcinoma (HCC), kolorektalnog karcinoma (CRC), glioblastoma (GB), raka želuca (GC), raka jednjaka, nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), raka pankreasa (PC), karcinoma bubrežnih ćelija (RCC), benigne hiperplazije prostate (BPH), raka prostate (PCA), raka jajnika (OC), melanoma, raka dojke, hronične limfocitne leukemije (CLL), karcinoma Merkelovih ćelija (MCC), sitnoćelijskog karcinoma pluća (SCLC), non-Hodžkinovog limfoma (NHL), akutne mijeloidne leukemije (AML), raka žučne kese i holangiokarcinoma (GBC, CCC), raka mokraćne bešike (UBC), raka materice (UEC).

Najpoželjniji je peptid sa ID BR. SEKV: 25 (vidite tabele 1), i njegove upotrebe u imunoterapiji HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL.

Predmetna objava se zatim odnosi na ovde predstavljene peptide koji imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili – u produženom obliku, kao što je varijanta dužine – MHC klase II.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što se navedeni peptidi (svaki) sastoje ili esencijalno sastoje od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na (ili u sekvencu) antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetna objava se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ovde predstavljene peptide. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetna objava se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira i/ili eksprimira ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

Predmetna objava se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv ovde predstavljenih peptida ili kompleksa navedenih ovde predstavljenih peptida sa MHC i metode za pravljenje istih.

Predmetna objava se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR-ove ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.

Antitela i TCR-ovi su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa prikazanom objavom.

Predmetna objava se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili prethodno opisani vektor ekspresije. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod proizvodnje ovde predstavljenog peptida, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ovde predstavljene ćelije domaćina i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetna objava se dalje odnosi na navedeni ovde predstavljeni metod, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni metod, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ili eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV: 288, poželjno sadrži ID BR. SEKV 1 do ID BR SEKV: 126, ili varijantu aminokiselinske sekvence.

Predmetna objava se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću ovde predstavljenog metoda, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih prema ovoj objavi.

Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, ovde predstavljene nukleinske kiseline, ovde predstavljenog vektora ekspresije, ovde predstavljene ćelije, ovde predstavljenih aktiviranog T limfocita, T-ćelijskog receptora ili antitela ili drugog peptida – i/ili molekula koji vezuju peptid-MHC, u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, navedeni lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je prikladan i koristi se za ćelijsku terapiju, vakcinu ili zasnovan na proteinu na solubilnom TCR-u ili antitelu.

Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu kako je predstavljena ovde, naznačeno time što su navedene ćelije raka ćelije HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL.

Predmetna objava se dalje odnosi na biomarkere zasnovane na ovde predstavljenim peptidima, u ovom dokumentu nazvanim „ciljevima“ koji se mogu koristiti za postavljanje dijagnoze raka, poželjno HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL. Marker može da bude ili prekomerna prezentacija samog(ih) peptida odnosno prekomerna ekspresija odgovarajućeg(ih) gena. Markeri se takođe mogu koristiti za predviđanje verovatnoće uspeha terapije, poželjno imunoterapije, te najpoželjnije imunoterapije čiji je cilj isti kao onaj koji se identifikuje biomarkerom. Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC.

Opciono, antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Predmetna objava se takođe odnosi na upotrebu navedenih novih ciljeva u kontekstu lečenja raka.

MXRA5 kodira jedan od proteina povezanih sa remodeliranjem matrice, koji sadrži ponovke bogate 7 leucinom i 12 domena sličnih imunoglobulinu C2 tipa povezanih sa perlekanom (RefSeq, 2002). Kineska studija identifikovala je MXRA5 kao drugi najčešći mutirani gen u nesitnoćelijskom karcinomu pluća (Xiong et al., 2012). Kod raka kolona, pokazano je da je MXRA5 prekomerno eksprimiran i da može služiti kao biomarker za rano dijagnostikovanje i metastaze u omentumu (Zou et al., 2002; Wang et al., 2013a).

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, kao i dužine 10, 11, 12 ili 13 aminokiselina ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante peptida objave) oni mogu biti dužine od 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Napomenuto je da se soli peptida u skladu sa predmetnom objavom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za objavu, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za objavu, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetne objave), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetne objave, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetne objave, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8–14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 2: učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori et al., 1997) primenom Hardi-Vajnbergove formule F = 1 - (1-Gf)<2>. Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (Chanock et al., 2004).

Peptidi iz ove objave, poželjno kada su uključeni u vakcinu iz ove objave kako je ovde opisana, vezuju se za A*02. Vakcina može takođe da uključuje sve-vezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina iz ove objave može da se koristi za lečenje malignog tumora kod pacijenata koji su A*02 pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.

Ako se A*02 peptidi iz ove objave kombinuju sa peptidima koji se vezuju za drugi alel, na primer A*24, veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva alela samog može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina koja sadrži HLA-A*24 i HLA-A*02 epitope može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).

U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine iz ove objave sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnom objavom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnom objavom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetnu objavu mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni u ovom dokumentu, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnom objavom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa sekvencom shodno patentnom zahtevu ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili sekvencom shodno patentnom zahtevu („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli: procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)], gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što (i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i (iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Kao što je ranije pomenuto, predmetna objava tako obezbeđuje peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihovu varijantu koja je 88% homologna sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihovom varijantom koji će indukovati T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom. Peptidi iz ove objave imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I, a elongirane verzije navedenih peptida za klasu II.

U predmetnoj objavi, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence pronalazači podrazumevaju da bočni lanci, na primer, jednog ili dva aminokiselinska ostatka budu izmenjeni (na primer tako što će biti zamenjeni bočnim lancem drugog aminokiselinskog ostatka koji se prirodno pojavljuje ili nekim drugim bočnim lancem) tako da peptid i dalje bude sposoban da se vezuje za HLA molekul na značajno isti način kao i peptid koji sadrži datu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288. Na primer, peptid može biti modifikovan tako da najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost interakcije sa i vezivanja za udubljenje za vezivanje prikladnog MHC molekula, kao što su HLA-A*02 ili -DR, i na taj način najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija.

Ove T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima ove objave. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. Tako će osoba stručna u predmetnoj oblasti moći da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 288, zadržavanjem poznatih sidrenih ostataka, i biće u stanju da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost vezivanja za MHC molekule klase I ili II. Varijante predmetne objave zadržavaju sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija, koje naknadno mogu unakrsno reagovati sa i ubiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima ove objave.

Originalni (nemodifikovani) peptidi kako su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, te supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima iz ove objave a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, nestandardne aminokiseline (tj. koje nisu uobičajene proteinogene aminokiseline koje se javljaju u prirodi) mogu se takođe koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnom objavom.

Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

Peptid koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu može imati zamenjenu jednu ili dve nesidrene aminokiseline (vidite u nastavku u pogledu sidrenog motiva) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom. U drugom otelotvorenju, u peptidu koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu, jedna ili dve aminokiseline mogu biti zamenjene njihovim partnerima za konzervativnu zamenu (vidite u nastavku dokumenta) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom.

Aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugim aminokiselinama čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, peptid iz ove objave može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili njihovu varijantu kako je naznačeno.

Takođe, mogu biti prikladni i duži (elongirani) peptidi. Moguće je da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže sam epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.

Peptidi iz ove objave mogu biti produženi za najviše četiri aminokiseline, to jest mogu da se dodaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline na bilo koji kraj u bilo kojoj kombinaciji između 4:0 i 0:4. Kombinacije elongacija u skladu sa ovom objavom navedene su u tabeli 3.

Tabela 3: kombinacije elongacija peptida objave

Aminokiseline za elongaciju/produžavanje mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koja druga aminokiselina(e). Elongacija može da se koristi za poboljšavanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.

Tako, epitopi predmetne objave mogu biti identični prirodno javljajućim tumorasociranim ili tumor-specifičnim epitopima ili mogu obuhvatati epitope koji se razlikuju za ne više od četiri ostataka od referentnog peptida, dokle god imaju značajno identičnu antigenu aktivnost.

U alternativnom otelotvorenju, peptid je produžen na jednom ili oba kraja za više od 4 aminokiseline, poželjno do ukupne dužine od najviše 30 aminokiselina. Ovako mogu nastati peptidi koji se vezuju za MHC klase II. Vezivanje za MHC klase II može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Saglasno tome, predmetna objava obezbeđuje peptide i varijante epitopa MHC klase I, naznačene time što peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14, naime 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminokiselina, a u slučaju elongiranih peptida koji se vezuju za klasu II, dužina može da iznosi i 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili 22 aminokiseline.

Naravno, peptid ili varijanta u skladu sa predmetnom objavom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Poželjno, kada se T ćelije specifične za peptid u skladu sa predmetnom objavom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

U naročito preferiranom otelotvorenju predstavljene objave peptid se sastoji ili se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288.

„Esencijalno se sastoji od“ znači da peptid u skladu sa predmetnom objavom, pored sekvence u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 288 ili njene varijante, sadrži dodatne N- i/ili C-terminalno locirane produžetke od aminokiselina koji nužno ne obrazuju deo peptida koji funkcioniše kao epitop za epitop MHC molekula.

Ipak, ovi produžeci mogu biti važni za obezbeđivanje efikasnog uvođenja peptida u skladu sa predmetnom objavom u ćelije. U jednom otelotvorenju predmetne objave, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „li“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi predmetne objave mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije kako su opisane u ovom dokumentu.

Pored toga, peptid ili varijanta mogu biti dalje modifikovani da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje reverznih peptidnih veza ili nepeptidnih veza.

U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere i sar. (1997) (Meziere et al., 1997). Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i sar. (Meziere et al., 1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili tbutiloksikarbonilna grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Nadalje, peptidi iz ove objave mogu biti sintetisani tako da se izmeni njihova prostorna konfiguracija. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida iz ove objave može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje peptida iz ove objave.

Slično tome, peptid ili varijanta iz ove objave može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije dobro su poznati u predmetnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. izdanje, CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004). Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidinacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksilnih grupa i sulfhidrilne modifikacije pomoću oksidacije cisteina performinskom kiselinom do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u predmetnoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, urednici Coligan i sar. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskom modifikacijom proteina.

Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima često se bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi se obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.

Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom. Woodward-ov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline. Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala. Reakcija lizinskih ostataka i drugih α-amino grupa je, na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikozilaciji proteina. Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.

Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka. Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.

U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).

Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG je često udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.

Peptid ili varijanta, naznačeni time što je peptid modifikovan ili sadrži nepeptidne veze, poželjno su otelotvorenje objave. Uopšteno, peptidi i varijante (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas i sar. (Lukas et al., 1981) i referenci koje su tamo citirane. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonilna (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidrilna grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih prethodno formiranih simetričnih anhidridnih derivata, sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog kuplovanja posredstvom N, N-dicikloheksil-karbodiimida/1 hidroksibenzotriazola. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (vidite, na primer, (rad Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija prema veličini, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Za identifikaciju peptida predmetne objave, baza podataka javno dostupnih podataka o ekspresiji RNK (Lonsdale, 2013) od oko 3000 uzoraka normalnih tkiva pretražena je za gene sa skoro pa odsutnom ekspresijom u vitalnim sistemima organa, i niskom ekspresijom u drugim važnim sistemima organa. U drugom koraku, tumor-asocirani peptidi dobijeni od proteinskih proizvoda ovih gena identifikovani su masenom spektrometrijom primenom platforme XPRESIDENT™ kako je opisano u ovom dokumentu.

Detaljnije, da bi se izabrali geni od interesovanja primenom podataka RNKSekv iz navedene baze podataka, smatralo se da su vitalni sistemi organa: mozak, srce, krvni sudovi, pluća i jetra. Medijana očitavanja po kilobazi na milion očitavanja (RPKM) za vitalne organe morala je da bude manja od 2, a 75% percentil je morao da bude manji od 5 RPKM da bi se izabrao gen. U slučaju da su sistemi organa bili pokriveni sa više od jedne klase uzorka, npr. različite regije mozga koje su analizirane zasebno, za izračunavanje su korišćeni maksimalna medijana i maksimalni 75% percentil u više klasa uzoraka. Smatralo se da su drugi važni sistemi organa: koža, nerv, hipofiza, kolon, bubreg, masno tkivo, nadbubrežna žlezda, mokraćna bešika, puna krv, jednjak, mišić, pankreas, pljuvačna žlezda, tanko crevo, želudac, dojka, slezina, štitasta žlezda. Maksimalna medijana RPKM za ove organe morala je da bude manja od 10 za izbor gena. Ostali organi su se smatrali nevitalnim te stoga nije primenjena granična vrednost za ekspresiju gena. Ovi organi su bili grlić materice i materica, jajovod, vagina, prostata, testis i jajnik. Primenom ovog odabira izabrano je oko 14.000 kandidatskih gena. Nakon toga su analizirani profili prezentacije peptida dobijenih iz korespondentnih proteina. Peptidi su se smatrali interesantnim ako su bili prezentovani na manje od pet normalnih uzoraka u skupu od više od 170 analiziranih normalnih (tj. nemalignih) uzoraka, i ako je najviša prezentacija u normalnom tkivu bila manja od 30% od medijane tumorskog signala (u svim uzorcima tumora).

Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje medijanu prezentacije uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2015) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995).

Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprejjonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih TUMAP-ova zabeleženog iz uzoraka primarnog tumora sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog raka.

Brojevi uzoraka bili su (ukupno/uzorci koji su prošli kontrolu kvaliteta (QC)): za PC N=39 (36), za RCC N= 22 (18), za CRC N=31 (28), za karcinom jednjaka N= 14 (11), za BPH i rak prostate N= 53 (43), za HCC N=15 (15), za NSCLC N=96 (87), za GC N=35 (33), za GB N= 38 (27), za rak dojke N= 2 (2), za melanom N=5 (2), za rak jajnika N= 21 (20), za CLL N= 5 (4), za SCLC N= 18 (17), NHL N= 18 (18), AML N= 23 (18), GBC, CCC N= 18 (17), za UBC N= 17 (15), za UEC N= 19 (16). Uzorci su prošli QC ako je dobijeno 5 replikata masenom spektrometrijom ili ako je uzorak kompletno potrošen, i ako su peptidi koji su korišćeni za izračunavanje faktora normalizacije (tj. koji se javljaju u tehničkim replikatima istog uzorka sa varijansom manjom od 50% i koji se javljaju u najmanje 2 nezavisna uzorka) najmanje 30% svih peptida izmerenih u uzorku. Uzorci za koje je određivanje podtipa rezultovalo retkim podtipom (kao što su A*02:05, A*02:06) su bili isključeni za izbor peptida iz ove objave.

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka primarnih HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL su prečišćeni, a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP-ovi sadržani u predmetnoj prijavi su ovim pristupom identifikovani na uzorcima HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC, i/ili CLL, čime je potvrđena njihova prezentacija na ovim vrstama tumora.

TUMAP-ovi identifikovani na multiplim tumorskim i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.

Pored toga, linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.x omogućava direktnu apsolutnu kvantifikaciju nivoa MHC-, poželjno HLA-restrikovanog, peptida na tumorskim ili drugim inficiranim tkivima. Ukratko, ukupan broj ćelija je izračunat iz ukupnog sadržaja DNK analiziranog uzorka tkiva. Ukupna količina peptida za TUMAP u uzorku tkiva izmerena je pomoću nanoLC-MS/MS kao odnos prirodnih TUMAP i poznate količine verzije TUMAP obeležene izotopom, takozvanog unutrašnjeg standarda. Efikasnost izolacije TUMAP utvrđena je pomoću dodavanja kompleksa peptid:MHC svih izabranih TUMAP-ova u lizat tkiva u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP i njihove detekcije pomoću nanoLC-MS/MS nakon završetka procedure izolacije peptida. Ukupan broj ćelija i ukupna količina peptida izračunati su iz merenja u triplikatu po uzorku tkiva. Efikasnosti izolacije specifičnog peptida izračunate su kao prosek iz 10 eksperimenata sa dodavanjem a svaki je meren u triplikatu (vidite primer 6 i tabelu 11).

Ova kombinovana analiza ekspresije RNK i podataka masene spektrometrije dovela je do 288 peptida predmetne objave. U mnogim slučajevima peptid je identifikovan samo u malom broju tumora. Ipak, zbog ograničene senzitivnosti analize rutinskom masenom spektrometrijom, RNK podaci daju mnogo bolju osnovu za procenu pokrivenosti (vidite primer 2).

Predmetna objava obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju maligniteta/tumora, poželjno HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL koji prekomerno ili isključivo prezentuju peptide objave. Masenom spektrometrijom je pokazano da ove peptide prirodno prezentuju HLA molekuli na uzorcima primarnih humanih HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC, CLL, i/ili uzorcima PC.

Dokazano je da su mnogi izvorni geni/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi, visoko prekomerno eksprimirani u malignim u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ove objave označavaju ili zdrava tkiva korespondentnog tipa tumora (jetre, kolona/rektuma, mozga, želuca, jednjaka, pluća, pankreasa, bubrega, prostate, jajnika, kože, dojke i leukociti) ili normalne ćelije drugih tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (vidite primer 2). Pored toga, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ove objave označava uzorak od pacijenta koji boluje od HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL, ali ne i na normalnim tkivima (vidite primer 1).

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, PC, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL koje prezentuju dobijene peptide.

Za peptide predmetne objave je dokazano da su sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore iIili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela iIili TCR-ova, kao što su solubilni TCR-ovi, u skladu sa predmetnom objavom (vidite primer 3 i primer 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnom objavom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako su peptidi predmetne objave korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetne objave nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Takođe su obezbeđeni peptidi koji su sposobni da se vezuju za TCR-ove i antitela kada ih prezentuje MHC molekul. Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I ili II tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I ili II.

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetne objave obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR-ovima predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR-a mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR-a i/ili beta lancu TCR-a ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruko veći od afiniteta vezivanja/poluživota vezivanja TCR-a koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR-a i/ili nemutirani beta lanac TCR-a. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR-ova, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za peptide u skladu sa ovom objavom može da se pojača pomoću metoda koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/peptid, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRα β genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa peptidom od interesa, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR alfa i/ili TCR beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigenska specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih mononuklearnih ćelija periferne krvi, PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR alfa i/ili TCR beta lanaca.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTR-ovi), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), β-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.

Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetne objave mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR alfa i TCR beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR alfa i TCR beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR alfa i TCR beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR alfa i TCR beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR alfa i TCR beta lanaca. (Schmitt et al.2009).

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni“ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR alfa i TCR beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR alfa i TCR beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR alfa i TCR beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR alfa i u TCR beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR alfa i TCR beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR alfa i TCR beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (vidite ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa.

Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu -NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, ptoluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Poželjno, lek predmetne objave je imunoterapeutik, kao što je vakcina. On se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (vidite u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (eng. keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (vidite WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnoj objavi se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnoj objavi.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 288 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Dalji aspekt objave obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid ili varijantu peptida iz ove objave. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt objave obezbeđuje vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira polipeptid u skladu sa ovom objavom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid objave koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK i sar. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirusni vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu iz ove objave. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu iz ove objave može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida iz ove objave. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901,4,582,800, 4,677,063, 4,678,751,4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje iz ove objave može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK iz ove objave se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Predmetna objava se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetne objave. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetne objave postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen i sar. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012). Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman i sar. (Sherman et al., 1986). Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetne objave, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini iz ove objave korisne za pripremanje peptida iz ove objave, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida iz ove objave tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa objavom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog raka prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Dalji aspekt objave obezbeđuje metod za proizvodnju peptida ili njegove varijante, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije objave koriste se u medicini. Na primer, peptid ili njegova varijanta mogu biti pripremljeni za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel i sar. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa objavom, adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa objavom, adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa objavom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, razblaživača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenoj smeši može, na primer, biti preuzeta iz A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa objavom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja.

Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristiti „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptidi predmetne objave mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt objave je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inženjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Dalji je aspekt objave da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetne objave takođe smatra „specifičnim“.

Predmetna objava odnosi se na peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihovu varijantu koja je najmanje 88% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihovom varijantom koja indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.

Predmetna objava se dalje odnosi na peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili njihovu varijantu koja je najmanje 88% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288, naznačeno time što navedeni peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

Predmetna objava dalje se odnosi na peptide predstavljene u ovom dokumentu koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I ili II humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što se peptid sastoji ili esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je peptid (hemijski) modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačene time što je peptid deo fuzionog proteina, konkretno koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (li), ili naznačene time što je peptid fuziran na (ili u) antitelo, kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetna objava se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ovde predstavljene peptide pod uslovom da peptid nije kompletan (potpun) humani protein.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetna objava se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije za upotrebu u medicini, konkretno za lečenje HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL.

Predmetna objava se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod proizvodnje ovde predstavljenog peptida, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ovde predstavljene ćelije domaćina i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni metod, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni metod, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288 ili navedenu varijantu aminokiselinske sekvence.

Predmetna objava se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću ovde predstavljenog metoda, naznačeno time što navedene T ćelije selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu.

Predmetna objava se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja ovde predstavljenih T ćelija.

Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, ovde predstavljene nukleinske kiseline, ovde predstavljenog vektora ekspresije, ovde predstavljene ćelije, ili ovde predstavljenog aktiviranog citotoksičnog T limfocita, u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.

Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.

Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu kako je predstavljena ovde, naznačeno time što su navedene ćelije raka ćelije HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL.

Predmetna objava se dalje odnosi na naročite markerske proteine i biomarkere zasnovane na ovde predstavljenim peptidima, u ovom dokumentu nazvanim „ciljevima“ koji se mogu koristiti za postavljanje dijagnoze i/ili određivanje prognoze HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL. Predmetna objava se takođe odnosi na upotrebu ovih novih ciljeva za lečenje raka.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog (poli)peptida za HCC, CRC, GB, GC, rak jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, rak dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL, isporučivanje toksina ćeliji HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL koja eksprimira markerski gen za rak u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida za HCC, CRC, GB, GC, rak jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, rak dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL) prema ovoj objavi.

Kad god je to moguće, antitela objave mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela objave mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela objave mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za HCC, CRC, GB, GC, rak jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, rak dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela objave može biti delimično ili potpuno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira ovde predstavljeni peptid, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288, polipeptid, ili njegova varijanta ili fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za HCC, CRC, GB, GC, rak jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, rak dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL koji se koristi za stvaranje ovde predstavljenih antitela.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd.; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela vidite, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).

Monoklonalna antitela objave mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela objave može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disulfidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela objave mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela objave se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.

Dalji je aspekt objave da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja regione koji određuju komplementarnost. U svrhu odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191) i domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR-ova opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetne objave mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.

Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti vezuju se za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Drugi aspekt predmetne objave uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen ovde predstavljeni peptid. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren i sar. (Ljunggren and Karre, 1985).

Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji je sposoban da eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 288, ili varijantu njegove aminokiselinske sekvence.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Plebanski i sar. (Plebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnoj objavi, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice i ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga, mogu se koristiti biljni virusi (vidite, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa kravljeg graška kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida objave korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt objave obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima objave.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 288.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu objave, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnom objavom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetne objave mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, objava takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz ove objave, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran’’ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: radovima Gattioni i sar. i Morgan i sar. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Drugi aspekt predmetne objave obuhvata upotrebu peptida koji su u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.

Svaki molekul objave, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetne objave može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) objave ili poznatim molekulom(ima).

Predmetna objava dalje obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, posebno HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL i drugih maligniteta.

Predmetna objava je dalje usmerena na komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Kompleti predmetne objave se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetne objave u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži(e) uputstva na posudi ili uz nju koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Kompleti predmetne objave mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnom objavom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, kompleti objave obuhvataju formulaciju objave upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd.) koji omogućava primenu agenasa objave koji su komponente predmetnog kompleta.

Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.

Budući da su peptidi objave izolovani iz HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL, lek objave se poželjno koristi za lečenje HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL.

Pored toga što su korisni za lečenje malignih tumora, peptidi predmetne objave su takođe korisni kao sredstva za dijagnostikovanje. Budući da su peptidi napravljeni iz ćelija HCC, CRC, GB, GC, raka jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanoma, raka dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC i CLL, i budući da je utvrđeno da ovi peptidi nisu prisutni ili su prisutni u manjim nivoima u normalnim tkivima, ovi peptidi mogu da se koriste za dijagnostikovanje prisustva raka.

Prisustvo peptida patentnog zahteva na biopsijama tkiva u uzorcima krvi može da pomogne patologu u postavljanju dijagnoze raka. Detekcija određenih peptida pomoću antitela, masene spektrometrije ili drugih metoda poznatih u stručnoj oblasti mogu da pokažu patologu da je uzorak tkiva maligan ili inflamiran ili uopšteno oboleo, ili može da se koristi kao biomarker za HCC, CRC, GB, GC, rak jednjaka, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, rak dojke, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC ili CLL. Prisustvo grupa peptida može da omogući klasifikaciju ili subklasifikaciju obolelih tkiva.

Detekcija peptida na uzorku obolelog tkiva može da omogući donošenje odluke o koristima terapija koje uključuju imunski sistem, posebno ako je poznato ili se očekuje da T limfociti budu uključeni u mehanizam delovanja. Gubitak MHC ekspresije je dobro opisani mehanizam pomoću kojeg inficirane ili maligne ćelije izbegavaju imunološki nadzor.

Tako, prisustvo peptida pokazuje da analizirane ćelije ne iskorišćavaju ovaj mehanizam.

Peptidi predmetne objave mogu da se koriste za analizu limfocitnih odgovora protiv tih peptida, kao što su T-ćelijski odgovori ili odgovori antitelima protiv peptida ili peptida u kompleksu sa MHC molekulom. Ovi limfocitni odgovori mogu da se koriste kao prognostički markeri za donošenje odluke o daljim koracima lečenja. Ovi odgovori mogu takođe da se koriste kao surogat markeri odgovora u imunoterapijskim pristupima čiji je cilj indukcija limfocitnih odgovora pomoću različitih sredstava, npr. vakcinacije proteinom, nukleinskim kiselinama, autolognim materijalom, ili adoptivni transfer limfocita. U smislu genske terapije, limfocitni odgovori protiv peptida mogu se razmatrati u pogledu procene neželjenih dejstava. Praćenje limfocitnih odgovora može takođe biti dragocena alatka za kontrolne preglede terapija transplantacijom, npr. za detekciju bolesti graft protiv domaćina i domaćin protiv grafta.

SLIKE

Na slici 1 prikazana je prekomerna prezentacija raznih peptida u različitim malignim tkivima u poređenju sa normalnim tkivima. Analize su uključivale podatke od više od 170 uzoraka normalnih tkiva, i 376 uzoraka raka. Prikazani su samo uzorci u kojima je pronađeno da je peptid prezentovan. Slika 1A) Gen: CENPE, peptid: KLQEKIQEL (ID BR. SEKV: 1), tkiva sleva nadesno: 4 ćelijske linije leukocitnog raka, 1 ćelijska linija raka pankreasa, 1 ćelijska linija melanoma, 2 uzorka normalnog tkiva (1 nadbubrežna žlezda, 1 slezina), 31 uzorak tkiva primarnog malignog tumora (1 rak mozga, 4 raka kolona, 1 rak jednjaka, 1 rak bubrega, 2 raka jetre, 16 rakova pluća, 4 raka jajnika, 1 rak rektuma, 1 rak želuca). Slika 1B) Gen: KIF15, peptid: QLIEKNWLL (ID BR. SEKV: 10), tkiva sleva nadesno: 5 ćelijskih linija leukocitnog raka, 1 ćelijska linija raka pankreasa, 1 ćelijska linija mijeloidne leukemije, 1 uzorak normalnog tkiva (1 nadbubrežna žlezda), 29 uzoraka tkiva malignog tumora (4 raka kolona, 2 raka jednjaka, 1 leukocitni rak, 1 rak jetre, 10 rakova pluća, 11 raka jajnika). Slika 1C) Gen: HAVCR1, peptid: LLDPKTIFL (ID BR. SEKV: 11), tkiva sleva nadesno: 1 ćelijska linija raka bubrega, 13 uzoraka tkiva malignog tumora (8 rakova bubrega, 1 rak jetre, 2 raka pluća, 2 raka rektuma). Slika 1D) Gen: RPGRIP1L, peptid: RLHDENILL (ID BR. SEKV: 13), tkiva sleva nadesno: 1 ćelijska linija raka bubrega, 1 ćelijska linija raka prostate, 1 ćelijska linija melanoma, 50 uzoraka tkiva malignog tumora (4 raka mozga, 1 rak kolona, 2 raka jednjaka, 3 raka bubrega, 2 raka jetre, 23 raka pluća, 7 rakova jajnika, 2 raka pankreasa, 2 raka prostate, 3 raka rektuma, 1 rak želuca). Slike 1 E - J prikazuju prekomernu prezentaciju raznih peptida u različitim malignim tkivima u poređenju sa normalnim tkivima. Analize su uključivale podatke od više od 320 uzoraka normalnih tkiva, i 462 uzorka raka. Prikazani su samo uzorci u kojima je pronađeno da je peptid prezentovan. Slika 1E) Gen: DNAH14, peptid: SVLEKEIYSI (ID BR. SEKV: 2), tkiva sleva nadesno: 4 ćelijske linije (3 ćelije krvi, 1 pankreasna), 2 normalna tkiva (1 limfni čvor, 1 dušnik), 52 maligna tkiva (2 raka žučnog puta, 1 rak mijeloidnih ćelija, 3 leukocitne leukemije, 5 rakova dojke, 1 rak jednjaka, 1 rak jednjaka i želuca, 1 rak žučne kese, 4 raka kolona, 7 rakova pluća, 6 rakova limfnog čvora, 7 rakova jajnika, 4 raka prostate, 4 raka kože, 2 raka mokraćne bešike, 4 raka materice). Slika 1F) Gen: MAGEA3, MAGEA6, peptid: KIWEELSVLEV (ID BR. SEKV: 40), tkiva sleva nadesno: 8 malignih tkiva (1 rak jetre, 3 raka pluća, 2 raka kože, 1 rak želuca, 1 rak mokraćne bešike). Slika 1G) Gen: HMX1, peptid: FLIENLLAA (ID BR. SEKV: 67), tkiva sleva nadesno: 7 malignih tkiva (4 raka mozga, 2 raka pluća, 1 rak materice). Slika 1H) Gen: CCDC138, peptid: FLLEREQLL (ID BR. SEKV: 84), tkiva sleva nadesno: 3 ćelijske linije (2 ćelije krvi, 1 koža), 24 malignih tkiva (1 rak mijeloidnih ćelija, 3 leukocitne leukemije, 1 rak kostne srži, 1 rak dojke, 1 rak bubrega, 2 raka kolona, 3 raka rektuma, 1 rak pluća, 7 rakova limfnog čvora, 3 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Slika 1I) Gen: CLSPN, peptid: SLLNQPKAV (ID BR. SEKV: 235), tkiva sleva nadesno: 13 ćelijskih linija (3 ćelije krvi, 2 bubrega, 8 pankreasa), 30 malignih tkiva (1 rak mijeloidnih ćelija, 1 leukocitna leukemija, 2 raka mozga, 2 raka dojke, 2 raka jednjaka, 1 rak mokraćne bešike, 1 rak rektuma, 2 raka jetre, 4 raka pluća, 5 rakova limfnog čvora, 2 raka jajnika, 2 raka kože, 4 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Slika 1J) Gen: SPC25, peptid: GLAEFQENV (ID BR. SEKV: 243), tkiva sleva nadesno: 3 ćelijske linije (1 ćelija krvi, 1 bubreg, 1 pankreas), 67 malignih tkiva (1 rak žučnog puta, 4 leukocitne leukemije, 1 rak mijeloidnih ćelija, 2 raka mozga, 3 raka dojke, 4 raka jednjaka, 2 raka žučne kese, 2 raka kolona, 1 rak rektuma, 2 raka jetre, 15 rakova pluća, 8 rakova limfnog čvora, 9 rakova jajnika, 3 raka kože, 4 raka mokraćne bešike, 6 rakova materice).

Na slici 2 prikazani su primerni profili ekspresije (relativna ekspresija u poređenju sa normalnim bubregom) izvornih gena predmetne objave koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u različitim malignim tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva. Slika 2A) PRIM2 - tkiva sleva nadesno: nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak (ceo), dojka, kolon, jednjak, srce, bubreg (triplikat), leukociti, jetra, pluće, limfni čvor, jajnik, pankreas, placenta, prostata, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, testis, timus, štitasta žlezda, mokraćna bešika, grlić materice, materica, vena (svaki normalan uzorak predstavlja skup od nekoliko donora), 22 pojedinačna uzorka raka prostate. Slika 2B) CHEK1 - tkiva sleva nadesno: nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak (ceo), dojka, kolon, jednjak, srce, bubreg (triplikat), leukociti, jetra, pluće, limfni čvor, jajnik, pankreas, placenta, prostata, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, testis, timus, štitasta žlezda, mokraćna bešika, grlić materice, materica, vena (svaki normalan uzorak predstavlja skup od nekoliko donora), 3 pojedinačna uzorka normalnog kolona, 10 pojedinačnih uzoraka kolorektalnog karcinoma. Slika 2C) TTC30A - tkiva sleva nadesno: nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak (ceo), dojka, kolon, jednjak, srce, bubreg (triplikat), leukociti, jetra, pluće, limfni čvor, jajnik, pankreas, placenta, prostata, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, testis, timus, štitasta žlezda, mokraćna bešika, grlić materice, materica, vena (svaki normalan uzorak predstavlja skup od nekoliko donora), 30 pojedinačnih uzoraka raka mozga. Slika 2D) TRIP13 - tkiva sleva nadesno: nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak (ceo), dojka, kolon, jednjak, srce, bubreg (triplikat), leukociti, jetra, pluće, limfni čvor, jajnik, pankreas, placenta, prostata, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, testis, timus, štitasta žlezda, mokraćna bešika, grlić materice, materica, vena (svaki normalan uzorak predstavlja skup od nekoliko donora), 1 pojedinačan uzorak normalnog pluća, 38 pojedinačna uzorka raka pluća. Slika 2E) MXRA5 - tkiva sleva nadesno: nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak (ceo), dojka, kolon, jednjak, srce, bubreg (triplikat), leukociti, jetra, pluće, limfni čvor, jajnik, pankreas, placenta, prostata, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, testis, timus, štitasta žlezda, mokraćna bešika, grlić materice, materica, vena (svaki normalan uzorak predstavlja skup od nekoliko donora), 9 pojedinačnih uzoraka raka pankreasa. Na slikama 2 F - H prikazani su primerni profili ekspresije izvornih gena predmetne objave koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u raku u panelu normalnih tkiva (beli stupci) i različitim uzorcima raka (crni stupci). Slika 2F) MMP11, MMP13 (ID BR. SEKV: 24) - tkiva s leva nadesno: 80 uzoraka normalnih tkiva (6 arterija, 2 ćelije krvi, 2 mozga, 1 srce, 2 jetre, 3 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 5 kostnih srži, 1 hrskavica, 1 kolon, 1 jednjak, 2 oka, 2 žučne kese, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 4 pankreasa, 2 periferna nerva, 2 hipofize, 1 rektum, 2 pljuvačne žlezde, 2 skeletna mišića, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 štitasta žlezda, 7 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 5 jajnika, 5 placenti, 1 prostata, 1 testis, 1 timus, 1 materica), 50 uzoraka raka (10 rakova dojke, 4 raka žučnog puta, 6 rakova žučne kese, 11 rakova jednjaka, 10 rakova mokraćne bešike, 10 rakova materice). Slika 2G) HORMAD1 (ID BR. SEKV: 168) - tkiva s leva nadesno: 80 uzoraka normalnih tkiva (6 arterija, 2 ćelije krvi, 2 mozga, 1 srce, 2 jetre, 3 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 5 kostnih srži, 1 hrskavica, 1 kolon, 1 jednjak, 2 oka, 2 žučne kese, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 4 pankreasa, 2 periferna nerva, 2 hipofize, 1 rektum, 2 pljuvačne žlezde, 2 skeletna mišića, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 štitasta žlezda, 7 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 5 jajnika, 5 placenti, 1 prostata, 1 testis, 1 timus, 1 materica), 41 uzorak raka (10 rakova dojke, 10 rakova kože, 11 nesitnoćelijskih karcinoma pluća, 10 sitnoćelijskih karcinoma pluća). Slika 2H) IGF2BP1, IGF2BP3 (ID BR. SEKV: 274) - tkiva s leva nadesno: 80 uzoraka normalnih tkiva (6 arterija, 2 ćelije krvi, 2 mozga, 1 srce, 2 jetre, 3 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 5 kostnih srži, 1 hrskavica, 1 kolon, 1 jednjak, 2 oka, 2 žučne kese, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 4 pankreasa, 2 periferna nerva, 2 hipofize, 1 rektum, 2 pljuvačne žlezde, 2 skeletna mišića, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 štitasta žlezda, 7 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 5 jajnika, 5 placenti, 1 prostata, 1 testis, 1 timus, 1 materica), 53 uzoraka raka (4 raka žučnog puta, 6 rakova žučne kese, 10 rakova limfnog čvora, 12 rakova jajnika, 11 rakova jednjaka, 10 rakova pluća).

Na slici 3 prikazani su primerni podaci imunogenosti: rezultati protočne citometrije nakon bojenja peptid-specifičnog multimera.

Slike 4A-R u gornjem delu prikazuju: medijane MS intenziteta signala od merenja tehničkog replikata su predstavljene kao obojene tačke za pojedinačne HLA-A*02 pozitivne normalne (zelene ili sive tačke) i uzorke tumora (crvene tačke) na kojima je detektovan peptid. Uzorci tumora i normalnog tkiva grupisani su prema organu iz kojeg potiču, a kutijasti dijagrami predstavljaju medijanu, 25. i 75. percentil (kutija) i minimalne i maksimalne (brkovi) vrednosti normalizovanih intenziteta signala u više uzoraka. Normalni organi poređani su prema kategorijama rizika (ćelije krvi, kardiovaskularni sistem, mozak, jetra, pluća: visok rizik, tamnozelene tačke; reproduktivni organi, dojka, prostata: nizak rizik, sive tačke; svi ostali organi: srednji rizik; svetlozelene tačke). Donji deo: relativna učestalost detekcije peptida u svakom organu prikazana je u vidu mozaičkog dijagrama. Brojevi ispod panela pokazuju broj uzoraka na kojima je peptid detektovan u odnosu na ukupan broj analiziranih uzoraka za svaki organ (N = 298 za normalne uzorke, N = 461 za uzorke tumora). Ako je peptid detektovan na uzorku ali nije mogao da se kvantifikuje iz tehničkih razloga, uzorak je uključen u ovu reprezentaciju učestalosti detekcije, ali u gornjem delu slike nije prikazana tačka. Tkiva (sleva nadesno): Normalni uzorci: arterija; ćelije krvi; mozak; srce; jetra; pluće; vena; adipozno: masno tkivo; nadbub. žl.: nadbubrežna žlezda; KS: kostna srž; kolorekt: kolon i rektum; duod: duodenum; ezof: jednjak; žuč. kesa: žučna kesa; LČ: limfni čvor; pank: pankreas; paratir: paraštitasta žlezda; perit: peritoneum; hipof: hipofiza; pljuv.žl.: pljuvačna žlezda; skel.miš: skeletni mišić; koža; tan.cr: tanko crevo; slezina; želudac; štitasta; traheja; ureter; bešika; dojka; jajnik; placenta; prostata; testis; timus; materica. Uzorci tumora: AML: akuta mijeloidna leukemija; PCA: rak prostate; BRCA: rak dojke; CLL: hronična limfocitna leukemija; CRC: kolorektalni karcinom; GALB: rak žučne kese; HCC: hepatocelularni karcinom; MEL: melanom; NHL: non-Hodžkinov limfom; OC: rak jajnika; OSCAR: rak jednjaka; OSC_GC: rak jednjaka/ želuca; PC: rak pankreasa; GB: glioblastom; GC: rak želuca; NSCLC: nesitnoćelijski karcinom pluća; RCC: karcinom bubrežnih ćelija; SCLC: sitnoćelijski karcinom pluća; UBC: karcinom mokraćne bešike; UEC: rak materice i endometrijuma.

Na slikama 5A-R prikazani su primerni profili ekspresije izvornih gena predmetne objave koji su prekomerno eksprimirani u različitim uzorcima raka. Uzorci tumora (crvene tačke) i normalnog tkiva (zelene ili sive tačke) grupisani su prema organu iz kojeg potiču, a kutijasti dijagrami predstavljaju medijanu, 25. i 75. percentil (kutija) i minimalne i maksimalne (brkovi) RPKM vrednosti. Normalni organi su poređani prema kategorijama rizika. RPKM = očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja. Normalni uzorci: arterija; ćelije krvi; mozak; srce; jetra; pluće; vena; adipozno: masno tkivo; nadbub. žl.: nadbubrežna žlezda; KS: kostna srž; hrskavica; kolorekt: kolon i rektum; ezof: jednjak; oko; žuč. kesa: žučna kesa; bubreg; LČ: limfni čvor; nerv; pank: pankreas; hipof: hipofiza; pljuv.žl.: pljuvačna žlezda; skel.miš: skeletni mišić; koža; tan.cr: tanko crevo; slezina; želudac; štitasta; traheja; bešika; dojka; jajnik; placenta; prostata; testis; timus; materica. Uzorci tumora: AML: akuta mijeloidna leukemija; PCA: rak prostate; BRCA: rak dojke; CLL: hronična limfocitna leukemija; CRC: kolorektalni karcinom; GALB: rak žučne kese; HCC: hepatocelularni karcinom; MEL: melanom; NHL: non-Hodžkinov limfom; OC: rak jajnika; OSCAR: rak jednjaka; PC: rak pankreasa; GB: glioblastom; GC: rak želuca; NSCLC: nesitnoćelijski karcinom pluća; RCC: karcinom bubrežnih ćelija; SCLC: sitnoćelijski karcinom pluća; UBC: karcinom mokraćne bešike; UEC: rak materice i endometrijuma.

Na slikama 6A do M prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa, na primer, peptidom ID br. sekv.11 (A, levi panel), odnosno peptidom ID br. sekv.14 (B, levi panel) (ID br. sekv.157 (C), 233 (D), 85 (E), 89 (F), 155 (G), 153 (H), 264 (I), 117 (J), 253 (K), 39 (L) i 203 (M)). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa relevantnim multimerom, na primer, A*02/ID br. sekv.11 (A) ili A*02/ID br. sekv. 14 (B). Desni paneli (na primer A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slikama 7A - C prikazana je prekomerna prezentacija raznih peptida u različitim malignim tkivima u poređenju sa normalnim tkivima. Analize su uključivale podatke od više od 320 uzoraka normalnih tkiva, i 462 uzorka raka. Prikazani su samo uzorci u kojima je pronađeno da je peptid prezentovan. Slika 7A) Gen: CCR8, peptid: LLIPFTIFM (ID BR. SEKV: 43), tkiva sleva nadesno: 16 malignih tkiva (1 rak žučnog kanala, 1 rak dojke, 1 rak kolona, 7 rakova pluća, 2 raka limfnog čvora, 3 raka jajnika, 1 rak kože); Slika 7B) Gen: CXCR5, peptid: ILVTSIFFL (ID BR. SEKV: 152), tkiva sleva nadesno: 6 normalnih tkiva (1 limfni čvor, 5 slezina), 16 malignih tkiva (8 leukocitnih leukemija, 8 rakova limfnog čvora); Slika 7C) Gen: CYSLTR1, peptid: VILTSSPFL (ID BR. SEKV: 156), tkiva sleva nadesno: 3 normalna tkiva (1 pluće, 1 limfni čvor, 1 slezina), 11 malignih tkiva (2 raka dojke, 5 leukocitnih leukemija, 3 raka limfnog čvora, 1 rak mijeloidnih ćelija).

PRIMERI

PRIMER 1

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tumorska tkiva pacijenata dobijena su od Asterand (Detroit, SAD i Royston, Herts, UK); Univerzitetske bolnice Val d’Hebron (Barselona); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Centra za imunoterapiju raka (CCIT), Bolnice Herlev (Herlev); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Univerzitetske bolnice u Ženevi; Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu; Univerzitetske bolnice u Minhenu; Prefekturalnog medicinskog univerziteta u Kjotou (KPUM); Univerziteta grada Osake (OCU); ProteoGenex Inc., (Culver City, CA, SAD); Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Normalna tkiva dobijena su od kompanije Bio-Options Inc., CA, SAD; BioServe, Beltsville, MD, SAD; Capital BioScience Inc., Rockville, MD, SAD; Geneticist Inc., Glendale, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Ženevi; Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu; Univerzitetske bolnice u Minhenu; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u Orbitrap (R = 30000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u Orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al., 2007). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću dekonvolucije naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke raka sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na slici 1. Pregled prezentacije peptida u okviru oboljenja prikazan je u tabeli 4 za izabrane peptide.

Tabela 4: pregled prezentacije izabranih peptida u okviru oboljenja. Peptid se smatrao interesantnim u entitetu ako je bio prekomerno prezentovan na uzorcima raka ovog organa u poređenju da normalnim tkivima. MEL = melanom, BRCA = rak dojke, OSCAR = karcinom jednjaka. BPH obuhvata benignu hiperplaziju prostate kao i rak pankreasa.

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptide objave

Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima. Za ovu objavu, pokazano je da je normalna tkivna ekspresija svih izvornih gena minimalna na osnovu gore opisanih podataka o ekspresiji RNK iz baze podataka koja pokriva oko 3000 uzoraka normalnih tkiva. Dodatne RNK analize normalnih i tumorskih tkiva dodate su u slučaju nekih maligniteta (HCC, CRC, GB, GC, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA) da bi se procenila ciljna pokrivenost u populaciji pacijenata koji imaju dotični malignitet.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (vidite primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva dobijena je komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Nemačka; Stratagene, Amsterdam, Holandija; BioChain, Hayward, CA, SAD). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 osobe) izmešana je tako da je RNK od svakog pojedinca bila težinski podjednaka. Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva za eksperimente sekvenciranja RNK dobijena je od: Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); BioCat GmbH (Hajdelberg, Nemačka); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“ (Napulj, Italija); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD), Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Hajdelberg, Nemačka)

Ukupna RNK iz tumorskih tkiva za eksperimente sekvenciranja RNK dobijena je od: Asterand (Detroit, Ml, SAD i Royston, Herts, UK), Bio-Options Inc. (Brea, CA, SAD), BioServe (Beltsville, MD, SAD), Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD), Tissue Solutions Ltd (Glazgov, UK), Univerzitetske bolnice u Bonu (Bon, Nemačka), Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Hajdelberg, Nemačka), Univerzitetske bolnice u Tubingenu (Tübingen, Nemačka).

Eksperimenti na mikročipu

Pokrivenost je procenjena analizom profila ekspresije RNK (Affymetrix mikročipovi) iz 30 GB, 16 CRC, 56 RCC, 12 HCC, 38 NSCLC, 11 PC, 34 GC i 20 uzoraka raka prostate.

Analiza genske ekspresije svih uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću Affymetrix Human Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnih mikročipova (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD). Svi koraci su izvršeni u skladu sa priručnikom za Affymetrix. Ukratko, sintetisana je dvolančana cDNK iz 5–8 µg ukupne RNK, primenom SuperScript RTII (Invitrogen) i oligo-dT-T7 prajmera (MWG Biotech, Ebersberg, Nemačka) kako je opisano u priručniku. In vitro transkripcija je izvršena sa kompletom BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SAD) za U133A čipove ili sa kompletom GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 čipove, nakon čega je sledila fragmentacija, hibridizacija i bojenje cRNK sa streptavidin-fikoeritrin i biotiniliranim anti-streptavidin antitelom (Molecular Probes, Leiden, Holandija). Slike su skenirane skenerom Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), a podaci su analizirani pomoću GCOS softvera (Affymetrix), upotrebom podrazumevanih podešavanja za sve parametre. Za normalizaciju je korišćeno 100 konstitutivnih gena obezbeđenih od strane kompanije Affymetrix. Vrednosti relativne ekspresije izračunate su iz logaritamskih odnosa signala datih od strane softvera a normalni uzorak bubrega je arbitrarno podešen na 1,0. Primerni profili ekspresije izvornih gena predmetne objave koji su veoma prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u HCC, CRC, GB, GC, NSCLC, PC, RCC ili BPH/PCA prikazani su na slici 2. Pregled pokrivenosti za izabrane gene prikazan je na Greška! Izvor reference nije pronađen..

Eksperimenti sekvenciranja RNK

Analiza ekspresije gena uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je sekvenciranjem naredne generacije (RNAseq) pomoću CeGaT (Tibingen, Nemačka). Ukratko, biblioteke za sekvenciranje su pripremljene primenom kompleta reagensa Illumina HiSeq v4 prema protokolu dobavljača (Illumina Inc., San Diego, CA, SAD), koji obuhvata fragmentaciju RNK, konverziju cDNK i dodavanje adaptera za sekvenciranje. Biblioteke dobijene od multiplih uzoraka se mešaju ekvimolarno i sekvenciraju na Illumina HiSeq 2500 sekvenceru prema uputstvima proizvođača, stvarajući jednostrana očitavanja veličine 50 bp. Obrađena očitavanja se mapiraju na humanom genomu (GRCh38) pomoću softvera STAR. Podaci o ekspresiji se obezbeđuju na nivou transkripta u vidu RPKM (očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja, koji generiše softver Cufflinks) i na nivou egzona (ukupna očitavanja, generiše softver Bedtools), na osnovu beleški ensembl baze podataka sekvenci (Ensembl77). Očitavanja egzona se normalizuju za dužinu egzona i veličinu poravnanja kako bi se dobile RPKM vrednosti.

Primerni profili ekspresije izvornih gena predmetne objave koji su veoma prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u NHL, BRCA, GBC, CCC, MEL, OC, OSCAR, SCLC, UBC, UEC prikazani su na slikama 2 F-H.

PRIMER 3

In vitro imunogenost MHC klasa I-prezentovanih peptida

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti TUMAP-ova predmetne objave, istraživači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigenprezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za 47 HLA-A*0201-restrikovanih TUMAP-ova objave do sada, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (Greška! Izvor reference nije pronađen. 6A i B).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih od Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka. PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Keln, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Hajdelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nirnberg, Nemačka). Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 289) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV. 290).

800.000 perli /200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C.

Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost peptida

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za 15 peptida iz ove objave prikazani su na slikama 3 i 6 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama.

PRIMER 4

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc.

Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama >50%.

Svi TUMAP-ovi se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.

PRIMER 5

Testovi vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama u skladu sa predmetnom objavom su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC proizvedeni su pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko i sar. (Rodenko et al., 2006).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS-u na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*02:01/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15–500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Tabela 5: rezultati vezivanja MHC klase I

Vezivanje HLA klasa I-restrikovanog peptida za HLA-A*02:01 procenjeno je pomoću prinosa izmene peptida: ≥10% = ; ≥20% = +; ≥50 = ++; ≥ 75% = +++

PRIMER 6

Tabela 6: poželjni peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom

Apsolutna kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije Stvaranje vezivača, kao što su antitela i/ili TCR-ovi, je težak proces, koji se može sprovesti samo za određeni broj izabranih ciljeva. U slučaju tumor-asociranih i tumorspecifičnih peptida, kriterijumi za odabir obuhvataju, bez ograničavanja, ekskluzivnost prezentacije i gustinu peptida prezentovanog na površini ćelije. Pored izolacije i relativne kvantifikacije ovde opisanih peptida, pronalazači su analizirali apsolutni broj kopija peptida po ćeliji kako je opisano. Kvantifikacija kopija TUMAP po ćeliji u uzorcima solidnog tumora iziskuje apsolutnu kvantifikaciju izolovanog TUMAP, efikasnost izolacije TUMAP i broj ćelija u analiziranom uzorku tkiva.

Kvantifikacija peptida pomoću nanoLC-MS/MS

Za preciznu kvantifikaciju peptida pomoću masene spektrometrije, za svaki peptid je generisana kalibraciona kriva primenom internog standardnog metoda. Interni standard je dvostruko izotopom obeležena varijanta svakog peptida, tj. u sintezu TUMAP su uključene dve aminokiseline obeležene izotopom. On se od tumorasociranog peptida razlikuje samo po svojoj masi ali ne pokazuje razliku u drugim fizičko-hemijskim svojstvima (Anderson et al., 2012). Interni standard je dodat u svaki MS uzorak a svi MS signali su normalizovani prema MS signalu internog standarda kako bi se izjednačila potencijalna tehnička odstupanja između MS eksperimenata.

Kalibracione krive su pripremljene u najmanje tri različite matrice, tj. eluati HLA peptida iz prirodnih uzoraka slični rutinskim MS uzorcima, a svaki preparat je izmeren u MS ciklusima u duplikatu. Za evaluaciju, MS signali su normalizovani prema signalu internog standarda a kalibraciona kriva je izračunata logističkom regresijom.

Za kvantifikaciju tumor-asociranih peptida iz uzoraka tkiva, u odgovarajuće uzorke je takođe dodat interni standard; MS signali su normalizovani prema internom standardu i kvantifikovani pomoću kalibracione krive peptida.

Efikasnost izolacije peptid/MHC

Kao i za svaki postupak prečišćavanja proteina, izolacija proteina iz uzoraka tkiva povezana je sa određenim gubitkom proteina od interesovanja. Da bi se utvrdila efikasnost izolacije TUMAP, kompleksi peptid/MHC su stvoreni za sve TUMAP-ove izabrane za apsolutnu kvantifikaciju. Da bi mogli da se razlikuju spajkovani od prirodnih kompleksa peptid/MHC korišćene su jednostruko izotopom obeležene verzije TUMAP-ova, tj. u sintezu TUMAP je uključena jedna aminokiselina obeležena izotopom. Ovi kompleksi su dodati u sveže pripremljene lizate tkiva, tj. u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP, a zatim uhvaćeni kao prirodni kompleksi peptid/MHC u narednom afinitetnom prečišćavanju. Merenje dobijanja jednostruko obeleženih TUMAP-ova stoga omogućava donošenje zaključaka u pogledu efikasnosti izolacije pojedinačnih prirodnih TUMAP-ova.

Efikasnost izolacije je analizirana na malom broju uzoraka i bila je uporediva među ovim uzorcima tkiva. Suprotno tome, efikasnost izolacije se razlikuje između pojedinačnih peptida. Ovo sugeriše da efikasnost izolacije, iako određena u samo ograničenom broju uzoraka tkiva, može da se ekstrapolira na bilo koji drugi preparat tkiva. Ipak, neophodno je da se svaki TUMAP pojedinačno analizira zato što efikasnost izolacije ne može da se ekstrapolira sa jednog peptida na druge.

Utvrđivanje broja ćelija u solidnom, zamrznutom tkivu

Da bi se utvrdio broj ćelija uzoraka tkiva podvrgnutih apsolutnoj kvantifikaciji peptida, pronalazači su primenili analizu sadržaja DNK. Ovaj metod je primenjiv za širok spektar uzoraka različitog porekla i, što je najvažnije, zamrznute uzorke (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). U toku protokola izolacije peptida, uzorak tkiva se obrađuje do homogenog lizata, iz kojeg se uzima mali alikvot lizata. Alikvot se deli na tri dela, iz kojih se izoluje DNK (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Nemačka). Ukupan sadržaj DNK iz svake izolacije DNK se kvantifikuje pomoću eseja kvantifikacije DNK zasnovanog na fluorescenciji (komplet eseja Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Nemačka) u najmanje dva replikata.

Da bi se izračunao broj ćelija, stvorena je standardna kriva DNK iz alikvota pojedinačnih zdravih ćelija krvi, sa rasponom definisanih brojeva ćelija. Standardna kriva se koristi za izračunavanje ukupnog sadržaja ćelija iz ukupnog sadržaja DNK iz svake izolacije DNK. Srednja vrednost ukupnog broja ćelija uzorka tkiva korišćenog za izolaciju peptida se ekstrapolira uzimajući u obzir poznatu zapreminu alikvota lizata i ukupnu zapreminu lizata.

Kopije peptida po ćeliji

Uz pomoć podataka iz gore navedenih eksperimenata pronalazači su izračunali broj kopija TUMAP po ćeliji deljenjem ukupne količine peptida sa ukupnim brojem ćelija uzorka, nakon čega je sledilo deljenje kroz efikasnost izolacije.

Lista referenci

Adelaide, J. et al., Cancer Res 67 (2007): 11565-11575

Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

American Cancer Society, (2015), www.cancer.org

Ampie, L. et al., Front Oncol.5 (2015): 12

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878

Appay, V. et al., Eur.J Immunol.36 (2006): 1805-1814

Arafat, H. et al., Surgery 150 (2011): 306-315

Aung, P. P. et al., Oncogene 25 (2006): 2546-2557

Avigan, D. et al., Clin Cancer Res.10 (2004): 4699-4708

Baba, T. et al., Eur.J Cardiothorac.Surg. 43 (2013): 759-764

Bahnassy, A. A. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 18240-18248

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Band, A. M. et al., J Mammary.Gland.Biol Neoplasia.16 (2011): 109-115 Bankovic, J. et al., Lung Cancer 67 (2010): 151-159

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beaty, T. H. et al., Hum.Genet. 132 (2013): 771-781

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Bell, J. L. et al., J Clin Oncol 33 (2015): 1285-1293

Bell, J. L. et al., Cell Mol Life Sci.70 (2013): 2657-2675

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), 57 (1995): 289-300

Berger, C. et al., Curr.Mol.Med.13 (2013): 1229-1240

Berman, R. S. et al., National Cancer Institute: PDQ(R) Colon Cancer Treatment (2015a)

Berman, R. S. et al., National Cancer Institute: PDQ(R) Rectal Cancer Treatment (2015b) Bhan, S. et al., Oncol Rep.28 (2012): 1498-1502

Bode, P. K. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 899-905

Bogush, T. A. et al., Antibiot.Khimioter. 54 (2009): 41-49

Bonventre, J. V., Trans.Am.Clin Climatol.Assoc. 125 (2014): 293-299 Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol.5 (2004): 29-43

Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 2817-2825

Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 5902-5908

Caballero, O. L. et al., PLoS.One. 5 (2010)

Carballido, E. et al., Cancer Control 19 (2012): 54-67

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother.53 (2004): 345-357

Chang, Y. S. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 59 (2007): 561-574 Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol.65 (2004): 1211-1223 Chapiro, J. et al., Radiol.Med. 119 (2014): 476-482

Chen, H. S. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi.11 (2003): 145-148 Chen, S. T. et al., Cancer Sci.102 (2011b): 2191-2198

Chen, Y. L. et al., Int J Surg.11 (2013c): 85-91

Chen, Y. T. et al., Cancer Immun.5 (2005): 9

Cierna, Z. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 472

Ciruelos Gil, E. M., Cancer Treat.Rev 40 (2014): 862-871

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114 Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995) Colombetti, S. et al., J Immunol.176 (2006): 2730-2738 Coosemans, A. et al., Anticancer Res 33 (2013): 5495-5500 Coulie, P. G. et al., Immunol.Rev 188 (2002): 33-42

Counter, C. M. et al., Blood 85 (1995): 2315-2320

Cuadros, T. et al., Cancer Res 74 (2014): 1416-1428

Cuadros, T. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): 2034-2047

Dalerba, P. et al., Int.J Cancer 93 (2001): 85-90

De, Plaen E. et al., Immunogenetics 40 (1994): 360-369

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170 Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Downie, D. et al., Clin Cancer Res.11 (2005): 7369-7375

Du, X. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 6324-6335

Duan, Z. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 2778-2785

Ek, S. et al., Cancer Res 62 (2002): 4398-4405

Emens, L. A., Expert.Rev.AnticancerTher. 12(2012): 1597-1611 Enguita-German, M. et al., World J Hepatol. 6 (2014): 716-737

Estey, E. H., Am.J Hematol.89 (2014): 1063-1081

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC

CancerBase No.11 [Internet], (2013), http://globocan.iarc.fr

Findeis-Hosey, J. J. et al., Biotech.Histochem. 87 (2012): 24-29

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.il.S.A 98 (2001): 8809-8814

Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett.31 (2009): 819-823

Frasor, J. et al., Mol.Cell Endocrinol. 418 Pt 3 (2015): 235-239

Fuge, 0. et al., Res Rep.Urol. 7 (2015): 65-79

Fujiyama, T. et al., J Dermatol.Sci. 75 (2014): 43-48

Fukuyama, T. et al., Cancer Res.66 (2006): 4922-4928

Fuqua, S. A. et al., Breast Cancer Res Treat.144 (2014): 11-19 Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gandhi, A. V. et al., Ann Surg.Oncol 20 Suppl 3 (2013): S636-S643 Gardina, P. J. et al., BMC.Genomics 7 (2006): 325

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Giannopoulos, K. et al., Leukemia 24 (2010): 798-805

Giannopoulos, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 95-103

Gibbs, P. et al., Melanoma Res 10 (2000): 259-264

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.lmmunol 9 (1997): 905-911

Gong, Y. et al., Adv.Anat.Pathol. 21 (2014): 191-200

Grah, J. J. et al., Tumori 100 (2014): 60-68

Granziero, L. et al., Blood 97 (2001): 2777-2783

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012) Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Gu, X. et al., Sci.Rep.4 (2014): 6625

Gunawardana, C. et al., Br.J Haematol. 142 (2008): 606-609

Hall, R. D. et al., Cancer Control 20 (2013): 22-31

Hamilton, K. E. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 1478-1486

Han, L. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 6734-6742

Hanagiri, T. et al., Anticancer Res.33 (2013): 2123-2128

Harig, S. et al., Blood 98 (2001): 2999-3005

Hasegawa, H. et al., Arch.Pathol.Lab Med.122 (1998): 551-554 Hayashi, S. I. et al., Endocr.Relat Cancer 10 (2003): 193-202 Hennard, C. et al., J Pathol. 209 (2006): 430-435

Herbert, N. et al., J Immunol.185 (2010): 902-916

Hinrichs, C. S. et al., Nat.Biotechnol.31 (2013): 999-1008 Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hoffmann, N. E. et al., Cancer 112 (2008): 1471-1479

Holtl, L. et al., Clin.Cancer Res.8 (2002): 3369-3376

Hsu, H. C. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.329 (2005): 1108-1117 Hu, S. et al., J Cancer Res Clin Oncol 140 (2014): 883-893

Huang, X. et al., Cell Prolif.48 (2015b): 593-599

Hui, L. et al., Oncol Rep.34 (2015): 2627-2635

Hussein, Y. M. et al., Med.Oncol 29 (2012): 3055-3062

Hwang, M. L. et al., J Immunol.179 (2007): 5829-5838

loannidis, P. et al., Anticancer Res 23 (2003): 2179-2183

Jeng, Y. M. et al., Br.J Surg.96 (2009): 66-73

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611 -4615 Kalos, M. et al., Sci.Transl.Med. 3(2011): 95ra73

Kang, C. Y. et al., J Gastrointest.Surg. 18 (2014): 7-15

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000) Kim, Y. D. et al., Int.J Mol.Med.29 (2012): 656-662

Kobayashi, H. et al., Oncol Lett.10 (2015): 612-618

Koido, S. et al., World J Gastroenterol. 19 (2013): 8531-8542 Krackhardt, A. M. et al., Blood 100 (2002): 2123-2131

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Lederer, M. et al., Semin.Cancer Biol 29 (2014): 3-12

Lee, M. Y. et al., J Cell Physiol 224 (2010): 17-27

Lee, W. C. et al., J Immunother.28 (2005): 496-504

Leitlinien fur Diagnostik und Therapie in der Neurologie, 030/099, (2014) Leivo, I. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 156 (2005): 104-113 Leonetti, M. D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 19274-19279 Li, H. et al., Bull.Cancer 99 (2012): E26-E33

Li, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 1809-1814

Li, W. M. et al., J Surg.Oncol (2016)

Li, Y. et al., Cancer Epidemiol. 39 (2015): 8-13

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lin, J. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 5708-5716

Lin, L. et al., Oncol Lett.6 (2013): 740-744

Lisitskaia, K. V. et al., Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol. (2010): 34-37

Liu, X. et al., Int.lmmunopharmacol.25 (2015): 416-424

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Llovet, J. M. et al., N.Engl.J Med. 359 (2008): 378-390 Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291 Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795 Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004) Luo, C. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 1288-1297

Mantia-Smaldone, G. M. et al., Hum.Vaccin.lmmunother.8 (2012): 1179-1191 Marten, A. et al., Cancer Immunol.Immunother.51 (2002): 637-644 Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res.43 (2015): 3180-3196

Massari, F. et al., Cancer Treat.Rev. 41 (2015): 114-121

Matsueda, S. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 1657-1666 Maus, M. V. et al., Blood 123 (2014): 2625-2635

Mayr, C. et al., Exp.Hematol. 34 (2006): 44-53

Mayr, C. et al., Blood 105 (2005): 1566-1573

Mehta, A. et al., Breast 23 (2014): 2-9

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Miyagi, Y. et al., Clin Cancer Res 7 (2001): 3950-3962

Miyoshi, Y. et al., Med.Mol.Morphol. 43 (2010): 193-196

Molina, J. R. et al., Mayo Clin Proc. 83 (2008): 584-594

Mongan, N. P. et al., Mol.Carcinog 45 (2006): 887-900

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res.12 (2006): 3435-3443

Moulton, H. M. et al., Clin Cancer Res 8 (2002): 2044-2051

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics.7 (2007): 3470-3480

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638 Murray, G. I. et al., Histopathology 57 (2010): 202-211

National Cancer Institute, (5-6-2015), www.cancer.gov

Noubissi, F. K. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014): 1718-1724 Oehlrich, N. et al., Int.J Cancer 117 (2005): 256-264

Okuno, K. et al., Exp.Ther Med.2 (2011): 73-79

Ottaviani, S. et al., Cancer Immunol.Immunother.55 (2006): 867-872 Otte, M. et al., Cancer Res 61 (2001): 6682-6687

Ozeki, N. et al., Int.J Mol.Sci.17 (2016)

Pai, V. P. et al., Breast Cancer Res 11 (2009): R81

Palmer, D. H. et al., Hepatology 49 (2009): 124-132

Palomba, M. L., Curr.Oncol Rep.14 (2012): 433-440

Perez, C. A. et al., Expert.Rev Anticancer Ther.11 (2011): 1599-1605 Phan, G. Q. et al., Cancer Control 20 (2013): 289-297

Pineda, C. T. et al., Cell 160 (2015): 715-728

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R- project.org/packe=nlme) (2015)

Piebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Porter, D. L. et al., N.Engl.J Med.365 (2011): 725-733

Prasad, M. L. et al., Head Neck 26 (2004): 1053-1057

Qian, Z. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 335-347

Quinn, D. I. et al., Urol.Oncol. (2015)

Raman, J. D. et al., Carcinogenesis 27 (2006): 499-507 Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219 Reck, M., Ann.Oncol 23 Suppl 8 (2012): viii28-viii34

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Reinisch, C. M. et al., Int.J Exp.Pathol. 92 (2011): 326-332 Reinisch, W. et al., J Immunother.25 (2002): 489-499 Reinmuth, N. et al., Dtsch.Med.Wochenschr.140 (2015): 329-333 Ries, J. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 817-824

Rinaldi, A. et al., Pathobiology 77 (2010): 129-135

Rini, B. I. et al., Curr.Opin.Oncol.20 (2008): 300-306

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Risinger, J. I. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 1713-1719

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc.1 (2006): 1120-1132

S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 032-0100L, (2013)

S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 020/007, (2011)

S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 032-0350L, (2013)

S3-Leitlinie Mammakarzinom, 032-0450L, (2012)

S3-Leitlinie Melanom, 032-0240L, (2013)

S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 043/0220L, (2014)

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Salman, B. et al., Oncoimmunology. 2 (2013): e26662

Sangro, B. et al., J Clin Oncol 22 (2004): 1389-1397

Schmidt, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 1164-1170

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Shahzad, M. M. et al., Cancer Lett.330 (2013): 123-129

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Sherman-Baust, C. A. et al., Cancer Cell 3 (2003): 377-386

Shi, M. et al., World J Gastroenterol.10 (2004): 1146-1151

Showel, M. M. et al., FIOOOPrime.Rep.6 (2014): 96

Siegel, S. et al., Blood 102 (2003): 4416-4423

Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004): 187-195 Skandalis, S. S. et al., Matrix Biol 35 (2014): 182-193

Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006): 3089-3094

Smith, M. J. et al., Br.J Cancer 100 (2009): 1452-1464

Son, M. Y. et al., Stem Cells 31 (2013): 2374-2387

Springelkamp, H. et al., Genet.Epidemiol.39 (2015): 207-216

Stahl, M. et al., Ann.Oncol.24 Suppl 6 (2013): vi51-vi56

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics.9 (2008): 163

Su, Z. et al., Cancer Res.63 (2003): 2127-2133

Sun, H. et al., J BUON.20 (2015): 296-308

Szajnik, M. et al., Gynecol.Obstet.(Sunnyvale.) Suppl 4 (2013): 3 Szarvas, T. et al., Int J Cancer 135 (2014): 1596-1604

Takayama, T. et al., Cancer 68(1991): 2391-2396

Takayama, T. et al., Lancet 356 (2000): 802-807

Tanaka, F. et al., Int.J Oncol 10(1997): 1113-1117

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci.62 (2005): 1755-1762

Thakkar, J. P. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.23 (2014): 1985-1996 Thorsen, K. et al., Mol Cell Proteomics. 7 (2008): 1214-1224

Tian, X. et al., J Transl.Med. 13 (2015): 337

Toomey, P. G. et al., Cancer Control 20 (2013): 32-42

Tradonsky, A. et al., Am.J Clin Pathol.137 (2012): 918-930

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Urgard, E. et al., Cancer Inform.10 (2011): 175-183

van der Bruggen, P. et al., Immunol.Rev 188 (2002): 51-64

van, Duin M. et al., Haematologica 96 (2011): 1662-1669

Velinov, N. et al., Khirurgiia (Sofiia) (2010): 44-49

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012): 1254-1261

Wang, G. H. et al., Oncol Lett.5 (2013): 544-548

Wang, Y. et al., Anticancer Res 33 (2013): 207-214

Wilhelm, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 7099-7109 Willcox, B. E. et al., Protein Sci.8 (1999): 2418-2423 Wittig, B. et al., Hum.Gene Ther.12 (2001): 267-278 Wlodarski, M. W. et al., J Leukoc.Biol 83 (2008): 589-601 World Cancer Report, (2014)

Wu, Z. Y. et al., Scand.J Immunol.74 (2011): 561-567 Xie, X. et al., Oncol Lett.7 (2014): 1537-1543

Xiong, D. et al., Carcinogenesis 33 (2012): 1797-1805 Xu, J. et al., J Mol.Biol 377 (2008): 28-46

Xu, L. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi.14 (2011): 727-732 Xu, X. et al., Exp.Mol.Pathol. 97 (2014): 579-584

Xu, Y. et al., Sci.Rep.5 (2015): 12104

Yakimchuk, K. et al., Mol.Cell Endocrinol. 375 (2013): 121-129 Yamada, R. et al., Tissue Antigens 81 (2013): 428-434 Yang, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1772 (2007): 1033-1040 Yao, J. et al., Cancer Immunol.Res.2 (2014): 371-379 Yin, B. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 2934-2941 Yu, J. et al., Gut 64 (2015): 636-645

Yu, W. et al., Toxicol.Appl.Pharmacol. 264 (2012): 73-83 Yuan, R. H. et al., Ann Surg.Oncol 16 (2009): 1711-1719 Zamuner, F. T. et al., Mol.Cancer Ther.14 (2015): 828-834 Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577 Zhan, W. et al., Clin Res Hepatol.Gastroenterol. (2015) Zhang, H. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1863-1871 Zhang, J. et al., Oncotarget.6 (2015): 42040-42052 Zhang, S. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 541-550 Zhang, X. et al., Int.J Oncol (2016)

Zhao, H. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi.10 (2002): 100-102 Zou, T. T. et al., Oncogene 21 (2002): 4855-4862

Follenzi A,et al. Nat Genet.2000 Jun;25(2):217-22.

Zufferey R, et al. J Virol.1999 Apr;73(4):2886-92.

Scholten KB, et al. Clin Immunol.2006 May; 119(2): 135-45.

Gustafsson C, et al. Trends Biotechnol. 2004 Jul;22(7):346-53. Review. Kuball, J., et al. (2007). Blood 109, 2331-2338.

Schmitt, T. M., et al. (2009). Hum. Gene Ther.20, 1240-1248

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ID BR. SEKV: 25; i njegova farmaceutski prihvatljiva so, i naznačeno time što navedeni peptid ima ukupnu dužinu od 11 do 16 aminokiselina.

2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što se navedeni peptid sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV 25.

3. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

4. T-ćelijski receptor, poželjno rekombinantni, solubilni ili T-ćelijski receptor vezan za membranu koji je reaktivan sa HLA ligandom u kompleksu sa HLA, naznačeno time što je navedeni ligand najmanje 88% identičan sa aminokiselinskom sekvencom u skladu sa ID BR. SEKV 25, i poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 25.

5. Antitelo, konkretno solubilno ili antitelo vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 25 kada je vezan za MHC molekul.

6. Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 ili TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, opciono povezana sa heterolognom promoterskom sekvencom, ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.

7. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, ili nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritična ćelija ili naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno T ćelija ili NK ćelija.

8. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, ili za proizvodnju T ćelijskog receptora u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitela u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 8 koja prezentuje peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7 i izolovanja peptida ili TCR-a ili antitela iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 25.

10. Aktivirani T limfocit, proizveden metodom u skladu sa patentnim zahtevom 9 koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2.

11. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 5, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, dodatne farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

12. Peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 5 za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka, ili za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka.

13. Peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4 za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka ili za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je navedeni rak izabran iz grupe koju čine hepatocelularni karcinom (HCC), kolorektal karcinom (CRC), glioblastom (GB), rak želuca (GC), rak jednjaka, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), rak pankreasa (PC), karcinom bubrežnih ćelija (RCC), benigna hiperplazija prostate (BPH), rak prostate (PCA), rak jajnika (OC), melanom, rak dojke, hronična limfocitna leukemija (CLL), karcinom Merkelovih ćelija (MCC), sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC), non-Hodžkinov limfom (NHL), akutna mijeloidna leukemija (AML), rak žučne kese i holangiokarcinom (GBC, CCC), rak mokraćne bešike (UBC), rak materice (UEC), i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid ID BR. SEKV 25.

14. Komplet koji se sastoji od:

a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćeliju u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, u rastvoru ili u liofiliziranom obliku;

b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;

c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije, i

d) opciono dalje sadrži jedan ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (vii) brizgalica.